CN103816296B - 紫珠总苷提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供紫珠总苷提取物，以重量计，其含有18％～45％毛蕊花糖苷和15％～40％Arenarioside，所述提取物由华紫珠或杜虹花的叶制备。本发明还提供该紫珠总苷提取物的制备方法及用途。本发明紫珠总苷提取物对神经细胞具有显著的保护作用，对帕金森模型小鼠的行为障碍和老年痴呆模型小鼠的记忆获得性障碍具有明显的改善作用，可用于治疗神经退行性疾病。本发明紫珠总苷提取物还对诸如皮炎或湿疹等皮肤病症状具有良好的治疗和改善作用。可用于治疗皮肤病。

Description

紫珠总苷提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及中医药领域，具体涉及紫珠总苷提取物及其制备方法和用途。
背景技术
紫珠是马鞭草科紫珠属植物的通称，种类繁多，在我国大约有35种，分 布较为广泛。紫珠所含的成分主要为黄酮类、萜类、苯乙醇苷类以及挥发油类 等。其中苯乙醇苷类是其含量较多的化学成分，因结构中大多含有苯丙酰基苷 元，因此也被称为苯丙素苷类化合物。已有文献报道，苯乙醇苷类成分具有止 痛抗菌消炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、保肝护肝和碱基修复作用，对于糖尿 病及相关疾病，学习、记忆能力低下等都具有明显的改善作用。近年来，随着 国内外对其研究的深入，越来越多的文献资料表明苯乙醇苷类化合物具有防治 神经退行性疾病的作用，尤其是在改善老年痴呆症、帕金森病上效果明显。中 国专利申请CN200710040195.2报道从肉苁蓉中制备肉苁蓉总苷(苯乙醇苷类 成分)提取物，并报道了该提取物用于治疗帕金森病的用途。中国专利 CN201010146367.6公开了从枇杷叶紫珠(Callicarpa kochiana)的地上部分中 制备以连翘酯苷B和毛蕊花糖苷为主要特征成分的提取物，并公开了该提取物 用于治疗老年痴呆药物中的应用。
然而，肉苁蓉属于濒危名贵中药材，产量有限，枇杷叶紫珠以野生为主， 产量小，并且该两种药材中苯乙醇苷类成分含量低，因此以肉苁蓉和枇杷叶紫 珠为原料制备苯乙醇苷类成分，生产成本高，不适合持续性发展。因此，用资 源丰富、价格便宜、并且苯乙醇苷类物质含量高的药材来制备治疗神经退行性 等疾病的药物有优越性及需求。另外，由于苯乙醇苷类物质药理活性广泛，苯 乙醇苷类物质的新药效及治疗作用也值得深入的开发。
发明内容
本发明的目的在于提供来源于华紫珠(Callicarpa cathayana H.T.Chang) 或杜虹花(Callicarpa formosana Rolfe)的紫珠总苷提取物，该提取物以苯乙 醇苷类成分毛蕊花糖苷和Arenarioside为特征性活性成分，对于神经退行性疾 病具有治疗功效。另外，该提取物还对湿疹或皮炎具有治疗功效。
本发明提供以下技术方案：
1、紫珠总苷提取物，以重量计，其含有18％～45％毛蕊花糖苷和15％～ 40％Arenarioside，所述提取物由华紫珠(Callicarpa cathayana H.T.Chang) 或杜虹花(Callicarpa formosana Rolfe)的叶(优选为干燥叶)制备。
2、根据技术方案1的紫珠总苷提取物，以重量计，其含有28％～45％毛 蕊花糖苷。
3、根据技术方案1或2的紫珠总苷提取物，以重量计，其含有28％～38％ 毛蕊花糖苷。
4、根据技术方案1-3中任一项的紫珠总苷提取物，以重量计，其含有 24％～40％Arenarioside。
5、根据技术方案1-4中任一项的紫珠总苷提取物，以重量计，其含有 25％～35％Arenarioside。
6、技术方案1-5中任一项所述的紫珠总苷提取物的制备方法，其包括以 下步骤：
(1)将华紫珠Callicarpa cathayana H.T.Chang)或杜虹花(Callicarpaformosana Rolfe)的叶(优选为干燥叶)粉碎，用溶剂提取1～3次，所述溶 剂为水、醇或者水与醇的混合物；
(2)将各次提取液合并，减压浓缩除去步骤(1)所述的有机溶剂；加入 0.5倍～2倍体积量的水，静置过夜，离心或过滤得到上清液；
(3a)使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱，用水和/或稀醇水溶液 洗涤，以除去杂质，然后以较高浓度的醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩， 干燥，得到紫珠总苷提取物；或者
(3b)用有机溶剂萃取上清液，将有机相减压浓缩，干燥，得到紫珠总苷 提取物。
7、根据技术方案6所述的制备方法，其中步骤(1)中，提取方法选自 闪式提取法、回流提取法、微波提取法、超声提取法和渗漉提取法。
8、根据技术方案6或7所述的制备方法，其中步骤(3a)中，所述树脂 填料选自大孔吸附树脂、聚酰胺树脂和离子交换树脂。
9、根据技术方案6-8中任一项所述的制备方法，其中步骤(3a)中，所 述大孔吸附树脂填料为HPD100、HPD200、D101、AB-8、SP825、ADS-7型 等大孔吸附树脂。
10、根据技术方案6-9中任一项所述的制备方法，其中步骤(3a)中， 所述稀醇水溶液为0～15体积％的稀醇水溶液。
11、根据技术方案6-10中任一项所述的制备方法，其中步骤(3a)中， 所述较高浓度的醇水溶液为30～90体积％的醇水溶液。
12、据技术方案6-11中任一项所述的制备方法，其中步骤(3b)中，所 述有机溶剂为正丁醇或乙酸乙酯。
13、根据技术方案6-12中任一项所述的制备方法，其中步骤(3a)中， 减压浓缩洗脱液后，一次或更多次进行以下操作：用水溶解浓缩液，使之通过 装填有树脂填料的色谱层析柱，用水和/或稀醇水溶液洗涤，以除去杂质，然 后以较高浓度的醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩。
14、技术方案1-5中任一项所述的紫珠总苷提取物在制备用于治疗或辅 助治疗神经退行性疾病的食品、保健品或药品中的用途。
15、技术方案1-5中任一项所述的紫珠总苷提取物在制备用于治疗或辅 助治疗皮肤病的化妆品、保健品或药品中的用途。
16、技术方案15所述的用途，其中所述皮肤病为湿疹或皮炎。
附图说明
图1为来自华紫珠叶的本发明紫珠总苷提取物的典型的高效液相色谱(使 用DAD检测器)图。
图2为来自杜虹花叶提取物的本发明紫珠总苷提取物的典型的高效液相 色谱(使用DAD检测器)图。
图1和2中，线性关系：Y＝16374*X+18.793，R＝0.9997；其中，Y为峰 面积，X为毛蕊花糖苷的浓度(mg/mL)，Arenarioside的含量以毛蕊花糖苷 为标准计。
图3示出动态轴向压缩高压制备液相色谱图。
图4示出毛蕊花糖苷单体的高压制备液相色谱图。
图5示出Arenarioside单体的高压制备液相色谱图。
