CN102188497B - 延胡索总碱的制备方法及延胡索制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种延胡索总碱的制备方法及延胡索制剂及其应用。本发明所提供的延胡索总碱的制备方法包括粉碎、提取和后处理，其中后处理乙酸乙酯萃取、浓缩和冷冻干燥。本发明中采用乙酸乙酯萃取的方法易回收，回收率高，毒性小，对环境友好，是工业化生产的理想溶剂，克服了以往的生物碱萃取溶剂多数采用氯仿，挥发性高、回收率低、生产成本高、对人和环境毒性极大的缺陷，同时也降低了成本。本发明采用乙酸乙酯萃取纯度达到80％以上。本发明还提供一种延胡索总碱制剂及其延胡索总碱制剂在制备治疗妇科疾病的药物中的应用，尤其是在制备治疗痛经、月经不调或子宫内膜异位症的药物中的应用。

Description

延胡索总碱的制备方法及延胡索制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种中药提取物的制备方法及其各类制剂，具体是从延胡索(元胡)中制备总碱提取物的方法以及用该总碱提取物制备的各类制剂，用于治疗妇科的痛经、月经不调、子宫内膜移位症。

背景技术

延胡索(元胡)为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的块茎。性温味苦，活血散瘀，利气止痛。延胡索中含有生物碱，其中属叔胺类者含量约0.65％，属季胺类者约0.3％。目前已分离得近20余个三种类型的生物碱，其中有：d-紫堇碱(d-C-orydaline即延胡索甲素)、dl-四氢巴马亭(dl-Tetrahydropalmatine即延胡索乙素)、元鸦片碱(Protopine即延胡索丙素)、1-四氢黄连碱(1-Tetrahydrocoptisine即延胡索丁素)、dl-四氢黄连碱(即延胡索戊素)、1-四氢非洲防己碱(1-Tetrahydrocolumbamine即延胡索己素)、紫堇鳞茎碱(Corybulbine即延胡索庚素)、β-高白居菜碱(β-Homoch-elidonine即延胡索庚素)、黄连碱(Coptisine)、去氢紫堇碱(Dehydrocorydaline即去氢延胡索甲素)。紫堇单酚碱(Corydalmine)、去氢延胡索胺(Dehydrocorydaline)及非洲防己碱(Columbamine)，以及d-海罂粟碱(d-Glaucine)等。研究证明，延胡索总碱有镇痛作用，催眠作用，镇静、安定作用，抗心律失常作用，抗溃疡作用以及预防和治疗心脑血管疾病的作用。因此，延胡索总生物碱有效部位制剂的需求量很大。

现阶段，中药生物碱的提取工艺已较成熟，根据生物碱的理化特性，采用适宜的溶剂如水、酸水、酸醇及及碱醇等，利用浸渍、渗漉、煎煮、回流、超声、醇解等技术将生物碱类成分提取出来，提取率能达到90％以上。但由于生物碱在中药中的相对含量较低(多数含量为0.01％-1％)，提取时势必引入大量的其他药物成分和杂质类成分，要保证最后制剂的安全有效，必须对其进行精制纯化，制备成有效部位甚至有效成分来应用，因此生物碱有效部位的精制纯化技术就显得十分重要。但由于其他多种成分的并存以及淀粉、树胶、果胶、粘液质、色素等杂质的干扰，生物碱有效部位的精制技术一直是中药现代化的“瓶颈”，严重影响了现代中药制剂对三效(高效、速效、长效)、三小(剂量小、毒性小、副作用小)、五方便(生产、运输、携带、贮存、应用方便)的要求。

