CN104857259A - 一种贝母花提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种贝母花提取物及其制备方法和应用。本发明所述的贝母花提取物中贝母素甲与贝母素乙含量为提取物总量的20％-60％(w/w)。其用途为用于制备具有止咳化痰效果的药物或保健品。其制备方法包括：超声提取，滤液浓缩，碱化，葡聚糖凝胶柱分离，洗脱液浓缩干燥得贝母花提取物。该贝母花提取物制备方法操作简便，可有效富集贝母花有效成分，具有较好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种贝母花提取物及其制备方法及应用。
背景技术
百合科贝母属Fritillaria包括多种重要的药用植物，其药用部位多为其地下鳞茎，贝母具有清热润肺，止咳祛痰的功效，据记载该属约有130种。在我国其种类主要包括川贝母、浙贝母、伊贝母等；对贝母的化学成分研究主要集中在它的生物碱类成分，贝母中非生物碱成分的文献报道相对较少。目前已发现贝母中主要有效成分为异甾体生物碱与甾体生物碱，到目前为止已经分离并确定结构的有100余个化合物，异甾体生物碱占86％，胆甾衍生物次之，不同贝母的生物碱种类差异比较大，如浙贝母的主要成分为贝母素甲(浙贝甲素)、贝母素乙(浙贝乙素)、异浙贝甲素、贝母辛、宁贝辛等。伊贝母中主要包括贝母辛、西贝素、新贝素甲、西贝素氮氧化物、西贝素苷、伊贝辛、伊贝碱苷B、伊贝碱苷E等；川贝母的主要成分有川贝碱、西贝素；青贝中有青贝碱；白炉贝中有白炉贝素；黄炉贝中有炉贝碱；白松贝中有松贝碱；甘肃贝母中有岷贝碱；棱砂贝母中有新贝甲素、西贝素、贝母辛、琼贝酮、代拉文酮、代拉夫林；暗紫贝母中有松贝辛；瓦布贝母中有西贝素、贝母辛、鄂贝乙素异浙贝甲素、西贝素等。土贝母的化学成分主要包括皂苷，脂肪酸，糖类及其苷类成分和三萜类成分。
长期以来，浙贝母植株都是以鳞茎入药，而浙贝母植株的花和地上部分常常被作为废物丢弃。贝母花为百合科(Lliaceae)植物浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.的干燥带茎梢的花，别名浙贝花、象贝花，主产于浙江鄞州、磐安等地。贝母花一般是在3～4月植株最后两朵花开放时采摘后干燥，具有较好的止咳化痰的功效。浙贝母鳞茎中主要活性有效成分为生物碱贝母素甲和贝母素乙；近年来的研究表明，贝母花含有与其鳞茎中相似的生物活性物质贝母素甲和贝母素乙，此外还包括其他生物碱、皂苷、氨基酸、色素等，尤以花蕾中生物碱含量最高，具有与鳞茎相似的药理活性，但贝母花中生物碱含量较浙贝母(鳞茎)低，故目前关于贝母花的研究开发较少。
目前浙贝母方面的研究主要集中在鳞茎，且现有文献主要针对浙贝母总生物碱提取研究。浙贝母生物碱组分的富集方法为：将提取物酸化除去弱极性杂质，再碱化萃取出生物碱 组分，或大孔吸附树脂除去强极性杂质得生物碱组分。
如CN201110129070.3公开一种浙贝母总生物碱提取富集方法，采用盐酸溶液提取，碱化二氯甲烷萃取得到总生物碱粗提物；总生物碱粗提物溶于盐酸溶液中，碱化萃取得到上样液，大孔树脂柱乙醇洗脱，得总生物碱提取物，总生物碱含量在60％以上。该方法采用两步萃取再用大孔树脂纯化，总生物碱富集效果好，但缺点是浙贝母的总生物碱提取转移率低。
丁春霞等在《现代中药研究与实践》2004年第18卷第2期发表的“浙贝母中生物碱提取方法以及条件的优化”文中研究显示用盐酸作提取溶媒，会将贝母里大量的水溶性成分提取出来，使萃取时产生严重的乳化现象，致使萃取不完全，造成生物碱损失。此外，大孔树脂对中药中各类化学成分的吸附特征常常不同，由于非极性静电吸附原理对生物碱有效成分和脂溶性杂质的分离选择性差，使得生物碱和大量脂溶性杂质往往一起洗脱下来，所以采用大孔吸附树脂难以分离得到高纯度的产物。
陈文君等在《浙江中医药大学学报》2008年7月第32卷第4期发表的“浙贝母花、地上茎与鳞茎总生物碱、总皂苷含量测定的比较”文中研究显示：浙贝母生物碱含量花为0.182％，茎为0.047％,鳞茎为0.341％；皂苷花为5.112％，茎为8.840％，鳞茎为1.724％。贝母花生物碱含量低于鳞茎，且皂苷含量较多，色素、氨基酸等成分多于鳞茎，采用先醇提后大孔树脂纯化，生物碱富集率较低。
对贝母花有效部位或者成分进行有针对性提取和富集的相关报道目前较少。《卫生部药品标准中药成方制剂》第六册颁布了贝母花流浸膏和贝母花片的质量标准，其提取方法均采用水提醇沉法，取贝母花，加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约500ml，放冷，加入等量的乙醇，搅匀，密闭，静置3～4天，取上清液，滤过，再加乙醇使成1000ml，即得，其中总生物碱含量不得少于0.085％。上述贝母花质量标准公开贝母花流浸膏未经提纯，其成分非常复杂，总生物碱含量非常低，临床治疗效果不明显。
如CN200510069198.X中公开了含贝母花有效成分的提取物制备方法，取贝母花适量，加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.15以上，加2倍量的乙醇，搅拌，静置48天，取上清液浓缩至相对密度为1.30-1.35的稠膏，或继续干燥粉碎成干粉，即得。上述专利公开的贝母花的提取工艺采用药材煎煮、浓缩、醇沉等常规性的方法，缺点是其生物碱提取率低，有效成分含量少。
