CN101570485B - 一种长链脂肪酸的糖醇酯及其分离提取方法和在抑制芳香化酶活性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长链脂肪酸的糖醇酯，即如式1所示的化合物亚麻酸山梨醇酯，以及它的制备方法。本发明的化合物未见报道，且其芳香化酶抑制活性比游离的脂肪酸强。本发明还公开了这种长链脂肪酸的糖醇酯或含其的植物提取物在制备抑制芳香化酶活性的制剂中的应用和在制备预防和治疗前列腺增生疾病的药物组合物中的应用。

Description

一种长链脂肪酸的糖醇酯及其分离提取方法和在抑制芳香化酶活性中的应用

技术领域

本发明涉及一种新化合物及其制备方法和应用，具体的涉及一种新的长链脂肪酸的糖醇酯及其分离提取方法和应用。

背景技术

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)是老年男性常见的生理病变，当病变引起排尿梗阻等一系列症状时称为前列腺增生症。国外1075例尸检报告表明：在25～30岁时，10％的男性可在显微镜下见到早期的前列腺增生病变；随着年龄的增长，经组织学诊断的前列腺增生的发生率也相应增加；至51～60岁，其发病率增加为75％；至85岁时，约有90％的男性有组织学上的前列腺增生病变。由上可见，随着我国人口老龄化的加速，由老龄引起的前列腺增生的发病率不断上升，良性前列腺增生症也越来越成为我国亟待解决的重要问题。良性前列腺增生的发病率很高，但其发病机理迄今尚未完全阐明。前列腺增生可能是一组多病因的疾病，其发病机制也是错综复杂的。BPH药物治疗的方向就是针对其各种可能的发病机制和存在因素，根据这些理论和文献报道，我们总结出多个成熟的和新的抗BPH药物的作用靶点，包括α1-肾上腺素受体、5α-还原酶、芳香化酶、磷酸二酯酶-5、糖酵解酶和环氧合酶-2等。

目前，临床上用于治疗前列腺增生的药物主要有：α1-肾上腺受体拮抗剂、5α-还原酶抑制剂、天然产物制剂等。由于前列腺增生发病原因错综复杂而且需要长期服药，只针对某一特定靶点的α1-受体阻断剂、5α-还原酶抑制剂等合成药物在长期服用中出现了一定的副作用，如低血压，阳痿、性功能障碍、头痛等，且治疗效果不够理想，从而限制这些药物在前列腺增生治疗中的应用。天然产物制剂具有整体性、多靶点和多成分协同作用的特点，特别是花粉制剂不影响体内激素分泌平衡，毒副作用小，适用于长期服用的特点，越来越受到患者的欢迎。

动物实验和临床研究均表明，雌激素在前列腺增生的发生、发展过程中均扮演着非常重要的角色。随着年龄的增加，男性体内的雌激素较稳定或稍有增加，与青年男性相比，老年男性血浆及前列腺组织内的雌/雄激素比例升高。而这种性激素平衡的改变可能诱导前列腺基质活性从而引BPH。有研究显示，前列腺基质增生中结合状态的雌性激素能够激活细胞合成和分泌细胞外基质蛋白，在细胞周围形成一层致密的纤维结缔组织，进而参与前列腺增生的发生发展。在最初的间质增生中，雌性激素的作用是主要的；在前列腺增生的过程中，雌雄性激素具有协同作用，因而有人称雌性激素是前列腺基质生长的刺激剂。鉴于雌激素在BPH中的重要作用，可使用抑制雌激素合成的方法，如使用芳香化酶抑制剂治疗前列腺增生。男性体内的雌激素主要是由雄激素前体转化而来，芳香化酶P450是这一转变过程的关键酶和限速酶。它是以NADPH为辅酶、细胞色素P450为介质的混合功能氧化酶。理论上，芳香化酶抑制剂具有治疗良性前列腺增生等一切激素依赖性疾病的潜在效果。并且目前已有一些使用芳香化酶抑制剂治疗BPH的实验报道：一种较弱的芳香化酶抑制剂睾内酯的治疗结果显示，50％的BPH患者症状改善，可自行排尿、前列腺体积减小30％，残余尿量明显减少。Michaud报道用一种独特的新型芳香化酶抑制剂TZA-2237进行动物(犬)实验，发现TZA-2237能够有效抑制雄激素和雌激素，可导致犬前列腺的基质细胞萎缩。但关于用芳香化酶治疗BPH的临床报道还不多，其疗效也需进一步验证。随着临床对雌激素在BPH中作用的逐渐认识，开发新的芳香酶抑制剂治疗BPH可能是下阶段药物治疗的方向之一。

