CN101318937B - 一种生物碱类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从猫豆中提取、制备的生物碱类化合物和有效部位，以猫豆为原料，通过粉碎，溶剂提取、树脂或硅胶柱层析分离纯化等方法，获得有效部位并从中分离得到该化合物：1，2-二氢-3-胍基-6-羟甲基-1-甲基吡嗪-2-酮，命名为猫豆胍；药效学实验证明，该化合物具有镇静催眠作用，可作为医药化工原料使用和制成具镇静催眠作用药物制剂。

Description

一种生物碱类化合物及其制备方法和用途

技术领域：

本发明属于天然药物化学领域和医药领域，涉及一种从猫豆中提取、制备的生物碱类化合物及其有效部位和在镇静催眠作用方面的用途。

背景技术：

猫豆是豆科藜豆属植物龙爪藜豆Stizolobium cochinchinensis(Lour)Tang et Wang的种子，是广西特色药食两用资源和经济作物。猫豆是提取左旋多巴最主要的原料药材，从猫豆提取左旋多巴已成为目前全世界左旋多巴原料药的主要来源。申请者完成的高纯度左旋多巴高效提取关键技术研究已经实施成果转化，使广西成为左旋多巴的国际生产基地。猫豆其它化学成分的研究对猫豆产业链的延伸及其综合利用率的提高有重要意义。

近年来，人们对猫豆的研究主要集中在左旋多巴提取分离工艺技术方面。猫豆中的左旋多巴已经得到较深入的研究和较好的利用，但对猫豆中其它活性物质的研究不够深入，有关其非左旋多巴活性成分的基础研究报道也较少，人们对猫豆活性成分的了解和研究尚不透彻。在猫豆提取左旋多巴生产企业所在地，农民用猫豆或提取左旋多巴后的猫豆渣来饲养家猪，发现猪食用后安静嗜睡，皮肤好，生长快，肉质好。提示去除左旋多巴后的猫豆及其豆渣中可能含有引起动物镇静嗜睡的成分。有报道称该成分是左旋多巴，也有报道称引起嗜睡的化学成分为猫豆毒苷，但都无确凿的药理学理论依据。为此，研究猫豆中具镇静催眠作用的化学成分，具有重要的理论和现实意义。

失眠是当代社会较常见的疾病，其发病率高，严重影响了人们的生活。目前治疗失眠的药物主要为苯二氮卓类，虽疗效较好，但易产生耐受性，长期使用会产生成瘾性。从中药中寻找副作用小的新型镇静催眠药物并应用于临床将给患者带来福音。

发明内容：

本发明的目的，在于提供一种从猫豆中获得的生物碱类化合物I：1，2-二氢-3-胍基-6-羟甲基-1-甲基吡嗪-2-酮，命名为猫豆胍，及其有效部位，提供其提取、制备方法及其在镇静催眠作用方面的应用，为研制开发镇静催眠新药提供新的天然活性物质。

本发明通过以下技术方案完成：

猫豆中生物碱类化合物I及其有效部位的提取分离和结构鉴定，镇静催眠活性研究及其医药用途。本发明所说的物碱类化合物I及其有效部位，其特征在于该化合物为1，2-二氢-3-胍基-6-羟甲基-1-甲基吡嗪-2-酮，命名为猫豆胍，其结构如式I所示：

式I

1、提取分离和结构鉴定

本发明以豆科藜豆属植物龙爪藜豆Stizolobium cochinchinensis(Lour)Tang et Wang的种子——猫豆为原料，经自然干燥后粉碎或破碎，用水、浓度为0.01-2mol/L的硫酸、盐酸或醋酸水溶液，或浓度为10-80％的酸性甲醇、酸性乙醇溶液，采用浸渍法，渗漉法提取，提取液直接或经浓缩后，过离子交换树脂柱或硅胶柱吸附，洗脱吸附物，收集有效部位流分，减压浓缩或直接浓缩，干燥，得到精制的提取物和有效部位。精制的提取物或有效部位溶解后，采用柱层析法，有机溶剂萃取法或溶剂沉淀法进一步分离纯化，最终获得化合物I。

