CN102772500A - 具有抗炎作用的热淋清颗粒原料头花蓼提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有抗炎作用的热淋清颗粒原料头花蓼提取物。具体地，本发明涉及一种头花蓼提取物，其制法包括：(1)将头花蓼地上部分鲜品或干品加5-15倍量的50~90%乙醇回流提取，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇浸膏；(2)使醇浸膏混悬于甲醇中，超声处理，离心，将上清液加载到MCI大孔树脂柱上；(3)用水，10%-100%甲醇依次进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，回收溶剂，由不同溶剂洗脱获得的部位干燥，得到30%-80%之间任意浓度间隔或浓度点的甲醇洗脱物，或者它们的混合物，即得。本发明头花蓼提取物具有如说明书所述的有益效果。
Description
技术领域
本发明属于中药领域，涉及用于制备中药热淋清颗粒的原料即药材头花蓼的提取物。具体地，本发明涉及由热淋清的原料即药材头花蓼的醇提取物所获得的有效部位，以及该有效部位的制备方法和用途，该有效部位具有良好抗炎作用。
背景技术
头花蓼(Polygonum capitatum Buch-Ham ex D.Don)为蓼科蓼属多年生草本植物。具有清热利湿、利尿通淋之功效，在临床上治疗泌尿系统感染有着显著的效果。以其为原料制成的中成药制剂“热淋清颗粒”2004年进入国家基本医疗保险目录，2012年进入贵州省基本药物目录。
头花蓼是少数民族地区的常用药，主要用于肾盂肾炎、尿道感染、利尿通淋等症。相关的药理学研究少见，目前仅有任光友等几篇报道。任光友采用大鼠细菌性肾盂肾炎模型进行实验，结果头花蓼水提取物组大鼠尿液中的WBC和BLD与对照组比较明显减少，显示头花蓼水提物对肾盂肾炎具有一定的抗炎作用。任光友等以小鼠腹腔注射大肠杆菌菌液观察5天内小鼠死亡情况，结果对照组死亡率为100%，头花蓼组死亡率分别为20%和50%，显示头花蓼水提物能够对抗大肠杆菌引起的感染。任光友等以头花蓼水提物灌胃给药予家兔，结果，头花蓼水提物组与对照组比较，体温无显著性差异，但能降低静脉注射伤寒副伤寒菌苗引起的家兔的发热体温。任光友等，以头花蓼水提物分别灌胃给药家兔、大鼠，与空白组和速尿对照组比较尿量。结果显示头花蓼水提物对家兔和大鼠无明显利尿作用。徐英春等人采用琼脂稀释法检测了头花蓼对10株淋病奈瑟球菌(淋球菌)的体外抑菌活性，结果头花蓼对淋球菌有抑菌活性。其对10株淋球菌的最小抑菌浓度范围为8~32g/L，平均值为11.2g/L。
中国专利申请公开说明书CN1054899A(中国专利申请号90107810.7，公开日1991年10月2日)中公开了一种泌感灵冲剂、糖浆生产工艺。该生产工艺是以四季草为原料用水煎煮30-60分钟，提取液过滤浓缩，将其上清液减压浓缩成膏，再用60-70%乙醇提取，将乙醇提取液真空干燥，得四季红浸膏，进一步配制成冲剂或糖浆剂，据信其具有解毒、散瘀、利尿、通淋的功效。
中华人民共和国卫生部药典委员会1998年编的中华人民共和国卫生部《药品标准—中药成方制剂》(第十七册)中收载了名为“热淋清颗粒”的中成药制剂，其是通过将头花蓼加水煎煮两次后过滤浓缩制成的。
CN 1481832A(中国专利申请号02129686.3，公开日2004年3月17日)和CN 1483466A(中国专利申请号03146381.9，公开日2004年3月24日)公开了头花蓼提取物，其基本上是由以下步骤制备的：a.由头花蓼全草的鲜品或干品用水分两次煎煮或者用醇水混合物分二至三次回流提取，每次1-2小时，合并煎煮液，过滤浓缩至20°C时的相对密度为1.2，喷雾干燥或减压干燥得到；或者，b.由头花蓼全草及其水提药渣经二氧化碳超临界萃取得到。据信此提取物可用于抗菌、抗炎、镇痛、利尿、治疗泌尿系统结石、治疗肾盂肾炎以及前列腺炎。
尽管目前有诸多关于制备头花蓼提取物的报道，然而本领域技术人员仍然期待从头花蓼获得临床有效的产品。
发明内容
本发明目的是期待从头花蓼获得一种临床有效的产品。本发明人发现，使用醇提取头花蓼，得到的提取物经特定的大孔树脂洗脱所获得的洗脱物，其在生物活性方面具有令人期待的效果。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种头花蓼提取物，其基本上由包括以下步骤的方法制备得到：
(1)将头花蓼地上部分鲜品或干品加5-15倍量(例如5-12倍量，例如6-10倍量)的50~90%(例如60~80%，例如65~75%，例如约70%)乙醇回流提取1-3次(例如2次)，每次1-3小时(例如约1.5小时)，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇浸膏；
(2)使醇浸膏混悬于甲醇中，超声处理0.5~5小时(例如0.5~3小时，例如1~2小时，例如约1.5小时)，离心，将上清液加载到MCI大孔树脂柱(例如，每100g浸膏使用树脂的量为0.5-4升，例如1-3升，例如1.5-2.5升，例如2升)上；
(3)用水，10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、100%甲醇依次进行梯度洗脱(例如每种溶剂用量为0.5~5倍柱体积，例如0.5~2.5倍柱体积，例如0.5~2倍柱体积，例如1倍柱体积)，收集各部分洗脱液，回收溶剂，由不同溶剂洗脱获得的部位干燥，得到30%-80%之间任意浓度间隔或浓度点的甲醇洗脱物，或者它们的混合物，即得。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物，其中步骤(3)所得甲醇洗脱物是40%-50%甲醇洗脱物(在本发明中可简称为：部位D)。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物，其中步骤(3)所得甲醇洗脱物是50%-60%甲醇洗脱物(在本发明中可简称为：部位F)。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物，其中步骤(3)所得甲醇洗脱物是40%-60%之间甲醇洗脱物的混合物(在本发明中可简称为：部位W)。