图6示出了不同种类的紫珠叶中苯乙醇苷类含量测定结果。
图7示出了不同浓度的毛蕊花糖苷对MPP+诱导的SH-SY5Y神经细胞损 伤的保护作用，其中“&&”表示与空白对照组相比P<0.01,“*”表示与模型 组相比p<0.05，“**”表示与模型组相比p<0.01。
图8示出了不同浓度的Arenarioside对MPP+诱导的SH-SY5Y神经细胞 损伤的保护作用，其中“&&”表示与空白对照组相比P＜0.01，“＊”表示与模 型组相比p＜0.05，“＊＊”表示与模型组相比p＜0.01。
图9示出了不同浓度的本发明实施例5制备的紫珠总苷提取物对MPP+诱 导的SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用，其中“&&”表示与空白对照组相 比P＜0.01，“＊”表示与模型组相比p＜0.05，“＊＊”表示与模型组相比p＜0.01。
图10示出了不同浓度的本发明实施例4、6和7制备的紫珠总苷提取物对 MPP+诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用，其中“&&”表示与空白对 照组相比P＜0.01，“＊”表示与模型组相比p＜0.05，“＊＊”表示与模型组相比 p＜0.01。
图11示出了苯乙醇苷类提取物对MPTP致帕金森小鼠的自主活动的影 响，其中1：空白对照组；2：模型组；3：肉苁蓉总苷组(400mg/kg)；4：本 发明实施例6紫珠总苷提取物低剂量组(100mg/kg)；5：本发明实施例6紫珠 总苷提取物高剂量组(300mg/kg)；6：本发明实施例7紫珠总苷提取物低剂量 组(100mg/kg)；7：本发明实施例7紫珠总苷提取物高剂量组(300mg/kg)； “&&”表示与空白对照组相比P＜0.01，“＊”表示与模型组相比p＜0.05，“＊＊” 表示与模型组相比p＜0.01，“#”表示与肉苁蓉总苷组相比P＜0.05。
图12示出了苯乙醇苷类提取物对MPTP致帕金森小鼠的滚筒行为的影 响，其中1：空白对照组；2：模型组；3：肉苁蓉总苷组(400mg/kg)；4：本 发明实施例6紫珠总苷提取物低剂量组(100mg/kg)；5：本发明实施例6紫珠 总苷提取物高剂量组(300mg/kg)；6：本发明实施例7紫珠总苷提取物低剂量 组(100mg/kg)；7：本发明实施例7紫珠总苷提取物高剂量组(300mg/kg)； “&&”表示与空白对照组相比P＜0.01，“＊”表示与模型组相比p＜0.05，“＊＊” 表示与模型组相比p＜0.01，“#”表示与肉苁蓉总苷组相比P＜0.05。
图13示出了紫珠总苷提取物对东莨菪碱致小鼠跳台潜伏期的影响，其中 1：空白对照组；2：模型组；3：枇杷叶紫珠总苷组(300mg/kg)；4：本发明 实施例6紫珠总苷提取物低剂量组(100mg/kg)；5：本发明实施例6紫珠总苷 提取物高剂量组(300mg/kg)；6：本发明实施例7紫珠总苷提取物低剂量组 (100mg/kg)；7：本发明实施例7紫珠总苷提取物高剂量组(300mg/kg)；“&&” 表示与空白对照组相比P＜0.01，“＊”表示与模型组相比p＜0.05，“＊＊”表示 与模型组相比p＜0.01，“#”表示与枇杷叶紫珠总苷组相比P＜0.05。
图14示出了紫珠总苷提取物对东莨菪碱致小鼠跳台错误次数的影响，其 中1：空白对照组；2：模型组；3：枇杷叶紫珠总苷组(300mg/kg)；4：本发 明实施例6紫珠总苷提取物低剂量组(100mg/kg)；5：本发明实施例6紫珠总 苷提取物高剂量组(300mg/kg)；6：本发明实施例7紫珠总苷提取物低剂量组 (100mg/kg)；7：本发明实施例7紫珠总苷提取物高剂量组(300mg/kg)；“&&” 表示与空白对照组相比P＜0.01，“＊”表示与模型组相比p＜0.05，“＊＊”表示 与模型组相比p＜0.01，“#”表示与枇杷叶紫珠总苷组相比P＜0.05。
图15示出了本发明紫珠总苷提取物及阳性对照药在不同给药时间对 DNCB致小鼠背部皮肤皮炎-湿疹模型的治疗作用。其中，A：空白对照组；B： 模型组；C：999皮炎平阳性对照组(500mg膏/kg，相当于醋酸地塞米松 0.375mg/kg)；D：本发明实施例6紫珠总苷提取物组(250mg/kg)；E：本发 明实施例8紫珠总苷提物组(250mg/kg)。
图16示出了各组小鼠皮肤病理组织照片。其中，A：空白对照组；B：模 型组；C：999皮炎平阳性对照组(500mg膏/kg，相当于醋酸地塞米松 0.375mg/kg)；D：本发明实施例6紫珠总苷提取物组(250mg/kg)；E：本发 明实施例8紫珠总苷提物组(250mg/kg)。
图17示出了本发明紫珠总苷提取物对皮炎-湿疹模型小鼠真皮内炎性细胞 的影响。其中，A：空白对照组；B：模型组；C：999皮炎平阳性对照组(500mg 膏/kg，相当于醋酸地塞米松0.375mg/kg)；D：本发明实施例6紫珠总苷提取物 组(250mg/kg)；E：本发明实施例8紫珠总苷提物组(250mg/kg)。“&&”表 示与空白对照组相比P＜0.01，“＊＊”表示与模型组相比p＜0.01。
图18示出了本发明紫珠总苷提取物对皮炎-湿疹模型小鼠血清中IL-2(a) 及TNF-α(b)的影响。其中，A：空白对照组；B：模型组；C：999皮炎平 阳性对照组(500mg膏/kg，相当于醋酸地塞米松0.375mg/kg)；D：本发明实施 例6紫珠总苷提取物组(250mg/kg)；E：本发明实施例8紫珠总苷提物组 (250mg/kg)。“&”表示与空白对照组相比P＜0.05，“&&”表示与空白对照组 相比P＜0.01，“＊”表示与模型组相比p＜0.05，“＊＊”表示与模型组相比p＜0.01。
具体实施方式
一方面，本发明提供紫珠总苷提取物，以重量计，其含有18％～45％毛蕊 花糖苷和15％～40％Arenarioside。本发明提取物由华紫珠(Callicarpa cathayana H.T.Chang)或杜虹花(Callicarpa formosana Rolfe)的叶(优选干 燥叶)制备。
毛蕊花糖苷和Arenarioside的结构式如下：
Figure BDA00002427936600061
毛蕊花糖苷 Arenarioside
以重量计，本发明紫珠提取物中毛蕊花糖苷的含量为18％～45％，优选为 28％～45％，优选为28％～38％。以重量计，本发明紫珠提取物中Arenarioside 的含量为15％～40％，优选为24％～40％，优选为25％～35％，优选为 25％～40％。
本发明紫珠提取物提取自华紫珠(Callicarpa cathayana H.T.Chang)或杜 虹花(Callicarpa formosana Rolfe)。
华紫珠(Callicarpa cathayana H.T.Chang)和杜虹花(Callicarpa formosanaRolfe)是紫珠属中较为常见的两个种，分布于贵州、浙江、江西、福建、广东、 江苏、湖北、广西、云南等地，并有大规模的人工种植，是当地重要的经济收 入来源。经过本发明人的研究表明，以重量计，这两种紫珠叶中含有大约2％～ 6％毛蕊花糖苷以及1％～4％Arenarioside。