虽然在教科书及各种文献中多有提取分离中药总生物碱的方法，但这些方法仅停留于实验室的研究水平，多数是将含有生物碱的溶液过柱后，以氨液或NaOH溶液洗脱，收集洗脱液后再以有机溶剂萃取生物碱；或者将上过样品的树脂以碱液浸泡，然后再用有机溶剂回流提取生物碱；或者是采用有机溶剂直接洗脱法；或者是采用大孔树脂富集后，以有机溶剂洗脱生物碱。但这些方法具有成本高、工艺操作繁琐，有机溶剂用量大、无法在大生产中放大实验和生物碱转移率低等缺点，因而不能在大生产中应用。在中国专利申请CN200610049743.3中提出了一种从中药延胡索中提取分离总生物碱的技术中涉及离子交换树脂法，基本过程为：先用NaCO₃或NaHCO₃或NaOH浸湿碱化，又以乙醇提取，提取液减压浓缩，浓缩液再酸化，酸化液进行树脂柱层析，并采用乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩。由于其进行碱化和酸化的步骤，制备工艺复杂，流程长操作繁琐，生产效率低。在中国专利申请200710098449.6中公开了一种从中药延胡索提取液中分离延胡索总生物碱的方法，该方法为：取延胡索提取液，调整pH值1至7，滤过，取滤液加于阳离子交换树脂柱上，先以水洗脱除杂，再用0.5％-15％酸液洗脱，收集洗脱液，加碱中和，经脱盐处理，回收溶剂，即得延胡索总生物碱，同样是流程长操作繁琐，生产效率低。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种延胡索总碱的制备方法，该方法工艺简单、总碱提取率高、提取物的成分活性效果好的特点，并解决了现有技术中用氯仿萃取时带来的挥发性大、乳化严重、溶剂回收率低、生产成本高、生产效率低、毒性大对环境不友好的缺点。

本发明的第二目的在于提供一种延胡索总碱制剂，该制剂的剂型完整，可针对患者的不同治疗需要选择所需的用药剂型，以提高治疗效果。

本发明的第三目的在于提供一种上述制备方法所制得的延胡索总碱或延胡索总碱制剂在制备治疗妇科疾病尤其是痛经、月经不调、子宫内膜异位症药物方面的新应用。

为实现本发明的第一目的，本发明采用如下技术方案：

一种延胡索总碱的制备方法，其中，该方法包括如下步骤：

1)将延胡索粉碎成粗颗粒；

2)将上步所得的粗颗粒进行提取得到提取液，提取液再进行减压浓缩得到浓缩液；

3)将所得的浓缩液进行后处理即得延胡索总碱提取物；

其中所述的后处理包括用乙酸乙酯萃取、浓缩和冷冻干燥。

以往的生物碱萃取溶剂多数采用氯仿，不仅挥发性高、回收率低、生产成本高，对人和环境毒性极大，而且氯仿用于萃取时容易乳化，不容易破乳，影响生产进度。本发明中采用乙酸乙酯萃取，不仅易回收，回收率高，毒性小，对环境友好，是工业化生产的理想溶剂，乙酸乙酯不容易乳化，即使产生乳化也容易破乳，同时乙酸乙酯的极性比氯仿大，延胡索总碱的萃取率比氯仿高，其纯度可达到80％以上。

根据前述的制备方法，其中，所述的乙酸乙酯为水饱和过的乙酸乙酯，所述的萃取为萃取三次。

由于乙酸乙酯有一定的溶水性，用水饱和过的乙酸乙酯萃取，可以减少水溶性成分被带入乙酸乙酯中，故本发明中采用水饱和过的乙酸乙酯来萃取。

根据前述的制备方法，其中，在步骤2)和步骤3)之间还包括将浓缩液进行酸化或碱化的过程。

根据前述的制备方法，其中，所述的酸化为采用1％-30％醋酸调节浓缩液的pH值2-3。

根据前述的制备方法，其中，所述的碱化为采用氨水调节浓缩液的pH值8-9。

根据前述的制备方法，其中，在所述酸化后还包括如下步骤：将酸化液进行树脂柱层析，首先用水洗、20％甲醇或乙醇洗脱、80-95％甲醇或乙醇洗脱，合并50-95％甲醇或乙醇洗脱液。

