CN102139002B

CN102139002B - 一种具有免疫抑制活性的黄柏提取物及其制备方法和医药用途

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Publication number: CN102139002B
Application number: CN 201110077860
Authority: CN
Inventors: 匡海学; 王秋红; 杨炳友; 夏永刚; 焦文娟
Original assignee: 匡海学
Priority date: 2011-03-30
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2031-03-30
Also published as: CN102139002A

Abstract

本发明涉及一种黄柏多糖提取物及其制备方法和医药用途。本发明提取物中黄柏多糖的含量以葡萄糖计，所述多糖的含量占黄柏提取物重量百分比65％以上；本发明通过大量的药理学实验发现，黄柏总多糖提取物具有显著的免疫抑制活性，可以制成用作免疫抑制的药物或作为制备其他免疫抑制药物的原料药，用于与免疫反应相关的各种疾病的治疗用途，包括治疗：肾炎、咽炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、肠炎、妇科炎症、类风湿关节炎、糖尿病等免疫相关性疾病。

Description

一种具有免疫抑制活性的黄柏提取物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明涉及一种中药有效部位提取物，尤其涉及一种具有免疫抑制活性的黄柏提取物及其制备方法，本发明还涉及该黄柏提取物作为免疫抑制剂治疗与免疫有关的免疫炎性损伤性疾病如肾炎、咽炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、肠炎、妇科炎症、类风湿性关节炎、糖尿病等免疫相关性疾病的医药用途，属于中药有效部位提取物领域。

背景技术

黄柏是芸香科植物黄皮树(Phellodendron Chinense Schneid.)及黄柏树(P.AmurenseRupr.)除去栓皮的干燥树皮，前者习称“川黄柏”，后者习称“关黄柏”。本品始载于《神农本草经》，原名“檗术”，列上品。“主五脏肠胃中结热、黄疸、肠痔、止泻痢、女子漏下赤白、阴伤蚀疮”是我国传统医学中一种重要的常用中药材。统理论认为具有清热燥湿、泻火解毒、治湿热引起的痢疾、黄疸、白带、痔疮便血、阴虚火旺引起的骨蒸痨热、目赤耳鸣、盗汗、口舌生疮等功效。现代药理学研究发现黄柏在降血糖、抗癌、抑制免疫、降血压、抗菌、抗炎、解热、抗溃疡、抗氧化、抗痛风、抗病毒等方面具有良好的功效。目前对黄柏化学成分的研究主要集中于黄柏中的小檗碱、黄酮类成分上，以黄柏多糖为主的提取物尚无人重视，研究甚少。近年来本课题组对一直被研究者所忽视的黄柏多糖的药理研究结果显示，黄柏多糖具有确切的免疫抑制活性，为黄柏中的重要活性物质，可以阐明黄柏多方面的药效，并通过免疫抑制作用机制，用于各种与免疫有关的免疫损伤性疾病如肾炎、肝炎、肺炎、糖尿病、妇科炎症、咽炎、肠炎、类风湿性关节炎、哮喘等的治疗。至此，黄柏多糖发挥免疫抑制活性用于该类疾病的治疗还未见报道。

发明内容

本发明目的之一是提供一种具有免疫抑制活性的黄柏提取物。

本发明目的之二是提供一种上述黄柏提取物的制备方法，该提取物中黄柏多糖的含量占提取物重量百分比的65％以上。

本发明目的之三是将上述黄柏提取物制成各种剂型的免疫抑制剂，用于与免疫有关的免疫炎性损伤性疾病如肾炎、肝炎、肺炎、妇科炎症、咽炎、肠炎、糖尿病、类风湿性关节炎、哮喘病等的医药用途。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一个目的是提供一种具有免疫抑制活性的黄柏提取物，本发明通过深入的化学、药理学、药效学研究，确定黄柏提取物为免疫抑制活性部位，具有显著的免疫抑制活性，用于与免疫相关的各种疾病的治疗用途，包括治疗过肾炎、咽炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、肠炎、妇科炎症、类风湿性关节炎及糖尿病等免疫相关性疾病。

本发明的另一个目的是提供一种上述黄柏提取物的制备方法，以葡萄糖(C₆H₁₂0₆)计，所述提取物中黄柏多糖的含量占提取物重量百分比的65％以上。其提取方法主要包括以下步骤：

(1)将黄柏用高浓度乙醇回流脱脂；(2)残渣加水回流提取，滤液浓缩，加入乙醇醇沉，离心得沉淀；(3)沉淀依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤；(4)洗涤后的沉淀用蒸馏水溶解，透析；(5)透析液浓缩，加入乙醇醇沉，离心得沉淀；(6)沉淀依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤；(7)洗涤后的沉淀用蒸馏水复溶，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法，脱去色素和蛋白质，即得黄柏提取物。

为了达到更好的提取效果，优选的，步骤(1)中将黄柏用6～10倍重量的80-95％乙醇回流脱脂2～4次，每次回流2-3h；步骤(2)中将残渣加6-10倍重量的蒸馏水回流提取2-4次，每次回流提取2-3h；将滤液浓缩至0.2-1.0倍体积，加入80-95％乙醇醇沉，离心得沉淀；步骤(3)、(6)中将沉淀依次用2-4倍重量的无水乙醇，2-4倍重量的丙酮分别洗涤；步骤(4)中的沉淀以0.5-2.0倍重量的蒸馏水溶解，以分子量大小为3.0×10³-1.2×10⁴的透析袋透析24-72h。

本发明的目的还包括将上述黄柏提取物制成各种剂型的免疫抑制剂，用于与免疫有关的免疫炎性损伤性疾病如肾炎、咽炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、肠炎、妇科炎症、类风湿关节炎及糖尿病等的医药用途。

本发明黄柏提取物可以加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂后，以常规的中药制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂，例如可以是注射剂(粉针、冻干粉针、水针、输液等)、口服制剂(片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊或滴丸)等。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

取干燥至恒重的黄柏粉末(60℃条件下干燥8h)约500g，用95％乙醇回流提取3次，每次3h，用亚麻布抽滤，将滤渣至通风处自然晾干，残渣加蒸馏水6倍量，回流提取3次，每次3h，用亚麻布抽滤，合并滤液，减压回收溶剂至0.5倍体积，用95％乙醇调至含醇量为80％，静置过夜，2000rpm每分钟离心，沉淀依次用3倍量无水乙醇、丙酮洗涤，蒸馏水溶解，经过弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂脱去总色素和蛋白质冷冻干燥得黄柏粗提物。取粗提物加水溶解，上清液装入透析袋中透析24h，透析液减压浓缩至0.5倍体积，加入95％乙醇调含醇量为80％，静置过夜，2000rpm每分钟离心，沉淀用3倍量无水乙醇、丙酮依次洗涤，得精制黄柏提取物。用DNS比色法，722型可见分光光度计在480nm处，测定黄柏多糖含量，以葡萄糖计为70％。

实施例2

取干燥至恒重的黄柏粉末(60℃条件下干燥8h)约500g，用80％乙醇回流提取2次，每次3h，用亚麻布抽滤，将滤渣至通风处自然晾干，残渣加蒸馏水10倍量，回流提取2次，每次3h，用亚麻布抽滤，合并滤液，减压回收溶剂至1.0倍体积，用100％乙醇调至含醇量为85％，静置过夜，2000rpm每分钟离心，沉淀依次用4倍量无水乙醇、丙酮洗涤，蒸馏水溶解，经过弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂脱去色素和蛋白质冷冻干燥，得提取物。用DNS比色法，722型可见分光光度计在480nm处，测定黄柏多糖含量，以葡萄糖计为65％。

实施例3制成输液剂

取实施例1所制备的黄柏提取物适量，加入适量增溶剂，研磨，再加入少量注射用水进行稀释，混匀，然后加入氯化钠适量，溶解后再加注射用水至规定量，滤过，灌封，灭菌，即得。

实施例4制成片剂

取实施例3所制备的黄柏提取物适量，加入稀释剂、崩解剂等辅料适量，混匀，制成颗粒，干燥，压制成片，包衣或喷薄膜衣即得。

试验例1黄柏提取物抗炎实验

ICR小鼠雄性80只，随机分成黄柏提取物高剂量组(400mg/kg)、黄柏提取物低剂量组(100mg/kg)、阳性对照地塞米松组(3.6mg/kg)和空白对照组。秤取各组小鼠体重，计算均值标准差确定无组间差异，连续灌胃给药三天，第三天于末次给药后50min，每鼠右耳涂致炎剂(二甲苯20ul)，左耳作为空白对照，3小时后将处死，剪下两耳并打下圆耳片，分析天平称重，计算小鼠耳朵肿胀度，比较4组肿胀度的差异性。实验结果见表1：

表1黄柏提取物抗炎实验结果(

n＝10)

注：与空白组比较＊p＜0.05，＊＊p＜0.01

结果表明，各给药组同空白对照组比较，黄柏高、低剂量组小鼠的左右耳差值重量减轻，出现极显著性差异(p＜0.01)。表明黄柏提取物高剂量、低剂量均能降低小鼠耳肿胀程度，具有抗炎作用。

试验例2黄柏提取物解热实验

取waster大鼠雄性80只，按体重随机分成黄柏提取物高剂量组(280mg/kg)、黄柏提取物低剂量组(70mg/kg)、阳性对照地塞米松组(3.78mg/kg)和空白对照组。先用肛温计测量每只鼠正常肛温(肛温计插入肛门内1.5cm)二次，记录各组小鼠初始体温，求其平均值作为正常体温，计算均值标准差确定无组间差异，禁食不禁水12h后，空白对照组生理盐水灌胃，模型对照组灌胃给药。灌胃给药30min后皮下注射2，4-二硝基酚(30mg/kg)致热，给致热剂后0.5小时、1小时、2小时、4小时和6小时记录大鼠体温变化。结果见下表2：

表2黄柏提取物解热实验结果(

n＝10)

注：各组与空白对照组在相同时间比较＊p＜0.05，＊＊p＜0.01

表2结果表明，各组动物的正常体温无明显的差异性(P＞0.05)，给致热剂后的不同时间各组动物体温明显升高。而不同时间各给药组分别同空白组比较，给致热剂后0.5h、1h各组无明显的差异性(P＞0.05)；给致热剂后2h，阳性对照组、黄柏提取物高剂量组动物体温明显降低(P＜0.01或P＜0.05)，其余各组无明显的差异性(P＞0.05)；给致热剂后4h，阳性对照组、黄柏提取物高、低剂量组动物体温明显降低(P＜0.01)，其他各组无明显的差异性(P＞0.05)；给致热剂后6h，各组动物体温之间无明显的差异性(P＞0.05)。表明黄柏提取物可抑制2，4-二硝基酚引起的大鼠体温升高，具有明显的解热作用。

试验例3黄柏提取物免疫抑制实验

取体重为18-22g的BALC/C小鼠雄性80只，按体重随机分成黄柏提取物高剂量组(400mg/kg)、黄柏提取物中剂量组(20mg/kg)、黄柏提取物低剂量组(10mg/kg)，每组设三个平行组。阳性对照地塞米松组(1.8mg/kg)、香菇多糖组(6.0mg/kg)、空白对照组(生理盐水0.5ml/天)，适应一周后开始按上述剂量给药。末次给药24小时后，按0.1ml/10g尾静脉注射用1％明胶稀释四倍的印度墨汁，注射后分别在2分钟、6分钟从眼静脉丛取血20ul，立即装入有2ml0.1％Na₂CO₃的试管中，以Na₂CO₃溶液作空白对照，于600nm比色测定。结果见表3：

表3黄柏提取物碳廓清实验结果

廓清指数K＝(1gOD₁-1gOD₂)/(t₂-t₁)；吞噬指数α＝体重/肝脾重×³√K

地塞米松组与空白组比较，廓清指数K值和吞噬指数α值均明显降低，且有极显著差异(p＜0.01)，黄柏提取物高剂量与空白组比较，廓清指数K值和吞噬指数α值均下降，α值(p＜0.05)，有显著差异，黄柏提取物中剂量与空白组比较，廓清指数K值和吞噬指数α值均下降，α值(p＜0.05)，有极显著差异，黄柏提取物低剂量与空白组比较，廓清指数K值和吞噬指数α值均下降，但是无显著差异(p＞0.05)。