本发明人通过以下色谱方法对不同紫珠药材中苯乙醇苷类的含量进行了 分析：
1.测试样品的制备方法：
精密称取测试紫珠药材的干燥叶粉末(过三号筛)0.25g，向其中加入70 (v/v)％甲醇水溶液25mL，称重，超声提取20min后，放冷，用70％甲醇 (v/v)％甲醇水溶液补重，取上清液，过滤，取滤液，备用。
2.色谱条件：
色谱柱：Cholester色谱柱(4.6＊250mm，5μm)；柱温：40℃；检测器：紫 外检测器(例如VWD或者DAD)；检测波长：332nm；流速：F＝1.0ml/min； 进样量：10μL；
流动相A：0.1(v/v)％甲酸-水，B：乙腈；
洗脱梯度：
Figure BDA00002427936600071
来自华紫珠叶和杜红花叶的本发明紫珠总苷提取物的典型的HPLC(使用 DAD检测器)色谱图参见图1和2。
不同种类的紫珠叶中苯乙醇苷类含量(以重量计)测定结果见表1和图6。
表1不同种类的紫珠叶中苯乙醇苷类含量测定结果
Figure BDA00002427936600072
从表1和图6可以看出，华紫珠叶和杜虹花叶中总苷(苯乙醇苷类)含量 很高，是其它种属紫珠叶含量的3～15倍，高含量的紫珠药材为苯乙醇苷类的 富集纯化带来了巨大的便利。
下表2列出了现有技术报道的不同药材中苯乙醇苷类成分的含量。
表2不同来源药材中苯乙醇苷成分的报道含量
Figure BDA00002427936600081
1邹国栋，程艳阳，方铁铮等.HPLC法测定紫珠叶中毛蕊花糖苷的含量[J].药物分析杂志， 2010，30(1)：160～162；
2周嵩煜，程艳阳，方铁铮.HPLC法测定大叶紫珠中毛蕊花糖苷的含量[J].药物分析杂志， 2010，30(10)：1295～1297
3李才堂，文萍，郭琦丽，虞金宝，HPLC测定裸花紫珠药材中毛蕊花糖苷的含量[J].中国 实验方剂杂志，2012，18(1)：84～86
4张恒，李鑫，热娜.卡斯木等，PR-HPLC测定不同寄主和不同产地肉苁蓉中松果菊苷和麦 角甾苷的含量[J].药物分析杂志，2003，4(23)：254～257；
5边宝林，王宏浩，杨健，5种不同药材中毛蕊花糖苷的含量比较[J].中国中药杂志，2010， 35(6)：739-740
6潘正，高运玲，张涛，邓杰.HPLC法测定独一味根中环烯醚萜苷和苯乙醇苷[J].中草药， 2011，42(2)：279-281；
7王满元，樊媛洁，张静，龚慕辛.PR-HPLC同时测定名族药红药中苯乙醇苷类化合物 plantainoside D和毛蕊花糖苷[J].中国中药杂志，2010，35(23)：3188～3191
8高慧敏，王智民，曲莉，付雪涛，李琳.RP-HPLCc测定木通中木通苯乙醇苷B的含量[J]， 中国中药杂志，2007，32(6)：476-478；
9王争，邓瑞雪，杨友亮等.HPLC法同时测定糙苏中3个苯乙醇苷类化合物含量[J].药物分 析杂志，2011，31(4)：668-670
再一个方面，本发明提供本发明紫珠总苷提取物在制备用于治疗或辅助 治疗神经退行性疾病的食品、保健品或药品中的用途。
如下文实施例所证明的，本发明紫珠总苷提取物对神经细胞具有显著的保 护作用，对帕金森模型小鼠的行为障碍和老年痴呆模型小鼠的记忆获得性障碍 具有明显的改善作用，可有效治疗神经退行性疾病。可将本发明紫珠总苷提取 物与药学上可接受的辅助添加剂或食品上可接受的辅助添加剂组合，从而制成 用于治疗或辅助治疗神经退行性疾病的产品，该产品可以为食品、保健品或药 品等。根据需要，可将所述产品制成颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液、固体饮 料、袋泡茶、散剂等形式。
又一个方面，本发明提供本发明紫珠总苷提取物在制备用于治疗或辅助治 疗皮肤病的化妆品、保健品或药品中的用途。所述皮肤病选自但不限于皮炎和 湿疹。
如下文实施例所证明的，本发明紫珠总苷提取物对DNCB致小鼠的皮炎- 湿疹症状具有良好的治疗和改善作用。可有效地治疗诸如皮炎或湿疹相关的疾 病。可将本方面紫珠总苷提取物与药学或食品、化妆品上可接受的辅料添加剂 组合，从而制成用于治疗和/或改善皮炎或湿疹疾病的外用产品，该产品可以 为化妆品、保健品及药品等。根据需要，可将所述产品制成酊剂、乳膏剂、凝 胶剂、贴剂、搽剂、喷雾剂等形式。
适用于本发明组合物中的药学上可接受的辅助添加剂或食品、化妆品上可 接受的辅助添加剂包括但不限于粘合剂、润滑剂、崩解剂、矫味剂、抗氧化剂、 乳化剂、增稠剂、防腐剂等。
上述粘合剂包括但不限于羟丙基纤维素、玉米淀粉、预胶化淀粉、改性玉 米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、乳糖、阿拉伯胶、乙基纤维素、 醋酸纤维素等。
上述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸钙、滑石、硬脂酸、 胶体二氧化硅、棕榈酸等。
上述崩解剂包括但不限于交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、淀 粉、马铃薯淀粉、预胶化淀粉、玉米淀粉、淀粉羟乙酸钠、微晶纤维素、羟丙 基纤维素等。
上述矫味剂包括但不限于水果香精、阿斯巴甜、甜菊糖苷等。
上述抗氧化剂包括但不限于抗丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、没 食子酸丙酯(PG)、抗坏血酸、α-生育酚等。
上述乳化剂包括但不限于阿拉伯胶、烷基苯磺酸钠、硬脂酰乳酸钠等。
上述增稠剂包括但不限于甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、琼 脂、海藻酸钠、明胶等。
上述防腐剂包括但不限于山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金酯类等。
另一方面，本发明提供紫珠总苷提取物的制备方法。本发明紫珠总苷提取 物通过水提取或醇提取或水、醇混合提取方法，从华紫珠叶和杜虹花叶中制备。 具体地，本发明提供紫珠总苷提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将华紫珠或杜虹花的叶粉碎，用溶剂提取1～3次，所述溶剂为水、 醇或者水与醇的混合物；
(2)将各次提取液合并，减压浓缩除去步骤(1)所述的溶剂；加入0.5 倍～2倍体积量的水，静置过夜，离心或过滤得到上清液；
(3a)使上清液通过装填有树脂填料的色谱层析柱，用水和/或稀醇水溶液 洗涤，以除去杂质，然后以较高浓度的醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩， 干燥，得到紫珠总苷提取物；或者
(3b)用有机溶剂萃取上清液，将有机相减压浓缩，干燥，得到紫珠总苷 提取物。