近年来，人们通过药效筛选，在天然产物中已发现黄酮、香豆素、萜类、脂肪酸和多酚等多类化合物具有芳香化酶抑制活性，并通过结构改造获得了一系列衍生物。文献报道过游离脂肪酸的抑制芳香化酶活性。(J.Nat.Prod.2006，69，700-703；Cancer Res 2006，66(24)：12026-12033)

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了一种长链脂肪酸的糖醇酯及其分离提取方法和应用，本发明的长链脂肪酸的糖醇酯未见报道，且其芳香化酶抑制活性比游离的脂肪酸强。

本发明涉及一种如式1所示的长链脂肪酸的糖醇酯亚麻酸山梨醇酯。

式1

本发明进一步涉及如式1所示的长链脂肪酸的糖醇酯的分离提取方法，其包含下列步骤：

(1)用下述两种方法中的任一种提取有效部位：

①二氧化碳超临界提取然后进行大孔树脂富集；

其中，油菜破壁花粉采用超临界二氧化碳萃取的提取工艺及获得的提取物已在本发明人申请号为CN200710043270.0的专利申请中公开，其说明书全文为本说明书所引用；超临界提取后的有效部位采用大孔树脂富集的工艺已在本发明人申请号CN200710043856.7的专利申请中公开，其说明书全文为本说明书所应用。

其中，所述的超临界二氧化碳萃取的温度优选在35～50℃范围，压力25～40MPa。

为了提高萃取物的收率，所述的超临界二氧化碳萃取中还采用萃取夹带剂。本发明优选甲醇、乙醇等C_1～4的低级醇，所述夹带剂的用量优选为破壁花粉重量的5～10％。

为了更好地提高萃取物的收率，本发明优选二级分离，其中分离釜I的温度为35～45℃、压力8～12MPa，分离釜II的温度为25～35℃、压力4～6Mpa。

在收率相同情况下，随着超临界二氧化碳萃取中CO₂每小时循环用量增大，萃取时间可缩短，反之，超临界二氧化碳萃取中CO₂每小时循环用量越小，萃取时间越长。本发明综合收率、工艺时间、成本等因素，优选采用25～45L/小时循环用量的CO₂萃取1～3小时左右。

本发明所说的油菜破壁花粉是指现有固体的破壁花粉，其可以市售得到，也可以采用现有花粉破壁技术(如可以参考：张星海等.油菜花粉的微生物破壁技术研究，食品科学，2003，24(3)：92～95；以及公开号为CN1452888A的专利申请文件公开的酶发酵破壁方法)自制得到。按常规，将油菜破壁花粉进行超临界二氧化碳萃取之前，尽量将破壁花粉，特别是市售产品去除水分，干燥完全。

根据本发明，油菜破壁花粉采用超临界二氧化碳萃取的萃取物可以是每个分离釜单独收集的产物，也可以是将两个分离釜的产物合并后的混合物；换言之，各个分离釜收集的产物可以分别过柱，也可以合并后过柱。上柱时，通常将萃取物蒸至无醇味，采用类似传统硅胶柱干法拌样的方式进行拌样，即取一部分(一般为装柱量20～60％，v/v)的大孔树脂与萃取物一起搅拌均匀，使其充分吸附，将拌样后的大孔树脂装入大孔树脂的柱顶端。

所述的大孔树脂可以是各种性质的大孔树脂，包括不同极性类型与不同的骨架类型。通过研究分析表明，苯乙烯骨架的非极性大孔树脂如D101型采用70％～80％乙醇洗脱，甲基丙烯酸骨架的大孔树脂如HP2MG采用60％～70％乙醇洗脱，中极性大孔树脂如DM301采用60％～75％乙醇洗脱，极性大孔树脂如DA201型、NKA-II型等，采用50％～70％乙醇洗脱，所得到的化学成分相似，药效结果也类似。综合考虑成本、大孔树脂的再生、循环使用等情况，优选极性大孔树脂作为工业化生产的树脂。

