CN104547148A - 一种用于防治老年性痴呆的白花蛇舌草提取物及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有鸡矢藤次苷衍生物的白花蛇舌草植物提取物在制备用于益智和防治老年性痴呆等疾病的药物的用途。本发明还涉及从植物白花蛇舌草（<i>Hedyotis</i><i>？diffusa</i>？Willd.）中提取、精制植物提取物的制备方法，其中有效成分为鸡矢藤次苷衍生物。其中采用水或醇提取，提取物经沉淀和色谱方法精制，如果需要还可用凝胶柱色谱进一步纯化，得到鸡矢藤次苷衍生物含量在25%，特别是50%以上的植物提取物。本发明的药物剂型优选包括注射剂、片剂、胶囊、软胶囊、口服液或滴丸等。

Description

一种用于防治老年性痴呆的白花蛇舌草提取物及制备方法

技术领域

本发明属于天然药物技术领域。具体涉及一种含有鸡矢藤次苷(scandoside)及其衍生物，即环烯醚萜苷类化合物，或称为总环烯醚萜苷的白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.)植物提取物在制备益智、增强记忆或防治老年性痴呆等疾病的药物中的用途。从中药白花蛇舌草中提取、精制得到的植物提取物及其提取方法。

背景技术

老年性痴呆，也叫阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease简称AD)，是大脑高级聚合过程的慢性功能障碍。由于起病隐匿，故使早期症状易被忽略，随着我国人口老龄化的加快，老年性痴呆患者日益增加，患AD的病人生活不能自理，时时需要家人照料，给患者、家庭、社会带来沉重的负担。治疗老年性痴呆的药物研究与开发范围除脑血循环改善剂、脑能量代谢激活剂外，在脑神经递质分解酶抑制剂等。近年来在神经肽、神经生长因子和中草药等方面的研究也十分活跃，并取得了一定进展。

不过，治疗老年性痴呆的药物有一个不得不面对的问题，由于防治记忆及认知障碍的用药周期相对较长，对AD患者也许是终生的，因此药物的安全使用至关重要，从已知的安全性较高的中药材提取中药有效成分，研制和开发中药新药是很有必要的。

白花蛇舌草又名蛇舌草、蛇针草、二叶律、白花十字草、龙舌草、鹤舌草等，为茜草科耳草属植物，其全草入药。白花蛇舌草为岭南地区常用中药，在广西、广东地区产量大，民间应用较多。在中药中白花蛇舌草主要用于肿瘤、蛇咬伤、小儿疮积、跌打创伤等。

环烯醚萜苷是植物白花蛇舌草中的一种主要化学成分，文献^1-7报道了白花蛇舌草中的环烯醚萜苷类化合物的结构如下：

参考文献： 

1.Takagi S.,Yamaki M.,Nishihama Y.,et al.On the iridoids glucosoides of the Chinese Drug“bai hua she she cao”.Yakugaku Zasshi,1982,36(4):366-369. 

2.吴孔松,曾光尧,谭桂山,等.白花蛇舌草化学成分的研究。天然产物研究与开发, 2006,18:52-54. 

3.Nishihama Y.,Masuda K.,Yamaki M.,et al.Three new iridoids glucosoides from Hedyotis diffusa.Planta Med,1981,43:28-33. 

4.杨亚滨,杨雪琼,丁中涛.白花蛇舌草化学成分的研究。云南大学学报(自然科学版),2007,29:187-189·

5.Wu H.M.,Tao X.L.,Chen Q.,et al.Iridoids from Hedyotis diffusa.J Nat Prod,1991,54(l):254-256. 

6.Liang Z.,Jiang Z.,Ho H.,et al.Comparative analysis of Oldenlandia diffusa and its substitutes by high performance liquid chromatographic fingerprint and mass spectrometric analysis. Planta Med,2007,73:1502-1508. 

7.张永勇,罗佳波.白花蛇舌草化学成分研究。中药材,2008,31:522-524.

