一种番泻叶提取物及其制备方法
(一)技术领域:
本发明涉及一种中草药提取物及其制备方法,特别是一种番泻叶提取物及其制备方法。
(二)背景技术:
番泻叶为豆科植物狭叶番泻(Cassia angustifolia Vahl)或尖叶番泻(Cassia acutifolia Delile)的干燥小叶。中医认为,番泻叶甘、苦、寒,归大肠经。具有泻热导泻,通便利水之功效,临床用于热结积滞、便秘腹痛,水肿涨满等症已有千余年的历史,已成为全世界范围内应用最广的导泻剂。根据对德国使用的98种导泻剂的统计分析表明,含番泻叶的制剂约占40%。番泻叶制剂的销售总额远远超出了其它泻剂,显示了良好的市场发展前景。
1941年,番泻叶的主要有效成分番泻苷A,B被Stoll及其工作组分离鉴定出来。1965年,Lemlin及Schmid等对番泻叶中的新成分番泻苷C,D分别进行了分离与结构测定。此后,人们对番泻中蒽醌类物质的研究不断深入,陆续分离鉴定出许多新的化合物。
随着番泻叶制剂的大量使用,该制剂引起的不良反应也日益受到关注。1996年6月德国药品管理机构-联邦药品和医疗用品研究所(BfArM)宣布限制含蒽类化合物泻药的应用。限制使用的原因,是因为BfArM认为,药品中的蒽类化合物的性质和含量随药材种类、制造工艺不同而异。其蒽类化合物中的配基可能具有遗传毒性或引起细胞转化作用。如已发现,芦荟大黄素在多种细胞株的AMES试验中有遗传毒性作用,在V79细胞体外试验中有致突变作用,像大黄素一样,可使C3H/M2成纤维细胞转化为恶性表型。大黄酚在多种细胞株有遗传毒性作用。大黄素和2-羟大黄素在多种菌株有遗传毒性作用。
药理实验表明,番泻叶导泻作用的有效成分是二蒽酮类衍生物,其主要成分是番泻苷A、B、C、D。药理研究发现,小鼠静注40mg/kg番泻无泻下作用,而口服则有100%效果。将番泻叶的各种分解产物直接注入盲肠时,大黄酸蒽酮泻下活性做强,并且与番泻叶的作用部位一致。进一步的药理实验表明,番泻苷A、B在消化道多种细菌作用下,通过不同的代谢途径,降解为大黄酸蒽酮,产生缓泻作用。番泻苷C是芦荟大黄素-大黄酸杂二蒽酮苷,番泻苷C经口服给药后,在肠内细菌的作用下,最后降解为芦荟大黄素蒽酮和大黄酸蒽酮而发挥作用。可以判断,芦荟大黄素、番泻苷C降解得到的芦荟大黄素蒽酮有可能是导致番泻叶制剂产生不良反应的原因之一。因此,在制备番泻苷(A+B)提取物的同时,控制芦荟大黄素、番泻苷C和其他衍生物的含量对无疑对提高番泻苷制剂的安全性具有十分重要的意义。
目前,番泻提取物的制备方法多为水煎煮或醇回流提取后浓缩干燥所得,由于没有进一步精制,因此番泻苷含量很低。中国专利CN 1810265A公开了一种用大孔树脂柱制备番泻苷提取物的方法,但是该方法在对番泻叶中番泻苷成分富集的同时没有对芦荟大黄素、番泻苷C的含量进行控制。中国专利CN 1037684C公开了一种选择性制备番泻苷A、B和A1的方法,但是该方法步骤多、操作复杂、对设备要求高、需要使用大量有机溶剂。
(三)发明内容:
本发明的目的是提供一种番泻叶提取物及其制备方法,该提取物的活性成分番泻苷A、B的重量百分含量以干品计≥60%,且芦荟大黄素、番泻苷C的含量小于100PPM;其制剂的制备方法操作简便,对设备要求不高,适宜大规模工业化应用。
本发明的技术方案是:一种番泻叶提取物,该提取物中番泻叶总苷的重量百分比含量以番泻苷A、B计≥50%,番泻苷A、B的重量百分含量以干品计≥60%,芦荟大黄素、番泻苷C的含量小于100PPM。
