CN101250175A - 杨梅素的制备方法、药物制剂及医药新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从蛇葡萄或其它葡萄科蛇葡萄属植物中产业化制备杨梅素(myricetin)的新方法。也公开了杨梅素药物制剂及医药新用途。这种制备新方法是利用氧化钙或氢氧化钙调解水溶液或含水乙醇、甲醇溶液成碱性，提取药材中的总黄酮，提取液浓缩，用稀酸调pH为2－8，析晶，得粗提物。粗提物用乙醇、甲醇、丙酮加热提取，析晶后可得杨梅素。本方法具有工艺简单、成本低，无污染，先进、安全、适用的特点。本发明的医药新用途是用于制备预防和治疗盆腔炎、附件炎、宫颈炎、阴道炎等妇科疾病的药物，可以只含杨梅素，也可以是含杨梅素的组合物；可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂或注射剂等药物制剂。

Description

杨梅素的制备方法、药物制剂及医药新用途

技术领域

本发明是关于一种从中药蛇葡萄或其它葡萄科蛇葡萄属植物中提取制备药物原料杨梅素的新方法、药物制剂及其医药新用途，属于中药领域。

背景技术

蛇葡萄为葡萄科蛇葡萄属植物(Ampelopsisgrossedetata)的茎叶。别名叫酸藤、山葡萄、爬山虎、野葡萄、烟火藤、山天萝、过山龙、母苦藤、酸古藤、禾黄藤、禾稼子藤、绿葡萄、假葡萄、水葡萄等。在恩施地区尤其是来凤大河镇盛产野生蛇葡萄。据《中草药汇编》、《广西药用植物名录》、《广东药用植物手册》、《上海常用中草药》等记载，该药性味甘淡、功效清热解毒，主治黄疸型肝炎、感冒风热、咽喉肿痛等。民间认为，大凡失音、中暑、口舌生疮、风火牙痛、便秘等症，泡开水饮用，有明显疗效；对马牙疳、脚丫湿疹等外敷也有一定疗效。目前从蛇葡萄中提取杨梅素的报道很少，现在利用的杨梅素大多都从杨梅中获得，用80％丙酮浸提，浸提液减压回收丙酮后过滤，滤液用石油醚萃取，水层以大孔吸附树脂柱层析处理，水冲洗后用甲醇洗脱，回收后得褐黑色浸膏。将甲醇洗脱物溶于250ml水中，用Sephadex HL-20柱层析分离，含水甲醇梯度洗脱。所用的提取溶剂多数属于易燃、易爆危险品，且生产周期较长，成本也较高，对环境也造成污染。本发明的特点在于提取过程使用了价格便宜的氧化钙和氢氧化钙，除去了大量杂质，提高了产率，生产工艺简单、生产周期短，安全、不污染环境，成本低，收率高，纯度高达95％以上，特别适合产业化大量生产。也为我们寻找新的药用植物资源奠定了基础。

杨梅素(myricetin)是一种黄酮类化合物，已经报道的药理作用有抑制血小板聚集、杨梅素对胶原、花生四烯酸及PAF诱导的兔血小板聚集有抑制作用，具有抗PAF作用，为一新的PAF受体拈抗剂。具抗血栓、抗心肌缺血、改善微循环、降血糖、抗氧化、保肝护肝、解轻乙醇中毒、抗肿瘤、抗突变、预防龋齿、消除体内自由基等多种药理活性。我们发现的杨梅素是从葡萄科植物蛇葡萄或同属其他植物中得到的，其含量高，毒副作用小，工艺简单，生产周期短，本发明的新工艺能从蛇葡萄属植物中产业化大量制备杨梅素，其用于未见报道的预防和治疗盆腔炎、附件炎、宫颈炎、阴道炎等妇科疾病等，具有广泛的应用前景。

杨梅素(myricetin)的结构

3，5，7，，3′，4′，5′，-六羟基黄酮

发明内容

本发明的目的之一是解决了天然界植物中杨梅素的含量少，提取分离困难，提供一种从蛇葡萄及同属植物中提取杨梅素的方法。

本发明的目的之二是提供了一种不使用大孔树脂，是合理的使用了氧化钙和氢氧化钙的碱性和钙离子的技术，从而制备杨梅素的方法，减少了对环境的严重污染问题，并且具有操作简单、周期短、纯度高的特点。

本发明的目的之三是提供了一种杨梅素的制备新方法并适合产业化生产。

本发明的目的之四是按药剂学方法，可以将本发明的杨梅素制备成多种临床药物剂型，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂中的任何一种；所说的非肠道给剂型选白于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种。