又如CN201010122848.3中公开一种浙贝母花微粉的制备方法，其将新鲜贝母花按花和水1:5-30提取，提取液真空浓缩，浓缩液喷雾干燥得微粉。该方法直接水提，含有大量的氨基酸，营养价值较高，但缺点是生物碱提取率较低，存在活性成分流失问题。
综上所述，目前针对贝母花开发的研究非常少，已公开贝母花提取物的成分非常复杂，通常以总生物碱为含量控制指标，且其含量非常低，临床治疗效果不明显；而且现有的提取方法中生物碱的提取率低，不具有通用性。因此，如何提供一种以治疗活性成分贝母素甲、贝母素乙为主要成分的贝母花提取物及其制备方法是本领域技术人员急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种贝母花提取物及其制备方法和应用，解决了背景技术中所述的技术缺陷。
本发明的技术方案具体如下：
一种贝母花提取物，该提取物中含有贝母素甲与贝母素乙，贝母素甲与贝母素乙的含量之和为提取物总量的20％-60％(w/w)。
为了获得更好的止咳化痰活性，上述贝母花提取物中贝母素甲与贝母素乙的含量之和为提取物总量的35％-55％(w/w)，且贝母素甲与贝母素乙的含量比值为1-2。
更优选的，贝母花提取物中贝母素甲与贝母素乙的含量之和为提取物总量的50％-55％(w/w)，且贝母素甲与贝母素乙的含量比值为1.5-1.8。
本发明还提供了一种如前所述的贝母花提取物的制备方法，具体制备步骤如下：步骤(1)贝母花经粉碎后，用3-20倍贝母花药材体积量PH为3-4的30-50％乙醇溶液超声提取，共2～3次，每次1h，合并滤液；步骤(2)滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25的稠膏，加入1-2倍体积量乙醇，调节PH至8，滤过得提取液；步骤(3)将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用10％-20％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用40％-60％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得。
优选的，步骤(1)采用10倍体积量PH为3的40％乙醇溶液超声提取，共3次，每次1h，合并滤液。
优选的，步骤(2)滤液减压浓缩至相对密度为1.20的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至8，滤过得提取液。
优选的，步骤(3)将提取液上Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱，先用15％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用45％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥粉碎，即得。
本发明还提供了一种如前所述的贝母花提取物在制备具有止咳化痰效果的药物或保健品中的应用。本申请的发明人发现，本发明提供的贝母花提取物治疗止咳化痰的效果明显优 于贝母花片，且当贝母花提取物中贝母素甲与贝母素乙的含量之和为提取物总量的50％-55％，且贝母素甲与贝母素乙的含量比值为1.5-1.8时，上述效果更好。
综上，本发明以贝母花为原料，通过酸性乙醇超声提取、减压浓缩、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离纯化获得贝母花提取物；本发明具体如下有益效果：
1、贝母花粉比重小，本发明采用3-20倍体积量PH为3-4的30-50％(v/v)乙醇溶液超声提取，酸性乙醇超声有利于生物碱浸出，简化步骤，提高提取效率；同时，其还能避免过多的脂溶性等杂质带到提取液中。本发明人发现，当采用10倍体积量PH为3的40％(v/v)乙醇溶液超声提取3次，每次1h时，贝母素甲和贝母素乙转移率最高，能最大程度保留贝母花中贝母素甲和贝母素乙成分，同时，通过减压浓缩控制贝母花中脂溶性成分如色素、皂苷、氨基酸等的溶解度，降低提取液中的非目标杂质成分，提高贝母提取物中贝母素甲和贝母素乙的纯度。
2、我们知道，生物碱和脂溶性成分可同时从大孔树脂、硅胶柱、聚酰胺柱等中洗脱下来，降低提取物中贝母素甲及贝母素乙含量，故现有文献公开的贝母及贝母花提取物中生物碱或者贝母素甲、贝母素乙的含量都偏低。本发明人经创造性试验发现，贝母素甲、贝母素乙对于Sephadex LH-20葡聚糖凝胶具有特殊的吸附性，只有特定纯度的乙醇可以完全将其洗脱下来。亦因此，本发明采用先用15％乙醇溶液上Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱洗脱至洗脱液无色，最大程度的将乙醇提取液中的酸性、中性物质从Sephadex LH-20葡聚糖凝胶中洗脱下来，再用45％乙醇溶液可以将贝母素甲和贝母素乙从凝胶柱上完全洗脱下来，不仅提高了提取物中贝母素甲和贝母素乙的转移率，而且将贝母花中的大部分脂溶性成分、其他生物碱等非目标成分去除了，提高了贝母素甲、贝母素乙的含量。
