CN101024663A - 一种新化合物、含有该化合物的提取物及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种螃蟹甲提取物及其制备方法，该提取物含拉布索型二萜类化合物至少20％；提取方法包括：用50％以上的醇提取得到含有拉布索型二萜类化合物的有效成分，过大孔树脂，先用40％乙醇洗脱，去除可能有毒的物质，最后用80％以上乙醇洗脱，以富集有效成分即得到螃蟹甲提取物；该提取物具有止咳的活性。

Description

一种新化合物、含有该化合物的提取物及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种糙苏属植物露木尔即螃蟹甲的植物提取物、该提取物含有的化合物及其制备方法，所述提取物中含拉布索型二萜类化合物至少20％；实验证明，该提取物具有显著的止咳活性。

背景技术

露木尔作为常用藏药，其来源为唇形科糙苏属植物螃蟹甲Phlomisyounghusbandii mukerjee的干燥块根。早在一千多年前我国藏族医药学典籍《四部医典》和《晶珠本草》就有记载，其性温，味甘苦，有止咳化痰、清热散寒、生肌敛疮之功效，用于治疗感冒、咳嗽、气管炎等症。《中国藏药》记载“楼莫尔(露木尔)以花色、块根大小及颜色分出三种，但由于区别特征不明显，加之功效相同，临床使用上未进一步区分，一般常用的露木尔(也称楼莫尔)，多指本品(螃蟹甲)及其同属的几种植物”。同时，《中国藏药》附注中称“同属(糙苏属)植物串铃草Phlomis mongolica Turcai、萝卜秦艽Phlomis medicinalis Diels、白元参Phlomis betonicoides Diels的块根也作本品(螃蟹甲)入药”。露木尔生长于海拔1700-3600m的山坡上，主要分布于四川西部和西藏东部。以前，该草药主要是少数民族民间用药，对有效成分、作用机理和安全性都不清楚，影响临床进一步应用。

发明内容

针对螃蟹甲植物的研究现状，本发明的目的就是通过实验性研究，阐明该药材的有效成分、作用机理和安全性，以便临床更好使用。

本发明人通过大量的试验研究，从糙苏属植物螃蟹甲中提取得到了一种新的化合物以及含有该化合物的螃蟹甲有效部位(提取物)，该提取物是螃蟹甲粗提物经过精制而制得，其中的有效成分明确，含量较高，达到了明确糙苏属植物(尤其是螃蟹甲)在止咳方面的有效部位其明确的组成和含量，从而提高了生物利用度，并且研究了露木尔植物的止咳作用的药理药效。

本发明的目的在于提供一种从螃蟹甲中提取得到的新化合物，该化合物具有止咳平喘的活性。

本发明的目的还在于提供一种螃蟹甲提取物，该提取物成分明确，具有明显的止咳平喘的活性。

本发明的目的还在于提供上述新化合物和螃蟹甲提取物的制备方法，该方法包括提取和精制纯化的过程，尤其是采用特定浓度的乙醇提取和洗脱以进行有效成分的富集等，使得螃蟹甲提取物中具有止咳作用的有效成分明确、含量高、杂质少，更有利于其在止咳平喘制剂上的应用。

一种化合物，其具有如下结构：

该化合物为phlomisoside V，在本发明中也称为藏糙苏苷V。

本发明还提供了一种螃蟹甲提取物，以提取物总重计，该提取物至少含拉布索型二萜类化合物20％，该类化合物包括藏糙苏酸(phlomisoic acid)、藏糙苏苷III(phlomisoside III)和藏糙苏苷V(phlomisoside V)。

根据精制步骤的不同，拉布索型二萜类化合物一般可达到20-90％，在本发明优选实施例中，拉布索型二萜类化合物可以占到40-60％，其中所述拉布索型二萜类化合物包括phlomisoic acid(藏糙苏酸)、phlomisoside III(藏糙苏苷III)、phlomisoside V(藏糙苏苷V)等成分，该提取物中含有的拉布索型二萜化合物，其中的phlomisoside III占提取物总重的至少5％，通常phlomisoside III的含量可以占提取物总重5-90％，在本发明优选实施例中，phlomisoside III的含量为提取物总重的20-80％。

