CN114902920A - 白及培育方法、白及提取物及其制备和抗氧化性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业技术和轻工业交叉技术领域，具体涉及一种高抗氧化性白及培育方法、白及提取物及其制备和抗氧化性检测方法。高抗氧化白及培育方法，将白及在温度范围‑5～22.5℃、年光照时间1000‑1600h、昼夜温差10‑18℃、湿度范围30％‑80％的环境下种植本文优化白及的栽培工艺，优选出最适宜产出高抗氧化性白及生长的温度范围、年光照时间、昼夜温差、湿度范围，具有更好的抗氧化性效果，羟自由基清除率较常规方法最大提高10.9％，DPPH自由基清除率较常规方法最大提高14.8％；其中昼夜温差是影响白及和白及提取物抗氧化性的关键因素；同时还进一步发现了白及提取物的平均分子量是影响白及提取物抗氧化性的主要因素，白及提取物分子量80‑100万之间具有最优的抗氧化性。
Description
技术领域
本发明属于农业技术和轻工业交叉技术领域，具体涉及一种高抗氧化性白及培育方法、白及提取物及其制备和抗氧化性检测方法。
背景技术
白及(Bletillastriata L.)是兰科(Orchidaceae)白及属宿根草本植物，中医理论认为，白及具有收敛、补血、止血、消肿等功效，外敷能治创伤出血、痈肿，烫伤，疔疮等，具有多种药用价值，白及提取物白及多糖具有广泛的应用场景。白及多糖的主要成分为葡甘露聚糖，是一种由摩尔比为1:1.6-1.7的葡萄糖和甘露糖主要通过1,4糖苷键聚合而成的高分子量的天然植物中性高分子，被证明具有良好的抗衰老、防癌、降低三高效果。目前的白及种植多是自然种植，种植条件各异，白及的产量、有效成分含量及药效参差不齐，影响白及多糖药效的主要因素尚不清除，更无法从栽培或制备工艺上对白及多糖药药效进一步优化。因而迫切需要对白及种植条件白及多糖制备工艺加以改进，急需一种标准化栽培方法和制备方法对白及有效成分和白及多糖药效进行标准化控制并阐述白及多糖药效主要影响因素进而对白及栽培或制备工艺进行优化。
发明内容
为解决以上至少一个问题，进一步提高白及有效成分和白及多糖的药效，本发明提供了一种高抗氧化性白及的栽培方法、高抗氧化性白及提取物、高抗氧化性白及提取物的制备方法和白及提取物抗氧化性检测方法，本文优化白及的栽培工艺，优选出最适宜产出高抗氧化性白及生长的温度范围、年光照时间、昼夜温差、湿度范围，较现有技术制得的白及提取物具有更好的抗氧化性效果；同时还进一步发现了白及提取物的平均分子量是影响白及提取物抗氧化性的主要因素。
进一步地，申请人发现白及提取物抗氧化性可以通过抑制自由基实现。
申请人提供一种高抗氧化白及培育方法，将白及在温度范围-5～22.5℃、年光照时间1000-1600h、昼夜温差10-18℃、湿度范围30％-80％的环境下种植。
同时提供一种高抗氧化白及提取物的制备方法，使用上述培育方法培育的白及作为原料，包括以下步骤：将白及粉碎加水溶解提取后加入乙醇沉淀制得白及提取物。
优选的，白及粉碎前还包括烘干过程；加水溶解提取时还包括在80-100℃下水浴处理；加入乙醇沉淀前后均包括离心处理过程。
一种高抗氧化白及提取物，其平均分子量范围为80-100万，由上述的制备方法制备；所述白及提取物羟自由基清除率>30％且DPPH自由基清除率>24％；
所述白及提取物羟自由基清除率测量所需样品体系为：A体积3％-8％质量分数的白及提取物水溶液、1-1.5倍A体积水、0.4-0.6倍A体积的0.1-20mmol/l的水杨酸溶液、0.4-0.6倍A体积的0.1-20mmol/l的FeSO4溶液和0.8-1.2倍A体积的0.1-20mmol/l的过氧化氢溶液；A取值1-1000ul；
所述DPPH自由基清除率测量所需样品体系为：B体积3％-8％质量分数的白及提取物水溶液、18-20倍B体积的0.01-10mmol的DPPH溶液；B取值1-1000ul。
同时提供一种白及提取物的抗氧化性检测方法，包括上述白及提取物的制备步骤并用于检测上述的白及提取物的抗氧化性，包括以下步骤：制备含白及提取物的样品组和不含白及提取物的参照组；向所述参照组和所述样品组加入处理试剂并测定所述参照组和所述样品组的特征量获取抗氧化性数据。本申请中DPPH自由基清除能力用DPPH自由基清除率D％表示；羟自由基清除能力用羟自由基清除率D％表示。
