CN101342230A - 一种黄芪颗粒及其质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄芪颗粒，按照下述方法制得：取黄芪药材，加水煎煮提取2次，每次煎煮1.5～2.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.30(70～80℃)的清膏；加入辅料，混匀后制粒，干燥，分装，灭菌，即得。该黄芪颗粒采用新的方法制得，减少了醇沉步骤，改变了煎煮时间，更有利于有效成分的溶出和保留，使黄芪药材中含有的黄芪多糖及总皂苷等有效成分尽量保留在制剂黄芪颗粒中，大大提高了其有效成分的含量，从而提高所得黄芪颗粒的临床有效性；同时可使生产周期明显缩短，并减少能耗，成本降低。本发明还提供了一种上述黄芪颗粒的质量控制方法。

Description

一种黄芪颗粒及其质量控制方法

技术领域

本发明属于药物制备工艺及质量控制技术领域，特别涉及一种黄芪颗粒及其质量控制方法。

背景技术

黄芪又称膜荚黄芪或黄耆，为豆科、多年生草本。主根长，圆柱形，稍带木质，外质土黄色或棕红色。喜干旱，适应性强。分布河北、山西、陕西、甘肃、青海、辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古等地。

黄芪的根是著名的常用中药。商品黄芪呈圆柱形，略扭曲，长20～60厘米，以条粗长、皱纹少、质坚而绵、粉性足、味甜者为好。主要含有香豆素、黄酮类化合物、皂苷及微量叶酸和数种维生素等。其味甘，微温，具有补气固表，托疮生肌、利水的功效，主治气血虚弱、自汗、久泻脱肛、子宫脱垂、肾炎浮肿、蛋白尿、糖尿病、慢性溃疡等症。近年来临床也用于治疗高血压和急慢性肾炎等。

黄芪颗粒是以黄芪药材为原料经过提取制成的颗粒剂，其传统的制备方法是：取黄芪1000g，加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.26，加乙醇使含乙醇量为70％，搅匀，静置，取上清液回收乙醇，浓缩成相对密度为1.36(38℃)的清膏，加辅料适量，制成颗粒，低温干燥，制成1000g，即得。

该传统方法采用了水提醇沉的方法制备黄芪颗粒，黄芪的主要功效成分是黄芪多糖和总皂苷，黄芪多糖和总皂苷均可溶解于水中，故传统方法采用了水提的方法，而以水作为溶剂提取黄芪，在煎煮过程中，也会将较多水溶性无效成分如淀粉、鞣质等一并提取出来，故采用醇沉的方法进行纯化。但由于多糖在乙醇中溶解性不好，在醇沉过程中，会除去大部分多糖，且由于生产环节的增加，也会对总皂苷造成损耗。

黄芪颗粒制剂传统的质量控制方法是：

(1)取黄芪颗粒5g，加水50ml，浸渍过夜，滤过，取滤液1ml，加0.2％茚三酮溶液2滴，在沸水浴中加热5分钟，显紫色。

(2)取黄芪颗粒5g，加甲醇20ml，置水浴上加热回流1小时，滤过，滤液置于经处理的中性氧化铝柱(100～120目，5g，内径10～15mm)上，用40％甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，置水浴上蒸干，残渣加水30ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪甲甙对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘约5分钟。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的棕褐色斑点。

该传统方法中仅仅采用了茚三酮显色反应和薄层色谱法对其中含有的黄芪甲苷等进行了定性鉴别，没有涉及任何含量测定，很显然，这对于黄芪颗粒的质量控制是不够准确可靠的，也不可能确保其临床疗效。

发明内容

本发明的目的就是针对上述黄芪颗粒的传统制备工艺及质量控制现状，提供一种采用新的制备方法获得的黄芪颗粒，可使黄芪药材中含有的黄芪多糖及总皂苷等尽量保留在制剂中，大大提高有效成分的含量，从而提高所得黄芪颗粒的临床有效性；同时，本发明还为上述黄芪颗粒提供了一种可靠的质量控制方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种黄芪颗粒，按照包括下述主要步骤的方法制备而得：

(1)制取黄芪清膏：

取黄芪药材，加水煎煮提取2次，每次煎煮1.5～2.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.30(70～80℃)的黄芪清膏；

(2)制备黄芪颗粒：

在上述黄芪清膏中加入蔗糖和/或其他制备颗粒剂时常用的糖类辅料，其加入量以1000g黄芪原生药材制得1000g颗粒计算，混匀后制粒，干燥，分装，灭菌，即制得所述的黄芪颗粒。