本发明的目的之五是药物优选含有1％-99％的杨梅素和99％-1％的赋形剂(包括其它配用的药物)，优选含有30％-80％的杨梅素和70％-20％的药用赋形剂(包括其它配伍用的药物)，最好含有60％-70％的杨梅素和40％-30％的赋形剂(包括其它配伍用的药物)。

本发明的目的之六是使用药物中常规的赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂等。本发明药物中的其它配伍用的药物，指的是以有效剂量的杨梅素为一定的药物原料，再配伍其它已允许合用的中药或化学药品。

本发明的目的之七是杨梅素用于预防和治疗盆腔炎、附件炎、宫颈炎、阴道炎等妇科疾病的药物。

本发明是通过以下方法实施的：将蛇葡萄或其它葡萄科蛇葡萄属植物原料药材用含氧化钙或氢氧化钙的水溶液或含水的乙醇、甲醇溶液(调解PH7-14)提取一次或多次，趁热过滤，合并提取液，浓缩，用稀酸调PH为2-8，析晶，得粗提物；粗提物用乙醇、甲醇或丙酮提取一次或多次，过滤，合并滤液，回收溶剂，析晶，得杨梅素晶体。

本文所指蛇葡萄为葡萄科蛇葡萄属植物，其嫩叶经过杀青、揉捻、烘干而成。提取溶剂为水或乙醇、甲醇的水溶液；所述加入的氧化钙或氢氧化钙等弱碱或弱碱盐的目的为除去药材中的鞣质、黏液脂等酸性杂质，优化杨梅素的提取效果、减少杂质、提高纯度，其加入的方法可以是直接加入也可以是水溶液加入，使PH值为7-14之间。提取一次或多次，合并提取液，浓缩，用盐酸或硫酸调PH值为2-8之间，析晶，用甲醇、乙醇或丙酮加热溶解，过滤，回收溶剂，放置，析晶，得杨梅素晶体。

杨梅素粗提物提取时溶剂浓度为10％-95％；可以是乙醇也可以是甲醇或丙酮。

本发明的有益效果在于：在制备过程中以水、乙醇、甲醇或丙酮为溶剂，加入的弱碱或弱碱盐、用的盐酸或硫酸均为医用试剂，成本低，污染小，提取工艺简单，生产周期短，收率高达5％以上，杨梅素的纯度可达95％以上。

本发明的上述方法可以用于产业化大量制备单体杨梅素。通过高效液相色谱和液—质联用进行分析，验证本发明方法制备的结晶物就是杨梅素。

1、高效液相(HPLC)分析

仪器：美国Agillent1100型高效液相色谱仪(配四元泵、二级管阵列检测器、自动进样器、柱温箱、软件为Agillent1100型多种数自动处理系统)。

条件：色谱柱为Zorbax C₁₈反相硅胶柱(4.6mmX150mm)，进样量为10ul，流动相为甲醇∶0.05％磷酸水＝47∶53，流速为1.0ml/min，检测波长为372nm。

保留时间为7.65min，为对称峰。

2、液—质联用(LC/MSD)分析

仪器：美国Agillent液—质联用仪(配四元泵、补偿单元泵、二级管阵列检测器、自动进样器、柱温箱、软件为Agillent1100型多种数据处理系统)。

条件：色谱柱为ZOBAX EXTEND C₁₈柱，流动相为甲醇∶0.05％磷酸水＝47∶53。流速为0.9ml/min，柱后补偿促离子化试剂氨水溶液(0.1ml/min)，质谱条件为负离子模式(NEG)电喷雾(API—ESI)扫描。

经液—质联用和高效液相分析，并结合文献资料证明本发明提取的化合物是杨梅素。

在本发明完成以前没有关于该工艺的报道。

本发明所述的药物及其制剂具有预防和治疗盆腔炎、附件炎、阴道炎等妇科疾病的作用，这些药理作用，通过以下药效学试验例得到证实。

1、杨梅素对体外抑菌实验的影响

平皿打空法：将上述细菌分别接种于普通营养琼脂培养基、巧克力琼脂培养基上过夜、(淋病奈瑟菌厌氧培养48小时)。转种液体肉汤培养基(血清)活化9亿/ml。将已活化好的菌株接种取0.1ml接种普通琼脂培养基和巧克力琼脂培养基上，用打孔器打孔。将杨梅素高压处理后稀释五个不同浓度(药品含量为：0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml、0.0125g/ml和0.00625g/ml)。对照用药(金鸡胶囊)浓度为0.1g/ml。分别加入孔内，每孔加药液50μl，设两个平行孔，进行24-48小时培养。结果见表1。