3、本发明提供一种贝母花提取物制备方法，包括酸性乙醇超声提取、减压浓缩、不同浓度乙醇洗脱Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离纯化过程，操作简单，工艺合理，同时该制备方法仅使用乙醇，未使用甲醇、氯仿等有机溶剂，环保低毒。
4、本发明提供一种贝母花提取物，当贝母花提取物中贝母素甲与贝母素乙的含量之和为提取物总量的50％-55％，且贝母素甲与贝母素乙的含量比值为1.5-1.8时，具有显著优于贝母花片的止咳化痰活性，疗效的对比实验详见实施例17和实施例18。
附图说明
图1是贝母素甲及贝母素乙对照品色谱图；1是贝母素甲，其出峰时间是14.987min；2是贝母素乙，其出峰时间是18.565min。
图2是实施例7贝母花提取物色谱图；1是贝母素甲，其出峰时间是15.027min；2是贝母素乙，其出峰时间是18.605min。
图3是实施例16浙贝母提取物色谱图；1是贝母素甲，其出峰时间是14.914min；2是贝母素乙，其出峰时间是18.494min。
具体实施方式
下面的实施例，用于进一步说明和描述本发明，但并不意味着本发明仅限于此。
实施例1：贝母素甲、贝母素乙含量测定方法
照药典规定的《高效液相色谱法检验标准操作程序》测定。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％二乙胺为流动相B，按下表中规定进行梯度洗脱，蒸发光散射检测器检测。理论板数按贝母素甲峰计算应不低于2000。
表1：梯度洗脱条件
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0-5 | 50 | 50 |
| 5-20 | 50-70 | 50-30 |
| 20-30 | 70-90 | 30-10 |
对照品溶液的制备：取贝母素甲对照品、贝母素乙对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含贝母素甲0.4mg、贝母素乙0.2mg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备：取贝母花药材粉末2g，精密称定，置烧瓶中，加浓氨试液4ml浸润1小时，精密加入三氯甲烷：甲醇(4：1)的混合溶液40ml，称定重量，混匀，置80℃水浴中加热回流2小时，放冷，再称定重量，加上述混合溶液补足减失的重量，滤过。精密量取续滤液10ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得药材供试品。精密称取贝母花提取物1mg，甲醇溶解定容至2ml，即得提取物供试品。
测定法分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液5～15μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算贝母素甲、贝母素乙的含量，即得。
实施例2：以提取物中贝母素甲和贝母素乙的含量和转移率为考察指标，对乙醇溶液pH值、乙醇体积分数、料液比、超声次数、超声时间、稠膏相对密度及乙醇用量进行考察。
1、取10g贝母花粉末，采用10倍体积量0.5％HCl、0.05％HCl、PH＝1、2、3、4、5、6的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，滤液浓缩干燥，测定提取物中贝母素甲+贝母素乙含量及其转移率。
试验结果表明：当PH3-4，提取物中贝母素甲+贝母素乙含量及转移率最佳。
表:2：溶剂酸度对提取效果的影响
| 0.5％HCL | 0.05％HCl | PH＝1 | PH＝2 | PH＝3 | PH＝4 | PH＝5 | PH＝6 | |
| 含量 | 0.326％ | 0.417％ | 0.469％ | 0.619％ | 1.694％ | 1.423％ | 0.716％ | 0.691％ |
| 转移率 | 86.78％ | 89.23％ | 91.32％ | 91.69％ | 94.37％ | 92.66％ | 88.71％ | 80.26％ |
2、取10g贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，滤液浓缩干燥，测定提取物中贝母素甲+贝母素乙含量及其转移率。
试验结果表明：当乙醇含量30-50％(v/v)时，提取物中贝母素甲+贝母素乙含量及转移率最佳。
表3：乙醇浓度对提取效果的影响
| 20％ | 30％ | 40％ | 50％ | 60％ | 70％ | 80％ | |
| 含量 | 0.739％ | 1.215％ | 1.659％ | 1.492％ | 1.026％ | 0.832％ | 0.765％ |
| 转移率 | 94.89％ | 94.57％ | 93.67％ | 92.21％ | 82.15％ | 78.42％ | 76.18％ |
3、取10g贝母花粉末，采用3、5、10、15、20倍量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，滤液浓缩干燥，测定提取物中贝母素甲+贝母素乙含量及其转移率。
试验结果表明：当提取溶剂为10倍体积量时，提取物中贝母素甲+贝母素乙含量及转移率即可达到最佳。