上述黄芪颗粒在制备过程中，其步骤(1)“制取黄芪清膏”过程中，可优选采用下述减压浓缩方法对滤过后的滤液进行浓缩：压力-0.06mpa～-0.09mpa、温度55～65℃。

上述黄芪颗粒的质量控制方法，在传统的黄芪颗粒质量控制基础上，主要增加了以黄芪甲苷和/或总皂苷的含量测定为评价指标来进行质量控制，其中：所述的黄芪颗粒中，黄芪甲苷(C₁₁H₆₈O₁₁)含量为0.2～1.0mg/g，总皂苷含量以黄芪甲苷(C₁₁H₆₈O₁₁)计为0.6～4.4mg/g。

上述黄芪甲苷含量可采用高效液相色谱法来测定而得，总皂苷可采用紫外-可见分光光度法测定而得，具体测定方法可如下：

一、黄芪甲苷的含量测定方法：

(1)对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释成每1ml含0.45～0.55mg的溶液，即得；

(2)供试品溶液的制备：取黄芪颗粒，研细，精密称定约4.5～5.5g，取置具塞瓶中，加浓度≥90％的甲醇溶液或甲醇(作为提取溶剂)75～250ml，超声处理30～40分钟(可适时振摇)，放冷，滤过，用相同溶剂分次洗涤瓶、滤纸和滤渣，洗液并入滤液中，滤液置水浴上蒸干；残渣加水10～15ml，使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4～5次，每次30～40ml，合并正丁醇液；用氨试液(参照中华人民共和国药典2005版一部中记载的方法制备：取浓氨溶液400ml，加水使成1000ml，即得)充分洗涤2～3次，每次40～50ml，分别合并正丁醇液、氨试液，正丁醇液备用；将氨试液用30～50ml水饱和正丁醇反提至少1次，分离所得的正丁醇层并入上述备用的正丁醇液中；置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10～20ml的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

(3)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水(体积比32∶68)为流动相，用蒸发光散射检测器检测，漂移管温度：40℃，载气压力：3.5bar，流速：1.0ml/min；

(4)测定法：精密吸取对照品溶液5μl，10μl，供试品溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，得黄芪颗粒中黄芪甲苷的含量。

二、总皂苷的含量测定方法：

(1)对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml含0.4～0.6mg的溶液，即得；

(2)供试品溶液的制备：按照与前述“黄芪甲苷的含量测定方法”中供试品溶液的制备方法，制得用微孔滤膜滤过后的续滤液，再精密量取此续滤液，稀释至5倍，摇匀，即可；或者，也可直接精密量取上述“黄芪甲苷的含量测定方法”中制得的供试品溶液，置量瓶中，加甲醇稀释至5倍，摇匀，即得；

(3)测定法：精密量取对照品溶液与供试品溶液各1ml，分别置具塞试管中，置水浴上挥干，精密加入5％香草醛冰醋酸溶液1ml和高氯酸4ml，混匀，置60℃水浴中加热15～40分钟，立即用水冷却，精密加入冰醋酸15ml，混匀，参照《中国药典》一部附录VA中的记载，采用紫外-可见分光光度法，在530nm波长处测定吸光度，计算，即得黄芪颗粒中总皂苷的含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明黄芪颗粒采用新的方法制得，减少了醇沉步骤，改变了煎煮时间，更有利于有效成分的溶出和保留，使黄芪药材中含有的黄芪多糖及总皂苷等有效成分尽量保留在制剂黄芪颗粒中，大大提高了其有效成分的含量，从而提高所得黄芪颗粒的临床有效性；并且通过减少醇沉步骤、缩短煎煮时间等工艺环节，使生产周期明显缩短，并减少能耗，成本降低；同时，在一定程度上，也克服了本技术领域内对黄芪药材的提取均采用水煮醇沉法这样的技术偏见。

发明人通过药理学试验等也证实，本发明的提取工艺所得的黄芪提取物A与传统方法所得的黄芪提取物B相比，两者均具有提高小鼠的特异性免疫和非特异性免疫功能的作用，对大黄致脾虚小鼠的胃肠推进功能有明显的恢复作用，同时，A、B药物相同剂量间比较A药物中剂量较B药物中剂量有明显的促进脾虚小鼠肠推进的功能，结果显示：黄芪提取物A的药理作用较优于黄芪提取物B，证明改进后的工艺更能保留黄芪的有效成分，有利于提高临床疗效。

此外，本发明提供的上述黄芪颗粒的质量控制方法，在传统质量控制基础上增加了黄芪甲苷和/或总皂苷的含量作为黄芪颗粒质量控制的重要指标，并提供了其相应的含量检测方法，与传统方法相比更科学，更准确，能更有效的控制黄芪颗粒的内在质量和临床疗效。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