优选的，所述特征量的测试方法为吸光光度法或滴定法；所述特征量为吸光度或滴定浓度。
优选的，所述抗氧化性数据为羟自由基清除能力或DPPH自由基清除能力；本文所述DPPH为1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，通常作为稳定的自由基使用。
优选的，所述羟自由基清除能力的判定方法为：
样品组包括：A体积3％-8％质量分数的白及提取物水溶液、1-1.5倍A体积水、0.4-0.6倍A体积的试剂一、0.4-0.6倍A体积的试剂二和0.8-1.2倍A体积的试剂三；
所述参照组包括不含试剂二的空白组和包含试剂二的对照组；
所述对照组包括：2-3倍A体积水、0.4-0.6倍A体积的试剂一、0.4-0.6倍A体积的试剂二和0.8-1.2倍A体积的试剂三；
所述空白组包括：2-4倍A体积水、0.4-0.6倍A体积的试剂一和0.8-1.2倍A体积的试剂三；
将所述样品组、所述对照组和所述空白组在20-45℃保温5-30min后测定分光光度值得出所述羟自由基清除能力；A取值1-1000ul。
优选的，所述羟自由基清除能力的计算方法为:
羟自由基清除率D％＝(对照组分光光度值-样品组分光光度值)÷(对照组分光光度值-空白组分光光度值)×100％；所述分光光度值的测定波长选择510nm；所述试剂一为0.1-20mmol/l的水杨酸溶液；所述试剂二为0.1-20mmol/l的FeSO4溶液；所述试剂三为0.1-20mmol/l的过氧化氢溶液。
优选的，所述DPPH自由基清除能力的判定方法为：
样品组包括：B体积3％-8％质量分数的白及提取物水溶液、18-20倍B体积的试剂四；
所述参照组包括0.75-0.8倍B体积的水、18-21倍B体积的试剂四；
将所述样品组、所述参照组在20-45℃保温5-30min后测定分光光度值得出所述DPPH自由基清除能力。
优选的，所述DPPH自由基清除能力的计算方法为:DPPH自由基清除率D％＝(参照组分光光度值-样品组分光光度值)÷参照组分光光度值×100％；所述分光光度值的测定波长选择515nm；所述试剂四为0.01-10mmol的DPPH溶液；B取值1-1000ul。
有益效果为：
(1)本文优化白及的栽培工艺，优选出最适宜产出高抗氧化性白及生长的温度范围、年光照时间、昼夜温差、湿度范围；具体在温度范围-5～22.5℃、年光照时间1000-1600h、昼夜温差10-18℃、湿度范围30％-80％的环境下种植，具有更好的抗氧化性效果，同等条件下，白及提取物羟自由基清除率>30％且DPPH自由基清除率>24％；羟自由基清除率较常规方法最大提高10.9％，DPPH自由基清除率较常规方法最大提高14.8％；其中昼夜温差是影响白及及白及提取物抗氧化性的关键因素。
(2)同时还进一步发现了白及提取物的平均分子量是影响白及提取物抗氧化性的主要因素，白及提取物平均分子量80-100万之间具有最优的抗氧化性。
附图说明
附图1示出了测定白及提取物平均分子量的原理图；
附图2示出了试验组1-8的羟自由基清除率和DPPH自由基清除率。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清除，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本文保护范围。
本申请公开了一种白及提取物的制备方法：将白及粉碎加水溶解提取后加入乙醇沉淀制得白及提取物；
具体地取各白及粉末样品制备3％-8％质量浓度的白及粉末/蒸馏水混合液进行提取，白及粉末可以根据实际需求在上述范围内调整；
100℃水浴提取1h(必须盖紧盖子防止水分流失)，具体作用为加速白及提取物充分溶解，水浴温度可以在60-100℃调整，提取时间在1-6h调整，较高的温度和较长的时间均有利于白及提取物充分溶解，但6h后时间对提取效率影响可以忽略不计；
冷却后5000-15000g离心1-20min，离心时间超过20min后，时间对产物产率可以忽略；
