CN113425647A

CN113425647A - 一种艾纳香药渣总黄酮提取物的制备方法及其应用

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Publication number: CN113425647A
Application number: CN202110899758.3A
Authority: CN
Inventors: 顾玮; 郝小江; 周立强; 陈俊磊; 黄烈军; 苑春茂
Original assignee: Key Laboratory of Natural Product Chemistry of Guizhou Academy of Sciences
Current assignee: Key Laboratory of Natural Product Chemistry of Guizhou Academy of Sciences
Priority date: 2021-08-06
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2021-09-24

Abstract

本发明公开了一种艾纳香药渣总黄酮提取物的制备方法及其应用，其以提取完“艾粉”后的艾纳香药渣为原料，将乙醇提取物分别采用溶剂萃取、大孔树脂处理等方法获得艾纳香药渣提取物。本发明方法处理获得的提取物均表现出显著的抗氧化活性及酪氨酸酶抑制活性，具有极高的美白和抗氧化功效。本发明提取物提取方法简单、安全，便于工厂化生产。提取物功效明确，便于进行质量控制，可以应用于美白及抗氧化类型的化妆品中，应用范围广阔。

Description

一种艾纳香药渣总黄酮提取物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物天然产物制备领域，具体来说是一种艾纳香药渣总黄酮提取物的制备方法及其在美白产品中的应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，对于生活品质的要求也越来越高。人们对于皮肤的养护需求越来越高，以往多以各种化学原料配制的化妆品显现出越来越多的副作用，长期使用甚至会对皮肤造成不可逆的损害，目前市场上常用的添加到化妆品的黑色素生成抑制剂熊果苷、龙胆酸、曲酸等都表现出一定的副作用。熊果苷使用不当不仅不会抑制黑色素生成，反而会促进黑色素生成；曲酸添加过量，可以导致皮肤过敏和皮炎等。因此，许多人群开始追求天然无毒植物来源的护肤品，寻找天然来源且高效安全的酪氨酸酶抑制剂已经成为美白产品行业发展的趋势。

艾纳香属菊科艾纳香属多年生草本或亚灌木，又名大风艾，冰片叶等。主要分布于我国云南、贵州、广西、广东、福建和台湾等省区。艾纳香全草可入药，有发汗祛痰之功效，是常用的民族药，全草入药，主要用于治疗食伤、霍乱、中暑、咽喉肿痛、胸腹疼痛等。其新鲜叶片主要用于提取“艾片”作为中药配方或添加剂使用。目前，以艾纳香挥发油或者“艾片”为原料衍生出一些中药产品，例如金骨莲胶囊、心胃止痛胶囊、咽立爽、金喉健喷雾剂、金风液、透骨香药乳等。提取过“艾片”的原材料一般用于做为农作物肥料或者废弃物处理，目前并未发现对艾纳香药渣的有效利用，造成资源的极大浪费。

现代研究发现，艾纳香有大量的黄酮及其苷类及倍半萜类等成分，其中黄酮及其苷类和倍半萜内酯等成分主要存在于艾纳香的非挥发性部位，在药渣中的含量很高。现代药理活性研究表明，艾纳香中化学成分具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等。前期研究也从中发现了具有抗流感病毒活性的倍半萜内酯类成分。因此艾纳香药渣中仍存在大量的活性成分，具有极高的开发潜力。

发明内容

本发明的目的是针对现在技术中艾纳香药渣不能回收在利用的问题，提供一种艾纳香药渣提取物的制备方法，该方法制备的提取物可以应用于美白或抗氧化护肤产品中。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种艾纳香药渣总黄酮提取物的制备方法，步骤包括：

(1)取干燥艾纳香药渣，粉碎后过40～60目筛，定量后加入4倍80％乙醇回流提取3次，过滤后回收提取液进行合并，浓缩干燥得到乙醇提取物浸膏；

(2)将步骤(1)所得浸膏加5％乙醇水溶液溶解，上D101或DA201大孔树脂柱吸附12h；

(3)依次用20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、100％乙醇洗脱，收集不同部分洗脱液；

(4)将步骤(3)所得不同部位洗脱液浓缩干燥，除去溶剂得到干燥粉末即得到艾纳香药渣提取物。

进一步的，步骤(1)中，所述回流提取温度为70℃，提取时间4h。

进一步的，步骤(2)中，浸膏的加水量为每1g提取物浸膏加1～2mL。

进一步的，步骤(3)中，洗脱速度为15mL·min^-1，每段洗脱剂的用量为5 L。

本发明方法艾纳香药渣提取物中主要含有黄酮类及其苷类成分、酚酸类、倍半萜等成分，通过对艾纳香药渣提取物进行LC-MS分析，确定艾纳香药渣中的主要成分是黄酮及其苷类成分，因此可以用6种代表性黄酮化合物作为其质量控制标准。