经过药理试验测试，本发明的含有上述成分的提取物具有明显的止咳活性，尤其对感冒和气管炎引起咳嗽具有显著的抑制作用。

本发明还提供了phlomisoside V化合物的制备方法，提取纯化的步骤包括：

将螃蟹甲药材用至少2倍量的50％-95％乙醇提取，提取液浓缩后用水溶解，经大孔吸附树脂吸附，依次用40％、95％的乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液，回收乙醇得浸膏，再经洗脱液为氯仿-甲醇的硅胶柱色谱、洗脱液为乙醇-水的凝胶柱色谱和制备高效液相色谱，其中，硅胶柱色谱的洗脱液为氯仿-甲醇，氯仿所占的重量百分比为20％-80％，优选30％-70％；凝胶柱色谱的洗脱液为乙醇-水，乙醇所占的重量百分比为20％-90％，优选40％-70％；制备高效液相色谱的洗脱液为甲醇-水，甲醇所占的重量百分比为20％-95％，优选30％-70％，得权利要求1所述的化合物。

在本发明的优选实施例中，phlomisoside V化合物的制备方法，提取纯化的步骤包括：

药材粉碎，取粗粉分别用8，6，4倍量95％乙醇回流提取，每次2h，合并提取液，减压浓缩得浸膏。将浸膏用水溶解后，经D-101型大孔吸附树脂吸附，分别用40％，95％乙醇洗脱，将95％乙醇洗脱物部分回收乙醇得浸膏。再经过反复硅胶柱色谱(氯仿-甲醇)、凝胶柱色谱(乙醇-水)和制备高效液相色谱(甲醇-水)分离，得化合物phlomisoside V。

本发明还提供了一种螃蟹甲提取物的制备(提取)方法，步骤为：

(1)螃蟹甲原料药材以50％以上浓度的醇提取，得到的提取物(粗提物)含有拉布索型二萜类化合物，该拉布索型二萜类化合物包括phlomisoic acid(1#)，phlomisoside V(2#)，phlomisoside III(3#)；

(2)将步骤(1)中得到的提取物(粗提物)上大孔吸附树脂柱(例如可以是D101或AB-8型)，用40％乙醇洗脱，弃去洗脱液；

(3)再用80％以上乙醇洗脱上述大孔吸附树脂柱中的提取物(粗提物)，收集洗脱液，即得到螃蟹甲提取物。

上述步骤(1)中提取用醇优选乙醇，浓度优选50％-95％，更优选70％-95％；步骤(3)中的乙醇浓度优选80％-95％，为了节省成本，更优选80％-90％。

本发明经过大量的工艺筛选实验，得到了具有极强止咳活性的提取物，上述工艺目的：

A、采用50％以上的醇提取，尤其是70-95％的醇，优选乙醇，目的是提取有效成分，得到拉布索型二萜类化合物，例如phlomisoic acid(1#)，phlomisoside V(2#)，phlomisoside III(3#)；

B、再用40％乙醇洗脱：目的是去除可能含有的有害成分，例如属于需进行限量检查的成分羟甲基糠醛、5-羟基-7-甲氧基-4，6-二甲基-2-苯并呋喃酮以及环烯醚萜类化合物等，经毒理研究证明，40％乙醇洗脱得到的洗脱物包含具有毒性的成分)；

C、最后用80％以上乙醇洗脱：目的是富积有效成分。

有文献报道螃蟹甲在洗脱时只采用80％乙醇洗脱。实验证明，80％乙醇洗脱虽然包含了所有植物中可能存在的各种类型的环烯醚萜类化合物，但也同时包含了羟甲基糠醛、5-羟基-7-甲氧基-4，6-二甲基-2-苯并呋喃酮以及环烯醚萜类化合物等有害或有毒成分，并不适合本发明欲达到的安全有效的止咳目的。

本发明的螃蟹甲提取物中含有的拉布索型二萜类化合物以phlomisoicacid，phlomisoside V，phlomisoside III为代表，结果如下所示。其中最具代表性的药效学成分为phlomisoside III，该化合物占螃蟹甲提取物(浸膏)重量的至少5％。申请人在实验中发现，在40％乙醇洗脱部位不含该化合物。

在本发明的优选实施例中，具有止咳效果的螃蟹甲提取物的制备方法的具体步骤为：

螃蟹甲粗粉20.0kg，分别用至少8倍量的95％乙醇回流提取三次，每次2h，合并提取液，减压浓缩得浸膏；浸膏用水溶解后，经D-101型大孔吸附树脂吸附，用40％洗脱至洗脱液无色，80％以上乙醇洗脱，回收溶剂浸膏(以下简称G)。