取上清，吸取上清液，慢慢加入4-10倍上清液体积的无水乙醇，改变上清液中白及提取物溶解度，有利于其沉析；
混匀后0-4℃静置过夜，5000-15000g离心1-20min，弃上清，沉淀中加入4-8倍上清液体积的蒸馏水，充分混匀充分溶解沉淀。
本申请还公开了一种白及提取物的抗氧化性检测方法，包括以下步骤：制备含白及提取物的样品组和不含白及提取物的参照组；向所述参照组和所述样品组加入处理试剂并测定所述参照组和所述样品组的特征量获取抗氧化性数据；特征量的测试方法为吸光光度法或滴定法；特征量为吸光度或滴定浓度。
滴定法对含白及提取物的样品组和不含白及提取物的参照组定量加入过量羟自由基或DPPH自由基试剂，充分反应后，加入第二种羟自由基或DPPH自由基清除试剂反滴定剩余羟自由基或DPPH自由基的含量，第二种羟自由基或DPPH自由基清除试剂可选抗坏血酸，指示剂可选淀粉/碘酸根指示剂、2,6-二氯酚靛酚或三价铁盐指示剂中任一种，抗坏血酸优先与羟自由基或DPPH自由基反应，待反应结束，进而与指示剂反应发生显著的显色反应，通过记录并计算溶液用量，进而推断出样品组和参照组消耗羟自由基或DPPH自由基数量。
同时也可以不选用显色剂使用库伦滴定法记录，滴定时溶液电荷或导电能力变化，将电荷浓度或导电能力最低的点判定为滴定终点，根据滴定终点进而推断出样品组和参照组消耗羟自由基或DPPH自由基数量。
上述两种滴定方法均可以利用自由基清除率D％＝(参照组分光光度值-样品组分光光度值)÷参照组分光光度值×100％计算样品组自由基清除率。本文所述DPPH为1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，通常作为稳定的自由基使用。
本申请公开了一种白及提取物的羟自由基清除能力的判定方法：
制备样品组，样品组包括：A体积3％-8％质量分数的白及提取物水溶液、1-1.5倍A体积水、0.4-0.6倍A体积的0.1-20mmol/l的水杨酸溶液、0.4-0.6倍A体积的0.1-20mmol/l的FeSO4溶液和0.8-1.2倍A体积的0.1-20mmol/l的过氧化氢溶液；
制备参照组，参照组包括不含FeSO4溶液的空白组和包含FeSO4溶液的对照组；
对照组包括：2-3倍A体积水、0.4-0.6倍A体积的0.1-20mmol/l的水杨酸溶液、0.4-0.6倍A体积的0.1-20mmol/l的FeSO4溶液和0.8-1.2倍A体积的0.1-20mmol/l的过氧化氢溶液；
空白组包括：2-4倍A体积水、0.4-0.6倍A体积的0.1-20mmol/l的水杨酸溶液和0.8-1.2倍A体积的0.1-20mmol/l的过氧化氢溶液；A取值1-1000ul；
将样品组、对照组和空白组在20-45℃保温5-30min后测定分光光度值得出羟自由基清除能力。
上述水、0.1-20mmol/l的水杨酸溶液、0.1-20mmol/l的FeSO4溶液及0.1-20mmol/l的过氧化氢溶液的体积和保温温度和时间可以根据实际需要适当调整，需要注意的是样品组、参照组、空白组中相同组分用量一致，保温处理条件一致。
进一步地，本申请公开了一种白及提取物的羟自由基清除能力的判定方法：
制备样品组，样品组包括：300ul体积3％质量分数的白及提取物水溶液、300ul水、150ul的0.1mmol/l的水杨酸溶液、150ul体积的0.1mmol/l的FeSO4溶液和300ul的0.1mmol/l的过氧化氢溶液；
对照组包括：600ul体积水、150ul的0.1mmol/l的水杨酸溶液、300ul的0.1mmol/l的FeSO4溶液和300ul的0.1mmol/l的过氧化氢溶液；
空白组包括：600ul体积水、300ul的0.1mmol/l的水杨酸溶液和300ul的0.1mmol/l的过氧化氢溶液；
将样品组、对照组和空白组在20℃保温5min后测定分光光度值得出羟自由基清除能力。按照上述羟自由基清除能力的计算方法计算羟自由基清除率D％。
同时，本申请公开了另一种白及提取物的羟自由基清除能力的判定方法：
制备样品组，样品组包括：300ul 8％质量分数的白及提取物水溶液、450ul体积水、150ul的20mmol/l的水杨酸溶液、150ul的20mmol/l的FeSO4溶液和300ul的20mmol/l的过氧化氢溶液；