表4：料液比对提取效果的影响
| 3 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 含量 | 0.851％ | 1.157％ | 1.633％ | 1.587％ | 1.564％ |
| 转移率 | 59.34％ | 72.32％ | 94.09％ | 94.76％ | 95.04％ |
4、取10g贝母花粉末，采用10倍量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取1、2、3、4、5、6次，每次1h，滤液浓缩干燥，测定提取物中贝母素甲+贝母素乙含量及其转移率。
试验结果表明：当超声次数为2-3次，提取物中贝母素甲+贝母素乙含量及转移率即可达到最佳。
表5：超声次数对提取效果的影响
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 含量 | 1.689％ | 1.625％ | 1.595％ | 1.478％ | 1.466％ | 1.434％ |
| 转移率 | 67.23％ | 87.56％ | 93.12％ | 94.26％ | 94.35％ | 94.69％ |
5、取10g贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次0.5、1、1.5h、2h，滤液浓缩干燥，测定提取物中贝母素甲+贝母素乙含量及其转移率。
试验结果表明：当每次超声时间为1小时/次，提取物中贝母素甲+贝母素乙含量及转移率即可达到最佳。
表6：超声时间对提取效果的影响
| 0.5h | 1h | 1.5h | 2h | |
| 含量 | 1.616％ | 1.649％ | 1.572％ | 1.549％ |
| 转移率 | 87.25％ | 94.56％ | 94.22％ | 94.84％ |
综上最佳提取工艺条件为：取适量贝母花药材粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液超声提取，共3次，每次1h，合并滤液。
6、取10g贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度＝1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35的稠膏，加入2倍量乙醇，调节PH至8，滤过浓缩干燥。测定提取物中贝母素甲+贝母素乙含量及其转移率。
试验结果表明：当稠膏相对密度为1.15-1.25时，提取物中贝母素甲+贝母素乙含量及转移率最佳。
表7：稠膏相对密度对有效成分的影响
| 1.10 | 1.15 | 1.20 | 1.25 | 1.30 | 1.35 |
| 含量 | 5.438％ | 6.359％ | 6.851％ | 6.517％ | 5.046％ | 4.152％ |
| 转移率 | 60.67％ | 77.12％ | 85.31％ | 84.43％ | 85.27％ | 86.69％ |
7、取10g贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.20的稠膏，加入1、1.5、2、2.5、3倍体积量乙醇，调节PH至8，滤过浓缩干燥。测定提取物中贝母素甲+贝母素乙含量及其转移率。
试验结果表明：当乙醇用量在1.5-3倍时，贝母素甲+贝母素乙含量及其转移率相当，考虑到后续上柱量的影响，1.5倍体积量最佳。
表8：乙醇用量对有效成分的影响
| 1 | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 | |
| 含量 | 5.621％ | 6.634％ | 6.725％ | 6.541％ | 6.411％ |
| 转移率 | 71.32％ | 83.24％ | 84.57％ | 85.26％ | 86.10％ |
实施例3：纯化工艺选择
取最佳提取工艺收集滤液处理后，上大孔树脂HPD100型、HPD722型、D101型，中性氧化铝柱，Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱，阳离子交换树脂柱，收集有效部位，浓缩干燥。测定其贝母素甲+贝母素乙转移率和含量。
试验结果表明：Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱在转移、富集贝母素甲和贝母素乙有比较明显的优势。
表9：不同纯化工艺提取物比较
| 纯化工艺 | HPD100 | HPD722 | D101 | 中性氧化铝 | LH-20 | 阳离子 |
| 转移率 | 65.62％ | 60.31％ | 70.56％ | 58.69％ | 83.15％ | 75.49％ |
| 含量 | 16.67％ | 14.64％ | 19.78％ | 10.12％ | 46.59％ | 13.58％ |
实施例4：