根据前述的制备方法，其中，在所述碱化后还包括如下步骤：将碱化液用石油醚萃取三次。

根据前述的制备方法，其中，步骤1)中所述的粉碎为粉碎成12-20目的粗颗粒。

根据前述的制备方法，其中，所述的树脂柱为AB-8、D₁₀₁、HP-20等。

更具体的说，本发明所提供的延胡索总碱制备方法包括如下步骤：

1)将延胡索粉碎成12-20目的粗颗粒；

2)将上步所得的粗颗粒以50％-85％甲醇或乙醇进行提取，以醋酸调pH值2-3，每次提取1-2小时，提取三次，合并提取液，所合并的提取液再进行减压浓缩得到浓缩液；

3)用1％-10％醋酸将上步所得的浓缩液调节pH值2-3进行酸化，酸化液进行树脂柱层析，依次用水洗、20％甲醇或乙醇洗脱、50-95％甲醇或乙醇洗脱，合并50-95％甲醇或乙醇洗脱液；

4)将上步所得的洗脱液再以水饱和过的乙酸乙酯萃取三次，浓缩至比重1.10-1.12，然后冷冻干燥即得延胡索总碱提取物。

或者本发明所提供的延胡索总碱制备方法包括如下步骤：

1)将延胡索粉碎成12-20目的粗颗粒；

2)将上步所得的粗颗粒以50％-85％甲醇或乙醇进行提取，以醋酸调pH值2-3，每次提取1-2小时，提取三次，合并提取液，所合并的提取液再进行减压浓缩得到浓缩液；

3)用氨水将上步所得的浓缩液调节pH值8-9进行酸化，碱化液以石油醚(1∶1)萃取三次；

4)再以水饱和过的乙酸乙酯萃取三次，减压回收，浓缩至比重1.10-1.12，然后冷冻干燥即得延胡索总碱提取物。

为实现本发明的第二目的，本发明采用如下技术方案：

一种延胡索总碱制剂，其中，所述的延胡索总碱制剂是由本发明所述的制备方法制得的延胡索总碱与药学上常用的辅料制成的延胡索总碱片剂、胶囊、软胶囊、滴丸或口服液。

可进一步将本发明所制备的延胡索总碱与药学上常用的辅料制成延胡索总碱片剂、延胡索总碱胶囊、延胡索总碱软胶囊、延胡索总碱滴丸或延胡索总碱口服液。

制成延胡索总碱片剂时，采用本领域常规的方法制备。其具体为将本发明所制备的延胡索总碱10-200mg，加入一定量的药用淀粉、糖粉、微粉硅胶、硬脂酸镁等，制粒，压片，制成每片含10-200mg延胡索总碱的延胡索片剂。

所制备的延胡索片剂可进一步进行包衣，如包糖衣，制成延胡索总碱糖衣片。

制成延胡索总碱胶囊时，采用本领域常规的方法制备。其具体为将本发明所制备的延胡索总碱10-200mg，加入一定量的药用淀粉、糖粉、羧甲基纤维素钠、微粉硅胶等，制粒，整粒，灌装，制成每粒胶囊含10-200mg延胡索总碱的延胡索胶囊。

制成延胡索总碱软胶囊时，采用本领域常规的方法制备。其具体为将本发明所制备的延胡索总碱10-200mg，加入一定量的精制豆油，加热混合均匀，以明胶为基质的胶基，制胶片，压制软胶囊。

制成延胡索总碱滴丸时，采用本领域常规的方法制备。其具体为将本发明所制备的延胡索总碱5-50mg，加入一定量的聚乙二醇(1500-20000)，加热混合均匀，用滴丸剂，制备滴丸，灭菌制成每丸重30-80mg的滴丸，每丸含延胡索总碱5-50mg。

制成延胡索总碱口服液时，采用本领域常规的方法制备。其具体为将本发明所制备的延胡索总碱10-200mg，加入一定量的注射用水，调pH值4-5，加入增溶剂、调味剂、甜味剂，混合均匀，过滤，灌装，灭菌，制成10-100ml的口服液，每只含延胡索总碱10-200mg。