在上述方法中，步骤(1)中的提取方法选自闪式提取法、回流提取法、 微波提取法、超声提取法和渗漉提取法，其中优选闪式提取法、回流提取法或 渗漉提取法，更优选闪式提取法。
在上述方法中，步骤(1)中的华紫珠或杜虹花的叶优选为干燥叶。通常 将华紫珠或杜虹花的叶粉碎成《中国药典2010版》凡例中定义的粗粉或最粗 粉。
在上述方法中，步骤(1)中的醇优选为乙醇或甲醇，最优选为乙醇，优 选为60％～90体积％的醇水溶液，更优选为60％～90体积％的乙醇或甲醇水 溶液。
在上述方法中，步骤(1)中的溶剂的用量为药材的5～20倍量(即，5～20ml 溶剂/g药材)，优选为8～12倍量(即，8～12ml熔剂/g药材)。
在上述方法中，步骤(3a)中，在减压浓缩洗脱液之后，任选一次或更 多次进行以下操作：用水溶解浓缩液，使之通过装填有树脂填料的色谱层析柱， 用水和/或稀醇水溶液洗涤，以除去杂质，然后以较高浓度的醇水溶液洗脱， 收集洗脱液，减压浓缩。
在上述方法中，步骤(3a)中的所述树脂填料选自但不限于大孔吸附树 脂、聚酰胺树脂和离子交换树脂。一种实施方案中，所述树脂填料优选为 HPD100、HPD200、D101、AB-8、SP825、ADS-7型大孔吸附树脂，更优选 为D101、AB-8型大孔吸附树脂。
在上述方法中，步骤(3a)中所述的稀醇水溶液为0～15体积％的稀醇 水溶液，优选0～10体积％。其用量为树脂柱床层体积的3～8倍，优选为树 脂柱床层体积的6倍。树脂柱床层体积根据实际待处理的上清液的量而变化， 例如树脂柱床层体积与待处理的上清液体积的比率可为约1:0.5～2。一种实施 方案中，所述醇优选为乙醇或者甲醇，最优选为乙醇。
在上述方法中，步骤(3a)中所述的较高浓度的醇水溶液为30～90体积％ 的醇水溶液，优选为30～50体积％的醇水溶液，更优选为30～40体积％的醇 水溶液。其用量为树脂柱床层体积的2～6倍，优选为树脂柱床层体积的3～4 倍。树脂柱床层体积根据实际待处理的上清液的量而变化，例如树脂柱床层体 积与待处理的上清液体积的比率可为约1:0.5～2。一种实施方案中，所述醇优 选为乙醇或者甲醇，最优选为乙醇。
在上述方法中，步骤(3b)中的有机溶剂优选为正丁醇或乙酸乙酯。其 用量为上清液体积的1～3倍，优选为2倍。一种实施方案中，所述有机溶剂为 水饱和正丁醇溶液。
有益效果
本发明紫珠总苷提取物含有较高量的活性成分毛蕊花糖苷和 Arenarioside，该提取物对神经细胞具有显著的保护作用，对帕金森模型小鼠 的行为障碍和老年痴呆模型小鼠的记忆获得性障碍具有明显的改善作用，可用 于制备治疗或辅助治疗神经退行性疾病的食品、保健食品或药品。本发明紫珠 总苷提取物对DNCB致小鼠的皮炎-湿疹症状具有良好的治疗和改善作用。可 有效地治疗皮炎或湿疹相关的疾病，可用于制备治疗或辅助治疗皮肤病的外用 化妆品、保健品或药品。
本发明提供的紫珠总苷提取物制备方法工艺简单，适合工业化生产，毛 蕊花糖苷和Arenarioside的得率高。本发明方法只采用水或醇为提取溶剂，减 少污染，所用的树脂均可再生重复利用，成本低，制得的高纯度紫珠总苷提取 物中含有18％～45％(w/w)的毛蕊花糖苷及15％～40％的Arenarioside (w/w)，工艺稳定，质量可控。
实施例
以下通过实施例对本发明进行举例说明，以下实施例不以任何方式对本发 明进行限制。
以下实施例中，华紫珠、杜红花和小叶紫珠的产地为湖北，裸花紫珠的产 地为海南，各药材的干燥叶粉碎至最粗粉(其定义参见中国药典2010版第二 部凡例)。提取所用闪式提取器为JHBE-50型，购自河南金鼐科技发展有限公 司，闪式提取2次，每次3min。D101、AB-8大孔吸附树脂均购自河北沧州宝 恩化工有限公司。聚酰胺树脂(80～120目)，购自国药集团化学试剂有限公司。
除非另有说明，以下实施例中的乙醇溶液指的是乙醇水溶液，且以体积百 分比计。
除非另有说明，以下实施例中术语“浓缩液体积与药材量相当”指浓缩液 体的量(以ml计)与原始药材的量(以g计)相等；树脂柱床层体积为待处 理的上清液体积的2-0.5倍。
以下实施例中，离心条件为5000rpm，约10分钟；
实施例1
将华紫珠的干燥叶粉碎至最粗粉，加12倍量(即，12ml/g华紫珠干燥叶) 的90％乙醇，闪式提取3min，提取次数为2次，合并两次提取物，减压浓缩 提取液，以除去乙醇，浓缩液体积与药材量相当。加一倍体积量的水，静置过 夜，离心得到上清液。使上清液通过D101大孔吸附树脂柱，以6倍树脂柱床 层体积量的水洗涤，接着用6倍树脂柱床层体积量的10％乙醇进行洗涤，弃去 水洗液及10％乙醇洗涤液，用3倍树脂柱床层体积量的40％乙醇进行洗脱， 收集洗脱液。将洗脱液减压浓缩，除去乙醇。用水将浓缩液稀释至初始上清液 体积，然后通过聚酰胺层析柱，以2倍树脂柱床层体积量的水洗涤，弃去水洗 液，接着用3倍树脂柱床层体积量的30％乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减 压浓缩，干燥，得到紫珠总苷提取物。
用大叶紫珠、杜虹花、小叶紫珠或裸花紫珠代替华紫珠作为药材原料，按 照上述方法制备各自的紫珠总苷提取物。
按照前文所述HPLC测定方法，对上述不同来源的紫珠药材的紫珠总苷 提取物进行分析，结果如表3所示：
表3
Figure BDA00002427936600131
上表中，得率(％)的计算如下：
Y＝MP/Mc×100
其中MP为紫珠总苷提取物的重量，MC为药材重量。
回收率(％)的计算如下：
Figure BDA00002427936600132
其中，Pi为紫珠总苷提取物中某成分i的百分含量，Ci为紫珠药材中某成分i 的百分含量，MP为紫珠总苷提取物的重量，MC为紫珠药材的重量。
从表3可以看出，相比于由大叶紫珠叶、小叶紫珠叶和裸花紫珠叶得到的 紫珠总苷提取物，由华紫珠叶或杜虹花叶制备的紫珠总苷提取物中毛蕊花糖苷 和Arenarioside的含量明显较高。相比于由大叶紫珠叶、小叶紫珠叶和裸花紫 珠叶，来自华紫珠叶或杜虹花叶的紫珠总苷提取物总量明显较高。
实施例2
将杜虹花的干燥叶粉碎至最粗粉，加12倍量(即，12ml/g杜虹花干燥叶) 的70％乙醇，闪式提取3min，提取次数为2次。合并两次提取物，减压浓缩 提取液，以除去乙醇，浓缩液体积与药材量相当。加一倍体积量的水，静置过 夜，离心得到上清液。使上清液通过D101大孔吸附树脂柱，以6倍树脂柱床 层体积量的水洗涤，弃去水洗液，用4倍树脂柱床层体积量的30％乙醇进行洗 脱，收集洗脱液。将洗脱液减压浓缩，干燥，得到紫珠总苷提取物，经过前述HPLC方法测定，其结果见表4。
实施例3
将华紫珠的干燥叶粉碎至最粗粉，加10倍量(即，10ml/g华紫珠干燥叶) 的90％乙醇，回流(常压下加热至沸腾)煎煮1h，煎煮次数为2次。合并两 次煎煮提取液，减压浓缩提取液，以除去乙醇，浓缩液体积与药材量相当。加 一倍体积量的水，静置过夜，离心得到上清液。使上清液通过D101大孔吸附 树脂柱，以3倍树脂柱床层体积量的水洗涤，然后用3倍树脂柱床层体积量的 10％乙醇洗涤，弃去水洗液及10％乙醇洗涤液，再以3倍树脂柱床层体积量的 40％乙醇洗脱，收集洗脱液。将洗脱液减压浓缩，干燥，得到紫珠总苷提取物， 经过前述HPLC方法测定，其结果见表4。