取1kg贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.20的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至7，滤过得提取液；将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用10％乙醇溶 液洗脱至洗脱液无色，再用40％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得贝母花提取物2.34g，贝母素甲+贝母素乙含量23.42％，贝母素甲/贝母素乙含量比值为0.67。
实施例5：
取1kg贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.17的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至9，滤过得提取液；将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用10％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用40％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得贝母花提取物2.18g，贝母素甲+贝母素乙含量36.42％，贝母素甲/贝母素乙含量比值为1.03。
实施例6：
取1kg贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.16的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至9，滤过得提取液；将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用10％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用45％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得贝母花提取物2.54g，贝母素甲+贝母素乙含量31.13％，贝母素甲/贝母素乙含量比值为1.47。
实施例7：
取1kg贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.15的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至8，滤过得提取液；将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用10％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用45％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得贝母花提取物1.95g，贝母素甲+贝母素乙含量53.22％，贝母素甲/贝母素乙含量比值为1.78。
实施例8：
取1kg贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.21的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至8，滤过得提取液；将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用20％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用40％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得贝母花提取 物1.81g，贝母素甲+贝母素乙含量36.22％，贝母素甲/贝母素乙含量比值为1.33。
实施例9：
取1kg贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.23的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至10，滤过得提取液；将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用10％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用60％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得贝母花提取物1.79g，贝母素甲+贝母素乙含量34.57％，贝母素甲/贝母素乙含量比值为1.55。
实施例10：
取1kg贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.19的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至9，滤过得提取液；将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用20％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用50％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得贝母花提取物2.17g，贝母素甲+贝母素乙含量40.34％，贝母素甲/贝母素乙含量比值为1.48。