为实现本发明的第三目的，本发明采用如下技术方案：

一种延胡索总碱或延胡索总碱制剂在制备治疗妇科疾病的药物中的应用，尤其是在制备治疗痛经、月经不调或子宫内膜异位症的药物中的应用。

本发明中，所述的延胡索总碱可以为现有技术中采用任意方法所制备的延胡索总碱，也可以为采用本发明所述的制备方法所制得的延胡索总碱。

本发明中，所述的延胡索总碱制剂为本发明所述的延胡索总碱制剂。

通过药效学试验表明，延胡索总碱或本发明所制备的延胡索总碱或延胡索总碱制剂对内异症具有明显的抑制作用，可用于制备治疗妇科疾病、尤其是用于制备治疗痛经、月经不调或子宫内膜异位症的药物。

本发明的延胡索总碱或延胡索总碱制剂用于治疗妇科疾病、尤其是用于治疗痛经、月经不调、子宫内膜异位症时，其剂量为25-100mg/kg。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明所提供的延胡索总碱的制备方法中，采用乙酸乙酯萃取，克服了现有技术中采用氯仿，不仅挥发性高、回收率低、生产成本高，对人和环境毒性极大，而且氯仿用于萃取时容易产生乳化，不容易破乳，影响生产进度的缺陷；

(2)本发明所提供的延胡索总碱的制备方法中，采用乙酸乙酯萃取，不仅易回收，回收率高，毒性小，对环境友好，是工业化生产的理想溶剂，乙酸乙酯作为萃取溶剂不容易乳化，即使产生乳化也容易破乳，同时乙酸乙酯的极性比氯仿大，延胡索总碱的萃取率比氯仿高，其纯度可达到80％以上，完全可以满足药用的要求；

(3)采用本发明所提供的延胡索总碱的制备方法所制备的延胡索制剂纯度高，将其进一步与药学上常用的辅料制成延胡索总碱片剂、胶囊、软胶囊、滴丸或口服液；

(4)本发明所制备的延胡索总碱经药效学试验可用于制备治疗妇科疾病的药物，尤其是用于制备痛经、月经不调或子宫内膜异位症的药物。

具体实施方式

以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。

一、提取工艺实施例

【实施例1】

延胡索粗粉10kg，以75％乙醇(以10％～30％醋酸调PH值2-3)进行提取每次提取2小时，提取三次，合并提取液，减压浓缩，浓缩液调pH＝2～3，酸液上大孔树脂D101柱，以水冲洗，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液再以水饱和过的乙酸乙酯(1∶1)萃取三次，浓缩至比重1.10-1.12，冷冻干燥得总生物碱120g。

【实施例2】

延胡索粗粉10kg，以85％甲醇(以10％～30％醋酸调PH值2-3)进行提取每次提取2小时，提取三次，合并提取液，减压浓缩，浓缩液调pH＝2～3，酸液上大孔树脂AB-8柱，以水冲洗，然后以85％乙醇洗脱，洗脱液再以水饱和过的乙酸乙酯(1∶1)萃取三次，浓缩至比重1.10-1.12，冷冻干燥得总生物碱116g。

【实施例3】

延胡索粗粉10kg，以85％乙醇(以醋酸调PH值2-3)进行提取，每次提取2小时，提取三次，合并提取液，减压浓缩，浓缩至比重1.10-1.15，浓缩液碱化(以氨水)至PH值8-9，以石油醚(1∶1)萃取三次，再以水饱和过的乙酸乙酯(1∶1)萃取三次，浓缩至比重1.10-1.12；冷冻干燥，冷冻干燥得总生物碱112g。

【实施例4】

延胡索粗粉10kg，以75％甲醇(以醋酸调PH值2-3)进行提取，每次提取1-2小时，提取三次，合并提取液，减压浓缩，浓缩至比重1.10-1.15，浓缩液碱化(以氨水)至PH值8-9，以石油醚(1∶1)萃取三次，再以水饱和过的乙酸乙酯(1∶1)萃取三次，浓缩至比重1.10-1.12；冷冻干燥，冷冻干燥得总生物碱123g。