②醇提取：取破壁后油菜花粉，粉碎，加甲醇和/或乙醇的水溶液加热回流或冷浸渗漉，滤过，合并滤液，减压回收溶剂，得流浸膏，将流浸膏溶于水中，依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取，每种溶剂萃取多次，至无色，取乙酸乙酯萃取部分，减压回收溶剂，得有效部位。

其中，所述的甲醇和/或乙醇的水溶液的用量较佳的为为8～10ml/g油菜花粉，优选10ml/g油菜花粉，甲醇或乙醇水溶液的体积浓度较佳的为75～95％；所述的加热回流或冷浸渗漉的次数较佳的为3次～5次；所述的流浸膏的相对密度较佳的为1.15～1.80；。

(2)柱层析：将步骤(1)所得的有效部位在正相硅胶层析柱上用洗脱剂进行梯度洗脱，经正相硅胶薄层层析法检测，收集展开剂为体积比10∶1的氯仿-甲醇时，Rf＝0.4～0.7的洗脱液，减压回收溶剂制得粗产物。

其中，所述的硅胶为100～400目；所述的硅胶的用量较佳的为步骤(1)所得的有效部位质量的8～15倍；所述的硅胶柱的规格较佳的为120cm×6cm、80cm×10cm或60cm×6cm；所述的洗脱剂较佳的为下述混合溶剂中的一种：石油醚-乙酸乙酯、正己烷-乙酸乙酯、环己烷-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、环己烷-丙酮或正己烷-丙酮。石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱的梯度较佳的为10∶1→1∶2，优选10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1→1∶2；所述的正己烷-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱的梯度较佳的为10∶1→1∶2，优选10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1→1∶2；所述的环己烷-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱的梯度较佳的为10∶1→1∶2，优选10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1→1∶2；所述的石油醚-丙酮混合溶剂进行洗脱的梯度较佳的为20∶1→1∶1，优选20∶1→10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1；所述的环己烷-丙酮混合溶剂进行洗脱的梯度较佳的为20∶1→1∶1，优选20∶1→10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1；所述的正己烷-丙酮混合溶剂进行洗脱的梯度较佳的为20∶1→1∶1，优选20∶1→10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1，其中，每个梯度下冲洗的洗脱剂的量均为3～6倍柱体积。上述比均为体积比。

(3)纯化：将步骤(2)所得的粗产物在正相硅胶层析柱上用洗脱剂进行洗脱，经正相硅胶薄层层析法检测，收集展开剂为体积比10∶1的氯仿-甲醇时，Rf＝0.4～0.41的洗脱液，减压回收溶剂，得到如式1所示的化合物；或在十八烷基反相硅胶层析柱上用洗脱剂进行洗脱，经反相硅胶薄层层析法检测，收集展开剂为体积比5∶1的甲醇-水时，Rf＝0.59～0.6的洗脱液，减压回收溶剂，得到如式1所示的化合物。

其中，硅胶层析柱的规格优选为120cm×6cm、80cm×4cm或40cm×3cm；硅胶优选为300～400目，用量优选为步骤(2)所得粗产物质量的10～40倍；所述的十八烷基反相硅胶层析柱的规格优选为120cm×6cm、80cm×4cm或40cm×3cm，反相硅胶用量优选为步骤(2)所得粗产物质量的10～40倍。

其中，所述的硅胶层析柱上所用的洗脱剂优选为氯仿-甲醇(优选体积比10∶1)或氯仿-丙酮(优选体积比5∶1)；所述的十八烷基反相硅胶层析柱上所用的洗脱剂优选为甲醇-水(优选体积比4∶1)、乙腈-水(优选体积比2∶1)或乙醇-水(优选体积比2∶1)中的一种。

本发明还提供了如式1所示的长链脂肪酸的糖醇酯或含其的植物提取物在制备抑制芳香化酶活性的制剂中的应用以及在制备预防和治疗前列腺增生疾病的药物组合物中的应用。本发明的化合物具有较强的芳香化酶抑制活性。

本发明的如式1所示的化合物可与药学上各种常用添加剂(如稀释剂和赋形剂等)制成药物组合物。根据治疗目的，可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等。