实施例4
将杜虹花的干燥叶粉碎至最粗粉，加12倍量(即，12ml/g杜虹花干燥叶) 的70％乙醇，回流(常压下加热至沸腾)煎煮1h，煎煮次数为2次。合并两 次煎煮提取液(请确认)，减压浓缩提取液，以除去乙醇，浓缩液体积与药材 量相当。加一倍体积量的水，静置过夜，离心得到上清液。使上清液通过HPD100 大孔吸附树脂柱，以6倍树脂柱床层体积量的水洗涤，弃去水洗液，用3倍树 脂柱床层体积量的40％乙醇洗脱，收集洗脱液。减压浓缩洗脱液，以除去乙醇。 用水将浓缩液稀释至初始上清液体积，然后通过ADS-7树脂柱，以3倍树脂 柱床层体积量的水洗涤，弃去水洗液，接着以3倍树脂柱床层体积量的50％溶 液进行洗脱，收集洗脱液。将洗脱液减压浓缩，干燥，得到紫珠总苷提取物， 经过前述HPLC方法测定，其结果见表4。
实施例5
将华紫珠的干燥叶粉碎至最粗粉，用90％乙醇按每克华紫珠叶粗粉1mL/h 的流速渗漉提取10h。收集渗漉液，减压浓缩渗漉液，以除去乙醇，浓缩液体 积与药材量相当。加一倍体积量的水，静置过夜，离心得到上清液。使上清液 通过D101大孔吸附树脂柱，以6倍树脂柱床层体积量的水洗涤杂质，接着以 6倍树脂柱床层体积量的10％乙醇洗涤，弃去水洗液和10％乙醇洗涤液，然后 以3倍树脂柱床层体积量的40％乙醇进行洗脱，收集洗脱液。将洗脱液减压浓 缩，干燥，得到紫珠总苷提取物，经过前述HPLC方法测定，其结果见表4。
实施例6
将华紫珠的干燥叶粉碎至粗粉，用90％乙醇按每克华紫珠叶粗粉1mL/h 的流速渗漉提取10h。收集渗漉液，减压浓缩渗漉液，以除去乙醇，浓缩液体 积与药材量相当。加一倍体积量的水，静置过夜，离心得到上清液。使上清液 通过D101大孔吸附树脂柱，以6倍树脂柱床层体积量的水洗涤杂质，接着以 6倍树脂柱床层体积量的10％乙醇洗涤，弃去水洗液和10％乙醇洗涤液，然后 以3倍树脂柱床层体积量的40％乙醇进行洗脱，收集洗脱液。减压浓缩洗脱液， 以除去乙醇。用水将浓缩液稀释至初始上清液体积，然后通过聚酰胺层析柱，以2倍树脂柱床层体积量的水洗涤，弃去水洗液，接着用3倍树脂柱床层体积 量的30％乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩，干燥，得到紫珠总苷提 取物，经过前述HPLC方法测定，其结果见表4。
实施例7
将华紫珠的干燥叶粉碎至最粗粉，加10倍量(即，10ml/g华紫珠干燥叶) 的90％乙醇，回流(常压下加热至沸腾)煎煮1h，煎煮次数为2次。合并两 次煎煮提取液，减压浓缩提取液，以除去乙醇，浓缩液体积与药材量相当。加 一倍体积量的水，静置过夜，离心得到上清液。向上清液中加入等体积的水饱 和正丁醇溶液萃取2次，合并正丁醇相，减压浓缩，干燥，得到紫珠总苷提取 物，经过前述HPLC方法测定，其结果见表4。
实施例8
将华紫珠的干燥叶粉碎至最粗粉，加10倍量(即，10ml/g华紫珠干燥叶) 的90％乙醇，回流常压下加热至沸腾)煎煮1h，煎煮次数为2次。合并两次 煎煮提取液，减压浓缩提取液，以除去乙醇，浓缩液体积与药材量相当，加一 倍体积量的水，静置过夜，离心得到上清液。向上清液中加入2倍体积量的乙 酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩，干燥，得到紫珠总苷提取物， 经过前述HPLC方法测定，其结果见表4。
表4
Figure BDA00002427936600161
实施例9
本发明紫珠总苷提取物以及相关成分毛蕊花糖苷和Arenarioside对 MPP+诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用
1仪器与试剂
CO2培养箱，型号MCO-18AIC，购自日本三洋公司；全自动酶标仪，型 号ELE800，购自美国Bio-tek公司；动态轴向压缩高压制备液相色谱仪，型 号LC3000，100mm×650mm(D×L)，购自北京创新通恒科技有限公司，C18 反向色谱填料，10μm，购自苏州赛分科技有限公司。
SH-SY5Y神经细胞株购自ATTC(American Type Culture Collection，Rockville，MD，U.S.A)。该细胞株用含有10％胎牛血清、2mM/L谷氨酰胺、 1％青霉素及链霉素双抗的RPMI 1640培养基(hyclone公司产品)，在37℃， 5％CO2培养箱中培养。
MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶)、MTT(噻唑蓝)、DMSO(二甲基亚砜)均 购自Sigma公司。
磷酸盐缓冲液(PBS)为现配现用。其配置方法为用蒸馏水中溶解8g NaCl、 0.2gKCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4， 加水定容至1L。
其余试剂均为国产化学纯试剂。
2实验方法
2.1毛蕊花糖苷及Arenarioside单体的制备
将实施例6所制备的20g紫珠总苷溶解于100mL水中，50mL/min的流速 注入制备液相色谱柱中，以乙腈∶水(0.1％TFA)＝13∶84为流动相，等度洗 脱，流速为400mL/min，紫外323nm在线检测，在线色谱图见图3，分别收 集含有毛蕊花糖苷和Arenarioside的馏分，减压浓缩，冷冻干燥得到4.52g毛 蕊花糖苷及3.68gArenarioside，按照前文所述HPLC方法，测定该两种单体 纯度大于98％，两种单体色谱图见图4及图5。
2.2本发明紫珠总苷提取物对MPP+诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤的保 护作用
测试的本发明提取物为实施例5制备的紫珠总苷提取物，其含有毛蕊花糖 苷37.75重量％和28.01重量％Arenarioside。用磷酸盐缓冲液(PBS)分别溶 解配制实施例5制备所得的紫珠总苷提取物、以上2.1中制备所得的毛蕊花糖 苷及Arenarioside单体的母液。试验时以RPMI 1640培养基稀释至各试验浓 度。MPP+用PBS溶解至1mM，试验时用培养基稀释至终浓度为500μM。 MTT用PBS配制，浓度为0.5mg/ml，使用前用0.22μm的滤膜过滤除菌。