【实施例5】

1)将延胡索粉碎成12目的粗颗粒；

2)将上步所得的粗颗粒以50％甲醇进行提取，以醋酸调pH值2，每次提取1小时，提取三次，合并提取液，所合并的提取液再进行减压浓缩得到浓缩液；

3)用1％醋酸将上步所得的浓缩液调节pH值2进行酸化，酸化液上大孔树脂AB-8柱进行树脂柱层析，依次用水洗、20％甲醇洗脱、50％甲醇洗脱，合并洗脱液；

4)将上步所得的洗脱液再以水饱和过的乙酸乙酯萃取三次，浓缩至比重1.10，然后冷冻干燥即得延胡索总碱提取物。

【实施例6】

1)将延胡索粉碎成20目的粗颗粒；

2)将上步所得的粗颗粒以85％乙醇进行提取，以醋酸调pH值3，每次提取2小时，提取三次，合并提取液，所合并的提取液再进行减压浓缩得到浓缩液；

3)用10％醋酸将上步所得的浓缩液调节pH值3进行酸化，酸化液上大孔树脂D101柱进行树脂柱层析，依次用水洗、20％乙醇洗脱、95％乙醇洗脱，合并洗脱液；

4)将上步所得的洗脱液再以水饱和过的乙酸乙酯萃取三次，浓缩至比重1.12，然后冷冻干燥即得延胡索总碱提取物。

【实施例7】

1)将延胡索粉碎成18目的粗颗粒；

2)将上步所得的粗颗粒以75％乙醇进行提取，以醋酸调pH值2.5，每次提取1.5小时，提取三次，合并提取液，所合并的提取液再进行减压浓缩得到浓缩液；

3)用5％醋酸将上步所得的浓缩液调节pH值2.5进行酸化，酸化液上大孔树脂HP-20柱进行树脂柱层析，依次用水洗、20％乙醇洗脱、75％乙醇洗脱，合并洗脱液；

4)将上步所得的洗脱液再以水饱和过的乙酸乙酯萃取三次，浓缩至比重1.11，然后冷冻干燥即得延胡索总碱提取物。

【实施例8】

1)将延胡索粉碎成12目的粗颗粒；

2)将上步所得的粗颗粒以50％甲醇进行提取，以醋酸调pH值2，每次提取1小时，提取三次，合并提取液，所合并的提取液再进行减压浓缩得到浓缩液；

3)用氨水将上步所得的浓缩液调节pH值8进行酸化，碱化液以石油醚(1∶1)萃取三次；

4)再以水饱和过的乙酸乙酯萃取三次，减压回收，浓缩至比重1.10，然后冷冻干燥即得延胡索总碱提取物。

【实施例9】

1)将延胡索粉碎成20目的粗颗粒；

2)将上步所得的粗颗粒以85％乙醇进行提取，以醋酸调pH值3，每次提取2小时，提取三次，合并提取液，所合并的提取液再进行减压浓缩得到浓缩液；

3)用氨水将上步所得的浓缩液调节pH值9进行酸化，碱化液以石油醚(1∶1)萃取三次；

4)再以水饱和过的乙酸乙酯萃取三次，减压回收，浓缩至比重1.12，然后冷冻干燥即得延胡索总碱提取物。

【实施例10】

1)将延胡索粉碎成18目的粗颗粒；

2)将上步所得的粗颗粒以75％乙醇进行提取，以醋酸调pH值2.5，每次提取1.5小时，提取三次，合并提取液，所合并的提取液再进行减压浓缩得到浓缩液；

3)用氨水将上步所得的浓缩液调节pH值8.5进行酸化，碱化液以石油醚(1∶1)萃取三次；

4)再以水饱和过的乙酸乙酯萃取三次，减压回收，浓缩至比重1.11，然后冷冻干燥即得延胡索总碱提取物。

二、制剂实施例

【实施例1】延胡索总生物碱片剂

取延胡索总碱50.0g，加入药用淀粉25.0g，糖粉5.0g，微粉硅胶5.0g，混合制粒，干燥，加入2.0g硬脂酸镁混合压片，制成每片含延胡索总碱50mg，1000片。