在本发明中，该部位W可以是部位D至部位F干燥品的混合物，亦可以是40%-60%甲醇洗脱所得混合液经除溶剂干燥后的干燥品。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物，其中部位D中含有可水解鞣质例如可水解鞣质davidiin。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物，其中部位F中含有黄酮苷类。根据本发明第一方面的头花蓼提取物，其中部位W中含有可水解鞣质和/或黄酮苷类，例如可水解鞣质davidiin和/或槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物，其照超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法(在本发明中可简称为UPLC-TOF-MS)测定，结果：
(1d)在保留时间12.0-13.0min之间(例如约12.5min处)显示可水解鞣质(例如davidiin)的色谱峰；
(1f)在保留时间12.8-13.8min之间(例如约13.3min处)、保留时间13.8-14.8min之间(例如约14.3min处)和保留时间14.8-15.8min之间(例如约15.3min处)显示黄酮苷类(例如槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin)的色谱峰；和/或
(w)显示以上(1d)和(1f)中所示任一或全部色谱峰；
其中，UPLC-TOF-MS的测定方法如下：
(i)供试液配制：称取适量头花蓼提取物粉末，加入70%甲醇制成浓度约5mg/ml的混悬液，超声使尽量溶解，混悬液稀释10倍，过滤，进样2μl作质谱检测；
(ii)色谱及质谱分析条件：
色谱柱：Acquity BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm)，柱温：40℃；流速：0.35ml/min；进样量：2μl；质谱条件：离子源：ESI源；干燥气体温度：180℃；毛细管电压：4500eV；检测模式：负离子模式；喷雾压力：2.5bar；干燥气(N2)流速：8L/min；扫描范围：100-2000amu；碰撞能量:10ev；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，0.1%甲酸乙腈溶液为流动相B，按下表规定的程序进行梯度洗脱：
| 时间(min) | A(%) | B(%) |
| 0 | 95 | 5 |
| 0.5 | 95 | 5 |
| 20 | 81.5 | 18.5 |
| 28 | 0 | 100 |
| 30 | 0 | 100 |
| 30.1 | 95 | 5 |
| 32 | 95 | 5 |
根据本发明第一方面的头花蓼提取物，其照所述超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，结果：(1d)在保留时间12.0-13.0min之间(例如约12.5min处)显示可水解鞣质(例如davidiin)的色谱峰。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物，其照所述超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，结果：
(1d)在保留时间12.0-13.0min之间(例如约12.5min处)显示可水解鞣质(例如davidiin)的色谱峰；和/或
(1f)在保留时间12.8-13.8min之间(例如约13.3min处)、保留时间13.8-14.8min之间(例如约14.3min处)和保留时间14.8-15.8min之间(例如约15.3min处)显示黄酮苷类(例如槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin)的色谱峰。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物，其具有本发明第二方面任一实施方案所述特征。
本发明第二方面提供了一种头花蓼提取物，其照超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法(在本发明中可简称为UPLC-TOF-MS)测定，结果：
(1d)在保留时间12.0-13.0min之间(例如约12.5min处)显示可水解鞣质(例如davidiin)的色谱峰；
(1f)在保留时间12.8-13.8min之间(例如约13.3min处)、保留时间13.8-14.8min之间(例如约14.3min处)和保留时间14.8-15.8min之间(例如约15.3min处)显示黄酮苷类(例如槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin)的色谱峰；和/或
(w)显示以上(1d)和(1f)中所示任一或全部色谱峰；
其中，UPLC-TOF-MS的测定方法如下：
(i)供试液配制：称取适量头花蓼提取物粉末,加入70%甲醇制成浓度约5mg/ml的混悬液，超声使尽量溶解，混悬液稀释10倍，过滤，进样2μl作质谱检测；
(ii)色谱及质谱分析条件：
色谱柱：Acquity BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm)，柱温：40℃；流速：0.35ml/min；进样量：2μl；质谱条件：离子源：ESI源；干燥气体温度：180℃；毛细管电压：4500eV；检测模式：负离子模式；喷雾压力：2.5bar；干燥气(N2)流速：8L/min；扫描范围：100-2000amu；碰撞能量:10ev；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，0.1%甲酸乙腈溶液为流动相B，按下表规定的程序进行梯度洗脱：
| 时间(min) | A(%) | B(%) |
| 0 | 95 | 5 |
| 0.5 | 95 | 5 |
| 20 | 81.5 | 18.5 |
| 28 | 0 | 100 |
| 30 | 0 | 100 |
| 30.1 | 95 | 5 |