对照组包括：900ul体积水、150ul的20mmol/l的水杨酸溶液、150ul的20mmol/l的FeSO4溶液和300ul的20mmol/l的过氧化氢溶液；
空白组包括：900ul体积水、150ul的20mmol/l的水杨酸溶液和300ul的20mmol/l的过氧化氢溶液；
将样品组、对照组和空白组在45℃保温30min后测定分光光度值得出羟自由基清除能力。按照上述羟自由基清除能力的计算方法计算羟自由基清除率D％。
同时，本申请公开了另一种白及提取物的羟自由基清除能力的判定方法：
制备样品组，样品组包括：300ul体积5％质量分数的白及提取物水溶液、450ul体积水、180ul的10mmol/l的水杨酸溶液、180ul的10mmol/l的FeSO4溶液和420ul的10mmol/l的过氧化氢溶液；
对照组包括：900ul体积水、180ul体积的10mmol/l的水杨酸溶液、180ul体积的10mmol/l的FeSO4溶液和420ul体积的10mmol/l的过氧化氢溶液；
空白组包括：1200ul体积水、180ul体积的10mmol/l的水杨酸溶液和420ul体积的10mmol/l的过氧化氢溶液；
将样品组、对照组和空白组在30℃保温10min后测定分光光度值得出羟自由基清除能力。按照上述羟自由基清除能力的计算方法计算羟自由基清除率D％。
本申请还公开了一种白及提取物的DPPH自由基清除能力的判定方法：
制备样品组，其包括：B体积3％-8％质量分数的白及提取物水溶液、18-20倍B体积的0.01-10mmol的DPPH溶液；
制备参照组，其包括0.75-0.8倍B体积的水、18-21倍B体积的0.01-10mmol的DPPH溶液；B取值1-1000ul；
将样品组、参照组在20-45℃保温5-30min后测定分光光度值得出DPPH自由基清除能力。
上述样品组和参照组总体积一致，保温温度和时间可以根据实际需要适当调整，但保温处理条件一致。
优选的，DPPH自由基清除能力的计算方法为:DPPH自由基清除率D％＝(参照组分光光度值-样品组分光光度值)÷参照组分光光度值×100％；分光光度值的测定波长选择515nm。
进一步地，本申请公开了一种白及提取物的DPPH自由基清除能力的判定方法：
制备样品组，其包括：50μl体积3％质量分数的白及提取物水溶液、900μl体积的0.01mmol的DPPH溶液；
制备参照组，其包括50μl体积的水、1900μl体积的0.01mmol的DPPH溶液；
将样品组、参照组在20℃保温5min后测定分光光度值得出DPPH自由基清除能力；使用上述DPPH自由基清除能力的计算方法计算DPPH自由基清除率D％。
同时，本申请还公开了另一种白及提取物的DPPH自由基清除能力的判定方法：
制备样品组，其包括：40μl体积8％质量分数的白及提取物水溶液、800倍体积的10mmol的DPPH溶液；
制备参照组，其包括40μl体积的水、72μl体积的10mmol的DPPH溶液；
将样品组、参照组在45℃保温30min后测定分光光度值得出DPPH自由基清除能力；使用上述DPPH自由基清除能力的计算方法计算DPPH自由基清除率D％。
进一步地，为了验证不同种植条件对白及提取物有效成分的影响，选取温度范围、年光照时间、昼夜温差、湿度范围四个变量在不同环境下进行正交试验，种植环境采用相同的常规腐殖土作为栽培土，白及幼苗来源和栽种方式相同：
1.仪器与材料
UV-1800PC型紫外可见分光光度计、电子天平、电热鼓风干燥箱、粉碎机、离心机、水浴锅；乌氏粘度计；
浓硫酸、无水乙醇、总抗氧化能力(DPPH法)试剂盒、羟自由基清除能力测定试剂盒、蒸馏水、购自专业农业公司的白及幼苗(苗高11-15cm、分叉2-3个、茎粗0.45-0.60cm)及栽培后收获的经鉴定的兰科植物白及(Bletillastriata L.)的块茎。
2.实验方法
2.1白及种植
各选择100株白及幼苗在作为试验组1-8种植，生长两个自然年后，挖掘块茎收集备用，期间除了施肥和驱虫外不做过多人工干预，具体如表1所示。
表1白及种植各试验组条件对比
2.2白及样品处理