抑菌标准判定：抑菌环＞6mm为耐药，6-8mm为低度敏感，8-10mm为中度敏感，＞10为高度敏感。

表1杨梅素对体外抑菌实验的影响

结果表明：杨梅素对大肠杆菌、白色念珠菌、淋病奈瑟菌、变形杆菌绿脓杆菌和化脓性链球菌有较强的抑菌作用，其中对大肠杆菌、白色念珠菌、淋病奈瑟菌、变形杆菌的抑菌作用最强。其最低抑菌浓度(MIC)分别为0.0125g/ml、0.0125g/ml、0.025g/ml、0.05g/ml；对绿脓杆菌和化脓性链球菌为低度敏感；金黄色葡萄球菌和肺炎克雷白菌不敏感。

2、杨梅素对大鼠急性血瘀模型血液流变学的影响

取大鼠60只，随机分为6组，按表2所示剂量每日灌胃给药一次，连续给药7天。第4天给药后30min，除空白对照组外，其余动物皮下注射盐酸肾上腺素注射液(0.1％)0.1ml/只，30min后置于1.5℃冰水浴中游泳5min。第5天重复游泳一次(条件相同)，第6天给药30min后，再注射一次盐酸肾上腺素注射液(0.1％)0.1ml/只，。末次给药30min后，于动物腹腔注射戊巴比妥钠35mg/kg麻醉大鼠，从大鼠腹主动脉取血，肝素抗凝，用LIANG-100微机显示自动血液血浆粘度剂测定其血液流变学各项指标，结果表明：杨梅素能明显降低全血比粘度、血浆粘度及红细胞压积，加快血沉速度，且高、中剂量组具有显著差异。见表2。

表2杨梅素对大鼠急性血瘀模型血液流变学的影响

与模型组比较*P＜0.05；**P＜0.01。

3、杨梅素对大鼠痛经模型的影响^[2]

取大鼠50只，分别在大鼠股部皮下植入己烯雌酚小丸(15mg/丸)，饲养8周后，将大鼠随机分为5组，每组10只，并按表3所示剂量每日灌胃给药一次，连续给药7天。于末次给药后1h，每只动物腹腔注射缩宫素ED₈₀量(2u/只)，观察15min内各组动物扭体发生率。结果表明：杨梅素对类痛经性疼痛有明显的拮抗作用，且高、中剂量组具有显著差异。见表3。

表3杨梅素对大鼠痛经模型的影响X²检验

与对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01。

4、杨梅素对小鼠角叉菜胶性足肿胀的影响

取小鼠50只，按体重分为5组，按表4所示剂量每日灌胃给药一次，共给药7天，末次给药后30min，于小鼠右后足掌腱膜下注入1％角叉菜胶0.03ml/只，于致炎后6h后将小鼠颈椎脱臼处死，剪下双侧后足，分别称重，求左、右足重量之差，即为肿胀度。结果表明：杨梅素能够明显抑制角叉菜胶引起的小鼠足肿胀，且高、中剂量组有显著差异。见表4。

表4杨梅素对小鼠角叉菜胶性足肿胀的影响

与对照组比较*P＜0.05；***P＜0.001。

5、杨梅素对二甲苯所致小鼠耳廓水肿的影响^[3]

取小鼠50只，按体重分为5组，按表5所示剂量每日灌胃给药一次，共给药7天，末次给药后2h，将二甲苯0.05ml滴于小鼠右耳，左耳为正常对照。4h后将小鼠颈椎脱臼处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径9mm的打孔器分别在左、右耳同一部位打下圆耳片，称重，求左、右耳片重量之差，即为肿胀度。结果表明：杨梅素能够明显抑制二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀，且具有显著差异。见表5。

表5杨梅素对二甲苯所致小鼠耳廓水肿的影响

与对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

6、杨梅素对大白鼠巴豆油致气囊肿的影响^[4]