本发明还对上述螃蟹甲提取物进行了化学成分研究，经过反复硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和制备高效液相色谱分离，从G中得到10个化合物分别为：phlomisoic acid(1#)，phlomisoside V(2#)，phlomisoside III(3#)，邻苯二甲酸正丁异丁酯(4#)，棕榈酸(5#)，油酸(6#)，β-谷甾醇(7#)，胡萝卜苷(8#)，8-乙酰基山栀苷甲酯(9#)，notohamosin A(10#)。

由于本发明的提取物中所含有的有效成分为混合物，其所含有的经检测已经明确的有效化合物成分包括phlomisoside III等，至今没有文献公开报道螃蟹甲在止咳方面有效成分的合理组成是什么，优选治疗量是多少，这样势必导致出现量效关系不容易把握、疗效不稳定等缺陷性特点，尤其对于适合治疗咳喘的中药剂型来说，组成成分确切、含量准确更易于把握制剂质量。申请人发现，本发明的制备方法得到的提取物中确切的有效成分以治疗有效量的拉布索型二萜类类化合物为主，且排除了羟甲基糠醛、5-羟基-7-甲氧基-4，6-二甲基-2-苯并呋喃酮等有毒成分，本发明还进行了大量的实验检测，结果证实，螃蟹甲提取物中以phlomisoic acid(1)，phlomisoside V(2)，phlomisoside III(3)为代表的拉布索型二萜类化合物。其中最具代表性的药效学成分为phlomisosideIII，实验证明，本发明的提取物其治疗效果是最佳的。

本发明还提供了一种药物组合物，其含有临床治疗有效量的上述螃蟹甲提取物和药物辅料，该药物临床推荐有效剂量为1.5-3g/日，优选3次/日。

上述药物组合物包括口服剂型和注射剂型。口服制剂包括片剂(普通片、分散片、缓/控释片、泡腾片、口崩片)、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、口服液、栓剂。

本发明还提供了所述新化合物在制备止咳药物中的应用。

本发明还提供了含有螃蟹甲提取物的组合物在制备止咳药物中的应用。

本发明的新化合物和螃蟹甲提取物药效试验结果如下，经过本发明的上述提取方法得到的螃蟹甲提取物用G表示，常规方法(包括文献记载的常规提取方法)的螃蟹甲的醇提取物以F+G表示，G中含有环烯醚萜类成分至少20(优选可达到约50％)，含有少量其他成分，甾醇类，如：β-谷甾醇、胡萝卜苷、有机酸酯类，如：邻苯二甲酸正丁异丁酯、棕榈酸、油酸等。其中F为先用水洗后，以40％乙醇洗脱部位；G为再用80％以上的乙醇洗脱部位；F+G基本上等于80％以上乙醇直接洗脱的部位。

药理学实验

一、G的止咳活性

实验材料：

1.药品：G微溶于水，易溶于乙醇等有机试剂，动物体内实验用0.5％Tween80加生理盐水研磨配制。磷酸可待因由中国药品生物制品检定所毒麻室提供。

2.动物：健康合格一级ICR小鼠[雌雄各半，体重(18～22)g]由中国药品生物制品检定所动物中心提供。

实验方法：

1.G对氨水诱发小鼠咳嗽的影响

取健康ICR小鼠，随机分组。给药途径为灌胃给药。磷酸可待因组腹腔注射0.05g/kg。给药一次，给药后一小时，将小鼠置入500ml烧杯，内放一棉球，1ml注射器吸取氨水0.2ml注入棉球，迅速倒置烧杯，观察记录小白鼠的咳嗽潜伏期和2min内咳嗽次数。小鼠1min内出现3次以上典型咳嗽动作(腹肌收缩或缩胸，同时张大嘴，有时可有咳声)者，算作“有咳嗽”，否则算作“无咳嗽”。经统计学处理，进行组间比较。

2.G对二氧化硫诱发小鼠咳嗽的影响

取健康ICR小鼠，随机分组。给药途径为灌胃给药。磷酸可待因组腹腔注射0.05g/kg。给药一次，给药后一小时，将小鼠逐只放入250ml干燥广口瓶内，并向瓶内注入5ml二氧化硫气体，立即封闭瓶口，观察小鼠在充满二氧化硫瓶内3min咳嗽潜伏期和咳嗽次数(观察标准同氨水引咳)。经统计学处理，进行组间比较。