| 32 | 95 | 5 |
根据本发明第二方面的头花蓼提取物，其照所述超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，结果：(1d)在保留时间12.0-13.0min之间(例如约12.5min处)显示可水解鞣质(例如davidiin)的色谱峰。
根据本发明第二方面的头花蓼提取物，其照所述超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，结果：
(1d)在保留时间12.0-13.0min之间(例如约12.5min处)显示可水解鞣质(例如davidiin)的色谱峰；和/或
(1f)在保留时间12.8-13.8min之间(例如约13.3min处)、保留时间13.8-14.8min之间(例如约14.3min处)和保留时间14.8-15.8min之间(例如约15.3min处)显示黄酮苷类(例如槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin)的色谱峰。
根据本发明第二方面的头花蓼提取物，其基本上由包括以下步骤的方法制备得到：
(1)将头花蓼地上部分鲜品或干品加5-15倍量(例如5-12倍量，例如6-10倍量)的50~90%(例如60~80%，例如65~75%，例如约70%)乙醇回流提取1-3次(例如2次)，每次1-3小时(例如约1.5小时)，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇浸膏；
(2)使醇浸膏混悬于甲醇中，超声处理0.5~5小时(例如0.5~3小时，例如1~2小时，例如约1.5小时)，离心，将上清液加载到MCI大孔树脂柱(例如，每100g浸膏使用树脂的量为0.5-4升，例如1-3升，例如1.5-2.5升，例如2升)上；
(3)用水，10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、100%甲醇依次进行梯度洗脱(例如每种溶剂用量为0.5~5倍柱体积，例如0.5~2.5倍柱体积，例如0.5~2倍柱体积，例如1倍柱体积)，收集各部分洗脱液，回收溶剂，由不同溶剂洗脱获得的部位干燥，得到30%-80%之间任意浓度间隔或浓度点的甲醇洗脱物，或者它们的混合物，即得。
根据本发明第二方面的头花蓼提取物，其中步骤(3)所得甲醇洗脱物是40%-50%甲醇洗脱物(在本发明中可简称为：部位D)。
根据本发明第二方面的头花蓼提取物，其中步骤(3)所得甲醇洗脱物是50%-60%甲醇洗脱物(在本发明中可简称为：部位F)。
根据本发明第二方面的头花蓼提取物，其中步骤(3)所得甲醇洗脱物是40%-60%之间甲醇洗脱物的混合物(在本发明中可简称为：部位W)。在本发明中，该部位W可以是部位D至部位F干燥品的混合物，亦可以是40%-60%甲醇洗脱所得混合液经除溶剂干燥后的干燥品。
根据本发明第二方面的头花蓼提取物，其中部位D中含有可水解鞣质例如可水解鞣质davidiin。
根据本发明第一方面的头花蓼提取物，其中部位F中含有黄酮苷类。
根据本发明第二方面的头花蓼提取物，其中部位W中含有可水解鞣质和/或黄酮苷类，例如可水解鞣质davidiin和/或槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin。
根据本发明第二方面的头花蓼提取物，其具有本发明第一方面任一实施方案所述特征。
本发明第三方面提供了制备本发明第一方面或第二方面任一实施方案所述头花蓼提取物的方法，其基本上包括以下步骤：
(1)将头花蓼地上部分鲜品或干品加5-15倍量(例如5-12倍量，例如6-10倍量)的50~90%(例如60~80%，例如65~75%，例如约70%)乙醇回流提取1-3次(例如2次)，每次1-3小时(例如约1.5小时)，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇浸膏；
(2)使醇浸膏混悬于甲醇中，超声处理0.5~5小时(例如0.5~3小时，例如1~2小时，例如约1.5小时)，离心，将上清液加载到MCI大孔树脂柱(例如，每100g浸膏使用树脂的量为0.5-4升，例如1-3升，例如1.5-2.5升，例如2升)上；
(3)用水，10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、100%甲醇依次进行梯度洗脱(例如每种溶剂用量为0.5~5倍柱体积，例如0.5~2.5倍柱体积，例如0.5~2倍柱体积，例如1倍柱体积)，收集各部分洗脱液，回收溶剂，由不同溶剂洗脱获得的部位干燥，得到30%-80%之间任意浓度间隔或浓度点的甲醇洗脱物，或者它们的混合物，即得。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(3)所得甲醇洗脱物是40%-50%甲醇洗脱物(在本发明中可简称为：部位D)。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(3)所得甲醇洗脱物是50%-60%甲醇洗脱物(在本发明中可简称为：部位F)。
根据本发明第三方面的方法，其中步骤(3)所得甲醇洗脱物是40%-60%之间甲醇洗脱物的混合物(在本发明中可简称为：部位W)。在本发明中，该部位W可以是部位D至部位F干燥品的混合物，亦可以是40%-60%甲醇洗脱所得混合液经除溶剂干燥后的干燥品。
根据本发明第三方面的方法，其中部位D中含有可水解鞣质例如可水解鞣质davidiin。
根据本发明第三方面的方法，其中部位F中含有黄酮苷类。
根据本发明第三方面的方法，其中部位W中含有可水解鞣质和/或黄酮苷类，例如可水解鞣质davidiin和/或槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin。
根据本发明第三方面的方法，其中所得头花蓼提取物具有本发明第一方面或第二方面任一实施方案所述特征。
本发明第四方面提供本发明第一方面或第二方面所述头花蓼提取物在制备抗炎药物中的用途。
本发明第五方面提供了选自下列的化合物：Davidiin、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、或石榴皮素B/carpinusin。