实施例1

本实施例为通过下述方法制得的黄芪颗粒：

取黄芪1000g加水煎煮二次，第一次煎煮2小时，第二次煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约1.30(70℃)的清膏，加入蔗糖适量，制成颗粒1000g，干燥，分装成15g/袋，灭菌，即得。

实施例2

本实施例为通过下述方法制得的黄芪颗粒：

取黄芪1000g加水煎煮二次，第一次煎煮2.5小时，第二次煎煮1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约1.20(80℃)的清膏，加入乳糖适量，制成颗粒1000g，干燥，分装成10g/袋，灭菌，即得。

实施例3

本实施例为通过下述方法制得的黄芪颗粒：

取黄芪1000g加水煎煮二次，第一次煎煮1.5小时，第二次煎煮2.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压(压力-0.06mpa～-0.07mpa、温度55～60℃)浓缩至相对密度约1.25(75℃)的清膏，加入木糖醇适量，制成颗粒1000g，干燥，分装成10g/袋，灭菌，即得。

实施例4

本实施例为通过下述方法制得的黄芪颗粒：

取黄芪1000g加水煎煮二次，第一次煎煮2小时，第二次煎煮1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压(压力-0.08mpa～-0.09mpa、温度60～65℃)浓缩至相对密度约1.28(70℃)的清膏，加入葡萄糖适量，制成颗粒1000g，干燥，分装成15g/袋，灭菌，即得。

实施例5

本实施例为本发明研发过程中对黄芪颗粒制备工艺的部分考察研究试验，主要是对黄芪提取工艺的考察：由于在该工艺路线中，发明人发现，提取时间长短、是否取消醇沉环节等对黄芪提取液及黄芪颗粒产品的主要成分及含量等都有较大影响，故在进行提取工艺考察时对二者进行研究，均选用黄芪甲苷含量、黄芪多糖含量和干膏收率为评价指标。

其中，黄芪甲苷的含量测定采用下述方法：

按《中华人民共和国药典》2005版一部附录VI D高效液相色谱法测定；

色谱条件和系统适用性试验：使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(体积比32∶68)为流动相；用蒸发光散射检测器检测；

对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml含0.5mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：精密量取提取液各10ml，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次30ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤两次，每次40ml，再用正丁醇饱和的水30ml洗涤1次，弃去水液，正丁醇液置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得；

测定法：精密吸取对照品溶液5μl，10μl，供试品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。

黄芪多糖的含量测定采用下述方法：

参考《中华人民共和国药典》2005版一部“灵芝”项下多糖测定方法测定；

对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；

标准曲线的制备：分别精密吸取上述对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml，置具塞试管中，加水至2.0ml，精密加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.2g，加硫酸100ml使溶解，摇匀)6ml，摇匀，置水浴中加热15分钟，取出，放入冰浴中，冷却15分钟；以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005版一部附录VA)，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，含量为横坐标，绘制标准曲线；

供试品溶液的制备：精密量取提取液各10ml，分别加入乙醇150ml，摇匀，4℃放置12h，取出，倾出上清液，沉淀加水溶解并转移至50ml量瓶中，过滤，取续滤液，精密量取该溶液1ml，加水稀释并定容于100ml，摇匀，即得；

测定法：精密量取供试品溶液1ml加水稀释至2ml，置具塞试管中，照“标准曲线的制备”项下方法，自“精密加入硫酸蒽酮溶液6ml”起，依法测定吸光度，在标准曲线上读出供试品溶液中葡萄糖的含量，计算，即得。

干膏收率的测定采用下述方法：

精密量取提取液各25ml，置于恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，残渣于105℃干燥5小时，取出，置于干燥器中放置30分钟，称重，计算即得。

一、黄芪提取时间的考察

1.试验方案设计：

利用单因素试验法，分别提取，每次提取时间分别为1小时、1.5小时、2h小时、2.5h小时、3小时，也即采用由相同处方量，相同加水量，不同提取时间制备提取液，以提取物中黄芪甲苷含量、黄芪多糖含量及干膏收率为评价指标，并采用综合评价方式进行分析，确定药材的提取时间。

综合评价计算公式：

综合得分＝Y1×40％+Y2×40％+Y3×20％

Y1为黄芪甲苷含量得分，＝100×(含量/最大含量值)

Y2为黄芪多糖含量得分，＝100×(含量/最大含量值)

Y3为干膏收率得分，＝100×(收率/最大收率)

2.试验方法：

称取500g黄芪药材五份，分别加入水煎煮(提取时间分别为①1小时；②1.5小时；③2小时；④2.5小时；⑤3小时)2次，每次的提取液分别滤过，滤液分别减压浓缩(-0.08～-0.09mpa、60℃)至500ml容量瓶中，定容。