将各产地各生长年限的白及剪须根、洗净，开水煮至无白心后，取出冷却，各样品置于电热鼓风干燥箱内65-80℃低温烘干，防止白及有效成分氧化，待完全干燥，将其粉碎后备用；
取各白及粉末样品0.05g，加入1ml蒸馏水，充分匀浆；100℃水浴提取2h(必须盖紧盖子防止水分流失)，冷却后10000g离心10min，取上清，吸取0.2ml上清，慢慢加入0.8ml的无水乙醇，混匀后0-4℃静置过夜，10000g离心10min，弃上清，沉淀即为白及提取物，沉淀中加入1ml蒸馏水，充分混匀溶解沉淀制备白及提取物溶液。白及粉末样品质量选择受限于检测设备浓度要求，根据设备需要白及粉末样品可以在0.01g-100g内变化，具体白及样品处理条件也可以在上述公开范围内变化。
2.3羟自由基清除能力测定
将试验组中已经制备的3％-8％质量分数的白及提取物溶液，按照下面方法测定羟自由基清除率：
分光光度计预热30min，调节波长至510nm，蒸馏水调零；
制备样品组，样品组包括：300μl白及提取物水溶液、450μl体积水、150μl体积的6mmol/l的水杨酸溶液、150μl体积的6mmol/l的FeSO4溶液和300μl体积的6mmol/l的过氧化氢溶液；
对照组包括：750μl水、150μl的6mmol/l的水杨酸溶液、150μl的6mmol/l的FeSO4溶液和300μl的6mmol/l的过氧化氢溶液；
空白组包括：900μl体积水、150μl的6mmol/l的水杨酸溶液和300μl的6mmol/l的过氧化氢溶液；
将样品组、对照组和空白组在37℃保温20min后测定分光光度值得出羟自由基清除能力。
上述水、水杨酸溶液、FeSO4溶液及过氧化氢溶液体积、保温温度和时间可以根据实际需要适当调整，需要注意的是样品组、参照组、空白组中相同组分用量一致，保温处理条件一致。
羟自由基清除能力的计算方法为:
羟自由基清除率D％＝(对照组分光光度值-样品组分光光度值)÷(对照组分光光度值-空白组分光光度值)×100％。
2.4DPPH自由基清除能力
将试验组中已经制备的3％-8％质量分数的白及提取物溶液，按照下面方法测定羟自由基清除率：
分光光度计预热30min，调节波长至515nm，蒸馏水调零；
制备样品组，其包括：50μl 3％-8％质量分数的白及提取物水溶液、950μl的0.1mmol/l的DPPH溶液；
制备参照组，其包括40μl的水、950μl的0.1mmol/l的DPPH溶液；
将样品组、参照组在45℃保温30min后测定分光光度值得出DPPH自由基清除能力。
上述样品组和参照组总体积一致，保温温度和时间可以根据实际需要适当调整，但保温处理条件一致。
优选的，DPPH自由基清除能力的计算方法为:DPPH自由基清除率D％＝(参照组分光光度值-样品组分光光度值)÷参照组分光光度值×100％。
2.5白及提取物平均分子量测定
高聚物在稀溶液中的粘度，主要反映了液体在流动时存在着内摩擦。其中因溶剂分子之间的内摩擦表现出来的粘度叫纯溶剂粘度，记作η0；此外还有高聚物分子相互之间的内摩擦，以及高分子与溶剂分子之间的内摩擦。三者之总和表现为溶液的粘度η。在同一温度下，一般来说，η>η0相对于溶剂，其溶液粘度增加的分数，称为增比粘度，记作ηsp，即
ηsp＝(η-η0)/η0；
而溶液粘度与纯溶剂粘度的比值称为相对粘度，记作ηr，即
ηr＝η/η0。
ηr也是整个溶液的粘度行为，ηsp则意味着已扣除了溶剂分子之间的内摩擦效应，两者关系为:
ηsp＝(η-η0)/η0＝ηr-1。
对于高分子溶液，增比粘度ηsp往往随溶液的浓度c的增加而增加。为了便于比较，将单位浓度下所显示出的增比浓度，即ηsp/c称为比浓粘度；而lnηr/c称为比浓对数粘度。ηr和ηsp都是无因次的量。
为了进一步消除高聚物分子之间的内摩擦效应，必须将溶液浓度无限稀释，使得每个高聚物分子彼此相隔极远，其相互干扰可以忽略不记。这时溶液所呈现出的粘度行为基本上反映了高分子与溶剂分子之间的内摩擦。这一粘度的极限值记为
利用乌氏粘度计，将试验组中白及提取液1ml，依次加0ml、2mL、5mL、8mL、15mL蒸馏水稀释后的相对浓度c’分别为0、1/3、1/6、1/9、1/16，根据实验对不同浓度的溶液测得相应流出时间计算ηr、lnηrηsp、ηsp/c’和lnηr/c’；ρ为液体的密度；r是毛细管半径；t是流出时间；ηr和ηsp都是无因次的量；[η]被称为特性粘度，其值与浓度无关。实验证明，当聚合物、溶剂和温度确定以后，[η]的数值只与高聚物平均相对分子质量M有关，它们之间的半经验关系可用Mark Houwink方程式表示：