其中化合物Davidiin具有如下化学结构：
本发明第六方面提供了Davidiin在制备抗炎药物中的用途。
本发明第六方面提供了槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、或石榴皮素B/carpinusin在制备抗炎药物中的用途。
本发明第六方面提供了一种药物组合物，其中包含本发明第一方面或第二方面任一实施方案所述的头花蓼提取物或者第五方面的化合物以及任选的药学可接受的载体。
根据本发明第六方面的药物组合物，其可用作抗炎药物。
根据本发明第六方面的药物组合物，其呈口服或注射给药的制剂形式。在一个实施方案中，所述药物组合物呈片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液剂、注射剂(水针和/或粉针)等的形式。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中，本发明方法得到“头花蓼提取物”，该术语亦可称为本发明的“头花蓼有效组分”或者本发明的“头花蓼有效部位”。
在本发明中，MCI大孔树脂可以是是由日本三菱公司生产的MCIGEL系列，MCI GEL系列反相分离填料是在三菱化学Diaion和Sepabeads大孔吸附树脂基础上设计的，因为基于现代的HPLC高压液相色谱分离技术，较小的颗粒有更高的色谱分离性能，广泛地用于天然产物和发酵产物的分离。MCI大孔树脂有两种填料：聚苯乙烯和丙烯酸型，聚苯乙烯型的树脂粒经范围为4μm-100μm，甲基丙烯酸酯型树脂的粒经范围为4μm－31μm。此外MCI系列不仅有大孔型的树脂，还有阴离子型及阳离子型等型号树脂。MCI GEL反相精细分离填料是一种树脂类填料，可用于分离皂苷类成分，一般用甲醇水或乙醇水洗脱。再者MCI一般用来去处极性小的成分中的叶绿素，对石油醚部分和氯仿部分去处叶绿素的效果很好。在本发明中，优选使用的MCI大孔树脂是聚苯乙烯型，其包括但不限于MCI GEL CHP 10M、MCI GEL CHP 5C、MCI GEL CHP55A、MCI GEL CHP 55Y、MCI GEL CHP 20Y、MCI GEL CHP 20P、MCI GEL CHP 20SS。此外，在本发明中，如未另外特别说明，优选地使用到型号为MCI GEL CHP 20P（75~150μm）的大孔树脂，其是最为广泛使用的型号。它是一种多孔性的聚苯乙烯高聚物，它所显示的反相吸附作用广泛，除了对高极性的糖、氨基酸基本没有吸附作用外，对大多数次生代谢产物有不同程度吸附，这使得它一方面能有效地除去对水溶性干扰极大的糖，氨基酸，另一方面又能分离不同类型的化合物。
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效低毒的头花蓼抗炎有效成分(有效部位)与应用。
在一个实施方案中，发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供了一种头花蓼有效组分(有效部位)，是由以下步骤获得：
(1)将头花蓼地上部分鲜品或干品加6-8倍量的65~75%乙醇回流提取2次(每次约1.5小)，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇浸膏；
(2)使醇浸膏混悬于甲醇中，超声处理(约1.5小时)，离心，将上清液加载到MCI大孔树脂(MCI GEL CHP 20P)柱(每100g浸膏使用树脂的量为约2升)上；
(3)用水，10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、100%甲醇依次进行梯度洗脱(例如每种溶剂用量为约1倍柱体积)，收集各部分洗脱液，回收溶剂，由不同溶剂洗脱获得的部位干燥，得到30%-80%之间任意浓度间隔或浓度点的甲醇洗脱物，或者它们的混合物，即得。
以上步骤(3)所得甲醇洗脱物可以是40%-50%甲醇洗脱物(部位D)；以上步骤(3)所得甲醇洗脱物可以是50%-60%甲醇洗脱物(部位F)；以上步骤(3)所得甲醇洗脱物可以是40%-60%之间甲醇洗脱物的混合物(部位W)。在本发明中，该部位W可以是部位D和部位F干燥品的混合物，亦可以是40%-60%甲醇洗脱所得混合液经除溶剂干燥后的干燥品。
以上步骤(3)所得部位D中含有可水解鞣质例如可水解鞣质davidiin；以上步骤(3)所得部位F中含有黄酮苷类；以上步骤(3)所得部位W中含有可水解鞣质和/或黄酮苷类，例如可水解鞣质davidiin和/或槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin。
根据本发明的任一个方面，其中部位D的头花蓼提取物中davidiin含量在50%以上，例如50-70%。
根据本发明的任一个方面，其中部位F的头花蓼提取物中槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin三者总重量占提取物重量的20%以上，例如25-50%。
根据本发明的任一个方面，其中部位W的头花蓼提取物中davidiin、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin四者总重量占提取物重量的40%以上，例如45-70%。
在本发明中，以g/kg表示试验的给药剂量时，如无另外说明，是指每kg动物体重给予相应试药(例如本发明提取物)折合成头花蓼干品的重量。
本发明头花蓼有效组分可以与药物制造上可以接受的辅料组合制备成各种常用制剂和缓释剂、控释剂、靶向制剂等。
附图说明
图1是部位D的液相色谱图，图2是部位F的液相色谱图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
A、提取物制备例部分
制备例1：头花蓼有效组分
(1)将头花蓼地上部分干品10Kg，加7倍量的70%乙醇回流提取2次，每次约1.5小时，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇浸膏(885g)；(2)使醇浸膏(45g)混悬于甲醇中，超声处理约1.5小时，离心，将上清液加载到MCI大孔树脂(MCI GEL CHP 20P)柱(每100g浸膏使用树脂的量为约2升)上；(3)用水，10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、100%甲醇依次进行梯度洗脱(每种溶剂用量为约1倍柱体积)，收集各部分洗脱液，回收溶剂，由不同溶剂洗脱获得的部位干燥，得到40%-50%甲醇洗脱物是部位D(得率8.2%)，50%-60%甲醇洗脱物是部位F(得率2.7%)，40%-60%甲醇洗脱物是部位W(得率11.3%)。