尽管文献报道了通过反复多次的正相和反相硅胶柱色谱分离纯化，从白花蛇舌草中得到包括鸡矢藤次苷和其他环烯醚萜衍生物类单体化合物的方法，但从未报道过这些单体化合物与益智和防治老年性痴呆的作用有关。

由于白花蛇舌草中化学成分复杂，而环烯醚萜类化合物不稳定，因此，到目前为止尚未有过由上述植物中提取得到鸡矢藤次苷及其衍生物具有益智和增强记忆力作用，可用于防治老年性痴呆的报道。另外，现有技术的有关报道中，鸡矢藤次苷及其衍生物的制备工业化生产过程中也存在一系列问题。

发明内容

本发明提供了含有鸡矢藤次苷衍生物的白花蛇舌草植物提取物或者鸡矢藤次苷类单体化合物或混合物在制备益智、增强记忆或防治老年性痴呆等疾病的药物中的用途。其中该提取物中鸡矢藤次苷衍生物总含量为25％以上，优选鸡矢藤次苷衍生物总含量为50％以上的提取物。所述鸡矢藤次苷衍生物可以为鸡屎藤次苷类化合物中任意单体，也可以为鸡矢藤次苷类化合物中任意多种单体化合物的混合物。

现通过对东莨菪碱致小鼠学习记忆获得障碍模型，通过暗箱实验、跳台实验等的研究，表明鸡矢藤次苷衍生物的单体化合物或混合物以及含有鸡矢藤次苷衍生物的植物提取物具有益智和防治老年性痴呆作用。

本文中上述植物提取物被简称为“白花蛇舌草提取物”。

本发明所述鸡矢藤次苷及其衍生物结构通式如下：

其中，R₁选自氢、乙酰基等；R₂选自氢、C₁-C₆低级烷基(优选甲基，乙基，丙基，乙丙基，丁基，异丁基)，C₂-C₆低级链烯基，C₁-C₆烷基苯基(优选(E)-6-O-香豆酰基)等；R₃选自氢、C₁-C₆低级烷基或C₂-C₆低级链烯基。

本文中所使用的术语“C₁-C₆低级烷基”是指具有1-6个碳原子的，直链或支链的饱和烃基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、正戊基、异戊基、正己基等。

本文中所使用的术语“C₂-C₆低级链烯基”是指具有2-6个碳原子，以及具有一或二个不饱和双键的直链或支链烃基，例如乙烯基、丙烯基、异丁烯基、异戊烯基等。

最优选的化合物，是其中R₁、R₂和R₃均为H的化合物，即鸡矢藤次苷。

本发明还提供了从白花蛇舌草植物原料中制备白花蛇舌草提取物的方法，其中提取物中鸡矢藤次苷类化合物总含量为25％以上，优选鸡矢藤次苷类化合物总含量为50％以上，更优选鸡矢藤次苷类化合物总含量为50-95％。应用该制备方法得到的提取物中以鸡矢藤次苷及其衍生物为主要成分的环烯醚萜类有效成分群，该有效成分群即是所述植物益智和防治老年性痴呆的有效部位。

本发明制备所述白花蛇舌草植物提取物的工艺方法如下：

提取方法：将植物白花蛇舌草粉碎，然后用水和/或C₁-C₆烷醇含量不大于95％的水溶液作为溶剂在0℃-溶剂回流的温度(优选室温至溶剂回流的温度)下提取，提取液经常压或减压浓缩得浸膏；其中所述C₁-C₆烷醇优选为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇或它们组成的混合溶剂，其中更优选甲醇、乙醇，特别优选乙醇。

精制方法：将浸膏用溶剂溶解后，用极性相反的其他溶剂进行沉淀或沉降，过滤收集沉淀物直接干燥，或收集溶液后，在浓缩干燥得到提取物再用色谱方法精制、纯化，用洗脱溶剂洗脱，收集富含鸡矢藤次苷类化合物的流分，浓缩，过滤，干燥，检测并收集富含鸡矢藤次苷衍生物的植物提取物。

