CN105085534B - 一种生物碱化合物及其提取分离方法 - Google Patents

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Abstract

一种新骨架生物碱化合物，分子式为C18H26N2O，命名为Oleracimine，化学结构式如式（Ⅰ）所示。本发明还提供一种新骨架生物碱化合物的提取分离方法，依次采用水煎煮提取、大孔吸附树脂、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、ODS中压柱、及Sephadex LH‑20，简单、快速的提取分离出骨架独特的新生物碱化合物，该化合物具有镇痛的作用，可用于制备治疗疼痛的药物。式（Ⅰ）如下。

Description

一种生物碱化合物及其提取分离方法
技术领域
本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及一种马齿苋药材中的新生物碱化合物及其提取分离方法。
背景技术
马齿苋(Portulaca oleracea L.)为马齿苋科植物，用于热毒血痢，痈肿疔疮，湿疹，丹毒，蛇虫咬伤，便血，痔血，崩漏下血等。2010版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒，凉血止血，止痢等功效；现代药理学研究表明，马齿苋具有抗炎止痛、抗菌抗病毒、降血压、血脂、抗氧化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、调节免疫功能等作用。
马齿苋的药理作用与其主要化学成分包括黄酮类、香豆素、萜类、甾类、生物碱、氨基酸、各种色素类和矿物质类等有很大关系。其中，生物碱是马齿苋中一类重要的化学成分，其结构类型众多。如马齿苋中含有去甲肾上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二环己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺；还有环二肽生物碱和酰胺类生物碱：马齿苋酰胺A、B、C、D、E、F、G、H(Oleracein A-H)等。但是对本申请中马齿苋的新化合物的分离和药理活性研究未见报道，目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，并且是药理活性比较弱，因此，对马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种简便、快速、纯度高的新生物碱化合物及其提取分离方法。
为实现本发明的上述目的，本发明提供一种新生物碱化合物，分子式为C18H26N2O，命名为Oleracimine，化学结构式如下。
本发明还提供一种新生物碱化合物的提取分离方法，具体步骤为。
步骤1：取马齿苋干燥药材，采用水煎煮提取，水提液过滤，合并滤液直接加热浓缩，得药液备用。
步骤2：将步骤1中所得药液直接经预处理过的大孔吸附树脂吸附除杂，分别以水和乙醇梯度洗脱，对乙醇洗脱液进行减压浓缩，得到浓缩液备用。
步骤3：将步骤2中浓缩液用乙酸乙酯反复多次萃取，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。
步骤4：将步骤3中乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析分离，依次用石油醚-丙酮梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的部分洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用。
步骤5：将步骤4中所得物再经ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料)层析分离，用甲醇-水等度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并部分洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物备用。
步骤6：将步骤5中所得浓缩物经Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶)，以甲醇-水等度洗脱得到新生物碱化合物。
所述大孔吸附树脂的预处理过程为乙醇浸泡过24小时，上柱，用乙醇洗至滴入水中无混浊，再用水洗至无醇味。
与现有技术相比本发明的有益效果。
本发明提供一种新生物碱化合物及其提取分离方法，依次采用水煎煮提取、大孔吸附树脂、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、ODS中压柱、及Sephadex LH-20，简便、快速的提取分离出独特的新生物碱化合物，该化合物具有镇痛作用，可用于制备治疗疼痛的药物。
附图说明
图1为本发明新生物碱化合物的紫外光谱图。
图2为本发明新生物碱化合物的红外光谱图。
图3为本发明新生物碱化合物的高分辨质谱图。
图4为本发明新生物碱化合物的1H-NMR光谱图。
图5为本发明新生物碱化合物的13C-NMR光谱图。
图6为本发明新生物碱化合物的核磁共振碳谱(DEPT)光谱图。
图7为本发明新生物碱化合物的核磁共振1H-1HCOSY光谱图。
图8为本发明新生物碱化合物的核磁共振HMBC光谱图。
图9为本发明新生物碱化合物的核磁共振HSQC光谱图。
图10为本发明新生物碱化合物的核磁共振NOESY光谱图。
具体实施方式
本发明提供一种新生物碱化合物，分子式为C18H26N2O。化学结构式如下。
所述新生物碱化合物根据结构命名为Oleracimine，表1为该新生物碱化合物的核磁数据：1H-NMR与13C-NMR在CDCl3中。其中，“-”表示＝NH与上面C169.4相连。