经测，部位D中davidiin含量68.1%，部位F中槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin三者总重量占提取物重量的34.6%；部位W中davidiin、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin者总重量占提取物重量的54.6%。
在下文中，如无另外说明，所用部位D、F、W试样是用本制备例1的产物。
制备例2：头花蓼有效组分
(1)将头花蓼地上部分干品10Kg，加6倍量的60%乙醇回流提取3次，每次约1小时，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇浸膏(935g)；(2)使醇浸膏(45g)混悬于甲醇中，超声处理约2小时，离心，将上清液加载到MCI大孔树脂(MCI GEL CHP 20Y)柱(每100g浸膏使用树脂的量为约3升)上；(3)用水，10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、100%甲醇依次进行梯度洗脱(每种溶剂用量为约2倍柱体积)，收集各部分洗脱液，回收溶剂，由不同溶剂洗脱获得的部位干燥，得到40%-50%甲醇洗脱物是部位D，50%-60%甲醇洗脱物是部位F，40%-60%甲醇洗脱物是部位W。各部位的得率基本与制备例1相同。
经测，部位D中davidiin含量52.6%，部位F中槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin三者总重量占提取物重量的27.6%；部位W中davidiin、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin者总重量占提取物重量的47.3%。
制备例3：头花蓼有效组分
(1)将头花蓼地上部分干品10Kg，加10倍量的80%乙醇回流提取1次3小时，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇浸膏(818g)；(2)使醇浸膏(45g)混悬于甲醇中，超声处理约1小时，离心，将上清液加载到MCI大孔树脂(MCI GEL CHP 55A)柱(每100g浸膏使用树脂的量为约1升)上；(3)用水，10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、100%甲醇依次进行梯度洗脱(每种溶剂用量为约0.5倍柱体积)，收集各部分洗脱液，回收溶剂，由不同溶剂洗脱获得的部位干燥，得到40%-50%甲醇洗脱物是部位D，50%-60%甲醇洗脱物是部位F，40%-60%甲醇洗脱物是部位W。各部位的得率基本与制备例1相同。
经测，部位D中davidiin含量64.7%，部位F中槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin三者总重量占提取物重量的39.3%；部位W中davidiin、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin者总重量占提取物重量的59.8%。
本发明人对上述部位D和部位F进行常规的色谱层析分离，获得单体含量分别在96%以上的davidiin、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin四种物质(本领域技术人员理解，此纯度的提取物可以认为是各物质的单体)。
试验例1：二甲苯致小鼠耳肿胀实验，考察头花蓼提取物的抗炎效果
动物：SPF级昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄兼用。
试药、剂量和给药方法：以上文“制备例1：头花蓼有效组分”所得的各种有效部位和对照试样头花蓼水提物(见上文)，剂量为每kg动物体重给予相应试药折合成头花蓼干品的重量为6g。各试药临用前用生理盐水混悬至相当于每只动物每次灌胃给药0.5ml的浓度，同时设置灌胃同体积生理盐水的对照组。
试验方法：小鼠雌雄兼用，随机分组，每一试药组20只动物；连续给药5天，末次给药60min后，用二甲苯0.1ml/只涂右耳致炎，30min后处死小鼠，用直径6mm的打孔器取左右两耳片。立即用电子天平称重，以两耳片重量差作为肿胀度(mg)，以下式计算各试药组的抑制率(%)：
其中肿胀度(mg)=右耳片重-左耳片重
对结果进行统计分析，各试验组肿胀度(mg)与溶媒对照组动物比较均有显著性差异(P<0.01)。
结果表明，部位D、部位F、部位W的抑制率(%)分别为71.2%、66.7%和65.2%。
然而，其它部位的抑制率(%)均低于40%，例如头花蓼水提物(制法：将头花蓼干品用10倍水(W/W)分成二次煎煮，每次1.5小时，过滤，合并滤液，将滤液浓缩至20℃时相对密度为1.1，浓缩液喷雾干燥得100目以上细粉)的抑制率(%)分别为33.2%；部位A(步骤(3)所得30%甲醇洗脱物)、部位B(步骤(3)所得35%-40%甲醇洗脱物)、部位C(步骤(3)所得40%甲醇洗脱物)、部位G(步骤(3)所得60%-80%甲醇洗脱物)的抑制率(%)在21.8%~34.7%之间。
将各有效部位进一步色谱纯化，可以得到一些化学单体，例如可水解鞣质davidiin(实施例1部位A经色谱法进一步纯化得到，HPLC纯度97.3%)，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin等。在上述抗炎试验中进一步发现，这些化合物均具有一定的抗炎效果，抑制率在48~65%的范围内，例如davidiin的胀度抑制率(%)达到64.6%(剂量为300mg/kg/d＊5d)。
C、化学分析例部分
使用UPLC-TOF-MS法测试制备例1所得醇提取物和各部位。