其中所述用于溶解提取物的溶剂为水或甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇和异丁醇的醇溶剂，或者它们的组合，优选水、甲醇或乙醇，更优选水或乙醇；所述用于沉淀的极性相反的其他溶剂是水或醇溶剂，所述醇溶剂选自水或甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇和异丁醇的醇溶剂，或者它们的组合，优选水、甲醇或乙醇，更优选水或乙醇；选自精制、纯化的色谱方法为大 孔吸附树脂色谱、正相硅胶和反相硅胶色谱，或者它们的组合，或者将提取得到的浸膏混合于硅胶或硅藻土中，晾干后用洗脱溶剂进行回流洗脱；所述洗脱溶剂为水，C₁-C₆烷基醇，如：甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇等，卤代烃，如：二氯甲烷、氯仿(三氯甲烷)等，醚类溶剂，如：乙醚、甲基叔丁醚等，酮类溶剂，如：丙酮、2-丁酮等，酯类溶剂，如：乙酸乙酯、甲酸乙酯等，以及由上述溶剂组成的混合溶剂，其中优选的洗脱溶剂为氯仿(三氯甲烷)、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和水中的一种或数种混合溶剂，所述精制方法中，当用苯乙烯型大孔吸附树脂柱精制时，洗脱溶剂优选为水和10-50％的乙醇或甲醇水溶液；当用反相硅胶色谱精制时，洗脱溶剂优选为水和10-50％的乙醇或甲醇水溶液；当用正相硅胶色谱精制时，洗脱溶剂为三氯甲烷或乙酸乙酯和90-100％乙醇水溶液或甲醇组成的混合溶剂，它们的比例为10:1-1:1。

如果需要，可将上述方法得到的产物用凝胶色谱法进一步纯化，收集含有鸡矢藤次苷类化合物的流分，浓缩，干燥，得到含有鸡矢藤次苷类化合物的植物提取物。其中所述的凝胶色谱的填料优选为Sephadex LH-20；以及洗脱所用的溶剂为选自乙醇、甲醇和水中的一种，或数种溶剂组合的混合溶剂。

其中所述制备方法中，富含鸡矢藤次苷类化合物的流分是通过薄层层析(TLC)、紫外(UV)、高压液相色谱(HPLC)等方法检测的，其中优选HPLC检测方法。

优选本发明得到的白花蛇舌草植物提取物中鸡矢藤次苷衍生物的总含量是通过HPLC方法检测的，优选用高效液相外标法测定，以鸡矢藤次苷作标准，计算其中鸡矢藤次苷类化合物的含量。

按照上述方法得到的白花蛇舌草植物提取物中鸡矢藤次苷衍生物总含量为25％以上，优选鸡矢藤次苷衍生物总含量为50％以上，更优选鸡矢藤次苷衍生物总含量为50-95％。

按照上述方法得到的含有鸡矢藤次苷衍生物的白花蛇舌草植物提取物具有益智、增强记忆的作用。

本发明介绍的制备方法是提供具有高含量鸡矢藤次苷衍生物的白花蛇舌草植物提取物制备方法中的一种，并不意味着只有通过上述方法得到的高含量鸡矢藤次苷衍生物的白花蛇舌草植物提取物才能用作制备益智、增强记忆或防治老年性痴呆等疾病的药物。可以想见，本领域技术人员用其他方法获得的富含鸡矢藤次苷衍生物的白花蛇舌草植物提取物也会具有同样的药物作用。

用以上提取和精制方法制备中药白花蛇舌草中的植物提取物，其中有效成分-鸡矢藤次苷衍生物在植物提取物中的含量可高达50％以上，其中大孔吸附树脂法精制更适合于工业化生产。

利用本发明方法得到的植物提取物可以与药物上可接受的载体一起制成各种药物制剂， 其中所述的药物制剂可以是药学领域常用的剂型，例如口服制剂或注射剂，所述的口服制剂例如是片剂、胶囊、口服液或滴丸等，所述的注射剂例如是溶液、悬浮液、乳液或冻干粉针制剂等。利用本发明的白花蛇舌草提取物制备所需各种剂型时，可以按照药学领域的常规生产方法制备。

与常规的中药制剂方法相比，应用本发明的白花蛇舌草提取物制备各种制剂时，因其中的有效成分高，以及其含量可以得到有效地控制，因此可获得高效的、质量均一的药品，有利于中药制剂的标准化。