【实例2】延胡索总生物碱片剂

取延胡索总碱200.0g，加入药用淀粉55.0g，糖粉12.0g，加羧甲基纤维素钠5.0g，加入淀粉浆，混合制粒，干燥，加入5.0g硬脂酸镁压片，制成每片含延胡索总碱200mg，1000片。

【实施例3】延胡索总生物碱胶囊

取延胡索总碱100.0g，加入药用淀粉40.0g，糖粉10.0g，羧甲基纤维素钠8.0g，混合均匀，加入淀粉浆，混合，制粒，干燥，装囊，制成1000粒，每粒含延胡索总碱100mg。

【实施例4】延胡索总生物碱胶囊

取延胡索总碱150.0g，加入药用淀粉50.0g，乳粉15.0g，微粉硅胶6.0g，混合均匀，加入淀粉浆混合，制粒，干燥，整粒，装囊，制成1000粒，每粒含延胡索总碱150mg。

【实施例5】延胡索总生物碱软胶囊

取延胡索总碱100.0g，加入500ml精制豆油，加热混合均匀，以明胶为基质的胶片，压制软胶囊，制成1000粒软胶囊，每粒含延胡索总碱50mg。

【实施例6】延胡索总生物碱软胶囊

取延胡索总碱200.0g，加入500ml精制豆油，加热混合均匀，以明胶为基质的胶片，压制软胶囊，制成1000粒软胶囊，每粒含延胡索总碱100mg。

【实施例7】延胡索总生物碱滴丸

取延胡索总碱50.0g，加入35.0g聚乙二醇6000，加热混合均匀，用滴丸机制备滴丸，灭菌制成1000粒。每粒含延胡索总碱5mg，制成每丸重40mg。

【实施例8】延胡索总生物碱滴丸

取延胡索总碱20.0g，加入20.0g聚乙二醇6000，加热混合均匀，用滴丸机制备滴丸，灭菌制成1000粒。每粒含延胡索总碱20mg，制成每丸重40mg。

【实施例9】延胡索总生物碱口服液

取延胡索总碱50.0g，加入注射用水9.8升，调pH 4.5，加入吐温-80 100ml，加入甜叶菊总甙5.0g，混合均匀，过滤，灌装，灭菌，制成1000只口服液，每只10ml，含延胡索总碱50mg。

【实施例10】延胡索总生物碱口服液

取延胡索总碱100.0g，加入注射用水9.7升，调pH 3.5，加入吐温-80 100ml，加入炼制蜂蜜200ml，混合均匀，过滤，灌装，灭菌，制成1000只口服液，每只10ml，含延胡索总碱100mg。

【试验例1】延胡索总生物碱的镇痛作用

(一)对醋酸所至小鼠扭体反应次数的影响

取小鼠60只，随机等分为六组，每组10只，第一组为正常对照组，第二组为阳性药阿司匹林20mg/Kg，第三、四、五、六组分别为延胡索总碱192、96、48、24mg/Kg。灌胃给药，体积均为20ml/kg，每日1次，连续3日，正常对照组给予等体积蒸馏水。于末次给药后1小时，腹腔注射0.6％冰醋酸，观察并记录注射冰醋酸5分钟后10分钟内的扭体次数。

结果见表1。

表1.对醋酸所致小鼠扭体反应次数的影响(X±S；n＝10)

注：与正常对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

由表1结果可见，延胡索总碱各给药组及阿司匹林组均可明显减少小鼠扭体反应次数，且有一定的量效关系。表明延胡索总碱对小鼠扭体反应具有明显的抑制作用。

(二)对小鼠热板痛阈值的影响[2]

选取合格(痛阈值在5-30s范围内)雌性小鼠60只，随机等分六组，每组10只，第一组为正常对照组，第二组为阳性药阿司匹林20mg/Kg，第三、四、五、六组分别为延胡索总碱192、96、48、24mg/Kg。灌胃给药，体积均为20ml/kg，每日1次，连续3日，正常对照组给予等体积蒸馏水。于末次给药后1、2、3h各测小鼠痛阈值一次。结果见表2。

表2.对小鼠热板痛阈值的影响(X±S；n＝10)