收集对数生长期的SH-SY5Y神经细胞，用细胞计数器计数，细胞浓度为 4×104个/ml培养基。在96孔板中每孔加入200μl细胞悬浮液(调整为8×103个/200μl培养基)。在37℃，5％CO2培养箱中贴壁培养24小时。实验分为11 个组：①空白对照组：使用RPMI 1640培养基，在5％CO2，37℃下孵育24h； ②模型组：使用含500μM MPP+的RPMI 1640培养基在5％CO2，37℃下孵 育24h；③本发明实施例5提取物试验高剂量组(16μg/mL)、中剂量组(1.6 μg/mL)、低剂量组(0.16μg/mL)(分别相当于毛蕊花糖苷10μM、1μM、 0.1μM)；④上述制备的毛蕊花糖苷单体高剂量组(10μM)、中剂量组(1μM)、 低剂量组(0.1μM)；⑤上述准备的Arenarioside单体高剂量组(10μM)、 中剂量组(1μM)、低剂量组(0.1μM)，其中③、④、⑤各给药实验组中， 将待测药品的母液先用RPMI 1640培养基稀释至设置的给药浓度后，取100μL 加入细胞中，在5％CO2，37℃下预保护24h后，小心吸弃上清液，再将待测 药品母液用预先配制好的含有500μM MPP+的RPMI 1640培养基溶液稀释至 设置的给药浓度后，取100μL加入细胞中，继续在5％CO2，37℃下孵育24h。 小心吸弃上清液，倒扣在吸水纸上拍干。空白组和模型组孵育24h后，同法操 作。每组样品设置5个平行孔。以上各组每孔加入浓度为0.5mg/ml MTT，在 5％CO2，37℃下孵育4h。小心吸弃上清液，倒扣在吸水纸上拍干。每孔各加 入200μL的二甲基亚砜(DMSO)，振荡300s。在OD570nm处测定各孔吸光值， 细胞活力按下式计算：
Figure BDA00002427936600181
统计学处理：所有数据采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用T-检验， 用方差分析确定差异的显著性，(p＜0.05为有差异，P＜0.01为有显著差异)。
3实验结果
由图7可知，毛蕊花糖苷单体对MPP+诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤具 有保护作用，其中0.1μM与1μM浓度的毛蕊花糖苷组与模型组相比均具有 显著性差异(p＜0.01)。
由图8可知，Arenarioside单体对MPP+诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤具 有保护作用，其中0.1μM与1μM浓度的Arenarioside组与模型组相比均具 有显著性差异(p＜0.01)。
由图9可知，本发明实施例5所制备的紫珠总苷提取物对MPP+诱导的 SH-SY5Y神经细胞损伤具有保护作用，高、中、低三个浓度的本发明提取物 组与模型组相比均具有显著性差异(p＜0.01)。
实施例10
本发明紫珠总苷提取物对MPP+诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作 用
1仪器与试剂
同实施例9，但不使用毛蕊花糖苷单体和Arenarioside单体。
2实验方法
类似于实施例9，但测试的本发明提取物为实施例4、实施例6及实施例 7制备的紫珠总苷提取物，其分别含有33.12重量％、45.06重量％和18.12重 量％的毛蕊花糖苷，且分别含有18.29重量％、40.25重量％和15.34重量％的 Arenarioside。
实验分为8个组：①空白对照组：使用RPMI 1640培养基在5％CO2，37℃ 下孵育24h；②模型组：使用含500μM MPP+的RPMI 1640培养基在5％CO2， 37℃下孵育24h；③本发明实施例4、6和7制备所得紫珠总苷提取物高剂量 组(16μg/mL)和低剂量组(1.6μg/mL)。处理方法类似于实施例9。
实验结果
由图10可以看出，本发明所制备的紫珠总苷提取物对MPP+诱导的 SH-SY5Y神经细胞损伤具有的保护作用，实施例4制备的紫珠总苷提取物高 剂量组(16μg/mL)与模型组比，具有显著性差异(p＜0.01)，实施例4制备的 紫珠总苷提取物低剂量组(1.6μg/mL)与模型组相比，具有差异(p＜0.05)， 实施例6制备的紫珠总苷提取物高剂量组(16μg/mL)及低剂量组(1.6μg/mL) 与模型组相比，都具有显著性差异(p＜0.01)，而实施例7制备的紫珠总苷提 取物高剂量组(16μg/mL)与模型组相比有差异(p＜0.05)，实施例7制备的紫 珠总苷提取物低剂量组(1.6μg/mL)与模型组相比无统计学差异。
实施例11
本发明紫珠总苷提取物对MPTP所致帕金森小鼠模型的行为学影响
1材料与方法
1.1动物
7周龄雄性昆明种小鼠，体重18～22g，由上海斯莱克实验动物有限责任公 司提供。合格证号：2007000539123。
1.2药物与试剂
本发明紫珠总苷提取物采用实施例6及实施例7所制备的提取物，其中实 施例6获得的紫珠提取物含有45.06重量％毛蕊花糖苷和40.25重量 ％Arenarioside，实施例7获得的紫珠提取物含有18.1重量％毛蕊花糖苷和 15.34％重量％Arenarioside。MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氧吡啶)购自 Sigma公司。肉苁蓉总苷：按照中国专利申请CN200710040195.2具体实施方 式中的制备方法2来制备，通过HPLC检测其含有松果菊苷28.23重量％，毛 蕊花糖苷4.18重量％、异毛蕊花糖苷5.30重量％。以上提取物以生理盐水配 成浓度为10～30mg/mL的溶液。
1.3仪器
YLS-1A型小鼠自主活动记录仪，购自上海欣曼科教设备有限公司， RB-200B型小鼠滚筒运动测试仪，购自北京新天地科技公司。
2动物模型建立与分组给药
将70只小鼠随机分为7组，分别为空白对照组、模型组、肉苁蓉总苷组 (400mg/kg)、本发明实施例6紫珠总苷提取物高剂量组(300mg/kg)、低剂量 组(100mg/kg)和本发明实施例7紫珠总苷提取物高剂量(300mg/kg)组、 低剂量组(100mg/kg)。按照上述剂量设置，对各药物试验组连续灌胃给药14 天，每次灌胃0.25mL，空白对照组和模型组则连续灌胃给予等体积的生理盐 水14天，自第11天开始连续4天在灌胃前1h对各药物试验组和模型组小鼠 腹腔注射MPTP(30mg/kg)0.25mL，空白对照组腹腔注射的生理盐水0.25mL， 最后1次给药后1天，进行行为学指标测试。
3检测指标及方法
3.1一般行为学观察
观察小鼠在腹腔注射MPTP造模后的一般行为表现，有无异常反应，比 较分析各组之间的差异。
3.2自主活动实验
使用YLS-1A型小鼠自主活动记录仪测定各实验组小鼠自发活动并记数， 将小鼠放入自主活动箱中(每次同时测定5只小鼠，每个活动箱中1只)由记录 仪自动记录小鼠活动，测定每只小鼠5min内的活动次数，进行统计学处理。
3.3滚筒实验
使用RB-200B型小鼠滚筒运动测试仪测试各实验组小鼠的滚筒行为表现。 测试前连续训练3天，每天2次，转速为12r/min，训练时间120s。将各实验 组小鼠置于滚筒仪的滚筒上，设置转速35r/min，测试小鼠从滚筒开始旋转到 离开滚筒的时间作为小鼠运动潜伏期，测试时间为120s。每只小鼠测3次取平 均值。
统计学处理：所有数据采用均数±标准差