取雌性大鼠50只，随机分为5组，在乙醚浅麻醉下，背部局部皮肤消毒后，在肩胛间区，皮下注射20ml空气，形成气囊，随即向气囊内注入1％巴豆油1ml，立即将鼠背朝下，徐徐转动，使巴豆油充分与囊内组织接触，24小时后抽去囊内气体。于致炎当日开始按表6剂量给药，共给7天，每日一次，末次给药后24小时，乙醚麻醉处死，测定囊内渗出液量，剥离囊壁肉芽肿，置生理盐水中漂洗干净，80℃烤箱中烤干，称重。比较各组渗出液量和肉芽肿重量。结果表明，杨梅素可明显抑制巴豆油所致气囊肿的肉芽增生，并减少了囊中渗出液量，且差异显著。见表6。

表6杨梅素片对大白鼠巴豆油致气囊肿的影响

与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

7、急性毒性

用最大浓度0.78g/ml，给药体积10ml/kg，给小鼠一日内灌胃给药3次，累积灌胃给药体积为30ml/kg(累积灌胃给药剂量为23.4g/kg)。观察14日，未见明显毒性反应和胃肠道反应，最大耐受剂量大于23.4g/kg。相当于临床人用药量的1170倍。从而表明给小鼠大量灌胃给药无急性毒性反应。

以上药效学试验表明本发明所述的杨梅素具有抗炎、止痛、增强细胞免疫力和抗菌的作用，可用于盆腔炎、附件炎、宫颈炎和阴道炎等妇科疾病的预防和治疗。

具体实施方式

实施例1

蛇葡萄1kg，加15000ml水，加入20g氧化钙或氢氧化钙，加热煎煮1.5h，过滤，滤渣加10000ml水，煎煮1h，过滤，滤渣再加水10000ml，煎煮1h，过滤，合并三次滤液，浓缩至2000ml，用稀盐酸调PH为6.5，放置过夜，离心，残渣加95％乙醇5000ml加热溶解，放冷，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加水至1000ml，放置过夜，滤过，滤渣干燥得黄绿色杨梅素晶体58.3g，收率约为5.83％，含量为97.4％。

实施例2

蛇葡萄1kg，加15000ml水，加入5g氧化钙或氢氧化钙，加热煎煮2h，过滤，滤渣加10000ml水，煎煮1h，过滤，滤渣再加水10000ml，煎煮1h，过滤，合并三次滤液，浓缩至2000ml，用稀盐酸调PH为2.3，放置过夜，离心，残渣加95％乙醇5000ml加热溶解，放冷，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加水至1000ml，放置过夜，滤过，滤渣干燥得黄绿色杨梅素晶体50.3g，收率约为5.03％，含量为95.4％。

实施例3

蛇葡萄1kg，加15000ml水，加入50g氧化钙或氢氧化钙，加热煎煮1h，过滤，滤渣加10000ml水，煎煮1h，过滤，滤渣再加水10000ml，煎煮1h，过滤，合并三次滤液，浓缩至2000ml，用稀盐酸调PH为7.2，放置过夜，离心，残渣加95％乙醇5000ml加热溶解，放冷，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加水至1000ml，放置过夜，滤过，滤渣干燥得黄绿色杨梅素晶体51.5g，收率约为5.15％，含量为96.8％。

实施例4

蛇葡萄100g，加甲醇(或95％乙醇)500ml，加入0.5g氧化钙或氢氧化钙，加热提取2h，过滤，滤渣加甲醇(或95％乙醇)500ml，提取1h，过滤，滤渣再加甲醇(或95％乙醇)500ml，提取0.5h，过滤，合并三次滤液，浓缩至200ml，用稀盐酸调PH为6.4，放置过夜，离心，残渣加50％甲醇(或50％乙醇)500ml加热溶解，放冷，过滤，滤液回收溶剂至100ml，放置过夜，滤过，滤渣干燥得绿色杨梅素晶体5.49g，收率约为5.49％，含量为96.5％。

实施例5

蛇葡萄100g，加甲醇(或95％乙醇)500ml，加入5g氧化钙或氢氧化钙，加热提取1h，过滤，滤渣加甲醇(或95％乙醇)500ml，提取1h，过滤，滤渣再加甲醇(或95％乙醇)500ml，提取0.5h，过滤，合并三次滤液，浓缩至200ml，用稀盐酸调PH为7.6，放置过夜，离心，残渣加50％甲醇(或50％乙醇)500ml加热溶解，放冷，过滤，滤液回收溶剂至100ml，放置过夜，滤过，滤渣干燥得绿色杨梅素晶体5.1g，收率约为5.1％，含量为95.7％。