本发明提取物中含有大量的黄酮及其苷类及倍半萜类等成分，用以上方法处理得到的提取物表现出显著的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性，可用于制备美白功能或抗氧化功能的化妆品。

本发明的有益技术效果是：本发明方法处理获得的提取物均表现出显著的抗氧化活性及酪氨酸酶抑制活性，具有极高的美白和抗氧化功效。本发明提取物提取方法简单、安全，便于工厂化生产。提取物功效明确，便于进行质量控制，可以应用于美白及抗氧化类型的化妆品中，应用范围广阔。

附图说明

图1是本发明方法的工艺流程图；

图2是实施例4中艾纳香药渣提取物的酪氨酸酶抑制活性结果；

图3是实施例5中艾纳香药渣80％乙醇提取物LC-MS总离子流图；

图4是实施例5中艾纳香药渣80％乙醇提取物的RP-HPLC色谱图；

图5是实施例5中艾纳香药渣80％乙醇提取物的RP-HPLC色谱图；

图6是实施例6混合标准品的RP-HPLC色谱图；

图7是实施例6金丝桃苷和芦丁的RP-HPLC色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种艾纳香药渣总黄酮提取物的提取方法，具体包括如下步骤(如图1所示)：

A1、取艾纳香药渣50g，向其中加入750mL提取剂(质量分数为80％的乙醇)，在80℃下回流提取3次，每次4h，过滤除去艾纳香药渣，将滤液浓缩，除去提取剂，得到总浸膏7.1g；

A2、向总浸膏加入10mL质量分数为5％的乙醇溶解，过滤，滤液用D101 型大孔树脂(650g)吸附，吸附时间为12h。洗脱前用5L去离子水洗脱吸附柱，直到流出液为无色为止后用不同质量分数的乙醇洗脱剂洗脱(不同质量分数的甲醇洗脱剂：20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇及100％乙醇)，洗脱速度为15mL·min^-1，每段洗脱剂的用量为5L；

A3、洗脱液加压浓缩不同质量分数的乙醇洗脱下来的样品，分别得 D101-20％乙醇组分2.11g、D101-40％乙醇组分0.58g、D101-60％乙醇组分0.35 g、D101-80％乙醇组分0.51g及D101-100％乙醇组分0.82g；

A4、分别取提取物20mg，用乙醇定容至1mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，用于后续测试；取提取物1mg，用1mL无水乙醇溶解，配置成1mg·mL^-1的浓度，用于后续应用。

实施例2

一种艾纳香药渣提取物的提取方法，具体包括如下步骤(如图1所示)：

B1、取艾纳香药渣50g，向其中加入750mL提取剂(质量分数为80％的乙醇)，在80℃下回流提取3次，每次4h，过滤除去艾纳香药渣，将滤液浓缩，除去提取剂，得到总浸膏7.1g；

B2、向总浸膏加入10mL质量分数为5％的乙醇溶解，过滤，滤液用DA201 型大孔树脂(700g)吸附，吸附时间为12h。洗脱前用5L去离子水洗脱吸附柱，直到流出液为无色为止后用不同质量分数的乙醇洗脱剂洗脱(不同质量分数的甲醇洗脱剂：20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇及100％乙醇)，洗脱速度为15mL·min^-1，每段洗脱剂的用量为5L；

B3、洗脱液加压浓缩不同质量分数的乙醇洗脱下来的样品，分别得 DA201-20％乙醇组分1.21g、DA201-40％乙醇组分0.83g、DA201-60％乙醇组分 0.31g、DA201-80％乙醇组分0.35g及DA201-100％乙醇组分2.10g。

B4、取提取物20mg，用乙醇定容至1mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，用于后续测试；分别取提取物1mg，用1mL无水乙醇溶解，配置成1mg·mL^-1的浓度，用于后续应用。

实施例3

对实施例1～2提取得到的艾纳香药渣提取物进行体外ABTS⁺·自由基清除和DPPH自由基清除活性测试，方法如下：

(1)ABTS⁺·自由基清除活性

配置含有0.082mmol·mL^-1ABTS⁺和0.029mmol·mL^-1K₂S₂O₈的ABTS⁺缓冲溶液(溶剂为无水乙醇)，将实施例1～2取所述提取物1mg，用1mL无水乙醇溶解，配置成1mg·mL^-1的浓度，依次按5倍稀释成200、40、8、1.6、0.32、 0.064μg·mL^-1。

按照如下比例配制3组溶液：

A：160μL ABTS⁺缓冲溶液+40μL无水乙醇；

B：160μL无水乙醇+40μL样品；

C：160μL ABTS⁺缓冲溶液+40μL样品；

将上述3组溶液避光摇匀，6min后酶标仪上测试734nm下得吸光值(OD 值)，并按照公式计算ABTS⁺·自由基清除率＝100％×((OD_A-OD_B)-OD_C)/ (OD_A-OD_B)；其中(OD_A-OD_B)代表没有清除剂条件下反应溶液的OD值；OD_C代表有清除剂(实施例1～2所述的艾纳香药渣提取物)条件下反应溶液的OD 值改变。