表1：新生物碱化合物的核磁数据。
序号 δC 类型 δH(J in Hz)
1 N
2 65.7 C -
3 206.2 C -
4 121.3 C -
4a 143.5 C -
4b 110.7 C
5 141.0 C
6 NH 4.07(1H,brs)-
7 50.6 C -
8 46.8 CH2 Ha:1.47(1H,d,13.2)
Hb:2.02(1H,d,13.2)
8a 38.9 C -
9 52.3 CH2 Ha:2.28(1H,d,15.3)
Hb:2.56(1H,d,15.3)
9a 169.4 C
10 29.1 CH3 1.30(3H,s)
11 27.4 CH3 1.45(3H,s)
12 14.4 CH3 1.88(3H,s)
13 21.2 CH3 1.82(3H,s)
14 28.6 CH3 1.34(3H,s)
15 32.5 CH3 1.29(3H,s)
16 28.8 CH3 1.16(3H,s)-
本发明还提供上述新生物碱化合物的提取分离方法，具体步骤为。
步骤1：称取马齿苋干燥药材50kg，采用水煎煮提取，水用量为药材的8～16倍，煎煮提取两次，每次煎煮2小时，水提液过滤，合并滤液直接加热浓缩，得药液备用。
步骤2：将步骤1中所得药液直接经预处理过的AB-8或D101大孔吸附树脂吸附除杂，分别以水和50％乙醇梯度洗脱，水洗脱除杂用量为2～3个柱体积，50％乙醇洗脱用量为冲至颜色变浅为止，对50％乙醇洗脱液进行减压浓缩，得到浓缩液备用。所述大孔吸附树脂的预处理过程为乙醇浸泡过24小时，上柱，用乙醇洗至滴入水中无混浊，再用水洗至无醇味。
步骤3：将步骤2中浓缩液用乙酸乙酯反复萃取3次，乙酸乙酯与浓缩液的比例为1:1(v:v)，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。
步骤4：将步骤3中乙酸乙酯萃取物干法上样，经硅胶柱层析分离，其中硅胶以200～400目，依次用石油醚-丙酮(1:1、1:2、1:3、1:5，v:v)梯度洗脱，每个比例洗脱得40个部位(即每个比例洗脱得40个瓶，每瓶200mL)，共得到160个部位(即共得到160个瓶)，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的90～130洗脱部位(即合并显色的90～130瓶，弃去1～89瓶与131～160瓶)，将合并后的90～130部位经40℃以下减压浓缩至干，备用。
步骤5：将步骤4中所得物再经ODS中压柱层析分离，其中填料粒度为20～40μm，用甲醇-水(50/50，v/v)等度洗脱(加压，使流速为1ml/min，温度为室温)，得到10个部位(即等度洗脱得10个瓶，每瓶100mL)，经薄层色谱进行检测，显色，合并6～7个部位，50℃以下减压浓缩至干，备用。
步骤6：将步骤5中所得物经Sephadex LH-20，以甲醇-水(70/30，v/v)等度洗脱，得到新生物碱化合物。经超高效液相色谱，归一法测定纯度均为90～99％。
本发明新生物碱化合物的镇痛作用。
1、药品和试剂。
实验所用新生物碱化合物由上述方法制备，纯度为98％，精密称取，用生理盐水稀释至下述各剂量组所需溶液。致痛剂为0.6％乙酸，用生理盐水配制。盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药厂)，用生理盐水稀释至下述剂量溶液。
2、动物。
昆明种雄性小鼠，体重为20±2g，清洁级，由大连医科大学实验动物中心提供。室温20～25℃，自由饮食，实验室适应一周后用于实验。
3、方法。
取健康小鼠，雌雄各半，共50只小鼠，体重20±2g，随机分为给空白对照组、本发明新生物碱化合物高剂量组(2mg/kg)、本发明新生物碱化合物中剂量组(1mg/kg)、本发明新生物碱化合物低剂量组(0.5mg/kg)、阳性药组(5mg/kg)五组，每组10只。
各组小鼠灌胃给予受试药物，每日两次，连续给药3天。空白对照组给予等体积的生理盐水，阳性药组给予盐酸吗啡注射液。末次给药1小时后，各组小鼠腹腔注射0.6％乙酸(0.1mL/10g体重)，观察30分钟内各组小鼠扭体出现时间、扭体次数、扭体结束时间，与空白对照组比较计算各组镇痛抑制率。按下式计算镇痛抑制率，各组小鼠扭体次数以t检验进行显著性分析，P＜0.05为有显著差异。
抑制率％＝(空白对照组平均扭体数－给药组平均扭体数)/空白对照组平均扭体数×100％。
4、结果。
空白对照组小鼠腹腔注射乙酸后表现为显著的扭体次数多，表现出强烈的疼痛反应；与空白对照组比较，中、高剂量组及阳性药组扭体次数及扭体结束时间均有减少趋势，本发明新生物碱化合物高剂量组、中剂量组、低剂量组及阳性药组潜伏期均有不同程度延长趋势。结果表明本发明新生物碱化合物对乙酸致小鼠扭体反应有一定的镇痛作用。具体实验结果如表2所示，表2为本发明新生物碱化合物对乙酸致扭体反应小鼠的镇痛作用影响。
表2：本发明对乙酸致扭体反应小鼠的镇痛作用影响(均数±标准差，n＝10)。
组别 扭体次数 镇痛抑制率(％)
空白对照组 47.9±6.9
高剂量组 17.9±4.4** 62.6％
中剂量组 20.0±7.1** 58.3％
低剂量组 39.7±7.1* 20.9％
阳性药组 0±0*** 100％
注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与空白对照组比较。
综上所述，本发明提供一种新生物碱化合物及其提取分离方法，依次采用水煎煮提取、大孔吸附树脂、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、ODS中压柱、及Sephadex LH-20，成功的提取分离出新生物碱化合物，该化合物由于其独特的化学结构，并从常用中药马齿苋中提取出来，实验结果表明其具有抑制乙酸致小鼠扭体反应的镇痛作用，因此可以作为天然产物开发中药的一类新药，具有广阔的前景。