3.G对氨水诱发小鼠咳嗽的影响

ICR小鼠灌胃给药，剂量为5g/kg.给药一次，给药后一小时，将小鼠置入500ml烧杯，内放一棉球，1ml注射器吸取氨水0.2ml注入棉球，迅速倒置烧杯，观察记录小白鼠的咳嗽潜伏期和2min内咳嗽次数。磷酸可待因组腹腔注射0.05g/kg。见下表。结果显示：G可以显著的止咳作用，可使咳嗽潜伏期延长，咳嗽次数减少。与蒸馏水组相比有显著差异，(P＜0.01)或(P＜0.05)。

表1  G对氨水诱发小鼠咳嗽的影响(n＝10)

组别	给药方式	剂量(g/kg)	咳嗽潜伏期(min)	咳嗽次数(2min内)
					G	ig	5	3.2±0.6**	35.3±10.3**
磷酸可待因组	sc	0.05	3.7±1.1**	12.6±5.9**
					蒸馏水组	ig	-	1.6±0.4	90.5±21.6

与蒸馏水组比较：^*P＜0.05  ^**P＜0.01

表2  G对氨水诱发小鼠咳嗽的影响(n＝10)

组别	给药方式	剂量(g/kg)	咳嗽潜伏期(min)	咳嗽次数(2min内)
					G	ig	1.0	1.2±0.9	95.3±14.4
G	ig	2.5	2.5±0.8*	75.6±15.7*
					G	ig	5.0	3.0±0.4*	49.8±17.6*
磷酸可待因组	sc	0.05	3.5±0.9**	42.1±12.9**
					蒸馏水组	ig	-	1.2±0.7	98.5±19.6

与蒸馏水组比较：^*P＜0.05  ^**P＜0.01

4.G对二氧化硫诱发小鼠咳嗽的影响

ICR小鼠灌胃给药，剂量为2.5、5g/kg.给药一次，给药后一小时，将小鼠逐只放入250ml干燥广口瓶内，并向瓶内注入5ml二氧化硫气体，立即封闭瓶口，观察小鼠在充满二氧化硫瓶内3min咳嗽潜伏期和咳嗽次数(观察标准同氨水引咳)。磷酸可待因组腹腔注射0.05g/kg。见下表。结果显示：G可以显著的止咳作用，可使咳嗽潜伏期延长，咳嗽次数减少。与蒸馏水组相比有显著差异，P＜0.01或P＜0.05。

表3  G对二氧化硫诱发小鼠咳嗽的影响  (n＝10)

组别	给药方式	剂量(g/kg)	咳嗽潜伏期(min)	咳嗽次数(3min内)
					G	ig	5	3.4±1.5**	53.8±15.2**
G	ig	2.5	2.8±1.1*	77.6±20.1*
					磷酸可待因组	sc	0.05	4.0±0.8**	41.6±9.7**
蒸馏水组	ig	-	1.9±1.0	103.5±18.8

与蒸馏水组比较：^*P＜0.05    ^**P＜0.01

急性毒性实验

实验材料

1.药品

G微溶于水，易溶于乙醇等有机试剂，动物体内实验用0.5％Tween80加生理盐水研磨配制。

2.动物

健康合格一级ICR小鼠[雌雄各半，体重(18～22)g]由中国药品生物制品检定所动物中心提供；

3.实验方法

因G毒性较低，测不出LD50及最小致死量等参数，故测其最大耐受量以及对小鼠体重的影响。健康小鼠80只，随机分为四组，每组20只，雌雄各半。禁食12小时后，24小时内分2次(间隔6小时)经口分别给予0.4ml最大浓度的G，剂量分别为1.0g/ml，1.0g/ml和0.8g/ml，相当于生药材240g/kg，600g/kg，600g/kg；空白对照组，经口一次给予等体积的无菌水；记录小鼠在试验前、试验后第七天的体重及体征表现。

4.实验结果与讨论

小鼠在经口给予G后，连续观察七日，实验中未见动物死亡及毒性反应。动物外观、活动、食欲正常，无异常分泌物及大小便异常。实验第七日后，各组动物体重无明显差异。实验中剂量已所能达到的最大浓度和最大体积。小鼠一日分别口服G相当于生药材600g/kg；说明G很安全。

二、G、F+G对氨水引发小鼠咳嗽的影响

1.实验目的：比较G、F+G对氨水引发小鼠咳嗽影响强弱。

2.样品：G、F+G，由中国药品生物制品检定所中药室提供。批号060910，060911。F+G和G是同一生药提取物，F+G是提取物I，25g生药/g提取物I；从提取物I中去掉F，得到G，100g生药/g提取物G。