上述步骤重复3遍，用ABTS⁺自由基清除率分别计算其IC₅₀，具体测试数据如表2所示：

(2)DPPH自由基清除活性

配置0.5mmol·L^-1DPPH溶液(溶剂为无水乙醇)，将实施例1～2取所述提取物1mg，用1mL乙醇溶解，配置成1mg·mL^-1的浓度，依次按5倍稀释成200、 40、8、1.6、0.32、0.064μg·mL^-1。

按照如下比例配制3组溶液：

A：160μL DPPH溶液+40μL无水乙醇；

B：160μL无水乙醇+40μL样品；

C：160μL DPPH溶液+40μL样品；

将上述3组溶液避光摇匀，6min后酶标仪上测试517nm下得吸光值(OD 值)，并按照公式计算DPPH自由基清除率＝100％×((OD_A-OD_B)-OD_C)/ (OD_A-OD_B)；其中(OD_A-OD_B)代表没有清除剂条件下反应溶液的OD值；OD_C代表有清除剂(实施例1～2所述的艾纳香药渣提取物)条件下反应溶液的OD 值改变。

上述步骤重复3遍，用DPPH自由基清除率分别计算其IC₅₀，具体测试数据如表1所示：

表1不同提取物的抗氧化活性(平均值±SD，n＝3)

*ABTS⁺·自由基清除活性中阳性药为维生素E，DPPH自由基清除活性中阳性药为维生素C

实例1～2的提取方法处理的艾纳香提取物S4～S13均表现出显著的ABTS⁺和DPPH自由基清除能力。

实施例4

对实施例1～2提取得到的艾纳香药渣提取物进行酪氨酸酶抑制活性测试，方法如下：

应用酪氨酸酶催化左旋多巴(L-DOPA)氧化速率的方法。以0.2M磷酸盐缓冲液(PBS)为为溶剂，将蘑菇酪氨酸酶配置成59U/mL，样品配置成100ug/mL 的溶液，将70uL0.2M PBS、20μL待测样品溶液、30μL 59U/mL的酪氨酸酶溶液在96孔板中混合，30℃恒温箱中孵育5min，后将各孔加入0.5mM左旋多巴(L-dopa)100μL，继续孵育10min后，于492nm下测定吸光值(D)。用0.2M PBS溶液代替酪氨酸酶溶液作为阴性对照，测得吸光值为(C)。同时将样品用酪氨酸酶代替作为空白对照，测得吸光值为(B)。用0.2M PBS溶液代替酪氨酸酶溶液和样品溶液作为空白组，测得吸光值为(A)。同时以曲酸(200μg/mL) 为阳性药，计算公式为：抑制率＝[(B-A)-(D-C)]/(B-A)×100％，每份样品重复做 3组，取平均值，计算清除率。清除率大于50％的初筛样品，进行复筛，从100 ug/mL开始，5倍稀释，浓度分别为：10ug/mL、2ug/mL、0.4ug/mL、0.08ug/mL、 0.016ug/mL、00032ug/mL。每份样品重复3次，取平均值，计算清除率及半数抑制浓度(IC₅₀)。

实验结果(表2)表明，以上工艺获得的艾纳香药渣提取物均表现出显著的酪氨酸酶抑制活性(图2所示)。其中S6、S11、S12、S13活性均高于阳性药曲酸。

表2艾纳香药渣提取物的酪氨酸酶抑制活性

实施例5

对实施例1～2提取得到的艾纳香药渣80％乙醇提取物进行LC-MS分析。

方法如下：

LC-MS条件：

LC条件：色谱柱：ACE Ultracore2.5 Super C18(100*2.1mm,1.9μm)；柱温：40℃；流动相：乙腈-水(含0.1％甲酸)，梯度洗脱(0～＜42min，5％A； 42～＜47min，95％A；47～50min，5％A)；流速：0.3ml/min；进样量：20μl；每针进样前平衡6min。

MS条件：质谱扫描参数见表3

表3质谱扫描参数

艾纳香药渣80乙醇提取物的LC-MS结果与通过检索数据库鉴定出54个化合物(见表4)，其中主要为黄酮及其苷类化合物22个；通过峰面积确定其相对含量，结合艾纳香中具有代表性的特征性成分，最后选定6种黄酮类化合物(圣草酚、木犀草素、艾纳香素、羟基芫花素、金丝桃苷、芦丁)作为其质量控制标准(图3、4和5)。