注：与正常对照组比较*P＜0.05。

由表2结果可见，延胡索总碱192、96mg/Kg，于给药后1、2、3小时均可明显延长热刺激所致小鼠疼痛反应时间，其作用强度与阳性药阿司匹林20mg/Kg相似；48mg/Kg于药后2、3小时亦具明显作用；而24mg/Kg痛阈值虽有所延长，但无统计学意义。表明延胡索总碱在48-192mg/kg剂量范围内对热刺激所致疼痛反应有明显抑制作用。

对本发明实施例1-10所制备的延胡索总碱提取物及制剂实施例1-10所制备的延胡索总碱制剂进行了相同的试验，其获得的结果相似。

【试验例2】延胡索总生物碱对实验性大鼠子宫内膜异位症的影响

本试验例通过制备“大鼠子宫内膜移位症模型”，观察了延胡索总碱及其在有效剂量范围内不同配比对内移症的影响。实验结果表明，延胡索总碱能明显减小大鼠异位内膜组织的体积，抑制内膜组织生长。病理组织学检查各给药组可见腺体数目明显减少、上皮细胞萎缩，其对大鼠内异症有显著的治疗作用。其有效剂量范围为延胡索总碱为25-100mg/Kg。对治疗“内异症”具有良好前景。

实验目的：按照中药新药研究指南要求，根据延胡索总生物碱的功能主治，选择适当的动物模型和试验方法，对该药的有效性做出科学的评价，为其临床研究提供药理学依据。

实验材料

药物延胡索总生物碱，含量≥80％，由北京大学天然药物和仿生药物国家重点实验室提供，批号：080119。实验前用蒸馏水配制成不同浓度的溶液，置4℃冰箱保存备用。孕三烯酮胶囊，2.5mg/粒，由北京紫竹药业有限公司生产，批号：53080101。实验前用0.5％羧甲纤维素钠配制成所需浓度；丹莪妇康煎膏，100g/瓶，昆明滇虹药业有限公司产品，批号：070902。实验前加适量蒸馏水配制成所需浓度的溶液，置4℃冰箱保存备用。己烯雌酚，0.5mg/片，合肥久联制药有限公司产品，批号：070303；庆大霉素，8万单位/2ml：，天津药业集团新郑股份有限公司产品，批号：070816；阿司匹林肠溶片，批号：0712231，神威药业有限公司产品。

试剂E2放射免疫分析药盒：购自北京市福瑞生物工程公司，批号：20080401。

动物Wistar大鼠，体重180～200g，雌性；KM小鼠，体重19～21g，雌性，均购自吉林大学基础医学院动物实验中心。小鼠合格证号：SCXK 2003-0001大鼠合格证号：。

仪器GC-2010r放射免疫计数器，科大创新股份有限公司中佳分公司生产。GJ-8402型热板测痛仪，浙江宁海白石电子医疗仪器厂。

统计学方法使用spss13.0统计软件，计量资料采用t检验，计数资料采用秩和检验。

方法与结果

一、延胡索总碱对实验性大鼠子宫内膜异位症的影响

取内异症模型大鼠110只，随机等为分十一组，第一组为假手术组，第二组为内异症模型组，第三、四组分别为阳性対照药孕三烯酮0.5mg/Kg、丹莪妇康煎膏5.4g/Kg，第五、六、七、八组分别为延胡索总碱200、100、50、25mg/Kg，模型组及假手术组均给予蒸馏水，每日1次，连续4周。每天观察给药后动物外观、行为活动、排便情况，每周称体重一次记录体重变化。末次给药后24h，以3％水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉，腹主动脉取血，分离血清，采用放免法测定雌二醇(E2)含量。剥离腹壁移植内膜组织，在光学显微镜下以卡尺测量其长、宽、高并计算体积，同时用10％福尔马林固定，做病理组织学检查。

(一)、对内移症大鼠异位内膜体积的影响

表3.对大鼠异位内膜体积的影响(X±S；n＝9)