3.实验材料

4.实验动物：ICR小鼠，II级，♀♂各半 体重22～25g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXX(京)2002-0003。

5.试剂与设备

5.1咳必清，25mg/片，天津力生制药股份有限公司生产，批号0509016。取1片咳必清放入乳钵中研磨后，加入蒸馏水至25ml，浓度为1mg/1ml备用。

5.2氨水，天津百世化工有限公司生产，批号：030909。

5.3JWC-201D超声雾化器，鞍山市同信医用仪器厂生产；2.4JOEREX(祖迪斯)运动数码秒表广州保税区麦斯卡发展有限公司生产。

6.剂量设计和试验用药液的配制

本试验以相同生药量为基础对F+G和G进行比较。

G对氨水诱发小鼠咳嗽的影响见表2。由表2的结果说明5g/kg，2.5g/kg均有效，考虑到同量生药提取F+G的量是G的4倍，故选取G2.5g/kg，F+G10g/kg进行比较。F+G和G均微溶水，故用0.5％Tween80加纯净水研磨配制。灌胃体积为20ml/kg，称取G1.25g，加50ul Tween80，加适量纯净水研磨，最终体积为10ml；称取F+G5g，加50ul Tween80，加适量纯净水研磨，最终体积为10ml。

7.供试品和对照品的给药途径、给药剂量及分组情况(见下表4)

表4.分组及给药途径和剂量

组别	动物数(只)	给药途径	给药剂量(g/kg)
				正常对照组	10	灌胃	生理盐水20ml/kg
咳必清	10	灌胃	0.02
				G中剂量	10	灌胃	2.5
F+G中剂量	10	灌胃	10

8.实验方法

小鼠40只，随机分为4组。正常对照组(给予生理盐水20ml/kg)，阳性对照组(给予咳必清0.02g/kg)，G组(给予G2.5g/kg)和F+G组(给予F+G10g/kg)。各组小鼠给药后30分钟，分别将小鼠(每次试验2只小鼠)放入500ml玻璃钟罩内，将50ml浓氨水(25％)置于JWC-201D超声雾化器中，超声雾化器与500ml玻璃钟罩喷雾装置相连，(风门调节在最小，雾量调节7档)。启动超声雾化器，雾化时间为15秒，停留5秒后迅速将小鼠取出，然后测定其咳嗽潜伏期(小鼠收腹、扬头、抓嘴同时张大嘴)及2分钟内每只小鼠的咳嗽次数。实验数据用SPSS11.5统计学软件作T检验。见表5。

表5.G、F+G对氨水引发小鼠咳嗽的影响(n＝10，X±SD)

组别	剂量(g/kg)	咳嗽潜伏期(S)	咳嗽次数(次)
				正常对照组	——	44.0±10.0	21.0±3.5
咳必清	0.02	66.8±21.79**	5.1±2.9**
				G	2.5	63.0±11.0**#	8.8±1.7**#
F+G	10	54.2±16.1*	12.6±5.7*

注：与正常对照组比较  **P＜0.01  *P＜0.05；与F+G组比较  #P＜0.05

实验结果表明，G、F+G对氨水引发的小鼠咳嗽均有明显镇咳作用，既能明显延长咳嗽的潜伏期又能明显减少咳嗽次数，P＜0.01或P＜0.05。对氨水引发的小鼠咳嗽的潜伏期，G延长的时间明显长于F+G，P＜0.05；对氨水引发的小鼠咳嗽次数，G明显比F+G少，P＜0.05。说明单纯的G的镇咳作用比相同生药量的F+G强。

三、化合物phlomisoside III、phlomisoside V对氨水引发小鼠咳嗽的影响

1.实验目的：考察phlomisoside III、phlomisoside V对氨水引发小鼠咳嗽的影响。

2.样品：由中国药品生物制品检定所中药室提供。

3.实验动物：ICR小鼠，II级，♀♂各半，体重22～25g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXX(京)2002-0003。