测定其中黄芪甲苷及黄芪多糖含量、干膏收率等，第1次提取时间的考察结果见下述表1和表2；第2次(均以第一次提取时间为2小时并滤过后的黄芪药渣为原料)提取时间的考察结果见下述表3和表4。

表1第一次提取时间的考察结果

表2第一次提取时间的考察结果分析

由表1和表2可知，第一次提取时，提取时间为1.5小时、2小时和2.5小时的样品综合得分均最高，且差异较小。而随着提取时间的增长，出膏率越来越大，但提取出的黄芪甲苷和黄芪多糖含量却越来越少，分析原因可能是由于有效成分对热不稳定，产生水解反应，导致含量减少。因此，结合试验结果，选择提取1.5～2.5小时作为黄芪药材第一次的提取时间。

表3第二次提取时间的考察结果

表4第二次提取时间的考察结果分析

由表3和表4可知，第二次提取时，提取时间为1.5小时、2小时和2.5小时的样品综合得分均最高，且差异较小。而随着提取时间的增长，出膏率越来越大，有效成分含量却越来越少。因此，结合试验结果，选择提取1.5～2.5小时作为黄芪药材的第二次提取时间。

综上，黄芪药材的两次提取时间最佳值均为1.5～2.5小时。

二、醇沉前后工艺对比考察

1.试验方案设计：

采用不同工艺提取(①醇沉②不醇沉)的样品进行考察，对比研究醇沉前后样品的差异。以提取物中黄芪甲苷含量、黄芪多糖含量及干膏收率为评价指标。

2.试验方法：

未醇沉样品制备：称取500g黄芪药材，分别加水煎煮二次，第一次提取2小时，第二次提取2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩(-0.08～-0.09mpa、60℃)至500ml容量瓶中，定容。

醇沉样品制备：称取500g黄芪药材，分别加水煎煮二次，第一次提取2小时，第二次提取2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度约为1.26(60℃)，加乙醇使含醇量为70％，摇匀，静置过夜，取上清液回收乙醇，减压浓缩(-0.08～-0.09mpa、60℃)至500ml容量瓶中，定容。

测定其中黄芪甲苷及黄芪多糖含量、干膏收率等，试验结果下述表5。

表5醇沉工艺对比考察

由表5可知，醇沉对样品中的黄芪甲苷、黄芪多糖等有效成分及干膏收率都有较大影响，即醇沉环节对有效成分的损耗较大，故考虑取消醇沉环节。

因此，综合上述试验结果，确定本发明黄芪颗粒的制备过程中黄芪的提取工艺为：取黄芪药材，加水煎煮提取2次，每次煎煮1.5～2.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.30(70～80℃)的黄芪清膏。

实施例6

本实施例为黄芪颗粒质量标准研究中黄芪甲苷含量测定方法的研究：

根据文献报道，黄芪皂苷为黄芪的主要有效成分。《中国药典》以黄芪甲苷为指标成分，采用HPLC法测定黄芪药材中黄芪甲苷的含量。为与原料药材保持一致，本发明参考《中国药典》2005年版一部中黄芪的含量测定方法，以黄芪甲苷为指标成分，建立了HPLC法测定本发明黄芪颗粒中黄芪甲苷的含量。

1、色谱条件的选择：

使用十八烷基硅烷键合硅胶柱。选择乙腈-水系统作为流动相，参考《中国药典》2005年版一部中黄芪的含量测定方法，并经试验验证后确定其比例为：乙腈-水的体积比32∶68，此时黄芪甲苷保留时间适宜，与相邻峰分离良好。由于黄芪甲苷仅有紫外末端吸收，且使用紫外检测器时其他组分的干扰很大，因此采用蒸发光散射检测器检测。选择漂移管温度为40℃，载气压力为3.5bar，在此条件下，图谱基线平稳，黄芪甲苷与相邻峰分离良好。

即，经试验后确定色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，即使用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以乙腈-水(体积比32∶68)为流动相；流速：1.0ml/min；使用蒸发光散射检测器，漂移管温度：40℃，载气压力：3.5bar。

2、测定法的确定：

参照上述药典记载的黄芪药材中黄芪甲苷含量测定的测定法，精密吸取对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算。

3、供试品溶液的制备：

药典记载的黄芪药材供试品溶液的制备方法较为复杂，所用时间较长；而且，黄芪颗粒制剂与黄芪药材在组分等方面的差异也决定其不适宜采用完全一致的处理方法。因此，发明人重点对黄芪颗粒供试品溶液的制备进行了不同处理方法的对比研究分析，主要试验内容如下：