注：与模型组比较*P＜0.05；**P＜0.01。

由表3结果可见，各给药组病灶体积与模型组比较均明显减小，且具有一定的量效关系，药物能明显减小异位内膜体积有效剂量范围：延胡索总碱为25-100mg/Kg。延胡索总碱为200mg/Kg作用强于阳性対照药孕三烯酮和丹莪妇康煎膏，表明延胡索总碱对内异症均有明显的抑制作用。

(二)、对内异症大鼠异位子宫内膜形态学的影响

肉眼可见异位内膜组织为隆起的小囊肿，给药后囊肿减小，并且粘连比模型组轻。光镜下，假手术组可见粘膜上皮完整，上皮细胞为柱状上皮，可见腺体、血管、间质等正常组织。子宫内膜异位模型组，可见移植的内膜组织生长，其被覆柱状上皮结构清晰，可见腺体，间质有中性粒细胞。各给药组异位内膜组织成抑制状态，与模型组比较可见腺体及间质有不同程度的减少，上皮细胞呈萎缩状态。其中延胡索总碱200、100、50mg/kg最明显，抑制作用较强，多数动物腺体消失，间质明显减少，上皮细胞成萎缩状态。其作用优于孕三烯酮组和丹娥妇康煎膏。结果见表4：

表4.病理检查各组大致情况

组别	光镜下内膜形态
		假手术对照组	黏膜上皮完整，上皮细胞为柱状上皮，可见腺体、血管、间质等正常。
模型对照组	可见移植的内膜组织生长，其被覆柱状上皮结构清晰，可见腺体较多，腺体排列不规则，间质有中性粒细胞。
		孕三烯酮组	异位内膜组织成抑制状态，腺体、间质明显减少、个别动物腺体消失，腺体排列规则，上皮细胞成萎缩状态。
丹娥妇康煎膏组	异位内膜组织成抑制状态，腺体及间质明显减少，个别动物腺体消失，上皮细胞变薄。
		延胡索总碱200mg/kg	异位内膜组织成抑制状态，多数动物腺体消失，间质明显减少，上皮细胞成萎缩状态。
延胡索总碱100mg/kg	异位内膜组织成抑制状态，部分动物腺体消失及间质明显减少，上皮细胞成萎缩状态。
		延胡索总碱50mg/kg组	异位内膜组织成抑制状态，部分动物腺体及间质明显减少。上皮细胞变薄。
延胡索总碱25mg/kg组	异位内膜组织成抑制状态，个别腺体及间质较模型组减少，上皮细胞变薄。

(三)、对内异症大鼠雌二醇含量的影响

末次给药后24h，以3％水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉，腹主动脉取血，分离血清，采用放免法测定雌二醇(E2)含量，结果见表5。

表5、对内异症大鼠雌二醇含量的影响(X±S；n＝9)

由表5结果可见延胡索总碱和丹莪妇康煎膏对E2均有一定的抑制作用。由此初步推测二者可能通过抑制卵巢合成或分泌E2而达到抑制移位内膜增生的。其他各组对内异症大鼠雌二醇含量影响则无规律变化，此可能与雌性大鼠性周期性变化有关。

对本发明实施例1-10所制备的延胡索总碱提取物及制剂实施例1-10所制备的延胡索总碱制剂进行了相同的试验，其获得的结果相似。

Claims (2)

1.一种延胡索总碱的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1）将延胡索粉碎成粗颗粒；

2）将上步所得的粗颗粒进行提取得到提取液，提取液再进行减压浓缩得到浓缩液；

3）将所得的浓缩液进行后处理即得延胡索总碱提取物；

其中所述的后处理包括用乙酸乙酯萃取、浓缩和冷冻干燥；

在步骤2）和步骤3）之间还包括将浓缩液进行碱化的过程；

在所述碱化后还包括如下步骤：将碱化液用石油醚萃取三次；

所述的乙酸乙酯为水饱和过的乙酸乙酯，所述的萃取为萃取三次；

所述的碱化为采用氨水调节浓缩液的pH值8-9。

2.一种延胡索总碱在制备治疗子宫内膜异位症的药物中的应用，其特征在于，所述的延胡索总碱为权利要求1所述的制备方法制得的延胡索总碱。