为了使片剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋形剂。例如，载体，如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素和硅酸等；粘合剂，如水、乙醇、丙醇、普通糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明教溶液，羧甲基纤维素、紫胶、甲基纤维素和磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干淀粉、藻酸钠、琼脂粉和海带粉，碳酸氢钠、碳酸钙、聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘酯、淀粉和乳糖等；崩解抑制剂，如白糖、甘油三硬脂酸酯、椰子油和氢化油；吸附促进剂，如季胺碱和十二烷基硫酸钠等；润湿剂，如甘油、淀粉等；吸附剂，如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土和胶体硅酸等；以及润滑剂，如纯净的滑石，硬脂酸盐、硼酸粉和聚乙二醇等。如果需要的话，还可以用通常的涂渍材料使片剂作为糖衣片剂、涂明胶膜片剂、肠衣片剂、涂膜片剂、双层膜片剂及多层片剂。

为了使丸剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋性剂，例如，载体，如乳糖，淀粉，椰子油，硬化植物油，高岭土和滑石等；粘合剂，如阿拉伯树胶粉，黄著胶粉，明胶和乙醇等；崩解剂，如琼脂和海带粉等。

为了使栓剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋性剂，例如，聚乙二醇，椰子油，高级醇，高级醇的酯，明胶和半合成的甘油酯等。

为了制备针剂形式的药物组合物，可将溶液和悬浮液消毒，并最好加入适量的氯化钠，葡萄糖或甘油等，制成与血液等渗压的针剂。在制备针剂时，也可使用本领域内任何常用的载体。例如，水，乙醇，丙二醇，乙氧基化的异硬脂醇，聚氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可加入通常的溶解剂、缓冲剂和止痛剂等。

本发明中，所述的药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据病人年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药。例如，片剂、丸剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒剂和胶囊是口服给药；针剂可以单独给药，或者和注射用输送液(如葡萄糖溶液及氨基酸溶液)混合进行静脉注射，如有必要可以单纯用针剂进行肌肉、皮内、皮下或腹内注射；栓剂为给药到直肠。本发明中，可以根据服药方法、病人年龄、性别和其它条件以及症状适当地选择用药剂量。通常的活性成分给药剂量可为：约0.025～0.10mg/Kg体重/天。

本发明进一步涉及如式1所示的长链脂肪酸的糖醇酯或含其的植物提取物在制备抑制芳香化酶活性的制剂、预防或治疗前列腺增生疾病的药物组合物中的应用。

本发明所用的试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一种未见报道的长链脂肪酸的糖醇酯及其制备方法和应用，本发明的化合物的芳香化酶抑制活性比游离的脂肪酸强。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

实施例1亚麻酸山梨醇酯的制备

1)超临界提取：将市售的油菜破壁花粉(安徽省宣城市百康蜂业生产)60℃减压干燥24小时，然后将干燥后的破壁花粉在40℃，萃取釜压力40MPa，分离釜I温度35℃、压力12MPa，分离釜II温度25℃、压力5MPa，以花粉重量8％重的浓度为95v/v％乙醇为夹带剂进行超临界二氧化碳(45L/小时的循环用量)萃取2.0小时，得到超临界萃取部分，收集超临界萃取物。

2)大孔树脂富集：将步骤1获得的萃取物蒸至无醇味，采用类似传统硅胶柱干法拌样的方式进行拌样，即取装柱量20～60％(v/v)的大孔树脂与萃取物一起搅拌均匀，使其充分吸附，将拌样后的大孔树脂装入大孔树脂柱顶端，其中大孔树脂选用极性大孔树脂DA201(生产厂商：天津市海光化工有限公司)，用50％(v/v)的乙醇洗脱，收集洗脱液，干燥。

3)柱层析：将上述有效部位拌硅胶上柱，进行硅胶(300-400目)柱层析(10倍样品质量的硅胶，可用120cm*6cm的柱子)，用石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱的梯度为：10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1→1∶2；其中每个梯度下冲洗的洗脱剂的量均为六倍柱体积。得到I～VII部分，收集上述混合溶剂石油醚-乙酸乙酯(2∶1)的洗脱部分，溶剂蒸干，得到洗脱部分V，溶剂蒸干。