(1)提取溶剂的选择

取黄芪颗粒(批号070601)，研细，精密称取5g，取4份，置具塞锥形瓶中，分别加甲醇(无水)、90％甲醇、70％甲醇、无水乙醇各70ml，超声处理30分钟，滤过，用约10ml同种溶剂洗涤滤纸和滤渣，洗液并入滤液中，挥干，残渣用水饱和正丁醇转移至分液漏斗中，用氨试液洗涤正丁醇层2次，每次40ml，分别合并正丁醇液、氨试液，用水饱和正丁醇20ml反洗，洗液并入正丁醇液中，置水浴上挥干，残渣加甲醇转入10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(微孔直径0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。

取供试品溶液和黄芪甲苷对照品溶液各10μl进样，记录色谱图，测定黄芪甲苷含量并加以比较，结果见下述表6。

表6提取溶剂考察结果

提取溶剂	甲醇	90％甲醇	70％甲醇	无水乙醇
					黄芪甲苷含量(mg/g)	0.917	0.909	提取物太多，无法挥干	0.555

试验结果表明，用甲醇和90％甲醇提取的结果无显著差异，均显著高于无水乙醇的提取结果；用70％甲醇提取时，由于溶剂含水量较高，提出的糖类物质较多，无法挥干溶剂，操作费时，因此将提取溶剂确定为≥90％的甲醇溶液或甲醇。

(2)提取方式的选择

取黄芪颗粒(批号070702)，研细，精密称取5g，取2份，置具塞锥形瓶中，各加甲醇70ml，分别超声提取30分钟和回流提取2小时，自超声处理后的“滤过”之后按照前文(1)“提取溶剂的选择”中的方法测定，结果见下述表7。

表7提取方式的考察结果

提取方法	超声处理30分钟	回流2小时
			黄芪甲苷含量(mg/g)	0.814	0.757

试验结果表明，超声提取30分钟的测定结果高于回流提取2小时的结果，故选择超声处理作为提取方式。

(3)超声提取时间的选择

取黄芪颗粒(批号070601)，研细，精密称取5g，取3份，置具塞锥形瓶中，各加甲醇70ml，分别超声提取20、30和40分钟，自超声处理后的“滤过”之后按照前文(1)“提取溶剂的选择”中的方法测定，结果见下述表8。

表8超声提取时间的考察结果

超声处理时间(min)	20	30	40
				黄芪甲苷含量(mg/g)	0.784	0.917	0.907

试验结果表明，超声提取20分钟的结果明显低于提取30分钟和40分钟的结果；超声提取30分钟和40分钟的结果无显著差异，故将超声提取时间定为30～40分钟。

(4)提取溶剂体积的选择

取黄芪颗粒(批号070601)，研细，精密称取5g，取3份，置具塞锥形瓶中，各加甲醇50ml、75ml、100ml，分别超声提取30分钟，自超声处理后的“滤过”之后按照前文(1)“提取溶剂的选择”中的方法测定，结果见下述表9。

表9提取溶剂体积的考察结果

提取溶剂体积(ml)	50	75	100
				黄芪甲苷含量(mg/g)	0.794	0.910	0.916

试验结果表明，使用50ml甲醇提取的含量测定结果明显偏低，使用75ml甲醇与100ml甲醇的提取结果无显著性差异，说明100ml甲醇已能将黄芪甲苷提取完全，当然，溶剂多于100ml也能提取较完全；从提取效果和节约成本等综合考虑，确定提取溶剂的体积为75～250ml。

(5)是否需要净化处理

取黄芪颗粒(批号070601)，研细，精密称取5g，取2份，置具塞锥形瓶中，各加甲醇100ml，超声提取30分钟，自超声处理后的“滤过”之后按照前文(1)“提取溶剂的选择”中的方法测定，但正丁醇层均不用氨试液洗涤，直接挥干，残渣分别用甲醇和流动相溶解，微孔滤膜过滤后进样分析。结果色谱图中其他组分峰多，相互重叠，主峰峰形钝，且峰面积减小，干扰严重，说明样品必须经净化处理后才能有利于准确测定。

(6)净化用碱溶液的选择

取黄芪颗粒(批号070702)，研细，精密称取5g，取2份，置具塞锥形瓶中，各加甲醇100ml，均超声提取30分钟，自超声处理后的“滤过”之后按照前文(1)“提取溶剂的选择”中的方法测定，区别为净化用碱性溶液分别使用氨试液和1％氢氧化钠溶液，测定结果见下述表10。