Claims (6)

1.一种生物碱化合物，其特征在于，化学结构式如下：
2.如权利要求1所述的生物碱化合物的提取分离方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1、取马齿苋干燥药材，采用水煎煮提取，水提液过滤，合并滤液直接加热浓缩，得药液备用；
步骤2、将步骤1中所得药液直接经预处理过的大孔吸附树脂吸附除杂，依次以水和50％乙醇梯度洗脱，对乙醇洗脱液进行减压浓缩，得到浓缩液备用；
步骤3、将步骤2中浓缩液用乙酸乙酯反复萃取，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物；
步骤4、将步骤3中乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析分离，用石油醚-丙酮梯度洗脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的部分洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用；
步骤5、将步骤4中所得物再经ODS柱层析分离，用甲醇-水等度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并部分洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物备用；
步骤6、将步骤5中所得浓缩物经Sephadex LH-20，以甲醇-水等度洗脱得到所述生物碱化合物。
3.如权利要求2所述的生物碱化合物的提取分离方法，其特征在于，所述步骤1中水煎煮提取两次，每次煎煮2小时。
4.如权利要求2所述的生物碱化合物的提取分离方法，其特征在于，所述步骤2中大孔吸附树脂的预处理过程为乙醇浸泡过24小时，上柱，用乙醇洗至滴入水中无混浊，再用水洗至无醇味。
5.如权利要求2所述的生物碱化合物的提取分离方法，其特征在于，所述步骤3中浓缩液用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯与浓缩液的体积比为1:1。
6.如权利要求1所述的生物碱化合物用于制备治疗疼痛的药物的用途。
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