4)纯化：将上述步骤所得的产物拌硅胶上柱，进行硅胶(300-400目)柱层析(十倍样品质量的硅胶，可用80cm*4cm等合适规格的柱)，以10倍柱体积的氯仿-甲醇10∶1洗脱，每次收集约四分之一柱体积的层析液，收集前二十个洗脱部分，第14～第18流份合并，减压回收溶剂，得到化合物亚麻酸山梨醇酯；或进行十八烷基反相硅胶(ODS)柱层析(十倍样品质量的反相硅胶，可用80cm*4cm的柱子)，以8倍柱体积的甲醇-水4∶1洗脱，每次收集约四分之一柱体积的层析液，收集前十五个洗脱部分，第3～第5流份合并，减压回收溶剂，得到化合物亚麻酸山梨醇酯。

实施例2亚麻酸山梨醇酯的制备

1)提取：取破壁后油菜花粉，粉碎，以10ml/g油菜花粉的比例用体积百分比95％乙醇加热回流或冷浸渗漉3次，滤过，合并滤液，减压回收溶剂，得相对密度为1.28的流浸膏。分配于水中，分别依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取，每次萃取溶剂用量为水溶液等体积，每种溶剂萃取多次，至近乎无色。取乙酸乙酯萃取部分，减压回收溶剂，蒸干得有效部位。

2)柱层析：将上述有效部位拌硅胶上柱，进行硅胶(300-400目)柱层析(十倍样品质量的硅胶，可用120cm*6cm等合适规格的柱子)，用石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，用石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱的梯度为体积比：10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1→1∶2，其中每个梯度下冲洗的洗脱剂的量均为6倍柱体积。得到I～VII部分，收集上述混合溶剂石油醚-乙酸乙酯(2∶1)的洗脱部分，溶剂蒸干，得到洗脱部分V，溶剂蒸干。

3)纯化：将上述步骤所得的产物拌硅胶上柱，进行硅胶(300-400目)柱层析(10倍样品质量的硅胶，用80cm*4cm的柱子)，以10倍柱体积的氯仿-甲醇10∶1，每次收集约四分之一柱体积的层析液，收集前二十个洗脱部分，第14～第18流份合并，减压回收溶剂，得到化合物亚麻酸山梨醇酯；或进行十八烷基反相硅胶(ODS)柱层析(10倍样品质量的反相硅胶，用80cm*4cm的柱子)，以10倍柱体积的甲醇-水4∶1洗脱，每次收集约四分之一柱体积的层析液，收集前15个洗脱部分，第3～第5流份合并，减压回收溶剂，得到化合物亚麻酸山梨醇酯。

其理化性质和波谱数据如下：

亚麻酸山梨醇酯：无色油状物，HRESIMS：m/z 465.2831[M+Na]⁺(calcdfor C₂₄H₄₂O₇Na，465.2828)；ESI-MS(positive+negative)：m/z 465[M+Na]⁺，443[M+H]⁺，477[M+Cl]^-，441[M-H]^-；IR max(KBr)cm^-1：3396，2928，2855，1739(C＝O)，1653，1462，1391，1175，1055，932，866，720；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δH 5.40～5.30(6H，m，H-9，10，12，13，15，16)，4.19～3.67(10H，m，H-1′～6′)，2.80(4H，t，J＝7.6Hz，H-11，14)，2.35(2H，t，J＝7.2Hz，H-2)，2.07(4H，t，J＝7.5Hz，H-8，17)，1.60(2H，m，H-3)，1.27-1.31(H-4，5，6，7)，0.97(3H，t，J＝7.5Hz，H-18)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)：δC 174.9(s，C-1)，34.2(t，C-2)，25.4(t，C-3)，29.2～29.7(t，C-4，5，6，7)，27.2(t，C-8)，132.0(d，C-9)，128.2(d，C-10，15)，25.6(t，C-11)，127.8(d，C-12)，127.2(d，C-13)，25.5(t，C-14)，128.3(d，C-16)，20.4(t，C-17)，14.3(q，C-18)，65.9(t，C-1′)，70.2(d，C-2′)，70.0(d，C-3′)，73.3(d，C-4′)，71.8(d，C-5′)，63.7(t，C-6′).