因此，本发明的另一目的是提供了本发明白花蛇舌草提取物在制药和保健品领域中的应用，特别是本发明白花蛇舌草提取物在制备用于益智和增强记忆力的药物中的应用，本发明的白花蛇舌草提取物可用于制备防治老年性痴呆疾病的药物和保健品。

本发明的药物制剂中还可以包含其他用于治疗阿尔茨海默病的活性剂或与其他治疗阿尔茨海默病(老年性痴呆)的药物一起或顺序给药。

具体实施方式

下面的制备实施例和实验实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：

1.提取：中药白花蛇舌草药材1kg，粗粉碎后加水浸泡提取3次，每次用水量为白花蛇舌草药材干重的12倍，每次浸泡24小时。合并提取液，减压浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，过滤，得澄清滤液。

2.醇沉精制：白花蛇舌草水提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为70％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。

3.大孔树脂吸附色谱精制：将2中的流浸膏加水溶解并过滤，滤液通过经处理的HP-20型大孔吸附树脂，用水和20％，30％，40％，50％，75％的乙醇梯度洗脱，HPLC检测，收集富含鸡矢藤次苷类化合物的流分，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物4.48g，经过高效液相色谱法测定，其中鸡矢藤次苷类化合物含量为51.8％。

实施例2：

1.提取：中药白花蛇舌草药材1kg，粗粉碎后加水煎煮二次，每次用水量为白花蛇舌草药材干重的12倍，煎煮温度为98℃，每次煎煮时间为1小时。合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，过滤，得澄清滤液。

2.醇沉精制：白花蛇舌草水提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为75％，静置16小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。

3.大孔树脂吸附色谱精制：将2中的流浸膏加水溶解并过滤，滤液通过经处理的D-101 型大孔吸附树脂，用水和20％，30％，40％，50％，75％的乙醇梯度洗脱，HPLC检测，收集富含鸡矢藤次苷类化合物的流分，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物4.42g，经过高效液相色谱法测定，其中鸡矢藤次苷类化合物含量为51.7％。

实施例3：

1.提取：中药白花蛇舌草药材1kg，粗粉碎后加水浸泡提取2次，每次用水量为白花蛇舌草药材干重的12倍，每次浸泡18小时，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置18小时，过滤，得澄清滤液。

2.醇沉精制：白花蛇舌草水提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为75％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。

3.大孔树脂吸附色谱精制：将2中的流浸膏加水溶解并过滤，滤液通过经处理的苯乙烯RH型大孔吸附树脂，用水和20％，30％，40％，50％，75％的乙醇梯度洗脱，HPLC检测，收集富含鸡矢藤次苷类化合物的流分，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物4.28g，经过高效液相色谱法测定，其中鸡矢藤次苷类化合物含量为51.4％。

实施例4：

1.提取：中药白花蛇舌草药材1kg，粗粉碎后加水煎煮二次，每次用水量为白花蛇舌草药材干重的12倍，煎煮温度为98℃，每次煎煮时间为1.5小时。合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，过滤，得澄清滤液。

2.醇沉精制：白花蛇舌草水提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为80％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。

3.大孔树脂吸附色谱精制：将2中的流浸膏加水溶解并过滤，滤液通过经处理的苯乙烯SP-700型大孔吸附树脂，用水和20％，30％，40％，50％，75％的乙醇梯度洗脱，HPLC检测，收集富含鸡矢藤次苷类化合物的流分，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物4.68g，经过高效液相色谱法测定，其中鸡矢藤次苷类化合物含量为54.4％。

实施例5：

1.提取：中药白花蛇舌草药材1kg，粗粉碎后加50％乙醇回流提取2次，每次用50％乙醇量为白花蛇舌草药材干重的13倍，每次提取1小时。合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，过滤，得澄清滤液。

2.醇沉精制：白花蛇舌草50％乙醇提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为75％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。

3.大孔树脂吸附色谱精制：将2中的流浸膏加水溶解并过滤，滤液通过经处理的苯乙烯SP-825型大孔吸附树脂，用水和20％，30％，40％，50％，75％的乙醇梯度洗脱，HPLC检测， 收集富含鸡矢藤次苷类化合物的流分，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物4.31g，经过高效液相色谱法测定，其中鸡矢藤次苷类化合物含量为52.6％。