[η]＝kMa；
根据[η]计算出高分子平均分子量M。
式中K为比例常数，α是与分子形状有关的经验常数。它们都与温度、聚合物、溶剂性质有关，在一定的相对分子质量范围内与相对分子质量无关。
K和α的数值，只能通过其它绝对方法确定，例如渗透压法、光散射法等等。粘度法只能测定[η]求算出M。
测定高分子的[η]时，用毛细管粘度计最为方便。当液体在毛细管粘度计内因重力作用而流出是遵守泊肃叶(Poiseuille)定律：
ρ为液体的密度；l是毛细管长度；r是毛细管半径；t是流出时间；h是流经毛细管液体的平均液柱高度；g为重力加速度；V是流经毛细管的液体体积；m是与机器的几何形状有关的常数，在r/l<<1时，可取m＝1)；
对某一支指定的粘度计而言，令
则
式中β<1,当t>100s时，等式右边第二项可以忽略。设溶液的密度ρ与溶剂密度ρ0近似相等。这样，通过测定溶液和溶剂的流出时间t和t0，就可求算ηr：
ηr＝η/η0＝t/t0；
进而可计算得到ηsp，ηsp/c和lnηsp/c值。配制一系列不同浓度的溶液分别进行测定，ηsp/c以和lnηsp/c为纵坐标，c为横坐标作图，如图1所示，得两条直线，分别外推到c＝0处，其截距即为[η]，代入[η]＝kMα，即可得到M。
3.结果分析和讨论
3.1抗氧化能力分析
试验组1-8采用上述2.3和2.4章节公开的羟自由基清除率和DPPH自由基清除率检测方法，如下表2和附图2所示：试验组1-3较试验组4-6具有显著更高的羟自由基清除率和DPPH自由基清除率，其中羟自由基清除率均超过30％，而DPPH自由基清除率均超过24％，结合试验条件变量分析试验组1-3的昼夜温差均大于10℃，而试验组4-6昼夜温差均小于10℃，且试验组4-6中具有最小昼夜温差的试验组6(昼夜温差5℃)具有最小的羟自由基清除率和DPPH自由基清除率，因而昼夜温差是影响白及提取物抗氧化性的最关键因素；进一步地，试验例7-8温湿度条件、光照等不相同，但仍呈现出昼夜温差越大羟自由基清除率和DPPH自由基清除率越大的趋势，进一步辅证了该结论。同时白及生长的温度范围(年中温度变化)，同等条件下对羟自由基清除率和DPPH自由基清除率并不明显，试验组3的温度范围(年中温度变化)虽然小于试验组1-2但同等条件下其羟自由基清除率和DPPH自由基清除率却大于试验组1-2，这说明温度范围不是影响白及提取物抗氧化性的最关键因素。同等条件下，白及提取物羟自由基清除率>30％且DPPH自由基清除率>24％；羟自由基清除率较常规方法最大提高10.9％，DPPH自由基清除率较常规方法最大提高14.8％。综上，高抗氧化性白及种植最适合昼夜温差范围为10-18摄氏度。
表2白及种植各试验组条件对比
3.2白及提取物的平均分子量分析
如下表3所示：对各试验组白及提取物平均分子量测试显示，具有较高羟自由基清除率和DPPH自由基清除率的试验组1-3和试验组7-8的白及提取物平均分子量明显小于试验组4-5，其平均分子量在80-100万之间，原因是昼夜温差大白及生长时为了应对低温将大分子物质部分分解，降低体液的凝固点，进而导致白及提取物(主要是甘露聚糖)中游离的醛基增多，增强了白及提取物的抗氧化性。
表3各试验组平均分子量对比
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
Claims (12)
1.一种高抗氧化白及培育方法，其特征在于，将白及在温度范围-5～22.5℃、年光照时间1000-1600h、昼夜温差10-18℃、湿度范围30％-80％的环境下种植。
2.一种高抗氧化白及提取物的制备方法，其特征在于，使用权利要求1所述培育方法培育的白及作为原料，包括以下步骤：将白及粉碎加水溶解提取后加入乙醇沉淀制得白及提取物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，白及粉碎前还包括烘干过程；加水溶解提取时还包括在80-100℃下水浴处理；加入乙醇沉淀前后均包括离心处理过程。