4.试剂与设备

4.1咳必清，25mg/片，天津力生制药股份有限公司生产，批号0509016。取1片咳必清放入乳钵中研磨后，加入蒸馏水至25ml，浓度为1mg/1ml备用。

4.2氨水，天津百世化工有限公司生产，批号：030909。

4.3 JWC-201D超声雾化器，鞍山市同信医用仪器厂生产；2.4JOEREX(祖迪斯)运动数码秒表，广州保税区麦斯卡发展有限公司生产。

5.试验用药液的配制、供试品和对照品的给药途径、给药剂量及分组情况参照上述二“F+G和G对氨水引发小鼠咳嗽的影响”项下。

6.实验方法参照上述二项下的方法。

7.实验结果表明，本发明的化合物phlomisoside III和phlomisoside V对氨水引发的小鼠咳嗽均有明显镇咳作用，既能明显延长咳嗽的潜伏期又能明显减少咳嗽次数，P＜0.01或P＜0.05。

表6.phlomisoside III、phlomisoside V对氨水引发小鼠咳嗽的影响

(n＝10，X±SD)

组别	剂量(mg/kg)	咳嗽潜伏期(S)	咳嗽次数(次)
				正常对照组	——	45.2±13.1	20.5±4.1

咳必清	20	65.2±19.37**	5.2±3.0**
				phlomisoside III	100	54.1±13.9**#	9.1±2.8**#
phlomisoside V	100	51.2±16.1*	10.7±6.1*

注：与正常对照组比较    **P＜0.01  *P＜0.05；与F+G组比较  #P＜0.05F的LD₅₀测定

【样品】

F，螃蟹甲植物提取药，微溶于水，中国药品生物制品所检定所中药室提供。

【实验动物】

II级KM小鼠，雌，体重21～23g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2002-001。

动物饲养在IVC系统，温度22～27℃，相对湿度50～70％，自由摄取标准饲料、饮用纯净水。五只一笼。实验动物使用许可证编号：syxk(津)2005-0001。

【试剂与设备】

电子天平，T500型，d＝0.1g，美国双杰兄弟(集团)公司，常州常熟双杰测试仪器厂生产。

【剂量设计】

经予试验，样品F，最高剂量设为14.0g/kg，剂间比为0.8，其余剂量依次为11.20、8.96、7.17、5.73g/kg。

【药液配制】

试验给药体积定为30ml/kg，即0.6ml/20g。于50ml三角瓶中称42g样品，加蒸馏水摇动至溶解，加至90ml，得药液a；取药液a60ml于B瓶，加蒸馏水至75ml，得药液b；取药液b60ml于C瓶，加蒸馏水至75ml，得药液c；取药液c60ml于D瓶，加蒸馏水至75ml，得药液d；取药液d36ml于E瓶，加蒸馏水至45ml，得药液e。按0.6ml/20g给小鼠a液、b液、c液、d液和e液相当于给小鼠14.00、11.20、8.96、7.17、5.73gF/kg。

【方法和结果】

购进ICR小鼠50只，雌雄各半，体重18～20g，观察3天，未见异常，分为5组，每组雌雄各5只。给药前12h，停食不停水。给药前称重，根据体重，分别给予a\b\c\d\e药液灌胃。观察7天。记录死亡情况，见表7和表8。

表7.各剂量组小鼠死亡情况

		15.00g/kg	12.00g/kg	9.60g/kg	7.68g/kg	6.14g/kg
							24h	♂	2	0	1	0	0
♀	1	0	0	0	0
						48h		♂	3	1	1	0	0
♀	2	1	2	1	0
							72h	♂	0	1	0	1	0
♀	1	1	1	1	1
						96h		♂	0	0	0	0	0
♀	0	0	0	0	0
							120h	♂	0	0	0	0	0
♀	0	0	0	0	0
						144h		♂	0	0	0	0	0
♀	0	0	0	0	0
							168h	♂	0	0	0	0	0
♀	0	0	0	0	0
						合计		♂	5	2	3	1
♀	4	2	2	2	1

表8.用Bliss法计算半数致死量

剂量	对数剂量(x)	动物数(只)	死亡数(只)	死亡百分率(％)	实验机率单位(Y)	回归机率单位(Y)
							14	1.1461	10	9	90.00	6.2817	5.8106
11.2	1.0492	10	4	40.00	4.7471	5.3129

8.96	0.95231	10	5	50.00	5	4.8151
							7.17	0.85552	10	3	30.00	4.476	4.3181
5.73	0.75815	10	1	10.00	3.7183	3.818

回归方程y(Probit)＝-0.075718+5.1358Log(D)

半数致死量LD₅₀＝9.7342g/kg

LD₅₀(Feiller校正)95％的可信限＝8.077--12.411g/kg

LD₅＝4.6561g/kg

LD₉₅＝20.351g/kg

结论：F的LD₅₀为9.73g/kg，其收率为3％，即33.3g生药/g，其LD₅₀相当于324g生药，与G比较，G的最大耐受量为大于600g生药，说明F的毒性远大于G。