Figure BDA00002427936600201
表示，组间比较采用T-检验， 用方差分析确定差异的显著性，(p＜0.05为具有差异，P＜0.01为具有显著差异)。
4结果
4.1一般行为学
腹腔注射MPTP(30mg/kg)后5min开始，与空白对照组相比MPTP模型 组小鼠的一般行为表现异常，大多数出现下列变化：举尾、竖毛、唾液分泌增 多、呼吸加快、肌张力减退、对外环境刺激敏感以及牙颤等，其持续时间一般 为3～4h。而本发明实施例6和7紫珠总苷提取物高剂量(300mg/kg)组、低 剂量组(100mg/kg)及肉苁蓉总苷组(400mg/kg)组小鼠的举尾、竖毛、唾液分 泌增多、呼吸加快、肌张力减退、对外环境刺激敏感以及牙颤等症状明显表现 较轻，持续时间为约1h左右。
4.2自主活动实验
图11所示结果表明，MPTP模型组与空白对照组相比活动次数明显减少 (P＜0.01)，用肉苁蓉总苷和本发明紫珠总苷提取物处理后，和模型组相比能增 加其活动次数。其中本发明实施例6紫珠总苷提取物高剂量(300mg/kg)组、 低剂量组(100mg/kg)与模型组相比具有显著差异(P＜0.01)，高浓度的本发 明实施例7紫珠总苷提取物组(300mg/kg)与模型组相比具有显著差异 (P＜0.01)，而低浓度的本发明实施例7紫珠总苷提取物组(100mg/kg)与模 型组相比具有差异(P＜0.05)。高浓度的本发明实施例6和7紫珠总苷提取物 组(300mg/kg)的效果均优于肉苁蓉总苷组(400mg/kg)，并且具有差异 (P＜0.05)。
4.3滚筒实验
图12所示结果表明，MPTP模型组与空白对照组相比，运动潜伏期明显 缩短(P＜0.01)，用肉苁蓉总苷和本发明紫珠总苷提取物处理后，和模型组相比 都可以显著增加滚筒运动的潜伏期(P＜0.01)。高浓度的本发明实施例6和7 紫珠总苷提取物组(300mg/kg)的效果均优于肉苁蓉总苷组(400mg/kg)，并 且具有差异(P＜0.05)。
实施例12
本发明紫珠总苷提取物对东莨菪碱所致小鼠记忆获得性障碍的改善作用
1材料与方法
1.1动物
7周龄雄性昆明种小鼠，体重18～22g，由上海斯莱克实验动物有限责任公 司提供。合格证号：2007000539123。
1.2药物与试剂
本发明紫珠提取物采用实施例6及实施例7所制备提取物，其中实施例6 获得的紫珠提取物含有45.06重量％毛蕊花糖苷和40.25重量％Arenarioside， 实施例7获得的紫珠提取物含有18.1重量％毛蕊花糖苷和15.34％重量 ％Arenarioside。氢溴酸东莨菪碱注射液，北京双鹤药业股份有限公司生产。 枇杷叶紫珠提取物：按照中国专利CN201010146367.6实施例1方法制备，通 过HPLC检测其含有连翘酯苷B 47.25重量％、毛蕊花糖苷17.26重量％。以 上提取物以生理盐水配成浓度为10～30mg/mL的溶液。
1.3仪器
STT-2小鼠跳台仪，购自上海欣曼科教设备有限公司。
2动物分组与给药
将70只小鼠随机分为7组，分别为空白对照组、模型组、枇杷叶紫珠总 苷组(300mg/kg)、本发明实施例6紫珠总苷提取物高剂量(300mg/kg)组、低 剂量组(100mg/kg)和本发明实施例7紫珠总苷提取物高剂量(300mg/kg) 组、低剂量组(100mg/kg)。按照上述剂量设置，对各药物试验组连续灌胃给 药30天，每次灌胃0.25mL，空白对照组和模型组则连续灌胃给予等量的生理 盐水30天。
3东莨菪碱致小鼠记忆获得障碍模型的建立及测试
按上述分组情况，于实验的第29天进行跳台训练，训练前1h灌胃给药， 于训练前15min除空白对照组外的各实验组腹腔注射东莨菪碱1mg/kg，空白 对照组腹腔注射1mg/kg生理盐水。训练时将各实验组小鼠放入跳台仪的反应 箱内适应环境3min，然后立即通36V交流电，小鼠受电击后，多数跳上跳台 逃避电击，小鼠从跳台跳下受到电击后又跳回跳台，训练5min。24h后进行测 试，将各实验组小鼠放于跳台上，记录小鼠第一次跳下跳台的时间(潜伏期T) 和5min内的受到电击的次数(错误次数N)。
统计学处理：所有数据采用均数±标准差
Figure BDA00002427936600221
表示，组间比较采用T-检验， 用方差分析确定差异的显著性，(p＜0.05为具有差异，P＜0.01为具有显著差异)。
4结果
如图13和14所示，与空白对照组比较，模型组小鼠跳台试验的测试潜伏 期明显缩短(p＜0.05)，错误次数明显增多(p＜0.05)，这说明小鼠的学习记忆获 得出现了障碍。与模型组相比，枇杷叶紫珠总苷组(300mg/kg)可以提高小鼠的 测试潜伏期(P＜0.05)，减少错误次数(p＜0.05)，本发明实施例6紫珠总苷提 取物高剂量(300mg/kg)组、低剂量组(100mg/kg)与模型组相比均可显著 提高小鼠的测试潜伏期(p＜0.01)，显著减少错误次数(P＜0.01)。高剂量的本 发明实施例7紫珠总苷提取物组(300mg/kg)与模型组相比可显著提高小鼠测 试潜伏期(P＜0.01)，并显著减少错误次数(P＜0.01)，低剂量的本发明实施例7紫珠总苷提取物组(100mg/kg)可提高小鼠测试伏期(p＜0.05)，并减少错 误次数(P＜0.05)。高剂量的本发明实施例6紫珠总苷提取物组(300mg/kg) 的效果优于枇杷叶紫珠总苷组(300mg/kg)(P＜0.05)。
实施例13
本发明紫珠总苷提取物对二硝基氯苯(DNCB)致小鼠慢性皮炎-湿疹的治 疗作用
1材料与方法
1.1动物
雄性昆明种小鼠7周龄，体重18～22g，由上海斯莱克实验动物有限责任公 司提供。合格证号：2007000539123。
1.2药物与试剂
本发明紫珠总苷提取物采用实施例6及实施例8所制备提取物，其中实施 例6获得的紫珠总苷提取物含有45.06重量％毛蕊花糖苷和40.25重量 ％Arenarioside，实施例8获得的紫珠总苷提取物含有19.23重量％毛蕊花糖 苷和15.95重量％Arenarioside。分别将实施例6及实施例8制备所得紫珠总 苷提取物加入热熔的凡士林中，配成紫珠总苷提取物质量浓度为10％待测样 品。2，4-二硝基氯苯((2，4-Dinitrochlorobenzene，DNCB)：分析纯，成都格雷 西亚化学技术有限公司，201205147)用丙酮配制成7w/v％及0.5w/v％的溶液， 待用；999皮炎平(三九医药公司，批号1203044H)。白细胞介素-2(IL-2)及 瘤坏死因子-α(TNF-α)放免试剂盒(美国Rapidbio(RB)公司，批号：201210)。 其他试剂均为国产化学纯。
1.3仪器
科德士宠物用电推剪(型号：CP-7800)；微量移液器(德国eppendorf)； Bio-Tec酶标仪(美国ELX-800)；二氧化碳培养箱(SANYO，MCO-18AIC (UV))；日立离心机(HICATHI，CT15E)；
2二硝基氯苯致小鼠背部皮炎-湿疹模型的制备