一种上述番泻叶提取物的制备方法,包括以下步骤:
1)提取:以番泻叶为原料,用水、低级醇或含水低级醇提取;
2)过滤:提取后蒸去低级醇;
3)除杂:水液经树脂吸附并用水或含水低级醇淋洗除去杂质;
4)洗脱:用含水低级醇洗脱;
5)浓缩:将所得洗脱液浓缩,蒸去低级醇;
6)调pH值:将所得浓缩液用无机酸调节至酸性,静置,过滤,去滤液;
7)干燥:将所得产物干燥,既得本发明提取物。
上述步骤(1)中提取用含水低级醇的碳数为C1-C3,包括水、乙醇、甲醇或丙酮,浓度为X,0≤X≤70%,加热温度为50-100℃。
上述步骤(1)中提取用含水低级醇的浓度为X,0≤X≤40%。
上述步骤(3)中树脂包括以苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯中任意一种或几种为骨架材料的极性或非极性树脂。例如D101、D201、AB-8、HP-20、XAD-4和XAD-16等。
上述步骤(3)中树脂为苯乙烯型大孔吸附树脂。
上述步骤(3)中除杂用的含水低级醇包括水、乙醇、甲醇或丙酮,浓度为X,0≤X≤5%。
上述步骤(3)中除杂用含水低级醇浓度为X,0≤X≤2%。
上述步骤(4)中洗脱用含水低级醇包括甲醇、乙醇或丙酮;浓度为X,10≤X≤40%。
上述步骤(4)中洗脱用含水低级醇浓度为X,优选15≤X≤20%。
上述步骤(6)中的调节PH值是pH值1-4。
上述步骤(6)中的调节PH值是pH值2-3。
上述番泻叶提取物作为主要活性成分,加入药剂学接受的辅料,制成药剂学可接受的剂型。
上述药剂学接受的剂型为口服剂或注射剂,包括片剂、丸剂、胶囊、滴丸、水针、粉针或输液。
利用本发明得到的番泻叶提取物制备所需药物的各种剂型时,可以按照药剂学领域的常规生产方法制备。如将该提取物与一种或多种载体混合,然后制成相应的剂型。
上述番泻叶提取物用于制备预防和治疗便秘的药剂。
有益效果分析:除杂用的含水低级醇包括水、乙醇、甲醇或丙酮,浓度为X,0≤X≤5%,实验表明,在该洗脱浓度下,杂质能够得到去除而使番泻苷得到富集;通过用大孔树脂和调节PH值沉淀的方法除杂和精制,与现有技术相比,不仅克服了单纯提取干燥获得提取物含量低的问题,也解决了,单纯使用大孔树脂法获得的提取物中含有的大黄酸等杂质引起的安全性问题。且所得最终产物番泻苷(A+B)含量高,杂质少。所得提取物中番泻苷A、B的含量达到60%以上,通过对该提取物按常规结晶方法精制,其番泻苷含量可以达到90%以上。因此所得番泻苷具有较高而可靠的生理活性。所得番泻苷提取物为浅黄至黄色粉末,外观优良,质量稳定、可靠。可将其用于制备预防和治疗便秘的药剂。且上述方法制备得到番泻叶提取物,工艺简单,不需特殊设备,安全,易于操作,成本低廉。
本发明的优越性:1、该方法制备的提取物的活性成分番泻苷A、B的重量百分含量以干品计≥60%,含量高,性能稳定,且芦荟大黄素、番泻苷C的含量小于100PPM;2、该方法简便、环保、工艺过程简单,不需特殊设备,安全,易于操作和进行质量控制,成本低廉,适合大规模工业化生产。
(四)附图说明:
图1为本发明所涉一种番泻叶提取物及其制备方法中实施例5用HPLC法测定的番泻苷A、B,芦荟大黄素和番泻苷C的色谱峰图谱。
图2为本发明所涉一种番泻叶提取物及其制备方法中实施例6用HPLC法测定的番泻苷A、B,芦荟大黄素和番泻苷C的色谱峰图谱。
(五)具体实施方式:
实施例1