经鉴别，化合物I为白色粉末，改良碘化铋钾试剂实验，碘-碘化钾试剂实验和硅钨酸试剂实验均呈阳性反应，证明其为生物碱类化合物。

对化合物I进行了结构研究。质谱EI-MS给出分子量为197，见附图1；高分辨质谱HR-ESI给出的分子量为198.0881，分子式为C₇H₁₁N₅O₂，见附图2。

¹H-NMR谱给出的化学位移：高场3.34302-3.42808ppm(3H，t)为三重峰，是的3个氢为甲基氢信号，被水峰的氢谱掩盖，因其裂分为三重峰，推测其与2个相邻氢或与2个远程氢偶合，即可能与亚甲基直接或间接相连；4.27680ppm(2H，d)为亚甲基的2个氢信号，与1个相邻氢偶合而裂分为二重峰；6.69883-6.77055ppm(1H，d)为环上氢信号，因与一个氢偶合而裂分为二重峰；7.28729ppm(4H，s)为4个活泼氢信号，因发生质子交换且交换速度慢而呈现平缓的钝峰；5.30423ppm(1H，s)为羟基活泼氢，因发生质子交换且交换速度慢而呈现平缓的钝峰。见附图3。

碳谱和dept谱结果表明，δc 30.347ppm碳谱峰为伯碳，为甲基碳信号；δc 58.317ppm碳谱峰为仲碳，应归属于亚甲基碳信号；δc 118.916ppm碳谱峰为次甲基碳信号，即环上的CH碳；δc 128.905ppm碳谱峰为季碳，应归属于芳杂环上不连接羰基而连接N原子的碳；δc 155.196，δc 156.476ppm碳谱峰为季碳，应归属于环上羰基碳和连接两个氮原子的季碳；δc 159.742ppm的碳谱峰信号处在最低场，可能是与三个N原子相连接的季碳。碳谱显示的碳原子数为7，与高分辨质谱给出的可能分子式含7个碳原子一致。见附图4。

核磁共振HSQC谱结果表明，C-1与甲基氢直接相关，说明其连接的是甲基氢；C-2与亚甲基氢直接相关，说明其连接的是亚甲基氢；C-3与次甲基氢直接相关，说明其连接的是次甲基氢。C-4、C-5、C-6和C-7碳信号未检测到直接相关点，说明这些碳未与氢直接相连接，即为季碳。见附图5。

核磁共振HSBC谱结果表明，C-1、C-2、C-4、C-6分别与C-3上的次甲基氢有相关点，说明这几个碳原子都与C-3上的氢产生远程耦合；C-3、C-4分别与C-2上的亚甲基氢有相关点，说明这两个碳原子都与C-2上的氢产生远程耦合；C-4和C-5分别与C-1上的甲基氢有相关点，说明这两个碳原子都与C-1上的氢产生远程耦合；C-7未检测到相关点，可能与其连接的氮原子太多有关。见附图6。

IR光谱分析结果也表明，化合物结构中含有仲胺基、苯环或芳杂环、羟基、羰基、甲基和亚甲基等基团。质谱中的碎片离子峰也支持这些分析结果。附图7。

经综合分析，确定化合物I的化学结构，化学名为：1，2-二氢-3-胍基-6-羟甲基-1-甲基吡嗪-2-酮，命名为猫豆胍，具体数据见表1～4、裂解图、附图1～7，结构式如下。

式I

表1质谱测定数据

表2核磁共振¹H谱数据(600MHz、DMSO)

表3核磁共振¹³C谱数据(600MHz、DMSO)