实施例6

蛇葡萄1kg，加5000ml水，加入20g氧化钙或氢氧化钙，加热煎煮2h，过滤，滤渣加5000ml水，煎煮1h，过滤，滤渣再加水5000ml，煎煮1h，过滤，合并三次滤液，浓缩至2000ml，用稀盐酸调PH为6.5，放置过夜，离心，残渣加甲醇(或丙酮)1000ml加热溶解，放冷，过滤，滤液回收溶剂，加水至1000ml，放置过夜，滤过，滤渣干燥得黄绿色杨梅素晶体58.5g，收率约为5.85％，含量为95.5％。

实施例7

蛇葡萄1kg，加15000ml水，加氧化钙5g，碳酸钠5g，碳酸氢钠5g，碳酸钾5g，氨水5ml，加热煎煮1.5h，过滤，滤渣加10000ml水，煎煮1h，过滤，滤渣再加水10000ml，煎煮1h，过滤，合并三次滤液，浓缩至2000ml，用稀盐酸调PH为2.3，放置过夜，离心，残渣加50％乙醇5000ml加热溶解，放冷，过滤，滤液回收乙醇至1000ml，放置过夜，滤过，滤渣干燥得黄绿色杨梅素晶体53.5g，收率约为5.35％，含量为97.6％。

实施例8

蛇葡萄1kg，加15000ml水，用氢氧化钠或氢氧化钾调PH值为8～13，加热煎煮1.5h，过滤，滤渣加10000ml水，煎煮1h，过滤，滤渣再加水10000ml，煎煮1h，过滤，合并三次滤液，浓缩至2000ml，用稀盐酸调PH为4.3，放置过夜，离心，残渣加50％乙醇5000ml加热溶解，放冷，过滤，滤液回收乙醇至1000ml，放置过夜，滤过，滤渣干燥得黄绿色杨梅素晶体56.3g，收率约为5.63％，含量为95.6％。

实施例9(胶囊剂)

杨梅素原料200g，药用淀粉适量，混合均匀，制粒，干燥，整粒，装入1号胶囊，制成1000粒，即得。每次2粒。每日3次。

实施例10(片剂)

杨梅素原料200g，药用淀粉适量，糊精适量，混合均匀，制粒，干燥，整粒，干燥，加入润滑剂适量，压片，制成1000片，即得。每次2片。每日3次。

实施例11(滴丸剂)

称取30g聚乙二醇4000，在水浴上熔化，加杨梅素原料10g，搅拌均匀，倾入保温管中，调节恒温装置，使药液在80-90℃下滴入冷却过的液体石蜡中，滴完后，将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油，制成1000粒，即得。每次10粒。每日3次。

实施例12(颗粒剂)

杨梅素原料100g，糖粉400g，混合均匀，用适量乙醇制粒，干燥、整粒、分装，制成250袋，即得。每次1袋。每日3次。

Claims (9)

1. 一种杨梅素的制备方法，其特征为：将蛇葡萄或其它葡萄科蛇葡萄属植物原料药材用含氧化钙或氢氧化钙的水溶液或含水的乙醇、甲醇溶液(调解PH7-14)提取一次或多次，趁热过滤，合并提取液，浓缩，用稀酸调PH为2-8，析晶，得粗提物；粗提物用乙醇、甲醇或丙酮提取一次或多次，过滤，合并滤液，回收溶剂，析晶，得杨梅素晶体。

2. 根据权利1所述的方法，其特征在于水、乙醇或甲醇水溶液提取时用量为药材重的5-50倍；提取时间为1h-3h；

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于加入的氧化钙或氢氧化钙也可以是氧化钙或氢氧化钙与其他弱碱盐或弱碱的一种或几种的混合物，包括：氨水、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氧化镁、氢氧化镁，也可以是用氢氧化钠或氢氧化钾调PH值。

4. 根据权利要求3所述的加入弱碱或弱碱盐的量为可将提取时溶液的PH值调为7-14；加入方式可以是水溶液也可以是直接加入。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于粗提物提取时提取液浓度为10％-95％。提取液可以是甲醇、乙醇、丙酮。调PH值的稀酸是盐酸或硫酸。

6. 一种药物制剂，其特征在于含有有效治疗剂量的杨梅素和一种或多种药学上可接受的药用赋形剂，或可与杨梅素组方的其它药物。

7. 根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于含有1％-99％的杨梅素和99％-1％的药用赋形剂或其它可组方的药物。

8. 根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于所说的药物是口服制剂或非肠道给药的剂型。

9. 权利要求6所述的制剂用于预防和治疗盆腔炎、附件炎、宫颈炎、阴道炎等妇科疾病的药物。