150公斤番泻叶药材(印度产),分次以10倍量、8倍量、5倍量水50℃水每次浸泡1小时,合并,直接吸附于D101树脂,以水洗去杂质,再以40%乙醇洗脱,浓缩洗脱液,加入10%HCL调节pH值至4,静置12h,过滤,减压干燥,得番泻叶提取物1200g,HPLC法测定番泻苷含量以番泻苷A、B计为65%。
取该提取物300g,加淀粉400g,微晶纤维素100g,以50%乙醇制粒,压片,得片剂,每片为80mg。
实施例2
15公斤番泻叶药材(印度产),装入回流提取罐,以分别以150L、100L30%乙醇回流提取2小时,合并,浓缩蒸去乙醇,水残液吸附于HP-20树脂,以2%乙醇溶液洗去杂质,再以30%乙醇洗脱,浓缩洗脱液,加入15%HCL调节pH值至2,静置24h,过滤,减压干燥,得到番泻叶提取物145g,HPLC法测定番泻苷含量以番泻苷A、B计为75%。
实施例3
80公斤番泻叶药材(印度产),装入回流提取罐,以分别以800L、650L、400L60%甲醇回流提取2小时,合并,浓缩蒸去乙醇,水残液吸附于AB-8树脂,以5%乙醇溶液洗去杂质,再以10%乙醇洗脱,浓缩洗脱液,加入5%硫酸调节pH值至3,静置24h,过滤,减压干燥,得到番泻叶提取物76g,HPLC法测定番泻苷含量以番泻苷A、B计为67%。
实施例4
35公斤番泻叶药材(印度产),装入回流提取罐,以分别以350L、300L、180L70%乙醇回流提取2小时,合并,浓缩蒸去乙醇,水残液吸附于D201树脂,以3%乙醇溶液洗去杂质,再以30%乙醇洗脱,浓缩洗脱液,加入15%HCL调节pH值至1,静置12h,过滤,减压干燥,得到番泻叶提取物335g,HPLC法测定番泻苷含量以番泻苷A、B计为82%。
将所得提取物用丙酮-水重结晶,得到50g含量为95%的番泻苷(以番泻苷A、B计)。
实施例5
取实施例4所得到的番泻叶提取物20mg,用水定容至10ml容量瓶。用HPLC法测定,番泻苷A、B含量为82%。取相应芦荟大黄素、番泻苷C对照品2mg,用水定容于5ml容量瓶。用对照品测定该提取物中芦荟大黄素、番泻苷C的含量,未检出相应的色谱峰,见附图1。
实施例6
取实施例4重结晶后的番泻苷20mg,用水定容至10ml容量瓶。用HPLC法测定,番泻苷A、B含量为98%。取相应芦荟大黄素、番泻苷C对照品2mg,用水定容于5ml容量瓶。用对照品测定该提取物中芦荟大黄素、番泻苷C的含量,未检出相应的色谱峰,见附图2。
实施例7 番泻苷提取物对正常小鼠小肠推进功能的影响
取ICR品系小鼠50只小鼠,随机分成5组:空白对照组,吗丁啉组,样品溶液低、中、高剂量组,每组10只,雌雄各半。分别灌胃给予吗丁啉4mg/kg,取实施例1样品,配成50、100、200mg/kg浓度,给药体积均为0.2ml/10g,空白对照组给同体积的纯净水。每天1次,连续7天。末次给药前禁食18小时,正常饮水。末次给药后60分钟,各组动物均灌服5%碳末混悬液(用5%碳末和10%的阿拉伯胶制成混悬液),体积为0.3ml/只。灌服碳末混悬液10分钟后,脱颈椎处死小鼠。打开腹腔,将消化道(自幽门至回盲部)完整的取出平铺于玻璃板上,测量其全长及碳末前锋至幽门的距离,按下式计算碳末推进百分比,结果用SPSS11.0统计软件进行方差分析。
结果:经方差分析知,吗丁啉组、样品中、高剂量(100、200mg/kg)组与空白对照组相比,均具有明显的统计学意义(P<0.01);样品低剂量组与空白组比较,均具有统计学意义(P<0.05。实验结果表明,样品有促进正常小鼠小肠推进功能的作用。结果见表1。