4.一种高抗氧化白及提取物，其特征在于，其平均分子量范围为80-100万，由权利要求2或3所述的制备方法制备。
5.根据权利要求4所述的白及提取物，其特征在于，所述白及提取物羟自由基清除率>30％且DPPH自由基清除率>24％；
所述白及提取物羟自由基清除率测量所需样品体系为：A体积3％-8％质量分数的白及提取物水溶液、1-1.5倍A体积水、0.4-0.6倍A体积的0.1-20mmol/l的水杨酸溶液、0.4-0.6倍A体积的0.1-20mmol/l的FeSO4溶液和0.8-1.2倍A体积的0.1-20mmol/l的过氧化氢溶液；A取值1-1000ul；
所述DPPH自由基清除率测量所需样品体系为：B体积3％-8％质量分数的白及提取物水溶液、18-20倍B体积的0.01-10mmol的DPPH溶液；B取值1-1000ul。
6.一种白及提取物的抗氧化性检测方法，其特征在于，包括权利要求2或3所述制备方法的白及提取物步骤并用于检测权利要求4所述的白及提取物的抗氧化性，包括以下步骤：制备含白及提取物的样品组和不含白及提取物的参照组；向所述参照组和所述样品组加入处理试剂并测定所述参照组和所述样品组的特征量获取抗氧化性数据。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述特征量的测试方法为吸光光度法或滴定法；所述特征量为吸光度或滴定浓度。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述抗氧化性数据为羟自由基清除能力或DPPH自由基清除能力。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述羟自由基清除能力的判定方法为：
样品组包括：A体积3％-8％质量分数的白及提取物水溶液、1-1.5倍A体积水、0.4-0.6倍A体积的试剂一、0.4-0.6倍A体积的试剂二和0.8-1.2倍A体积的试剂三；
所述参照组包括不含试剂二的空白组和包含试剂二的对照组；
所述对照组包括：2-3倍A体积水、0.4-0.6倍A体积的试剂一、0.4-0.6倍A体积的试剂二和0.8-1.2倍A体积的试剂三；
所述空白组包括：2-4倍A体积水、0.4-0.6倍A体积的试剂一和0.8-1.2倍A体积的试剂三；
将所述样品组、所述对照组和所述空白组在20-45℃保温5-30min后测定分光光度值得出所述羟自由基清除能力。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述羟自由基清除能力的计算方法为:羟自由基清除率D％＝(对照组分光光度值-样品组分光光度值)÷(对照组分光光度值-空白组分光光度值)×100％；所述分光光度值的测定波长选择510nm；所述试剂一为0.1-20mmol/l的水杨酸溶液；所述试剂二为0.1-20mmol/l的FeSO4溶液；所述试剂三为0.1-20mmol/l的过氧化氢溶液；A取值1-1000ul。
11.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述DPPH自由基清除能力的判定方法为：
样品组包括：B体积3％-8％质量分数的白及提取物水溶液、18-20倍B体积的试剂四；
所述参照组包括0.75-0.8倍B体积的水、18-21倍B体积的试剂四；
将所述样品组、所述参照组在20-45℃保温5-30min后测定分光光度值得出所述DPPH自由基清除能力。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述DPPH自由基清除能力的计算方法为:DPPH自由基清除率D％＝(参照组分光光度值-样品组分光光度值)÷参照组分光光度值×100％；所述分光光度值的测定波长选择515nm；所述试剂四为0.01-10mmol的DPPH溶液；B取值1-1000ul。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
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