效果实施例

表1说明了亚麻酸山梨醇酯和亚麻酸对芳香化酶的抑制作用。其中，亚麻酸为对比例，购自Sigma公司。

该测试方法是根据文献《芳香化酶抑制剂筛选模型的建立》(全海天，楼丽广，中国药理学通报，2004，20(10)：1189-1192)，用胎盘的微粒体作为芳香化酶的酶源，以[1β-³H]雄烯二酮作为反应底物，通过测得产物³H₂O的放射能来检测芳香化酶的活性，以液体闪烁计数仪计数³H₂O的放射率，计算化合物芳香化酶的抑制作用。

一、材料和仪器

人的胎盘取自上海市静安区妇产科医院。[1β-³H]雄烯二酮(958.3TBq·mol^-1)为Perkin Elmer Life Sciences Inc产品；雄烯二酮，对照品Aminoglutethimide，NADPH为Sigma公司产品；供试样品自制。葡聚糖T70为Amersham Bioscience公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

超速离心机购自HITACHI Co，低温离心机购自International EquipmentCo，，-86℃超低温冰箱购自Thermo Electron Co，放射性同位素检测仪购自Beckman Co。

二、方法

1.微粒体的制备所有步骤均在0～4℃进行。胎盘得到后立刻放在冰上，除去绒毛膜和大血管，用0.01mol·L^-1 PBS(内含1％KCl)清洗后用剪刀剪碎，用0101mol·L^-1PBS(内含0124mol·L^-1蔗糖和0.5μmol·L^-1雄烯二酮)进行匀浆。离心900×g 60min。弃沉淀，上清液离心10000×g 60min以沉淀线粒体成分。上清液再离心125000×g 60min即可得到微粒体部分。沉淀再用0.01mol·L^-1 PBS(内含0.1mmol·L^-1 EDTA，0.5μmol·L^-1雄烯二酮)重悬浮，悬浮的蛋白用以0.01mol·L^-1 PBS为溶剂的0.1％NP-40溶解至蛋白终浓度为2～3g·L^-1。

2.酶反应体系的建立反应底物[1β-³H]雄烯二酮事先保存在无水乙醇内，反应时用0.067mol·L^-1 PBS稀释，乙醇的终浓度小于1％。反应以0.067mol·L^-1PBS为缓冲液，0.4ml的反应体系中还包含0.01ml微粒体制备液，50pmol[1β-³H]雄烯二酮和0.20mg NADPH。反应在37℃进行，以加入NADPH开始，分别进行2，5，10，15min，然后加0.4ml 20％的三氯乙酸终止反应1min。终止后加入1.0ml预冷的氯仿抽提，继续振荡10min后离心3200×g 10min，吸上清约0.8ml，然后加入0.8ml 5％dextran coated charcoal，37℃继续振荡温浴30min。混合液离心3200×g 10min。取上清液测定³H的放射能，空白对照用无微粒体的反应液。样品浓度为100μg/ml，在NADPH加入前加入。

3.K_m和V_max的测定0.4ml反应体系中，对照品Aminoglutethimide的浓度分别取1，2，4，12.5，25μg/ml，供试样品的浓度分别取10，25，50，100，200μg/ml，反应5min，反应体系中其他成分与步骤同2。

4.测定底物的K_m和V_max 在远远过量的NADPH和O₂存在的情况下，芳香化酶的催化反应是单底物反应。变化[1β-³H]雄烯二酮的浓度，并始终控制产物量小于底物量的5％，运用米-孟氏方程式，采用1/v-1/[S]双倒数作图法，可计算出K_m和V_max。

5.测定对照品和供试品的抑制率和IC₅₀ 0.4ml反应体系中，对照品浓度为1μg/ml，供试品浓度为100μg/ml，反应5min，体系其他成分与步骤同2，测定抑制率。

本发明中的化合物抑制芳香化酶活性的测试结果如表1所示。

表1化合物抑制芳香化酶活性的测试结果

化合物	抑制率(100μg/mL)
		亚麻酸山梨醇酯	79％
亚麻酸	55％

结论：本发明的化合物芳香化酶的抑制活性较好，且强于游离脂肪酸亚麻酸。

Claims (10)

1.一种如式1所示的长链脂肪酸的糖醇酯，即亚麻酸山梨醇酯，

式1。

2.如权利要求1中式1所示的长链脂肪酸的糖醇酯的分离提取方法，其特征在于包含下列步骤：

(1)用下述两种方法中的任一种提取有效部位：

①二氧化碳超临界提取油菜破壁花粉，然后进行大孔树脂富集；

②醇提取：取破壁后油菜花粉，粉碎，加甲醇和/或乙醇的水溶液加热回流或冷浸渗漉，滤过，合并滤液，减压回收溶剂，得流浸膏，将流浸膏溶于水中，依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取，每种溶剂萃取多次，至无色，取乙酸乙酯萃取部分，减压回收溶剂，得有效部位；