本发明的药理实验中涉及的提取物按照实施例1的方法制得。

附图说明

图1：螃蟹甲提取物对照品的色谱图；

图2；本发明得到的螃蟹甲提取物的色谱图；

图3：phlomisoside V的¹³C-NMR图；

图4：phlomisoside V的¹H-NMR图；

图5：phlomisoside III的¹³C-NMR图；

图6：phlomisoside III的¹H-NMR图。

具体实施方式

以下实施例是为了参照附图更详细地说明本发明，并非对本发明构成限制。

其中，图1为螃蟹甲提取物对照品的色谱图；图2为本发明的用大孔树脂洗脱得到的螃蟹甲提取物的色谱图；图3-图4是phlomisoside V的¹³C-NMR图和¹H-NMR图；图5-图6为phlomi soside III的¹³C-NMR图和¹H-NMR图。

从螃蟹甲提取物的色谱图结果得出：以80％乙醇洗脱，phlomisoside III含量为25.8％；以95％乙醇洗脱，phlomisoside III含量为21.1％。

实施例1  螃蟹甲提取物

螃蟹甲粗粉20.0kg，分别用至少8倍量的95％的乙醇回流提取三次，每次2h，合并提取液，减压浓缩得浸膏；浸膏用水溶解后，经D-101型大孔吸附树脂吸附，用40％洗脱至洗脱液无色，80％或以上的乙醇洗脱，回收溶剂浸膏，得到螃蟹甲提取物约100g，收率为0.5％。

经过检测(检测方法如下所述)，该提取物中含有拉布索型二萜类化合物50g，相当于提取物的50％(以phlomisoside III计)，其中含有化合物phlomisoside III20g，相当于提取物的20％。

根据需要可以再经过D-101型大孔吸附树脂吸附，步骤如上，得到的提取物中含有拉布索型二萜类化合物可以达到提取物的80％甚至90％(以phlomisoside III计)，其中含有化合物phlomisoside III的量可达到提取物重量的40％-90％。

检测方法：

薄层色谱法：TLC法鉴别phlomisoside III。

供试品溶液的制备：取本品粉末0.5g，加甲醇5mL，超声处理10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取phlomisoside III对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的褐红色斑点。

液相色谱法：HPLC法测定phlomisoside III及总拉布索型二萜类化合物的含量。

色谱条件：

色谱柱：Alltima C18，5μm，4.6mm×250mm；流动相：乙腈-水(40∶60)，流速：0.8mL/min；检测波长：203nm。

对照品溶液的制备：

精密称取phlomisoside III对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液即得。(10.15mg/25mL；10.38mg/25mL)。

供试品溶液的制备：

大孔树脂80％乙醇洗脱物(G)：取本品粉末约0.05g，精密称定，精密加入甲醇10ml溶解，摇匀，滤过，取续滤液即得。(0.05258g，0.0502g)。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

附图中三个色谱峰分别为：phlomisoic acid(化合物I)、phlomisosideIII(化合物II)和phlomisoside V(化合物III)。

以phlomisoside III为对照，以峰面积定量，计算提取物中phlomisoside III和总拉布索型二萜类化合物(phlomisoside III计)的含量。

实施例2  螃蟹甲提取物颗粒剂的制备

提取物250g，葡萄糖100g，糊精200g，以稀淀粉糊为粘合剂制粒，分装，即得。

实施例3  螃蟹甲提取物口服液的制备

取按上述方法制得的提取物250g，葡萄糖50g，加水1L，搅拌溶解，加入10g抗氧剂硫代硫酸钠，补充水至10L，混匀，滤过，分装，热压灭菌，即得。

实施例4  螃蟹甲提取物胶囊的制备

取按上述方法制得的提取物250g，淀粉100g，以20％乙醇为粘合剂制粒，装胶囊，即得。

实施例5  螃蟹甲提取物分散片剂型的制备

取按上述方法制得的提取物25g，加淀粉50g，混匀，以淀粉浆为粘合剂，制粒，烘干，整粒，压片，即得。

实施例6  螃蟹甲提取物泡腾片剂型的制备

处方：枸橼酸60g，碳酸氢钠50g，G500g，淀粉400g，共制成1000片。

制备工艺：将处方量的枸橼酸加G和适量的淀粉制粒，碳酸氢钠加剩余的淀粉制粒，分别干燥后，混合，压片即得。

实施例7  螃蟹甲提取物

螃蟹甲粗粉20.0kg，用至少8倍量70％的乙醇回流提取三次，每次2h，合并提取液，减压浓缩得到的浸膏用水溶解后，经D-101型大孔吸附树脂吸附，用40％洗脱至洗脱液无色，85％乙醇洗脱，回收溶剂浸膏，即得螃蟹甲提取物100g。