实施例6：

1.提取：中药白花蛇舌草药材1kg，粗粉碎后加95％乙醇回流提取3次，每次用95％乙醇量为白花蛇舌草药材干重的12倍，每次提取1.5小时。合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，过滤，得澄清滤液。

2.醇沉精制：白花蛇舌草95％乙醇提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为60％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。

3.大孔树脂吸附色谱精制：将2中的流浸膏加水溶解并过滤，滤液通过经处理的苯乙烯SP-700型大孔吸附树脂，用水和20％，30％，40％，50％，75％的乙醇梯度洗脱，HPLC检测，收集富含鸡矢藤次苷类化合物的流分，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物3.60g，经过高效液相色谱法测定，其中鸡矢藤次苷类化合物含量为56.5％。

实施例7：

1.提取：中药白花蛇舌草药材1kg，粗粉碎后加95％乙醇浸泡提取3次，每次用95％乙醇量为白花蛇舌草药材干重的12倍，每次浸泡时间为24小时。合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，过滤，得澄清滤液。

2.醇沉精制：白花蛇舌草95％乙醇提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为60％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。

3.反相硅胶(C-18)柱色谱精制：将2中的流浸膏加水溶解并过滤，滤液通过中压反相硅胶(C-18)柱色谱柱，用水和10％的乙醇梯度洗脱后，再用20％的乙醇溶液洗脱，HPLC检测，收集富含鸡矢藤次苷类化合物的流分，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物2.63g，经过高效液相色谱法测定，其中鸡矢藤次苷类化合物含量为58.8％。

实施例8：

1.提取：中药白花蛇舌草药材1kg，粗粉碎后加95％乙醇回流提取3次，每次用95％乙醇量为白花蛇舌草药材干重的10倍，每次提取时间为2.5小时。合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，过滤，得澄清滤液。

2.醇沉精制：白花蛇舌草95％乙醇提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为75％，静置36小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。

3.正相硅胶柱色谱精制：将2中的浸膏硅胶拌样，通过正相硅胶(100-200目)柱，氯仿-甲醇(50:1-1:1)梯度洗脱，HPLC检测，收集富含鸡矢藤次苷类化合物的流分，合并，减压回收溶剂至干即得植物提取物5.99g，经过高效液相色谱法测定，其中鸡矢藤次苷类化合物 含量为60.8％。

实施例9：

1.提取：中药白花蛇舌草药材1kg，粗粉碎后加95％乙醇浸泡提取3次，每次用95％乙醇量为白花蛇舌草药材干重的12倍，每次浸泡时间为24小时。合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，过滤，得澄清滤液。

2.醇沉精制：白花蛇舌草95％乙醇提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为65％，静置24小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。

3.反相硅胶(C-18)柱色谱精制：将2中的流浸膏加水溶解并过滤，滤液通过中压反相硅胶(C-18)柱色谱柱，用水和10％的乙醇梯度洗脱后，再用18％的乙醇溶液洗脱，HPLC检测，收集富含鸡矢藤次苷类化合物的流分，合并，减压浓缩，冷冻干燥即得植物提取物2.63g，经过高效液相色谱法测定，其中鸡矢藤次苷类化合物含量为50.3％。

实施例10：

1.提取：中药白花蛇舌草药材1kg，粗粉碎后加95％乙醇回流提取3次，每次用95％乙醇量为白花蛇舌草药材干重的12倍，每次提取时间为2.5小时。合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至稠浸膏，加入蒸馏水加热溶解，冷却至室温，静置24小时，过滤，得澄清滤液。

2.醇沉精制：白花蛇舌草95％乙醇提取浓缩液，在充分搅拌下，加乙醇(95％)，使溶液含醇量为75％，静置32小时，过滤，收集滤液，再减压回收乙醇至流浸膏状。

3.正相硅胶柱色谱精制：将2中的浸膏硅胶拌样，通过正相硅胶(100-200目)柱，乙酸乙酯-乙醇(50:1-1:1)梯度洗脱，HPLC检测，收集富含鸡矢藤次苷类化合物的流分，合并，减压回收溶剂至干即得植物提取物3.86g，经过高效液相色谱法测定，其中鸡矢藤次苷类化合物含量为61.2％。