表4红外光谱数据

质谱裂解图：

2、镇静催眠活性研究

(1)实验方法

①对小鼠自主活动的影响

取小鼠50只，雌雄各半。随机分成5组，即空白对照组，安定组，LDA大、中、小剂量，每组10只。给药前把各小鼠投入动物活动箱中适应5分钟，记录2分钟的动物走动路程和穿梭次数。后LDA大、中、小剂量组分别给药625、500、375mg/kg，安定组给予安定1mg/kg，空白对照组给予同体积生理盐水10ml/kg。给药60min后，同法测定小鼠走动路程和穿梭次数。结果见表5。

②对小鼠戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响

分组同自主活动法。给药30min后，腹腔注射30mg/kg的戊巴比妥钠，以给药后15min内小鼠翻正反射消失达1min以上为入睡指标，记录入睡小鼠的只数及睡眠时间。结果见表6。

③延长戊巴比妥钠睡眠时间的研究

分组同自主活动法。给药60min后，腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg，以动物注射戊巴比妥钠后15min内翻正反射消失为睡眠潜伏期，以动物翻正反射消失至恢复为睡眠持续时间，观察并记录各组小鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间。结果见表7。

(2)实验结果

表5对小鼠自主活动的影响(x±s，n＝10)

与空白对照组相比：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

表6对小鼠戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响(n＝10)

与空白对照组相比：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

表7延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的作用(x±s，n＝10)

与空白对照组相比：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

(3)实验结论

实验结果表明，猫豆中生物碱类化合物I在一定剂量时具有镇静催眠作用。

3、化合物I的用途

本发明所述猫豆中生物碱类化合物I及其有效部位，作为药物活性成分，可以制成具有镇静催眠作用的药物原料及常规的药用剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液和注射剂。

本发明的优点在于，提供了从猫豆中分离得到的一种生物碱类化合物I及其有效部位。其来源于广西丰富的特色药食两用资源——猫豆，采用的提取分离工艺简单易行，质量可控，药效肯定，对从中药中寻找新的镇静催眠药物有促进作用，对广西猫豆资源的综合利用和猫豆产业的发展壮大具有重要意义。

附图说明：

图1化合物I质谱EI-MS图

图2化合物I高分辨质谱HR-ESI图

图3化合物I ¹H-NMR谱图

图4化合物I ¹³C-NMR谱和DEPT谱图

图5化合物I核磁共振HSQC图

图6化合物I核磁共振HMBC图

图7化合物I IR谱图

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于所列举的实例。

实施例一

猫豆粗粉1公斤，加10倍量0.1mol/L硫酸溶液浸渍15小时，不时振摇，得到提取液，抽滤，滤液减压浓缩，浓缩液过强酸性阳离子交换树脂柱(也可用弱酸性阳离子交换树脂、强碱性或弱碱性阴离子交换树脂)吸附，水洗后用0.1％氨水洗脱，收集含化合物I的洗脱液，减压浓缩，干燥，得到精制的提取物和有效部位。精制的提取物或有效部位溶解，过强酸性阳离子交换树脂层析柱(也可用弱酸性阳离子交换树脂、强碱性或弱碱性阴离子交换树脂)，0.1％氨水洗脱，分离得到化合物I。

实施例二

猫豆粗粉1公斤，加5倍量0.1mol/L盐酸溶液浸渍5小时，再用15倍量的0.1mol/L盐酸溶液渗漉，收集渗漉液，抽滤，减压浓缩，浓缩液过强酸性阳离子交换树脂柱(也可用弱酸性阳离子交换树脂、强碱性或弱碱性阴离子交换树脂)吸附，水洗后用0.1％氢氧化钠洗脱，收集含化合物I的洗脱液，减压浓缩，干燥，得到精制的提取物和有效部位。精制的提取物或有效部位溶解，过硅胶柱层析，甲醇洗脱，分离得到化合物I。