将小鼠于实验前1d，腹部刮毛，选取约2cm×2cm范围皮肤备用。 实验第1天，用微量移液器量取7w/v％DNCB丙酮溶液25μl涂抹于小鼠腹 部剪毛区致敏；实验第5天小鼠背部刮毛，鼠背左右各选取约1cm×1cm范 围备用；第6天开始，在实验组小鼠背部左右两侧剪毛区涂抹0.5w/v％DNCB 溶液20μl背部激发，每隔3天1次，共4次。小鼠背部皮肤明显出现皮粗糙、增厚、苔藓化、潮红、红斑、角化、破损等现象，说明造模成功。
3动物分组与给药
将40只小鼠随机取8只为空白对照组，其余32只小鼠用于制备小鼠皮炎 -湿疹模型，造模成功后，将32只小鼠按严重与不严重平均分入各组，其中B 为模型组(给予250mg凡士林空白基质)，C为阳性对照999皮炎平软膏组 (500mg膏/kg，相当于醋酸地塞米松0.375mg/kg)，D为本发明实施例6紫珠 总苷提取物组(250mg/kg)，E为本发明实施例8紫珠总苷提取物组 (250mg/kg)，每组8只。在造模成功的第2d开始，在各给药组小鼠背部左、 右两侧分别均匀涂抹药物，经皮给药。2次/d，连续14天。
4检测指标及方法
4.1一般行为学状态的影响
在饲养过程中，观察模型制备前后，药物治疗对小鼠体质量、毛色、饮食、 活动等一般状况有无影响。
4.2皮肤形态学变化
分别在造模成功后24h及治疗过程中，观察小鼠激发部位皮肤反应及皮损 的形态变化，观察指标包括粗糙、增厚、苔藓化、潮红、红斑、角化、破损等。
4.3组织病理学检查
在药物治疗结束后，剪取各组小鼠皮损部位皮肤，环钻取全层皮肤，左右 背部皮损处取直径0.3cm圆形标本各一块，制作石蜡切片，HE染色，显微镜 下观察皮肤的组织病理学变化。每组共20个标本，每个标本随机取5个高倍 视野(×200)，用网型目镜计数单位视野真皮层炎性细胞浸润的数量。
4.4对血清中细胞因子的影响
小鼠摘眼球取血，室温血液自然凝固10-20min，3000转/min，离心20min， 仔细收集上清。严格按照IL-2和TNF-α试剂盒说明书进行检测。
5结果
5.1对一般行为学状态的影响
在饲养过程中，造模前后各组小鼠体质量的组间比较无统计学差异，毛色 饮食未见异常实验组小鼠致敏及激发后经常搔抓患耳躁动，观察期间无动物 死亡。
5.2皮肤形态学的影响
造模后，小鼠背部出现湿疹样反应，表现为不同程度的弥漫性红斑水肿、 抓痕伴血痂，边界不清，出现粗糙、增厚、苔藓化、潮红、红斑、角化、破损 等现象。给药7d后，模型组无明显变化；给药各组小鼠背部红斑缩小，水肿 消退，抓痕陈旧。给药14d后，模型组小鼠无明显变化，给药组红斑消退，皮 肤恢复正常。不同时期的小鼠背部变化情况见图15。
5.3组织病理学检查
5.3.1对皮炎-湿疹模型小鼠皮肤病变的影响
模型组小鼠表皮出现中度角化，局灶性角化不全和灶性表皮坏死，表皮明 显增厚，棘细胞层增加，部分棘细胞肿胀，海绵层水肿，表皮至真皮炎性细胞 增多；各给药组及阳性对照组表皮角化、棘细胞层增厚、炎性细胞渗透等病理 表现均有不同程度改善。见图16。
5.3.2对皮炎-湿疹模型小鼠真皮内炎性细胞计数的影响
由图17可以看出，模型组小鼠的真皮内炎性细胞数明显增加，各给药组 真皮内炎性细胞数与模型组相比明显减少，并且有显著性差异(P＜0.01)，紫 珠总苷提取物组与阳性对照组相比无显著性差异。
5.4对血清中细胞因子的影响
由图18可看出，模型组小鼠的血清中的IL-2浓度水平与空白对照组相比， 明显降低(P＜0.05)，各给药组小鼠血清中的IL-2水平较之模型组相比，均有 提高，其中皮炎平组与本发明实施例6制备所得紫珠总苷提取物组与模型组相 比，有显著性差异(P＜0.01)，本发明实施例8制备所得紫珠总苷提取物组与 模型组相比无显著性差异。而模型组小鼠的血清中的TNF-α浓度水平与空白 对照组相比，则是明显提高(P＜0.01)，各给药组小鼠血清中的IL-2水平较之 模型组相比，均有降低，其中皮炎平组与本发明实施例6制备所得紫珠总苷提 取物组与模型组相比，有显著性性差异(P＜0.01)，本发明实施例8制备所得 紫珠总苷提取物组与模型组相比有差异(P＜0.05)。
本发明上述实施方式和实施例的描述仅出于阐释和说明的目的，并非以任 何方式限制本发明。很明显，本领域技术人员根据本发明上下文的教导可进行 多种改动和变化。这些改动和变化均落在权利要求所限定的本发明精神和范围 内。

Claims (9)

1.紫珠总苷提取物，以重量计，其含有18％～45％毛蕊花糖苷和15％～40％Arenarioside，其中通过包括以下步骤的方法制备所述提取物：
(1)将华紫珠(Callicarpa cathayanaH.T.Chang)的叶或杜虹花(Callicarpaformosana Rolfe)的叶粉碎，用溶剂提取1～3次，所述溶剂为醇或者60～90体积％的醇水溶液，其中所述醇为乙醇或甲醇；
(2)将各次提取液合并，减压浓缩除去步骤(1)所述的溶剂；加入0.5倍～2倍体积量的水，静置过夜，离心或过滤得到上清液；
(3a)使上清液通过装填有选自大孔吸附树脂和聚酰胺树脂的树脂填料的色谱层析柱，用0～15体积％的醇水溶液洗涤，以除去杂质，然后以30～50体积％的醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得到紫珠总苷提取物，其中所述醇为乙醇或甲醇；或者(3b)用有机溶剂萃取上清液，将有机相减压浓缩，干燥，得到紫珠总苷提取物，其中所述有机溶剂为正丁醇或乙酸乙酯。
2.根据权利要求1的紫珠总苷提取物，以重量计，其含有28％～45％毛蕊花糖苷。
3.根据权利要求1的紫珠总苷提取物，以重量计，其含有24％～40％Arenarioside。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的紫珠总苷提取物，其中在所述紫珠总苷提取物的制备方法的步骤(1)中，提取方法选自闪式提取法、回流提取法、微波提取法、超声提取法和渗漉提取法。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的紫珠总苷提取物，其中在所述紫珠总苷提取物的制备方法的步骤(3a)中，减压浓缩洗脱液后，一次或更多次进行以下操作：用水溶解浓缩液，使之通过层析柱，用0～15体积％的醇水溶液洗涤，以除去杂质，然后以30～50体积％的醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，其中所述醇为乙醇或甲醇。
6.权利要求1-5中任一项所述的紫珠总苷提取物在制备用于治疗神经退行性疾病或皮肤病的药品中的用途。
7.权利要求1-5中任一项所述的紫珠总苷提取物在制备用于辅助治疗神经退行性疾病的食品中的用途。
8.权利要求1-5中任一项所述的紫珠总苷提取物在制备用于辅助治疗神经退行性疾病或皮肤病的保健品中的用途。
9.权利要求1-5中任一项所述的紫珠总苷提取物在制备用于辅助治疗皮肤病的化妆品中的用途。
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