表1样品对正常小鼠小肠推进功能的影响(x±s)
与空白组比较,**P<0.01,*P<0.05
实施例8番泻叶提取物对复方地芬诺酯致小鼠便秘模型的影响
取ICR品系小鼠60只小鼠,随机分成6组:空白对照组,模型对照组,通便灵组,样品溶液低、中、高剂量组,每组10只,雌雄各半。分别灌胃给予通便灵1500mg/kg,取实施例1获得的番泻叶提取物配成样品50、100、200mg/kg溶液,给药体积均为0.2ml/10g,空白对照组和模型对照组给同体积的纯净水。每天1次,连续7天。末次给药前禁食18小时,正常饮水。除空白组外,均灌胃给予剂量为10mg/kg的复方地芬诺酯0.2ml/10g造模,空白对照组给予同体积的纯净水。造模后30分钟,各组动物如前给药,同时每只小鼠均灌服0.4ml的5%碳末混悬液(用5%碳末和10%的阿拉伯胶制成混悬液),开始计时。每只小鼠单独饲养,正常供给饲料和饮水,观察并记录每只动物首次排出黑便的时间(即为首便时间)及6小时内排便粒数。结果用SPSS11.0统计软件进行方差分析。
表2样品对复方地芬诺酯致小鼠便秘模型的影响(x±s)
模型组与空白组比较,##P<0.01;给药组与模型组比较,料P<0.01,*P<0.05
结果:经方差分析可见,模型组与空白组相比,首便时间和6小时内排便粒数,均具有明显的统计学意义(P<0.01),说明口服复方地芬诺酯制造小鼠便秘模型成功。各给药组小鼠均有不同程度的软便排出。首便时间和排便粒数,通便灵组、样品中、高剂量组与模型组比较,均具有明显的统计学意义(P<0.01),样品低剂量组与模型组比较具有统计学意义(P<0.05)。实验结果表明,样品有促进便秘小鼠缩短排便时间和增加排便粒数的作用。
实施例9样品的急性毒性试验结果
方法:取ICR品系小鼠40只,雌雄各半,随机分成两组,即空白对照组和给药组,每组20只,给药组每只小鼠以40ml/kg的体积1次性灌胃给予实施例1所得样品配成的样品溶液(样品溶度为0.75g/ml),相当于给药剂量为30g/kg。空白对照组给同体积的纯净水。给药后即刻观察动物的外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等情况,与空白对照组动物比较。连续观察14天。
结果:给药组小鼠给药后随即出现自主活动减少,约20分钟后上述症状消失,继续观察,2小时后给药组小鼠陆续出现软便,粪便较稀,甚至出现水样便,第2天,体重下降。给药后第5天起,小鼠体重恢复正常,连续观察14天,小鼠全部健康存活,体重增加正常,均未出现毒性反应及死亡,与空白对照组比较未见明显差异,所有动物解剖肉眼观察未见任何明显的脏器改变。结果证实,在本实验条件下,小鼠以40ml/kg的体积灌胃给药1次,未见明显毒性反应,该样品的毒性大于30g/kg,约相当于最小有效剂量的600倍。
结论:用样品溶液灌胃后,正常小鼠小肠内碳末的推进速度均有所加快,说明本品可能是通过促进肠道的蠕动而使肠道内容物在肠腔内滞留时间缩短,减少水分的吸收,从而加速排便的作用。复方地芬诺酯所致的便秘小鼠,用样品溶液灌胃后,其碳末排出速度均有不同程度的加快,首便时间明显缩短,排便粒数也有不同程度的增多,从而提高了排便频率,且所排出粪便较软,说明样品具有软化粪便、促进排便的作用。该样品的毒性大于30g/kg,约相当于最小有效剂量的600倍。