实施例11：

将上述实施例6中得到的白花蛇舌草提取物3.60g，用蒸馏水溶解后，通过SephadexLH-20凝胶色谱柱纯化，用H₂O洗脱，收集样品液，减压回收，冷冻干燥，得到进一步纯化的提取物2.18g。

进一步纯化的提取物的定量分析：以鸡矢藤次苷为参照物，，HPLC检测，经过凝胶柱色谱进一步纯化的提取物中鸡矢藤次苷类化合物含量为94.6％。

纯化后的提取物定性分析：经液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)检测分析，初步确定进一步纯化的提取物中含有的环烯醚萜苷类化合物包括：鸡矢藤次苷(scandoside)(M＝390)，鸡矢藤次苷甲酯(scandoside methyl ester)(M＝404)，(E)-6-O-香豆酰鸡矢藤次苷甲酯[(E)-6-O-p-cpumaroyl scandoside methyl ester](M＝550)，(E)-6-O-阿魏酰鸡矢藤次苷甲酯 [(E)-6-O-feruloyl scandoside methyl ester](M＝580)，(Z)-6-O-香豆酰鸡矢藤次苷甲酯[(Z)-6-O-p-cpumaroyl scandoside methyl ester](M＝550)和(Z)-6-O-阿魏酰鸡矢藤次苷甲酯[(Z)-6-O-feruloyl scandoside methyl ester](M＝580)。具体结构如下：

实施例12：提取物中主要环烯醚萜苷类化合物的分离纯化和结构鉴定

上述实施例11中得到的进一步纯化的白花蛇舌草提取物2.18g，用蒸馏水溶解后，中压反相硅胶(C-18)柱色谱分离，用H₂O-甲醇(1:0-0:1)梯度洗脱，根据薄层色谱检查，合并组成成分相似的洗脱液，减压回收溶剂至干燥，按极性大小得到5个分离部位F1(0.18g)、F2(0.44g)、F3(0.62g)、F4(0.20g)和F5(0.31g)。

取F3部位(0.62g)用纯净水溶解后，经过反相(C-18)制备型HPLC分离纯化得到两个单体化合物F3-1(96.1mg)和F3-2(83.8mg)。经HPLC归一化法测定，得到两个化合物的纯度分别为98.6％和95.6％；经过分别测定两个化合物的紫外光谱，红外光谱，一维核磁共振氢谱、碳和DEPT谱，以及电喷雾质谱测定，F3-1和F3-2分别鉴定为鸡矢藤次苷(scandoside)和鸡矢藤次苷甲酯(scandoside methyl ester)。

实验实施例 

白花蛇舌草提取物对于益智和防治老年性痴呆的作用

下文中采用的缩写“hds”是指鸡矢藤次苷衍生物含量大于50％的白花蛇舌草提取物。

实验实施例1：用东莨菪碱致小鼠学习记忆获得障碍模型

[实验材料和仪器]

1.实验动物：雄性昆明种小鼠，体重20-22g，由山东大学动物室提供，实验前动物在本所动物房笼养两天。

2.受试药物：鸡矢藤次苷和通过以上制备实施例1得到的白花蛇舌草提取物(含量为 51.8％)，用蒸馏水溶解。

3.给药途径：灌胃，对照组灌胃等体积的蒸馏水

4.剂量：鸡矢藤次苷：2.5，5.0，10.0mg/kg_体重；白花蛇舌草提取物：6.25，12.5，25.0mg/kg _体重

5.阳性对照药：石杉碱甲：2.5mg/kg_体重

6.仪器：小鼠跳台仪：XZC-5A

7.试剂：东莨菪碱，购自Sigma公司

结果：经跳台法检测发现scandoside和白花蛇舌草提取物分别2.5-10.0mg/kg和6.25-25.0mg/kg范围内可明显延长动物第一次跳下平台的潜伏期，同时5分钟内的下台次数(错误次数)减少，表明白花蛇舌草提取物可明显改善东莨菪碱导致的小鼠学习记忆获得障碍，结果见表1。

表1.hds对东莨菪碱致痴呆模型小鼠跳台实验潜伏期和错误次数的影响

表中潜伏期和错误次数表示为：Mean±SEM(平均值±标准偏差)，

与正常组比较^#P<0.05，^##P<0.01，与模型组比较*P<0.05，**P<0.01.