UPLC-TOF-MS的测定方法如下：
(i)供试液配制：称取适量头花蓼提取物粉末,加入70%甲醇制成浓度约5mg/ml的混悬液，超声使尽量溶解，混悬液稀释10倍，过滤，进样2μl作质谱检测；
(ii)色谱及质谱分析条件：
色谱柱：Acquity BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm)，柱温：40℃；流速：0.35ml/min；进样量：2μl；质谱条件：离子源：ESI源；干燥气体温度：180℃；毛细管电压：4500eV；检测模式：负离子模式；喷雾压力：2.5bar；干燥气(N2)流速：8L/min；扫描范围：100-2000amu；碰撞能量:10ev；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，0.1%甲酸乙腈溶液为流动相B，按下表规定的程序进行梯度洗脱：
| 时间(min) | A(%) | B(%) |
| 0 | 95 | 5 |
| 0.5 | 95 | 5 |
| 20 | 81.5 | 18.5 |
| 28 | 0 | 100 |
| 30 | 0 | 100 |
| 30.1 | 95 | 5 |
| 32 | 95 | 5 |
结果：
(1d)部位D样品显示，在保留时间约12.5min处显示可水解鞣质(例如davidiin)的色谱峰，参见图1。
(1f)部位F样品显示，在保留时间12.8-13.8min之间(例如约13.3min处)、保留时间13.8-14.8min之间(例如约14.3min处)和保留时间14.8-15.8min之间(例如约15.3min处)显示黄酮苷类(例如槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin)的色谱峰，参见图2；
本发明提供的头花蓼各有效部位，其中所包含的部位物质及其表征数据见下表：
其中峰15为Davidiin，其化学结构如下：
Claims (15)
1.一种头花蓼提取物，其基本上由包括以下步骤的方法制备得到：
(1)将头花蓼地上部分鲜品或干品加5-15倍量的50~90%乙醇回流提取1-3次，每次1-3小时，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇浸膏；
(2)使醇浸膏混悬于甲醇中，超声处理0.5~5小时，离心，将上清液加载到MCI大孔树脂柱上；
(3)用水，10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、100%甲醇依次进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，回收溶剂，由不同溶剂洗脱获得的部位干燥，得到30%-80%之间任意浓度间隔或浓度点的甲醇洗脱物，或者它们的混合物，即得。
2.根据权利要求1的头花蓼提取物，其中：
步骤(3)所得甲醇洗脱物是40%-50%甲醇洗脱物，即部位D；
步骤(3)所得甲醇洗脱物是50%-60%甲醇洗脱物，即部位F；或者
步骤(3)所得甲醇洗脱物是40%-60%之间甲醇洗脱物的混合物，即部位W。
3.根据权利要求1至2任一项的头花蓼提取物，其中：
部位D中含有可水解鞣质例如可水解鞣质davidiin；
部位F中含有黄酮苷类；或者
部位W中含有可水解鞣质和/或黄酮苷类，例如可水解鞣质davidiin和/或槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin。
4.根据权利要求1至3任一项的头花蓼提取物，其照超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，结果：
(1d)在保留时间12.0-13.0min之间显示可水解鞣质(例如davidiin)的色谱峰；
(1f)在保留时间12.8-13.8min之间、保留时间13.8-14.8min之间和保留时间14.8-15.8min之间显示黄酮苷类(例如槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin)的色谱峰；和/或
(w)显示以上(1d)和(1f)中所示任一或全部色谱峰；
其中，UPLC-TOF-MS的测定方法如下：
(i)供试液配制：称取适量头花蓼提取物粉末,加入70%甲醇制成浓度约5mg/ml的混悬液，超声使尽量溶解，混悬液稀释10倍，过滤，进样2μl作质谱检测；
(ii)色谱及质谱分析条件：
色谱柱：Acquity BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm)，柱温：40℃；流速：0.35ml/min；进样量：2μl；质谱条件：离子源：ESI源；干燥气体温度：180℃；毛细管电压：4500eV；检测模式：负离子模式；喷雾压力：2.5bar；干燥气(N2)流速：8L/min；扫描范围：100-2000amu；碰撞能量:10ev；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，0.1%甲酸乙腈溶液为流动相B，按下表规定的程序进行梯度洗脱：
。
5.根据权利要求1至4任一项的头花蓼提取物，其特征在于：
其照所述超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，结果：(1d)在保留时间12.0-13.0min之间(例如约12.5min处)显示可水解鞣质(例如davidiin)的色谱峰；或者
其照所述超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，结果：
(1d)在保留时间12.0-13.0min之间显示可水解鞣质(例如davidiin)的色谱峰；和/或
(1f)在保留时间12.8-13.8min之间、保留时间13.8-14.8min之间和保留时间14.8-15.8min之间显示黄酮苷类(例如槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin)的色谱峰。
6.一种头花蓼提取物，其照超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，结果：