表4艾纳香药渣80％乙醇提取物的LC-MS分析结果

实施例6

选取实施例中确定的艾纳香中6种代表性黄酮类成分作为质量控制依据，用RP-HPLC法对实施例1～2所述艾纳香药渣提取物进行代表性黄酮类化合物(包括圣草酚、木犀草素、艾纳香素、羟基芫花素、金丝桃苷和芦丁)的含量测试，方法如下：

(1)试剂与材料

95％乙醇(重庆万盛川东化工有限公司)；甲醇色谱纯(上海星可高纯溶剂有限公司)；磷酸(天津市富宇精细化工有限公司)；水(杭州娃哈哈集团有限公司)；浓盐酸(重庆江川化工集团有限公司)；圣草酚(CAS号：552-58-9，纯度为98.0％，上海麦克林生化科技有限公司)；木犀草素(CAS号：491-70-3，纯度为98.0％，有上海麦克林生化科技有限公司)；艾纳香素为实验室自己制备，纯度99％；羟基芫花素(CAS号：20243-59-8，纯度为98.0％，上海源叶生物科技有限公司)；金丝桃苷(CAS号：482-36-0，纯度为98.0％，上海麦克林生化科技有限公司)；芦丁(CAS号：153-18-4，纯度为98.0％，上海麦克林生化科技有限公司)。

(2)圣草酚、木犀草素、艾纳香素和羟基芫花素混合标准品的标准曲线的建立

分别精密称定圣草酚、木犀草素、艾纳香素和羟基芫花素标准品1mg，加入甲醇定容至1mL，按2:1:2:2体积混合均配置成285.7、142.9、285.7、285.7 μg·mL^-1的标准品溶液，分别取1μL，3μL，5μL，7μL，9μL等浓度不同体积，用安捷伦1260型高效液相分析，色谱条件1为：色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：水(A)-甲醇(B)系统，梯度洗脱程序为：0～20min，20％(B)；20～30min，30％(B)；30～50min，40％(B)； 50～80min，55％(B)；80～100min，70％(B)；100～120min，90％(B)；流速：1mL·min-1；检测波长：254nm；进样量：20μL；柱温：30℃。以标准品峰面积(Y)为纵坐标，以标准品进样量(X)为横坐标，建立标准曲线，即得圣草酚:Y＝139.22X-65.159，R²＝0.9999，线性范围为[0.286，2.571]μg、木犀草素:Y＝798.62X-381.92，R²＝0.9997，线性范围为[0.143，1.287]μg、艾纳香素: Y＝129.42X-60.446，R²＝0.9997，线性范围为[0.286，2.571]μg和羟基芫花素标: Y＝465.62X-222.58，R²＝0.9996，线性范围为[0.286，2.571]μg(如图6和图7 所示)。

(3)金丝桃苷和芦丁的标准曲线的建立

分别精密称金丝桃苷和芦丁标准品1mg，加入甲醇定容至2mL，按1:1体积混合均配置成500μg·mL-1的标准品溶液，分别取1μL，3μL，5μL l，7μL， 9μL等浓度不同体积，用安捷伦1260型高效液相分析，色谱条件2为：色谱柱： ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：水(A)-甲醇(B)系统，梯度洗脱程序为：0～20min，20％(B)；20～30min，25％(B)；30～70min， 25％(B)；70～80min，60％(B)；80～100min，80％(B)；流速：1mL·min-1；检测波长：365nm；进样量：1μL；柱温：30℃。以标准品峰面积(Y)为纵坐标，以标准品进样量(X)建立标准曲线：金丝桃:Y＝2566.6X-1357.8，R²＝0.9995，线性范围为[0.5，4.5]μg、和芦丁:Y＝2823X-1371.9，R²＝0.9999，线性范围为[0.5， 4.5](如图4和5所示)。

(4)艾纳香药渣提取物中6种黄酮成分的含量测定

取实施例1～2所述艾纳香药渣提取物各40mg，用甲醇定容至1mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，分别按色谱条件1和2进样检测，进样量为10μL。

根据上述实验方法，将各个成分的峰面积带入其标准曲线，通过换算得到各个标准品的质量百分含量，然后按提取方法中所用艾纳香药渣的质量为100％计，折算出得到的艾纳香药渣提取物中各个成分的质量百分数。具体数据如表5 所示：

表5艾纳香药渣提取物中6种黄酮类化学成分含量(平均值±SD，n＝3)

—表示未检测到其含量。

Claims

1.一种艾纳香药渣总黄酮提取物在美白或抗氧化护肤产品中的应用。

2.一种艾纳香药渣提取物的制备方法，其特征在于，步骤包括：

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(1)中，所述回流提取温度为70℃，提取时间4h。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(2)中，浸膏的加水量为每1g提取物浸膏加1～2mL。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(3)中，洗脱速度为15mL·min-1，每段洗脱剂的用量为5L。

6.一种由权利要求2-5任一项所述方法制备的艾纳香药渣提取物。