实验实施例2：小鼠避暗实验

动物：SPF昆明种雄性小鼠，体重19-20g，由山东大学动物室提供，实验前动物在本所动物房笼养两天。

试剂及配制：hds(实施例1的产物，含量51.8％)用蒸馏水稀释成6.25mg/10ml(6.25mg/kg)、12.5mg/10ml(12.5mg/kg)、25.0mg/10ml(25.0mg/kg)，灌胃给药。

石杉碱甲：2.5mg/kg，用蒸馏水配成2.5mg/5ml灌胃给药。

仪器：SBA-2小鼠避暗仪，由山东医药工业研究所安评中心提供。

方法：SPF昆明种小鼠，体重19-20g，雄性，随机分5组，正常对照组，模型组，石杉碱甲组(2.5mg/kg)，hds组(6.25mg/kg、12.5mg/kg和25.0mg/kg)，正常对照组灌服水，其余灌服给药，给药第8和第9天进行小鼠避暗实验。第8天学习前20分钟腹腔注射氢溴酸东莨菪碱(5.0mg/kg)。

实验装置为一条件反射箱，分为明暗两部分，两室中有一小孔洞使小鼠可自由通行，箱底有铜栅，其中暗室底部的铜栅通以36V电压。实验时将小鼠放入明室并背向暗室，因小鼠有喜暗及钻洞的习性，所以在实验训练期间会多次钻入暗室，当小鼠一走入暗室四足接触铜栅时就会受到电击，此行为即为错误，其正常反应为马上设法退出暗室。第一天训练时，记录小鼠在3分钟内进入暗室的次数及第一次进入暗箱的时间。24小时后再做实验，观察5分钟内小鼠首次进入暗箱的时间即潜伏期，小鼠进入暗箱的次数即错误次数。

对实验结果进行统计并比较各组小鼠第一次进入暗室的潜伏期及进入暗室的次数即错误次数。从下表可以看出在小鼠避暗实验中，模型组与正常组相比有显著性差异，实验方法造模成功。与模型组相比，石杉碱甲组、hds低剂量(6.25mg/kg)组以及高剂量(25.0mg/kg)或中剂量(12.5mg/kg)组均能有效延长第一次进入暗室的潜伏期及减少进入暗室的次数即错误次数，说明石杉碱甲、hds在小鼠避暗实验中有对抗氢溴酸东莨菪碱引起的记忆获得障碍的作用。结果见下表。

表2.Hds在小鼠避暗实验中对抗氢溴酸东莨菪碱引起的记忆获得障碍的作用

与正常组比较^##P<0.01，与模型组比较*P<0.05，**P<0.01.

表3.Hds在小鼠避暗实验中对抗氢溴酸东莨菪碱引起的记忆获得障碍的作用

与正常组比较^##P<0.01，与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

Claims (9)

1.一种具有益智、增强记忆或防治老年性痴呆作用的白花蛇舌草提取物，该提取物是从中药白花蛇舌草中提取制备的，其中的有效成分是以鸡矢藤次苷衍生物为主要成分的环烯醚萜类化合物，所述衍生物可以为一种鸡矢藤次苷衍生物的单体化合物，也可以为鸡矢藤次苷衍生物中任意多种化合物的混合物；

所述鸡矢藤次苷衍生物结构通式如下：

其中，R₁选自氢、乙酰基等；R₂选自氢、C₁-C₆低级烷基（优选甲基，乙基，丙基，乙丙基，丁基，异丁基），C₂-C₆低级链烯基，C₁-C₆烷基苯基（优选(E)-6-O-香豆酰基）等；R₁选自氢、C₁-C₆低级烷基或C₂-C₆低级链烯基。