(1d)在保留时间12.0-13.0min之间显示可水解鞣质(例如davidiin)的色谱峰；
(1f)在保留时间12.8-13.8min之间、保留时间13.8-14.8min之间和保留时间14.8-15.8min之间显示黄酮苷类(例如槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin)的色谱峰；和/或
(w)显示以上(1d)和(1f)中所示任一或全部色谱峰；
其中，UPLC-TOF-MS的测定方法如下：
(i)供试液配制：称取适量头花蓼提取物粉末,加入70%甲醇制成浓度约5mg/ml的混悬液，超声使尽量溶解，混悬液稀释10倍，过滤，进样2μl作质谱检测；
(ii)色谱及质谱分析条件：
色谱柱：Acquity BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm)，柱温：40℃；流速：0.35ml/min；进样量：2μl；质谱条件：离子源：ESI源；干燥气体温度：180℃；毛细管电压：4500eV；检测模式：负离子模式；喷雾压力：2.5bar；干燥气(N2)流速：8L/min；扫描范围：100-2000amu；碰撞能量:10ev；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，0.1%甲酸乙腈溶液为流动相B，按下表规定的程序进行梯度洗脱：
。
7.根据权利要求6的头花蓼提取物，其特征在于：
照所述超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，结果：(1d)在保留时间12.0-13.0min之间显示可水解鞣质(例如davidiin)的色谱峰；或者
照所述超高效液相色谱-飞行时间-质谱联用法测定，结果：
(1d)在保留时间12.0-13.0min之间显示可水解鞣质(例如davidiin)的色谱峰；和/或
(1f)在保留时间12.8-13.8min之间、保留时间13.8-14.8min之间和保留时间14.8-15.8min之间显示黄酮苷类(例如槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin)的色谱峰。
8.根据权利要求6至7任一项的头花蓼提取物，其基本上由包括以下步骤的方法制备得到：
(1)将头花蓼地上部分鲜品或干品加5-15倍量的50~90%乙醇回流提取1-3次，每次1-3小时，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇浸膏；
(2)使醇浸膏混悬于甲醇中，超声处理0.5~5小时，离心，将上清液加载到MCI大孔树脂柱上；
(3)用水，10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、100%甲醇依次进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，回收溶剂，由不同溶剂洗脱获得的部位干燥，得到30%-80%之间任意浓度间隔或浓度点的甲醇洗脱物，或者它们的混合物，即得。
9.根据权利要求8的头花蓼提取物，其中：
步骤(3)所得甲醇洗脱物是40%-50%甲醇洗脱物，即部位D；
步骤(3)所得甲醇洗脱物是50%-60%甲醇洗脱物，即部位F)；
步骤(3)所得甲醇洗脱物是40%-60%之间甲醇洗脱物的混合物，即部位W。
10.根据权利要求6至9任一项的头花蓼提取物，其中：
部位D中含有可水解鞣质例如可水解鞣质davidiin；
部位F中含有黄酮苷类；或者
部位W中含有可水解鞣质和/或黄酮苷类，例如可水解鞣质davidiin和/或槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、石榴皮素B/carpinusin。
11.制备权利要求1至10任一项所述头花蓼提取物的方法，其基本上包括以下步骤：
(1)将头花蓼地上部分鲜品或干品加5-15倍量的50~90%乙醇回流提取1-3次，每次1-3小时，过滤，使滤液浓缩、干燥，得醇浸膏；
(2)使醇浸膏混悬于甲醇中，超声处理0.5~5小时，离心，将上清液加载到MCI大孔树脂柱上；
(3)用水，10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、100%甲醇依次进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，回收溶剂，由不同溶剂洗脱获得的部位干燥，得到30%-80%之间任意浓度间隔或浓度点的甲醇洗脱物，或者它们的混合物，即得。进一步地，其特征如本发明第三方面所述。
12.权利要求1至10任一项所述头花蓼提取物在制备抗炎药物中的用途。
13.选自下列的化合物：Davidiin、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、或石榴皮素B/carpinusin。
14.Davidiin、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-吡喃葡萄糖苷、或石榴皮素B/carpinusin在制备抗炎药物中的用途。
15.一种药物组合物，其中包含权利要求1至10任一项所述头花蓼提取物或者权利要求13的化合物以及任选的药学可接受的载体。进一步地，该药物组合物用作抗炎药物。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhang Liyan Inventor after: Liang Bin Inventor after: Jiang Zhihong Inventor after: Liang Chun Inventor after: Li Menglin Inventor after: Xie Yu Inventor after: Tang Jingwen Inventor before: Liang Bin Inventor before: Jiang Zhihong Inventor before: Liang Chun Inventor before: Zhang Liyan Inventor before: Li Menglin Inventor before: Xie Yu Inventor before: Tang Jingwen |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: LIANG BIN JIANG ZHIHONG LIANG CHUN ZHANG LIYAN LI MENGLIN XIE YU TANG JINGWEN TO: ZHANG LIYAN LIANG BIN JIANG ZHIHONG LIANG CHUN LI MENGLIN XIE YU TANG JINGWEN |