实施例三

猫豆粗粉1公斤，加15倍量酸性乙醇溶液浸渍10小时，不时振摇，得到提取液，抽滤，滤液减压浓缩，干燥，得到粗提物，粗提物过硅胶柱层析，甲醇或乙醇洗脱，收集含化合物I的洗脱液，减压浓缩，干燥，得到精制的提取物和有效部位。精制的提取物或有效部位溶解，过硅胶柱层析，以氯仿-甲醇-水或乙酸乙酯-甲醇-水不同梯度混合溶剂洗脱分离得到化合物I。

实施例四

猫豆粗粉1公斤，加20倍量水浸渍24小时，不时振摇，得到提取液，抽滤，滤液减压浓缩，浓缩液过强酸性阳离子交换树脂柱(也可用弱酸性阳离子交换树脂、强碱性或弱碱性阴离子交换树脂)吸附，水洗后用0.1％氨水洗脱，收集含化合物I的洗脱液，减压浓缩，干燥，得到精制的提取物和有效部位。提取物或有效部位用酸性水溶液溶解，加入有机溶剂或水结晶，反复重结晶3次，得到化合物I。

实施例五

胶囊剂的制备

取提取分离得到的化合物I或其有效部位，加入药用辅料淀粉和糊精适量，混匀，加70％乙醇做润湿剂，制粒，烘干，整粒，加入硬脂酸镁或滑石粉作润滑剂，混匀，装入胶囊，制成每粒含化合物I 150mg的胶囊剂，即得。

实施例六

注射剂的制备

取提取分离得到的化合物I或其有效部位，加入注射用纯净水适量，过滤，灌封，高压灭菌，制成每250ml含化合物300mg的注射液供静脉滴注使用。

Claims (11)

1.一种猫豆的有效部位的制备方法，其特征在于提取用的原料为豆科藜豆属植物龙爪藜豆Stizolobium cochinchinensis(Lour)Tang et Wang的种子——猫豆，用水、稀硫酸、稀盐酸、稀醋酸或两种酸的混合水溶液或酸性甲醇、酸性乙醇，采用浸渍法，渗漉法提取，提取液直接或经浓缩后，过离子交换树脂柱或硅胶柱吸附，洗脱吸附物，收集有效部位流分，减压浓缩或直接浓缩得到精制的猫豆的有效部位；其中，猫豆的有效部位中含有结构如式I所示的猫豆胍

式I。

2.一种如权利要求1所述的制备方法所制备得到的猫豆的有效部位。

3.一种权利要求1中的猫豆胍的制备方法，其特征在于按照如权利要求1所述的制备方法得到精制的猫豆的有效部位后，将该有效部位溶解，采用柱层析法，有机溶剂萃取法或溶剂沉淀法进行分离纯化，得到猫豆胍。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于离子交换树脂包括苯乙烯系或丙烯酸系强酸性、弱酸性阳离子交换树脂，强碱性阴离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂；洗脱溶剂包括稀氨水、氢氧化钠溶液、稀盐酸和乙醇，柱层析载体为离子交换树脂、硅胶、氧化铝的一种；有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、氯仿和乙酸乙酯。

5.权利要求1中的猫豆的有效部位在制备具镇静催眠作用药物组合物及其制剂中的用途，其中所述的药物组合物及其制剂中含有权利要求1中的猫豆胍，以及一种或多种在药学上可接受的药用辅料。

6.权利要求1中的猫豆胍在制备具镇静催眠作用药物组合物及其制剂中的用途，其中所述的药物组合物及其制剂中含有权利要求1中的猫豆胍，以及一种或多种在药学上可接受的药用辅料。

7.如权利要求5或6所述的用途，其特征在于所述制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液和注射剂。

8.权利要求1中的猫豆的有效部位在制备具镇静催眠作用药物中的应用。

9.权利要求1中的猫豆胍在制备具镇静催眠作用药物中的应用。

10.以权利要求1中的猫豆的有效部位为成分之一的复方在制备具镇静催眠作用药物中的应用。

11.以权利要求1中的猫豆胍为成分之一的复方在制备具镇静催眠作用药物中的应用。

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