2.根据权利要求1所述的白花蛇舌草植物提取物，该提取物中鸡矢藤次苷衍生物总含量为25%以上，优选鸡矢藤次苷衍生物总含量为50%以上，更优选鸡矢藤次苷衍生物总含量为50-95%。

3.根据权利要求1所述的鸡矢藤次苷衍生物在制备益智、增强记忆或防治老年性痴呆等疾病的药物中的用途时，所述衍生物可以为一种鸡矢藤次苷衍生物的单体化合物，也可以为鸡矢藤次苷衍生物中任意多种化合物的混合物。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的白花蛇舌草植物提取物的制备通过下述步骤获得：

⑴ 将植物白花蛇舌草粉碎，然后用水和/或C₁-C₆烷醇含量不大于95%的水溶液作为溶剂进行提取，提取液经常压或减压浓缩得浸膏，或经喷雾干燥得粉末；

⑵ 将浸膏或粉末用溶剂溶解后，用极性相反的其他溶剂进行沉淀或溶解，用常规方法进行处理得到含有环烯醚萜类化合物的白花蛇舌草提取物，得到沉淀物或溶解液浓缩物；

⑶ 将上述得到的产物用色谱方法精制、纯化、用洗脱溶剂洗脱，收集富含鸡矢藤次苷衍生物的流分，浓缩，过滤，干燥，得到含有鸡矢藤次苷衍生物的提取物，其中鸡矢藤次苷衍生物总含量为25%以上，优选鸡矢藤次苷衍生物总含量为50%以上，更优选鸡矢藤次苷衍生物总含量为50-95%。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的C₁-C₆烷基醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇或它们组成的混合溶剂。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于用于精制、纯化的色谱方法为大孔吸附树脂色谱、正相硅胶、反相硅胶色谱，或者它们的组合，或者将浸膏混合于硅胶或硅藻土中，晾干后用有机溶剂或水回流洗脱；如果需要，还可将得到的产物用凝胶色谱法进一步纯化。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于洗脱所用的溶剂为水，C₁-C₆烷基醇，如：甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇等，卤代烃，如：二氯甲烷、氯仿（三氯甲烷）等，醚类溶剂，如：乙醚、甲基叔丁醚等，酮类溶剂，如：丙酮、2-丁酮等，酯类溶剂，如：乙酸乙酯、甲酸乙酯等，以及由上述溶剂组成的混合溶剂。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于洗脱所用的溶剂优选氯仿（三氯甲烷）、乙酸乙酯、乙醇、甲醇和水中的一种或数种混合溶剂；特别是，所述精制方法中，当用苯乙烯型大孔吸附树脂柱精制时，洗脱溶剂优选为水和10-50%的乙醇或甲醇水溶液；当用反相硅胶色谱精制时，洗脱溶剂优选为水和10-50%的乙醇或甲醇水溶液；当用正相硅胶色谱精制时，洗脱溶剂为三氯甲烷或乙酸乙酯和90-100%乙醇水溶液或甲醇组成的混合溶剂，它们的比例为10:1-1:1。

9.一种益智、增强记忆或防治老年性痴呆等疾病的药物组合物，其中含有富含鸡矢藤次苷衍生物的白花蛇舌草提取物，以及药学上可接受的载体，所述组合物优选被制成片剂、注射剂、胶囊、软胶囊、口服液或滴丸等药物制剂，优选白花蛇舌草提取物中鸡矢藤次苷衍生物总含量为25%以上，优选鸡矢藤次苷衍生物总含量为50%以上，更优选鸡矢藤次苷衍生物总含量为50-95%；

其中所述鸡矢藤次苷衍生物结构通式如下：

 

其中，R₁选自氢、乙酰基等；R₂选自氢、C₁-C₆低级烷基（优选甲基，乙基，丙基，乙丙基，丁基，异丁基），C₂-C₆低级链烯基，C₁-C₆烷基苯基（优选(E)-6-O-香豆酰基）等；R₁选自氢、C₁-C₆低级烷基或C₂-C₆低级链烯基。