实施例11：
取1kg贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.14的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至8，滤过得提取液；将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用20％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用60％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得贝母花提取物1.68g，贝母素甲+贝母素乙含量48.36％，贝母素甲/贝母素乙含量比值为2.42。
实施例12：
取1kg贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.17的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至8，滤过得提取液；将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用20％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用60％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得贝母花提取物1.34g，贝母素甲+贝母素乙含量53.21％，贝母素甲/贝母素乙含量比值为2.07。
实施例13：
取1kg贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.18的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至8，滤过得提取液；将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用10％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用45％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得贝母花提取物1.47g，贝母素甲+贝母素乙含量47.25％，贝母素甲/贝母素乙含量比值为1.88。
实施例14：
取1kg贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.08的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至9，滤过得提取液；将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用20％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用55％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得贝母花提取物2.16g，贝母素甲+贝母素乙含量28.51％，贝母素甲/贝母素乙含量比值为1.61。
实施例15：
取1kg贝母花粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.23的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至8，滤过得提取液；将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用10％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用60％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得贝母花提取物2.24g，贝母素甲+贝母素乙含量30.12％，贝母素甲/贝母素乙含量比值为1.39。
实施例16：
取1kg浙贝母药材粉末，采用10倍体积量PH＝3的40％(v/v)乙醇溶液，超声提取3次，每次1h，合并滤液；滤液减压浓缩至相对密度为1.15的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至8，滤过得提取液；将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用10％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用45％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥，即得贝母花提取物2.87g，贝母素甲+贝母素乙含量34.35％，贝母素甲/贝母素乙含量比值为1.74。
实施例17：镇咳试验
取体重18-22g小鼠60只，雌雄各半，随机分成空白组、贝母花片组(给药量0.28g/kg，相当生药量1g/kg，临床成人用量3倍)、实施例4、7、10、11贝母花提取物(给药量0.2mg/kg，相当于生药量0.1g/kg)，连续灌胃给药7天。末次给药后40min分别将小鼠置密闭玻璃箱，用超声雾化器向箱中喷入浓氨水，造成小鼠咳嗽反射。记录2min内小鼠咳嗽次数。