表10净化用碱性溶液的考察结果

洗涤用碱性溶液	氨试液	1％氢氧化钠溶液
			黄芪甲苷含量(mg/g)	0.811	0.801

试验结果表明，两种洗涤方式处理后黄芪甲苷含量无显著性差异，且色谱图基线均较平稳，利于测定。但用1％氢氧化钠溶液萃取时乳化较严重，操作费时，故选用氨试液洗涤正丁醇层。

(8)是否用正丁醇对氨液层进行反洗的考察

为考察净化用的氨试液是否需要用正丁醇反洗，取黄芪颗粒(批号070702)，研细，精密称取5g，取2份，置具塞锥形瓶中，各加甲醇100ml，均超声提取30分钟，自超声处理后的“滤过”之后按照前文(1)“提取溶剂的选择”中的方法测定，但分别用正丁醇对氨液层进行反洗和不反洗处理，测定黄芪甲苷的含量，结果见下述表11。

表11是否反洗的考察结果

处理方法	反洗	不反洗
			黄芪甲苷含量(mg/g)	0.822	0.712

试验结果表明，用正丁醇对氨液层进行反洗的含量显著高于不反洗处理的含量，说明在净化用氨试液中含有少量黄芪甲苷，需要用正丁醇对氨试液层进行反洗，以避免测定组分的损失。

综合上述试验研究，确定了如本发明所述的供试品溶液的制备方法，即：

取黄芪颗粒，研细，精密称定约4.5～5.5g，置具塞瓶中，加浓度≥90％的甲醇溶液或甲醇75～250ml，超声处理30～40分钟，放冷，滤过，用相同溶剂分次洗涤瓶、滤纸和滤渣，洗液并入滤液中，滤液置水浴上蒸干；残渣加水10～15ml，使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4～5次，每次30～40ml，合并正丁醇液；用氨试液充分洗涤2～3次，每次40～50ml，分别合并正丁醇液、氨试液，正丁醇液备用；将氨试液用30～50ml水饱和正丁醇反提至少1次，分离所得的正丁醇层并入上述备用的正丁醇液中；置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10～20ml的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

根据上述试验研究确定的供试品溶液制备方法、及色谱条件和测定法等，及药品研究的相关规定，发明人还进行了色谱系统适用性试验，以对照品溶液和供试品溶液各10μl进样，记录色谱图，以黄芪甲苷峰计算色谱柱的理论板数，测得色谱柱的理论板数为1.1×10⁴；在供试品溶液的色谱图中，黄芪甲苷峰与其相邻的色谱峰均可以完全分离；计算得黄芪甲苷峰的拖尾因子为0.92，峰形基本对称。

此外，发明人还进行了专属性、线性范围、日内精密度、日间精密度、回收率、重复性、耐用性等方法学考察研究。结果证实：上述测定方法的专属性良好(阴性无干扰)；黄芪甲苷峰面积的对数值与进样量的对数值呈良好的线性关系；日内精密度及日间精密度良好；平均回收率为99.2％，其RSD值为3.9％；对同一批次黄芪颗粒(批号070701)6份样品测得的平均含量为0.724mg/g，其RSD为值1.8％，重复性良好；在Kromasil 100-5 C₁₈柱(150×4.6mm，5μm)、Luna 5μ C₁₈(2)100A柱(150×4.6mm)、Reliasil C₁₈柱(150×4.6mm，5μm)三种色谱柱上黄芪甲苷都可与相邻峰分离，且保留时间相近，方法耐用性好。

实施例7

本实施例为黄芪颗粒质量标准研究中总皂苷含量测定方法的研究：

黄芪含有多种皂苷类成分。据文献报道，甾体皂苷类成分在高氯酸溶液中，与香草醛反应呈现紫色，可用于含量测定。本发明参考文献的方法，建立了比色法(紫外-可见分光光度法)测定本品中总皂苷的含量。

1、溶液的制备：

对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml含约0.5mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：按照本发明“黄芪甲苷的含量测定方法”中供试品溶液的制备方法，取黄芪颗粒，研细，精密称定5g，置具塞瓶中，加浓度甲醇75ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，用甲醇分次洗涤瓶、滤纸和滤渣，洗液并入滤液中，滤液置水浴上蒸干；残渣加水10ml，使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次30ml，合并正丁醇液；用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，分别合并正丁醇液、氨试液，正丁醇液备用；将氨试液用30ml水饱和正丁醇反提1次，分离所得的正丁醇层并入上述备用的正丁醇液中；置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10ml的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液稀释至5倍，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。

2、测定方法的建立：

(1)测定波长的选择

为确定测定波长，精密量取对照品溶液和供试品溶液各1ml，置具塞试管中，在水浴上挥干溶剂，精密加入5％香草醛冰醋酸溶液1ml和高氯酸4ml，混匀，在60℃水浴中加热15分钟，取出，立即用水冷却，精密加入冰醋酸15ml，摇匀，以相应试剂为空白，在400～800nm波长范围内扫描。结果供试品溶液与对照品溶液在约530nm波长处均有最大吸收，故确定其测定波长为530nm。

(2)加热温度的选择

取对照品溶液和供试品溶液(批号070701)，照前文(1)“测定波长的选择”项下的方法试验，加热温度分别为40℃、50℃、60℃、70℃和80℃，测定总皂苷含量并加以比较，结果见下述表12。

表12加热温度的考察结果

温度	40℃	50℃	60℃	70℃	80℃
						含量(mg/g)	4.033	4.019	4.054	4.065	4.155

试验结果表明，在40～80℃下加热后测定，结果无明显差异。但随加热温度升高，吸收度值会明显增加，以60℃时含量测定结果相对稳定，且温度适中，故选择60℃为加热温度。试验结果还表明，加热温度对溶液的吸光度值影响显著，所以测定时应注意供试品溶液和对照品溶液的加热温度应完全一致，否则会影响测定的结果。

(3)加热时间的选择

取对照品溶液和供试品溶液(批号070601)，照前文(1)“测定波长的选择”项下的方法试验，在60℃水浴中分别加热10min、15min、20min、30min和40min后，测定吸光度，计算总皂苷含量并加以比较，结果见下述表13。

表13加热时间的考察结果

加热时间	10min	15min	20min	30min	40min
						含量(mg/g)	3.454	3.469	3.545	3.552	3.476

试验结果表明，加热15～40min，测定结果无明显差异且测定值稳定，故选择加热时间为15～40min。

综合上述试验研究，确定了如本发明所述的测定方法，即：

①对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml含0.4～0.6mg的溶液，即得；

②供试品溶液的制备：按照本发明“黄芪甲苷的含量测定方法”中供试品溶液的制备方法，制得用微孔滤膜滤过的续滤液后，精密量取并稀释至5倍，摇匀，即得。

③测定法：精密量取对照品溶液和供试品溶液各1ml，置具塞试管中，在水浴上挥干溶剂，精密加入5％香草醛冰醋酸溶液1ml和高氯酸4ml，混匀，在60℃水浴中加热15～40分钟，取出，立即用水冷却，精密加入冰醋酸15ml，摇匀，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2005年版一部附录VA)，在530nm波长处测定吸光度，计算，即得。

实施例9

本实施例为采用下述方法测定7批试制黄芪颗粒中黄芪甲苷含量：

(1)对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释成每1ml含0.5mg的溶液，即得；

(2)供试品溶液的制备：取试制的各批次黄芪颗粒，分别研细，精密称定约5g，各置具塞锥形瓶中，加甲醇100ml，超声处理30分钟，适时振摇，放冷，滤过，用甲醇分次洗涤锥形瓶、滤纸和滤渣，洗液并入滤液中，滤液置水浴上蒸干；残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次30ml，合并正丁醇液；用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，分别合并正丁醇液、氨试液，正丁醇液备用；将氨试液用30ml水饱和正丁醇反提1次，分离所得的正丁醇层并入上述备用的正丁醇液中；置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得；

(3)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水(体积比32∶68)为流动相，用蒸发光散射检测器检测，漂移管温度：40℃，载气压力：3.5bar，流速：1.0ml/min；

(4)测定法：精密吸取对照品溶液5μl，10μl，供试品溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，得黄芪颗粒中黄芪甲苷的含量。

其中，该7批试制黄芪颗粒为采用不同批次黄芪药材、采用下述方法制得：取黄芪药材1000g，加水煎煮提取2次，每次煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.30(70～80℃)的黄芪清膏；在清膏中加入蔗糖，制得1000g颗粒，混匀后制粒，干燥，分装成15g/袋，灭菌，即得。

批号分别为070601、070701、070702、070703、070704、070801、070802。

黄芪甲苷含量测定结果见下述表14。

表14试制样品中黄芪甲苷的含量测定结果

批号	含量(mg/g)	含量(mg/袋)
			070601	0.929	13.94
070701	0.724	10.86
			070702	0.794	11.91
070703	0.883	13.24
			070704	0.681	10.22
070801	0.223	3.345
			070802	0.756	11.34

实施例10

本实施例为采用下述方法测定7批试制黄芪颗粒(即实施例9中的7批黄芪颗粒)中总皂苷含量：

(1)对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml含0.5mg的溶液，即得；

(2)供试品溶液的制备：精密量取实施例9中制得的供试品溶液各2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