经过如实施例1所述方法的检测，该提取物中含有拉布索型二萜类化合物20g，相当于提取物的20％(以phlomisoside III计)，其中含有化合物phlomisoside III5g，相当于提取物的5％。

实施例8

螃蟹甲粗粉20.0kg，分别用至少8倍量的85％的乙醇回流提取三次，每次2h，合并提取液，减压浓缩得浸膏；浸膏用水溶解后，经D-101型大孔吸附树脂吸附，用40％洗脱至洗脱液无色，85％的乙醇洗脱，回收溶剂浸膏，重复经D-101型大孔吸附树脂吸附分步骤2～3次，得到螃蟹甲提取物100g。

经过如实施例1所述方法的检测，得到的提取物中含有拉布索型二萜类化合物占提取物总量的80％(以phlomisoside III计)，其中含有化合物phlomisoside III的量占提取物重量的80％。

实施例9

将螃蟹甲药材粉碎，取粗粉用8、6、4倍量95％乙醇回流提取，每次2h，合并提取液，减压浓缩得浸膏。将浸膏用水溶解后，经大孔吸附树脂吸附，分别用40％、95％乙醇洗脱，将95％乙醇洗脱物部分回收乙醇得浸膏。再经过反复硅胶柱色谱(洗脱液：氯仿-甲醇，重量比为9∶1)、凝胶柱色谱(洗脱液：乙醇-水，重量比为7∶3)和制备高效液相色谱(洗脱液：甲醇-水梯度洗脱)分离，得化合物phlomisoside V。

Claims (10)

1、一种化合物，其为藏糙苏苷V，具有如下结构：

2、权利要求1所述化合物的提取方法，其中包括：

将螃蟹甲药材用至少2倍量的50％-95％乙醇提取，提取液浓缩后用水溶解，经大孔吸附树脂吸附，依次用40％、95％的乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液，回收乙醇得浸膏，再依次经过洗脱液为氯仿-甲醇的硅胶柱色谱、洗脱液为乙醇-水的凝胶柱色谱和梯度洗脱分离且洗脱液为甲醇-水的制备高效液相色谱，得权利要求1所述的化合物。

3、一种螃蟹甲提取物，以提取物总重计，该提取物至少含拉布索型二萜类化合物20％，该类化合物包括藏糙苏酸、藏糙苏苷III和藏糙苏苷V等。

4、如权利要求3所述的螃蟹甲提取物，其中含有以提取物总重计至少5％的藏糙苏苷III。

5、如权利要求3所述的螃蟹甲提取物，其由以下方法制得：

(1)螃蟹甲原料药材以50％以上浓度的醇提取，得到的提取物含有拉布索型二萜类化合物，该类化合物包括藏糙苏酸、藏糙苏苷III和藏糙苏苷V等；

(2)将(1)中得到的提取物用40％乙醇洗脱，弃去洗脱液；

(3)再用80％以上的乙醇洗脱，即得到螃蟹甲提取物；

以提取物总重计，所述螃蟹甲提取物中含拉布索型二萜类化合物至少20％。

6、权利要求3所述的螃蟹甲提取物的制备方法，其中包括：

(1)螃蟹甲原料药材以50％以上浓度的醇提取，得到的提取物含有拉布索型二萜类化合物，该类化合物包括藏糙苏酸、藏糙苏苷III和藏糙苏苷V等；

(2)将(1)得到的提取物加入至大孔吸附树脂柱中，用40％乙醇洗脱，弃去洗脱液；

(3)再用80％以上的乙醇洗脱(2)中所述大孔吸附树脂柱中的提取物，即得到螃蟹甲提取物。

7、权利要求6所述的制备方法，其中步骤(1)中醇的浓度为70-95％。

8、一种药物组合物，其特征在于含有治疗有效量的权利要求3所述的螃蟹甲提取物和药学可接受的辅料。

9、权利要求1所述的化合物在制备止咳药物中的应用。

10、权利要求3所述的螃蟹甲提取物在制备止咳药物中的应用。

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