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Relingqing Polygonum capitatum Buch-Ham ex D.Don raw material extract with anti-inflammatory action Effective date of registration: 20140807 Granted publication date: 20140326 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited by Share Ltd. Guiyang Xinhua Branch Pledgor: GUIZHOU WARMEN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: 2014990000643 |
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| PLDC | Enforcement, change and cancellation of contracts on pledge of patent right or utility model | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20180926 Granted publication date: 20140326 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited by Share Ltd. Guiyang Xinhua Branch Pledgor: GUIZHOU WARMEN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: 2014990000643 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Relingqing Polygonum capitatum Buch-Ham ex D.Don raw material extract with anti-inflammatory action Effective date of registration: 20180926 Granted publication date: 20140326 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited by Share Ltd. Guiyang branch Pledgor: GUIZHOU WARMEN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: 2018990000887 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PM01 | Change of the registration of the contract for pledge of patent right |
Change date: 20191128 Registration number: 2018990000887 Pledgee after: Agricultural Bank of China Limited by Share Ltd. Guiyang Xinhua Branch Pledgee before: Agricultural Bank of China Limited by Share Ltd. Guiyang branch |
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| PM01 | Change of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20230223 Granted publication date: 20140326 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited by Share Ltd. Guiyang Xinhua Branch Pledgor: GUIZHOU WARMEN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: 2018990000887 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Extract of Polygonum capitatum, the raw material of Relinqing granules with anti-inflammatory effect Effective date of registration: 20230223 Granted publication date: 20140326 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited by Share Ltd. Guiyang Xinhua Branch Pledgor: GUIZHOU WARMEN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2023990000128 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |