CN103191289B - 知母黄柏药对中四种有效部位的同步制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种知母黄柏药对中四种有效部位的同步制备方法，所述四种有效部位分别为总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物、总生物碱提取物，同步制备方法的步骤包括：溶剂提取、过滤、大孔树脂和阳离子树脂吸附、洗脱、浓缩、冷冻干燥。本发明的制备方法能有效避免单一提取带来的资源浪费，提高效率，为综合研究知母黄柏药对中各有效部位的药效提供简便易行的操作方法，易于工业化生产。同时对这四种有效部位分别进行了降糖降脂研究，结果表明知母黄柏药对中四种有效部位均有降糖作用，为进一步开发成药品提供了参考。

Description

知母黄柏药对中四种有效部位的同步制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及中医药领域，特别是涉及一种知母黄柏药对中四种有效部位的同步制备方法及其应用。

背景技术

糖尿病(DiabetesMellitus，简称DM)是一种常见的的内分泌代谢失常性疾病，糖尿病的临床表现常被描述为:“三多一少”即:多尿、多饮、多食和体重减轻。糖尿病患者长期处于高血糖状态，而高血糖可连累各组织器官出现严重的并发症，多表现为感染、心脑血管疾病、肾病变、神经病变及酮症酸中毒等，其对人体的危害远远超过了糖尿病本身。DM本身是一种非常复杂的代谢性疾病，与多种病理生理机制相关，包括了肥胖、高血压、脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗等。糖尿病属于中医“消渴病”的范畴。中医治疗糖尿病的历史源远流长，中医将多饮、多食、多尿，久则身体消瘦或尿有甜味为主要症状的一类病症称为“消渴”。

中医学从宏观上对糖尿病的病因与发病机制有较为全面的认识，认为其最基本的病机是阴虚燥热。中医治疗消渴病的治则主要为滋阴清热，益气养阴，重视补肾、健脾及活血化疲等。知母和黄柏（川）是临床常用的清热药对之一。二者伍用最早出自金·李杲《兰室秘藏》滋肾丸。其主要药效部分分为皂苷类，黄酮类，生物碱类和多糖类四部分。知母根茎含皂苷约6％，知母根茎中黄酮主要为芒果苷，约占0.7％；川黄柏中的总生物碱含量为3.99％-5.33％，小檗碱含约3.4％。现代药理研究表明，黄柏总生物碱中的主要成分小檗碱能改善糖尿病肾病小鼠肾功能不全。知母皂苷能显著提高糖尿病小鼠的糖耐量，降低实验性糖尿病小鼠的空腹血糖。知母中的多糖、芒果苷等成分也有降血糖的作用。

现有关于知母黄柏提取物的制备方法与降血糖作用专利申请多为单独研究知母，对知母黄柏药对研究比较少。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种知母黄柏药对中四种有效部位的同步制备方法。

具体的技术方案如下：

一种知母黄柏药对中四种有效部位的同步制备方法，所述四种有效部位分别为总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物、总生物碱提取物，同步制备方法包括如下步骤：

（1）将重量比为1:0.8-1.2的知母和黄柏粉碎至10-120目，用体积浓度为60%～95%的乙醇回流提取1-5次，再用体积浓度为20%～60%的乙醇回流提取1-5次，合并提取液；

（2）将步骤（1）得到的提取液用300-400目的滤袋过滤，将滤液通过串联的大孔树脂和离子交换树脂；

（3）用10-15倍柱体积的水洗脱串联的大孔树脂和离子交换树脂，收集洗脱液及未吸附的滤液，得总多糖提取液；

再用6-10倍柱体积的体积浓度为40%的乙醇洗脱大孔树脂，收集洗脱液得总皂苷提取液；

再用6-10倍柱体积的体积浓度为70%的乙醇洗脱大孔树脂，收集洗脱液得总黄酮提取液；

最后用6-10倍柱体积的浓度为0.5-1mol/L的氨水洗脱离子交换树脂，收集洗脱液得总生物碱提取液；

（4）将步骤（3）得到的总多糖提取液、总皂苷提取液、总黄酮提取液、总生物碱提取液分别进行浓缩、冷冻干燥，得总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物、总生物碱提取物。

在其中一些实施例中，所述总多糖提取物中总多糖的含量大于50%（一般在50-68%之间）；总皂苷提取物中总皂苷的含量大于50%（一般在50-68%之间）；总黄酮提取物中总黄酮的含量大于50%（一般在50-68%之间）；总生物碱提取物中总生物碱的含量大于50%（一般在50-68%之间）。

在其中一些实施例中，所述总皂苷提取物的主要成分包括知母皂苷BII，所述总黄铜提取物的主要成分包括芒果苷，所述总生物碱提取物的主要成分包括盐酸小檗碱和黄柏碱。

在其中一些实施例中，步骤（1）中每次提取所用的乙醇的量为知母和黄柏总重量的6-10倍，每次提取的时间为1-2h。

在其中一些实施例中，所述大孔树脂为PIPO-OO、D101、XDA-5、AB-8中的一种；离子交换树脂为001×7、001×4中的一种。

在其中一些实施例中，步骤（4）中浓缩的工艺条件为：控制真空度为0.06-0.10MPa，温度为70-80℃；冷冻干燥的工艺条件为：控制真空度小于20Pa，温度为-45～-60℃。

本发明的另一目的是提供上述制备方法得到的总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物或总生物碱提取物的应用。

具体的技术方案：

上述制备方法得到的总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物或总生物碱提取物在制备治疗降血糖的药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种治疗降血糖的药物。

一种治疗降血糖的药物，包括上述制备方法得到的总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物或总生物碱提取物以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的有益效果：

本发明采用乙醇提取，经两节串联树脂（大孔树脂和离子交换树脂）同时提取分离知母黄柏药对中总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物和总生物碱提取物，有效避免单一提取带来的资源浪费，提高效率，为综合研究知母黄柏药对的各部位药效提供简便易行的操作方法，易于工业化生产。同时对这四种有效部位分别进行了降糖降脂研究，结果也更进一步明确知母黄柏药对中四种有效部位均有降糖作用，为进一步开发成药品提供了参考。

附图说明

图1为实施例1总生物碱提取物的高效液相-蒸发光检测谱图（1为黄柏碱，2为盐酸小柴碱）；

图2为实施例1总皂苷提取物的高效液相-蒸发光检测谱图（3为知母皂苷BII）；

图3为实施例1总黄酮提取物的高效液相检测谱图（4为芒果苷）。

具体实施方式

本发明实施例所使用的原料知母为百合科知母属植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的根茎，主选河北产地道药材。黄柏为芸香科植物黄皮树PhelledendronchinenseSchneid的干燥树皮，也就是俗称的川黄柏，主选四川、贵州产地道药材。

知母黄柏药对中四种有效部位总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物和总生物碱提取物的含量分析方法如下：

1.总皂苷

精密吸取知母皂苷BII对照品适量，配置为0.116mg/ml的溶液，摇匀，作为对照品溶液。精密吸取知母皂苷BII对照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml于带塞刻度试管中，水浴挥干，加5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，于70℃水浴15min，取出，冰浴5min，加冰醋酸5ml，摇匀即得。以随行试剂为空白，于545nm波长下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，知母皂苷BII毫克数为横坐标，绘制标准曲线。

精密称取总皂苷提取物样品3份，每份20mg置于10ml容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述样品溶液1ml于带塞刻度试管中，水浴挥干，加5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，于70℃水浴15min，取出，冰浴5min，加冰醋酸5ml摇匀，于545nm波长下测定吸光度，外标两点法计算含量。

2.菝契皂苷元

色谱条件:色谱柱：DikmaC18（4.6×250mm）；流动相：甲醇：水；流速：1.0ml/min；蒸发光散射检测器检测，漂移管温度：40℃，氮气压力：3.0Bar。

标准曲线绘制:精密量取菝契皂苷元对照品配成的0.33mg/ml的对照品溶液4、8、12、16、20ul，依次进样，测定色谱峰峰面积，以峰面积值为纵坐标，进样量（ug）为横坐标，绘制标准曲线。

含量测定：精密称取总皂苷提取物样品3份，每份100mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀。作为菝契皂苷元含量测定的供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液10μL，注入色谱液相仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。

3.总黄酮

精密吸取芒果苷对照品适量，配置为30ug/ml的溶液，摇匀，作为对照品溶液。精密吸取芒果苷对照品溶液1，2，5，10，15，25ml于50ml量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀。以随行试剂为空白，于247nm波长下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，芒果苷的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

精密称取总黄酮提取物样品3份，每份5mg置于10ml容量瓶中，加70％甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀。取上述供试品溶液在247nm下测定吸光度。外标两点法计算含量。

4.总生物碱

精密称取盐酸小檗碱对照品配成浓度为0.8mg/ml的对照品溶液。精密吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于10ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀即得。以0.1mol/L盐酸溶液为空白，于265nm波长测定吸光度。以吸光度为纵坐标，盐酸小檗碱浓度为横坐标，绘制标准曲线。

精密称取总生物碱提取物样品3份，每份200mg置于100ml容量瓶中，用乙醇定容至刻度；取10ml溶液于中性氧化铝柱（5.00g）上，乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，用乙醇定容至25ml容量瓶中，摇匀。各精密移取0.3ml于5ml容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。于265nm波长测定吸光度，外标两点法计算含量。

5.盐酸小檗碱

色谱条件：色谱柱：DikmaC18（4.6×250nm）;流动相:乙腈-0.1％磷酸溶液(50:50)(每100ml加十二烷基硫酸钠0.1g);流速:1.0ml/min；检测波长265nm。

标准曲线绘制：精密称取盐酸小檗碱对照品加乙腈制成浓度为0.13mg/ml的对照品溶液。分别精密吸取1,4,8,12,16,20ul对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录峰面积值。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

含量测定：精密称取总生物碱提取物样品3份，每份20mg置于100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。吸取20ul注入高效液相色谱仪，测定色谱峰峰面积，计算含量。

6．总多糖

精密称取葡萄糖对照品适量（约100mg）,置于100mL量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密吸取葡萄糖对照品溶液0.0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8mL，置加10mL具塞刻度试管中,用纯水补足至1mL,精密加入1mL5%苯酚试液，摇匀，迅速加入5.0mL浓硫酸，摇匀后置于40℃水浴中加热15min，取出，迅速冷却至室温，于620nm处测定吸光度。以葡萄糖对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

精密称取知母、黄柏药对总多糖提取物样品各3份，每份10mg,置于10mL容量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述样品溶液1mL，精密加入1mL5%苯酚试液，摇匀，迅速加入5.0mL浓硫酸，摇匀后置于40℃水浴中加热15min，取出，迅速冷却至室温，于620nm处测定吸光度，外标两点法计算含量。

以下通过具体实施例对本发明做进一步阐述。

实施例1

一种知母黄柏药对中四种有效部位的同步制备方法，所述四种有效部位分别为总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物、总生物碱提取物，同步制备方法包括如下步骤：

（1）将重量比为1:1的知母和黄柏（各50g）粉碎至10-120目，用体积浓度为65%的乙醇先浸泡2-3h，回流（温度控制在80-100℃）提取3次，再用体积浓度为40%的乙醇回流（温度控制在80-100℃）提取3次，合并提取液；每次提取所用的乙醇的量为知母和黄柏总重量的6-10倍，每次提取的时间为1-2h；

（2）将步骤（1）得到的提取液用300-400目的滤袋过滤，将滤液通过串联的PIPO-00大孔树脂和阳离子交换树脂001×7；上样量为原料（重量g）：树脂（重量g）=1:1时，完成上样，流速为1/30BV/min。

（3）用10倍柱体积的水洗脱串联的大孔树脂和离子交换树脂，收集洗脱液及未吸附的滤液，得总多糖提取液；

再用6倍柱体积的体积浓度为40%的乙醇洗脱大孔树脂，收集洗脱液得总皂苷提取液；

再用6倍柱体积的体积浓度为70%的乙醇洗脱大孔树脂柱，收集洗脱液得总黄酮提取液；

最后用6倍柱体积的浓度为0.5-1mol/L的氨水洗脱离子交换树脂，收集洗脱液得总生物碱提取液；

（4）将步骤（3）得到的总多糖提取液、总皂苷提取液、总黄酮提取液、总生物碱提取液分别进行浓缩、冷冻干燥，得总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物、总生物碱提取物；

浓缩的工艺条件为：控制真空度为0.06-0.10MPa，温度为70-80℃；冷冻干燥的工艺条件为：控制真空度小于20Pa，温度为-45～-60℃。

总生物碱提取物的主要成分包括包括盐酸小檗碱、黄柏碱（参见图1）；所述总皂苷提取物的主要成分包括包括知母皂苷BII（参见图2）等；总黄酮提取物的主要成分包括芒果苷（参见图3）。

采用上述含量分析方法进行检测，所述总多糖提取物中总多糖的含量为54%；总皂苷提取物中总皂苷的含量为59%；总黄酮提取物中总黄酮的含量为55%；总生物碱提取物中总生物碱的含量为54%。

实施例2

一种知母黄柏药对中四种有效部位的同步制备方法，所述四种有效部位分别为总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物、总生物碱提取物，同步制备方法包括如下步骤：

（1）将重量比为1:0.8的知母和黄柏（分别为500g和400g）粉碎至10-120目，用体积浓度为75%的乙醇先浸泡2-3h，回流（温度控制在80-100℃）提取5次，再用体积浓度为60%的乙醇回流（温度控制在80-100℃）提取4次，合并提取液；每次提取所用的乙醇的量为知母和黄柏总重量的6-10倍，每次提取的时间为1-2h；

（2）将步骤（1）得到的提取液用300-400目的滤袋过滤，将滤液通过串联的PIPO-00大孔树脂和阳离子交换树脂001×4；上样量为原料（重量g）：树脂（重量g）=1:1时，完成上样，流速为1/30BV/min。

（3）用15倍柱体积的水洗脱串联的大孔树脂和离子交换树脂，收集洗脱液及未吸附的滤液，得总多糖提取液；

再用8倍柱体积的体积浓度为40%的乙醇洗脱大孔树脂，收集洗脱液得总皂苷提取液；

再用10倍柱体积的体积浓度为70%的乙醇洗脱大孔树脂，收集洗脱液得总黄酮提取液；

最后用8倍柱体积的浓度为0.5-1mol/L的氨水洗脱离子交换树脂，收集洗脱液得总生物碱提取液；

（4）将步骤（3）得到的总多糖提取液、总皂苷提取液、总黄酮提取液、总生物碱提取液分别进行浓缩、冷冻干燥，得总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物、总生物碱提取物；

浓缩的工艺条件为：控制真空度为0.06-0.10MPa，温度为70-80℃；冷冻干燥的工艺条件为：控制真空度小于20Pa，温度为-45～-60℃。

所述总皂苷提取物的主要成分包括包括知母皂苷BII等；总黄酮提取物的主要成分包括芒果苷；总生物碱提取物的主要成分包括包括盐酸小檗碱、黄柏碱（液相-蒸发光检测谱图与实施例1相似，略去）。

采用上述含量分析方法进行检测，所述总多糖提取物中总多糖的含量为53%；总皂苷提取物中总皂苷的含量为56%；总黄酮提取物中总黄酮的含量为54%；总生物碱提取物中总生物碱的含量为52%。

实施例3

一种知母黄柏药对中四种有效部位的同步制备方法，所述四种有效部位分别为总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物、总生物碱提取物，同步制备方法包括如下步骤：

（1）将重量比为1:1.2的知母和黄柏（分别为5kg和6kg）粉碎至10-120目，用体积浓度为80%的乙醇先浸泡2-3h，回流（温度控制在80-100℃）提取4次，再用体积浓度为30%的乙醇回流（温度控制在80-100℃）提取5次，合并提取液；每次提取所用的乙醇的量为知母和黄柏总重量的6-10倍，每次提取的时间为1-2h；

（2）将步骤（1）得到的提取液用300-400目的滤袋过滤，将滤液通过串联的PIPO-00大孔树脂和阳离子交换树脂001×7；上样量为原料（重量g）：树脂（重量g）=1:1时，完成上样，流速为1/30BV/min。

（3）用12倍柱体积的水洗脱串联的大孔树脂和离子交换树脂，收集洗脱液及未吸附的滤液，得总多糖提取液；

再用10倍柱体积的体积浓度为40%的乙醇洗脱大孔树脂，收集洗脱液得总皂苷提取液；

再用8倍柱体积的体积浓度为70%的乙醇洗脱大孔树脂柱，收集洗脱液得总黄酮提取液；

最后用10倍柱体积的浓度为0.5-1mol/L的氨水洗脱离子交换树脂，收集洗脱液得总生物碱提取液；

（4）将步骤（3）得到的总多糖提取液、总皂苷提取液、总黄酮提取液、总生物碱提取液分别进行浓缩、冷冻干燥，得总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物、总生物碱提取物；

浓缩的工艺条件为：控制真空度为0.06-0.10MPa，温度为70-80℃；冷冻干燥的工艺条件为：控制真空度小于20Pa，温度为-45～-60℃。

所述总皂苷提取物的主要成分包括包括知母皂苷BII等；总黄酮提取物的主要成分包括芒果苷；总生物碱提取物的主要成分包括包括盐酸小檗碱、黄柏碱（液相-蒸发光检测谱图与实施例1相似，略去）。

采用上述含量分析方法进行检测，所述总多糖提取物中总多糖的含量为53%；总皂苷提取物中总皂苷的含量为54%；总黄酮提取物中总黄酮的含量为53%；总生物碱提取物中总生物碱的含量为53%。

实施例4知母黄柏药对总多糖提取物对糖尿病小鼠降糖作用的实验研究

1受试药物与仪器

按实施例1方法得到的总多糖提取物，其中总多糖的含量为54%；生理盐水

2实验动物

KM小鼠，雄性，体重（20±2）g,SPF级。

3实验方法

取体重20士2g的雄性KM小鼠，随机分为4组:正常对照组,灌胃生理盐水;总多糖提取物低、中、高剂量组分别灌胃知母聚糖溶液50、100、200mg/kg,1次/d,连续用药3周。末次给药6h后断头处死小鼠,取血液,葡萄糖氧化酶法测血糖值;另离心分离血清,置-20℃冰箱保存,1个月内做胰岛素的放射免疫测定。小鼠剖腹,自肝内门静脉按10ml/只的剂量,用注射器将生理盐水缓慢注入肝脏,将肝脏中残留血液冲洗掉,取出肝脏,称重,按每1g肝加入pH7.4等渗磷酸盐缓冲液(PBS)50ml用组织研磨器制备匀浆。取匀浆0.5ml,加入4%的磺基水杨酸溶液0.5ml,充分混匀,离心(3500r/min,20min)。弃去沉淀,蒽酮法测定肝糖原含量。结果见表1。

表1总多糖提取物对正常小鼠血糖、血胰岛素水平和肝糖原含量的影响

与对照组相比：*P〈0.05，**P〈0.01

实施例5知母黄柏药对总皂苷提取物对糖尿病小鼠降糖作用的实验研究

1受试药物与仪器

按实施例2方法得到的总皂苷提取物，其中总皂苷的含量为56%；生理盐水；降糖平（杭州中美华东制药有限公司，批号：101202）

2实验动物

KM小鼠，雄性，体重（20±2）g,SPF级

3实验方法

（1）对正常小鼠糖耐量的影响

取体重20士2g的雄性KM小鼠，共50只。测空腹血糖,随机分为5组。分别灌胃0.5ml药液或等体积的生理盐水,10min后灌胃淀粉(10g/kg)0.5ml,分别于给淀

粉后0.5h、1h、2h测血糖。结果如表2。

表2总皂苷提取物对正常小鼠糖耐量的影响(x±s,n=10)

与对照组相比：*P〈0.05，**P〈0.01

（2）对四氧嘧啶模型小鼠糖耐量的影响

取体重20士2g的KM雄性小鼠，禁食(不禁水)12h后,尾静脉注射55mg/kg新配制的四氧嘧啶生理盐水液,72h后,尾部取血测血糖值,选血糖>11.1mmo/L的小鼠50只,随机分为5组,其余步骤同（1）。结果如表3。

表3总皂苷提取物对四氧嘧啶模型小鼠糖耐量的影响(x±s,n=10)

与对照组相比：*P〈0.05，**P〈0.01

（3）对小鼠空腹血糖的影响

取雄性四氧嘧啶糖尿病KM小鼠50只随机分5组,正常对照组和模型组,灌胃生理盐水;知母聚糖低、中、高剂量组分别灌胃知母聚糖溶液50、100、200mg/kg，1次/d,连续给药30d,每10d称体重1次,根据体重调整给药量;分别于第10,20,30d末次灌胃2h后(禁食12h)小鼠尾部取血测血糖值。结果见表4。

表4总皂苷提取物对四氧嘧啶模型小鼠血糖的影响(x±s,n=10)

与对照组相比：*P〈0.05，**P〈0.01

实施例6知母黄柏药对总黄酮提取物对糖尿病小鼠降糖作用的实验研究

1、受试药物与仪器

按实施例2方法得到的总黄酮提取物，其中总黄酮的含量为53%；消渴丸（广州中一药业有限公司，批准文号：国药准字z44020045）；四氧嘧啶（sigma）

2、实验动物

KM小鼠，雄性，体重（20±2）g,SPF级

3、试验方法

（1）对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖的影响

取健康雄性KM小鼠125只,除10只留作正常对照组外,其余109只小鼠禁食12h后,尾静脉注射四氧嘧啶100mg/kg。72h后禁食8h,测定空腹血糖,选择血糖值≥11.1mmol/L的小鼠50供试验用,根据血糖值将高血糖小鼠分为5组,分别为DM组,消渴丸组，总黄酮提取物低、中、高剂量组,按表5中剂量给药,1次/d,连续给药3周,监测血糖值,结果见表5。

表5总黄酮对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠空腹血糖的影响(x±s，n=10)

注：与对照组相比：*P〈0.05，**P〈0.01

（2）对STZ糖尿病小鼠血糖的影响

取健康雄性KM小鼠90只,随机选取10只作为正常对照组,其余80只造模。动物禁食不禁水12h,按65mg/kg体重的剂量腹腔注射STZ,正常对照组按相同剂量注射柠檬酸缓冲液,于造模后1周测定各鼠空腹血糖值,筛选血糖值≥11.1mmol/L的小鼠为糖尿病实验模型鼠。

将55只糖尿病实验模型成功小鼠按血糖值分为DM组,消渴丸组、总黄酮低、中、高剂量组(分别为40,80,160mg/kg),正常对照组和DM组灌等量水,连续给药4周。末次给药后禁食12h,眼眶静脉丛取血,分离血清测血糖变化值,结果见表6。

表6总黄酮提取物对STZ所致糖尿病小鼠空腹血糖的影响(x±s，n=10)

注：与对照组相比：*P〈0.05，**P〈0.01

实施例7知母黄柏总生物碱提取物对糖尿病小鼠空腹血糖的影响

1、受试药物与仪器

按实施例3方法得到的总生物碱提取物，其中总生物碱的含量为53%；盐酸二甲双肌，规格:0.25/片，生产，临用前研碎用0.5%CMC一Na配制。

2、实验动物

KM小鼠，雄性，体重（20±2）g,SPF级

3实验方法

采用高糖高脂结合尿链佐菌素(STZ)诱导2型糖尿病小鼠的造模方法。简述如下:3周雄性KM小鼠随机分为普通饮食组(10只)、高糖高脂饮食对照组(10只)、造模组(80只,高糖高脂饮食)。喂养五周,禁食12h后普通饮食组、造模组腹腔一次性注射STZ(STZ100mg/kg体重，用0.1mol/L无菌柠檬酸钠缓冲液pH4.5配置,0.2um微孔滤膜过滤灭菌)。注射STZ后继续高糖高脂喂养6周。取血测定血糖。以小鼠空腹血糖≥11.1mmol/L的小鼠53只为2型糖尿病模型。

取糖尿病小鼠50只随机平均分为模型对照组、总生物碱提取物低、中、高组(100、200、400mg/kg)、二甲双胍组(250mg/kg)五组每天灌胃治疗。小檗碱溶于1.5%的羧甲基纤维素中。普通饮食对照组和模型组每天0.2mL羧甲基纤维素灌胃。灌胃6周。末次灌胃2h后(禁食12h)小鼠尾部取血测血糖值。结果见表7。

表7总生物碱提取物对STZ所致糖尿病小鼠空腹血糖的影响(x±s，n=10)

注：与对照组相比*P〈0.05，**P〈0.01

结论：知母黄柏药对中四种有效部位（总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物、总生物碱提取物）对糖尿病小鼠的药理研究表明，这4种提取物均具有降血糖作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种知母黄柏药对中四种有效部位的同步制备方法，其特征在于，所述四种有效部位分别为总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物、总生物碱提取物，同步制备方法包括如下步骤：

(1)将重量比为1:0.8-1.2的知母和黄柏粉碎至10-120目，加入体积浓度为60％～95％的乙醇回流提取1-5次，再用体积浓度为20％～60％的乙醇回流提取1-5次，合并提取液；

(2)将步骤(1)得到的提取液用300-400目的滤袋过滤，将滤液通过串联的大孔树脂和离子交换树脂；

(3)用10-15倍柱体积的水洗脱串联的大孔树脂和离子交换树脂，收集洗脱液及未吸附的滤液，得总多糖提取液；

再用6-10倍柱体积的体积浓度为40％的乙醇洗脱大孔树脂，收集洗脱液得总皂苷提取液；

再用6-10倍柱体积的体积浓度为70％的乙醇洗脱大孔树脂，收集洗脱液得总黄酮提取液；

最后用6-10倍柱体积的浓度为0.5-1mol/L的氨水洗脱离子交换树脂，收集洗脱液得总生物碱提取液；

(4)将步骤(3)得到的总多糖提取液、总皂苷提取液、总黄酮提取液、总生物碱提取液分别进行浓缩、冷冻干燥，得总多糖提取物、总皂苷提取物、总黄酮提取物、总生物碱提取物；

所述总皂苷提取物的主要成分包括知母皂苷BII，所述总黄酮提取物的主要成分包括芒果苷，所述总生物碱提取物的主要成分包括盐酸小檗碱和黄柏碱；

所述大孔树脂为D101、XDA-5中的一种；离子交换树脂为001×7、001×4中的一种。

2.根据权利要求1所述的知母黄柏药对中四种有效部位的同步制备方法，其特征在于，所述总多糖提取物中总多糖的含量大于50％；总皂苷提取物中总皂苷的含量大于50％；总黄酮提取物中总黄酮的含量大于50％；总生物碱提取物中总生物碱的含量大于50％。

3.根据权利要求1所述的知母黄柏药对中四种有效部位的同步制备方法，其特征在于，步骤(1)中每次提取所用的乙醇溶液的量为知母和黄柏总重量的6-10倍，每次提取的时间为1-2h。

4.根据权利要求1所述的知母黄柏药对中四种有效部位的同步制备方法，其特征在于，步骤(4)中浓缩的工艺条件为：控制真空度为0.06-0.10MPa，温度为70-80℃；冷冻干燥的工艺条件为：控制真空度小于20Pa，温度为-45～-60℃。