试验例4黄柏提取物治疗大鼠慢性肾炎实验

取雄性Wister大鼠60只，体重180-220g，24h后检查尿蛋白应为正常。先普通喂养1周使其适应环境，然后随机分成6组：A正常组，B模型组，C阳性药肾炎四味片(荆州制药厂生产，批号为980401)对照组(0.1g/ml)，D黄柏提取物低剂量组(0.1g/ml)，E黄柏提取物中剂量组(0.2g/ml)，F黄柏提取物高剂量组(0.4g/ml)。将经典BORDER方法加以改良制成大鼠慢性肾炎模型：阳离子化牛血清蛋白(C-BSA)1mg溶于0.5ml磷酸盐缓冲液中，与等量不完全弗氏试剂乳化，给大鼠多点皮下注射为预免疫。1周后开始正式免疫，尾静脉注射C-BSA2.5mg(溶于1ml磷酸盐缓冲液中)，每周3次，连续4周。于正式免疫后第2周开始给药，第6周结束实验。实验过程中无动物死亡，正式免疫后第2周模型组开始出现不同程度的精神萎靡、少动、皮毛枯槁不泽；正式免疫后第3周，模型组开始出现阴囊水肿，各治疗组未见阴囊水肿。实验结束时测定大鼠24h尿蛋白，结果见表4：

表4黄柏提取物治疗大鼠慢性肾炎实验结果(

n＝10)

与正常组相比，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与病理组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与阳性对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

本实验结果显示，正式免疫2周时，造模组尿蛋白升高，与正常组相比有显著差异(P＜0.01)；正式免疫4周后(即免疫同时给药后)，各治疗组尿蛋白上升趋势减缓，以低剂量上升显著，然与病理组相比仍有显著差异(P＜0.05)；实验结束时，可见模型组及低剂量组尿蛋白进一步升高，其余三组尿蛋白均有不同程度降低，以高剂量组下降幅达最大，其次为对照组。各组疗效依次为：高剂量治疗组＞阳性对照组＞中剂量治疗组＞低剂量治疗组。由此可见，黄柏提取物能显著降低尿蛋白，改善肾功能，表现出剂量依赖性，可用于治疗慢性肾炎。

Claims

1.一种具有免疫抑制活性的黄柏提取物，其特征在于该提取物的制备方法如下：(1)将黄柏用6～10倍重量的80～95％乙醇回流脱脂2～4次，每次回流2～3h；(2)残渣加6～10倍重量的蒸馏水回流提取2～4次，每次回流提取2～3h，滤液浓缩至0.2～1.0倍体积，加入80～95％乙醇醇沉，离心得沉淀；(3)沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇，丙酮分别洗涤；(4)洗涤后的沉淀用0.5～2.0倍重量的蒸馏水溶解，以分子量大小为3.0×10³-1.2×10⁴的透析袋透析24～72h；(5)透析液浓缩，加入乙醇醇沉，离心得沉淀；(6)沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇，丙酮分别洗涤；(7)洗涤后的沉淀用蒸馏水复溶，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法脱去提取物中的色素和蛋白质，即得黄柏提取物。

2.权利要求1所述黄柏提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将黄柏用高浓度乙醇回流除去脂溶性杂质；(2)残渣加水回流提取，滤液浓缩，加入乙醇醇沉，离心得沉淀；(3)沉淀依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤；(4)洗涤后的沉淀用蒸馏水溶解，透析；(5)透析液浓缩，加入乙醇醇沉，离心得沉淀；(6)沉淀依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤；(7)洗涤后的沉淀用蒸馏水复溶，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法脱去提取物中的色素和蛋白质，即得权利要求1所述的黄柏提取物。

3.权利要求2所述黄柏提取物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中将黄柏用6～10倍重量的80～95％乙醇回流脱脂2～4次，每次回流2～3h；步骤(2)中将残渣加6～10倍重量的蒸馏水回流提取2～4次，每次回流提取2～3h，将滤液浓缩至0.2～1.0倍体积，80～95％乙醇醇沉，离心得沉淀；步骤(3)、(6)中将沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇，丙酮分别洗涤；步骤(4)中的沉淀以0.5～2.0倍重量的蒸馏水溶解，以分子量大小为3.0×10³-1.2×10⁴的透析袋透析24～72h。

4.权利要求1所述具有免疫抑制活性的黄柏提取物在制备治疗免疫相关疾病的药物中的用途：加上药学上常用的附加剂或与其它医药原料配伍制备成临床上常用的注射制、片剂、颗粒剂、胶囊剂或外用制剂，其中所述的免疫相关疾病是肾炎、咽炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、肠炎、妇科炎症、类风湿性关节炎、糖尿病。