表10：各组药物对浓氨水引咳的抑制作用
| 组别 | 动物数 | 剂量 | 咳嗽次数 |
| 空白组 | 10 | - | 76.25±10.12 |
| 贝母花片 | 10 | 0.28g/kg | 54.39±7.62** |
| 实施例4 | 10 | 0.2mg/kg | 27.53±9.56** |
| 实施例7 | 10 | 0.2mg/kg | 16.25±5.42** |
| 实施例10 | 10 | 0.2mg/kg | 18.71±4.16** |
| 实施例11 | 10 | 0.2mg/kg | 29.58±8.96** |
注：**与空白组比较P<0.01
由实验结果可知：贝母花片和本发明贝母花提取物均有镇咳效果；本发明贝母花提取物镇咳效果优于贝母花片，且当贝母素甲+贝母素乙含量为35％-55％(w/w)，贝母素甲/贝母素乙和含量比值为1-2，效果更佳。
实施例18：祛痰试验
取体重18-22g小鼠60只，雌雄各半，随机分成空白组、贝母花片组(给药量0.28g/kg，相当生药量1g/kg，临床成人用量3倍)、实施例4、7、10、11贝母花提取物(给药量0.2mg/kg，相当于生药量0.1g/kg)，连续灌胃给药7天。末次给药后30min各鼠肌注20％乌拉坦0.15ml，待小鼠于半昏迷状态时，将小鼠固定，剪开颈部皮肤，暴露并分离气管，在甲状软骨下缘正中处插入直径1mm，长约10cm毛细管。30min后，去除毛细管，测量痰液高度。
表11：各组药物对毛细管排痰法排痰量的影响
| 组别 | 动物数 | 剂量 | 痰液高度cm |
| 空白组 | 10 | - | 0.26±0.15 |
| 贝母花片 | 10 | 0.28g/kg | 0.58±0.32** |
| 实施例4 | 10 | 0.2mg/kg | 0.99±0.26** |
| 实施例7 | 10 | 0.2mg/kg | 1.47±0.42** |
| 实施例10 | 10 | 0.2mg/kg | 1.35±0.67** |
| 实施例11 | 10 | 0.2mg/kg | 1.03±0.55** |
注：**与空白组比较P<0.01
试验结果表明：贝母花片和本发明贝母花提取物均有祛痰效果；本发明贝母花提取物祛痰效果优于贝母花片，且当贝母素甲+贝母素乙含量为35％-55％(w/w)，贝母素甲/贝母素乙和含量比值为1-2，效果更佳。
Claims (8)
1.一种贝母花提取物，其特征在于，所述提取物中含有贝母素甲与贝母素乙，贝母素甲与贝母素乙的含量之和为提取物总量的20％-60％(w/w)。
2.根据权利要求1所述的贝母花提取物，其特征在于，所述贝母素甲与贝母素乙的含量之和为提取物总量的35％-55％(w/w)，且贝母素甲与贝母素乙的含量比值为1-2。
3.根据权利要求2所述的贝母花提取物，其特征在于，所述贝母素甲与贝母素乙的含量之和为提取物总量的50％-55％(w/w)，且贝母素甲与贝母素乙的含量比值为1.5-1.8。
4.一种根据权利要求1～3任一项所述的贝母花提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)贝母花经粉碎后，用3-20倍体积量、PH为3-4的30-50％乙醇溶液超声提取，共2～3次，每次1h，合并滤液；步骤(2)滤液减压浓缩至相对密度为1.15-1.25的稠膏，加入1-2体积倍量乙醇，调节PH至8，滤过得提取液；步骤(3)将提取液用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱分离，先用10％-20％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用40％-60％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥粉碎，即得。
5.根据权利要求4所述的贝母花提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)采用10倍体积量、PH为3的40％乙醇溶液超声提取，共3次，每次1h，合并滤液。
6.根据权利要求4所述的贝母花提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)滤液减压浓缩至相对密度为1.20的稠膏，加入1.5倍体积量乙醇，调节PH至8，滤过得提取液。
7.根据权利要求4所述的贝母花提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)将提取液上Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱，先用15％乙醇溶液洗脱至洗脱液无色，再用45％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩干燥粉碎，即得。
8.一种根据权利要求1～3任一项所述的贝母花提取物在制备具有止咳化痰效果的药物或保健品中的应用。
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