(2)柱层析：将步骤(1)所得的有效部位在正相硅胶层析柱上用洗脱剂进行梯度洗脱，经正相硅胶薄层层析法检测，收集展开剂为体积比10∶1的氯仿-甲醇时，R_f＝0.4～0.7的洗脱液，减压回收溶剂制得粗产物；

(3)纯化：将步骤(2)所得的粗产物在正相硅胶层析柱上用洗脱剂进行洗脱，经正相硅胶薄层层析法检测，收集展开剂为体积比10∶1的氯仿-甲醇时，R_f＝0.4～0.41的洗脱液，减压回收溶剂，得到如式1所示的化合物；或在十八烷基反相硅胶层析柱上用洗脱剂进行洗脱，经反相硅胶薄层层析法检测，收集展开剂为体积比5∶1的甲醇-水时，R_f＝0.59～0.6的洗脱液，减压回收溶剂，得到如式1所示的化合物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：在步骤(1)②中：所述的甲醇或乙醇水溶液的用量为8～10ml/g油菜花粉；所述的甲醇或乙醇水溶液的体积浓度为75～95％；；所述的冷浸渗漉的次数为3～5次；所述的流浸膏的相对密度为1.15～1.80；所述的水的用量是1-5ml/g流浸膏；所述的萃取过程中，每种溶剂每次萃取的用量为1-5倍水溶液体积。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：在步骤(2)中：所述的硅胶为100～400目；所述的硅胶的用量为步骤(1)所得的有效部位质量的8～15倍；所述的硅胶柱的规格为120cm×6cm、80cm×10cm或60cm×6cm；所述的洗脱剂为下述混合溶剂中的一种：石油醚-乙酸乙酯、正己烷-乙酸乙酯、环己烷-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、环己烷-丙酮和正己烷-丙酮。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱的梯度范围为体积比：10∶1→1∶2；所述的正己烷-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱的梯度范围为体积比：10∶1→1∶2；所述的环己烷-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱的梯度范围为体积比：10∶1→1∶2；所述的石油醚-丙酮混合溶剂进行洗脱的梯度范围为体积比：20∶1→1∶1；所述的环己烷-丙酮混合溶剂进行洗脱的梯度范围为体积比：20∶1→1∶1；所述的正己烷-丙酮混合溶剂进行洗脱的梯度范围为体积比：20∶1→1∶1。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱的梯度为体积比：10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1→1∶2；所述的正己烷-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱的梯度为体积比：10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1→1∶2；所述的环己烷-乙酸乙酯混合溶剂进行洗脱的梯度为体积比：10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1→1∶2；所述的石油醚-丙酮混合溶剂进行洗脱的梯度为体积比：20∶1→10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1；所述的环己烷-丙酮混合溶剂进行洗脱的梯度为体积比：20∶1→10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1；所述的正己烷-丙酮混合溶剂进行洗脱的梯度为体积比：20∶1→10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1；所述的每个梯度下冲洗的洗脱剂的量均为3～6倍柱体积。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：在步骤(3)中：所述的硅胶层析柱的规格为120cm×6cm、80cm×4cm或40cm×3cm；所述的硅胶为300～400目，用量为步骤(2)所得的粗产物质量的10～40倍；所述的十八烷基反相硅胶层析柱的规格为120cm×6cm、80cm×4cm或40cm×3cm，反相硅胶用量为步骤(2)所得的粗产物质量的10～40倍。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的硅胶层析柱上所用的洗脱剂为氯仿-甲醇或氯仿-丙酮；所述的十八烷基反相硅胶层析柱上所用的洗脱剂为甲醇-水、乙腈-水或乙醇-水。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的硅胶层析柱上所用的氯仿-甲醇的比例为体积比10∶1；所述的氯仿-丙酮的比例为体积比5∶1；所述的十八烷基反相硅胶层析柱上所用的甲醇-水的比例为体积比4∶1；乙腈-水的比例为体积比2∶1；乙醇-水的比例为体积比2∶1。

10.如权利要求1中式1所示的长链脂肪酸的糖醇酯或含其的植物提取物在制备抑制芳香化酶活性的制剂，或制备预防或治疗前列腺增生疾病的药物组合物中的应用。