(3)测定法：精密量取对照品溶液与供试品溶液各1ml，分别置具塞试管中，置水浴上挥干，精密加入5％香草醛冰醋酸溶液1ml和高氯酸4ml，混匀，置60℃水浴中加热15分钟，立即用水冷却，精密加入冰醋酸15ml，混匀，采用紫外-可见分光光度法，在530nm波长处测定吸光度，计算，即得黄芪颗粒中总皂苷的含量。测定结果见下述表15。

表15总皂苷含量测定结果

批号	含量(mg/g)	含量(mg/袋)
			070601	3.395	50.92
070701	3.982	59.73
			070702	0.670	10.05
070703	3.753	56.30
			070704	2.511	37.655
070801	4.009	60.14
			070802	3.615	54.22

实施例11

本实施例为黄芪颗粒传统制备方法和本发明制备方法中对黄芪药材两种提取工艺得到的黄芪提取物的部分药效学对比试验研究。

试验药物包括两种：一种是用本发明工艺所制备的提取物A(按照实施例1的方法制得的相对密度约1.30(70℃)的黄芪清膏)，一种是以传统工艺(按照传统方法制得的相对密度为1.30(70℃)的黄芪清膏)所制备的提取物B；

主要药效学实验从非特异性免疫功能、特异性免疫功能、补气健脾三个方面进行试验设计与研究，对工艺改进前后两种制剂的黄芪提取物进行主要的药效学试验与对比研究，为其临床应用和工艺改进提供药理学依据。

1、药物配置：

精确量取A、B提取液各三份，分别为25ml、12.5ml、6.25ml，分别用蒸馏水定容至100ml混匀，配置为黄芪提取物A、B的高、中、低剂量组药液，根据给药剂量，小鼠以0.2ml/10g的给药容量灌胃给药。

各受试药物按剂量设计表(见下述表16)配成水溶液。A药、B药均为棕褐色澄清的液体，各药物组颜色深浅不同。其中A药和B药的高、中剂量组药液在冰箱久置会有少许沉淀物生成。以上各组药物4℃冷藏，灌胃给药前温水浴预热，并且充分摇匀后给药。

表16黄芪提取物小鼠药效试验剂量设计表

盐酸左旋咪唑片、复方阿胶浆和归脾丸(浓缩丸)，分别为重庆市青阳药业有限公司、山东东阿阿胶股份有限公司和河南宛西制药股份有限公司产品。

2、试验动物

昆明种小鼠，普通级，18-26g，雌雄各半；由四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号均为：SCXK(川)2004-15。部分试验小鼠由成都中医药大学医学试验动物中心提供，合格证号：SCXK(川)2004-11。

3、实验方法

3.1非特异性免疫功能实验(小鼠外周血象的影响)

取健康、体重为22±2g的小鼠104只，雌雄各半，按体重分层，随机分为10组，即空白组(12只)、模型组(12只)、西阳组(10只)、中阳组(10只)，A药高剂量组(10只)、A药中剂量组(10只)、A药低剂量组(10只)、B药高剂量组(10只)、B药中剂量组(10只)、B药低剂量组(10只)，各受试药物组小鼠均按表16设计的剂量以20ml/kg的给药容量灌胃给药，空白组和模型组给予等容量的蒸馏水，预给药3天。

各组小鼠于开始给药的第4天给药后1小时后，每鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg进行免疫抑制造模。造模后继续灌胃给药3日，末次给药后1小时后各鼠摘取眼球取血，进行血细胞分析。分析结果见下述表17。

表17对环磷酰胺致免疫抑制小鼠外周血象的影响(x±s)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

表17结果表明：模型组小鼠的WBC、RBC、HGB、PLT、HCT均低于空白组，其中WBC明显低于空白组(P＜0.001)，表明造模成功。

WBC(白细胞总数)：各给药组药物都有升高WBC的趋势，其中A药物高剂量、中剂量，B药物高剂量、中剂量、低剂量均有明显的升高WBC的作用(P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001)。

RBC(红细胞总数)：各给药组药物都有升高RBC的趋势，其中A药物中剂量有明显的升高RBC的作用(P＜0.05)。

HGB(血红蛋白)：A药物高、中、低剂量都有升高HGB的趋势(P＞0.05)。

HCT(红细胞压积)：A药物中剂量能明显升高HCT(P＜0.05)。

PLT(血小板总数)：各给药组药物都有升高PLT的趋势，其中B药物高剂量有明显的升高PLT的作用(P＜0.05)。

以上各指标A、B药物相同剂量间比较无明显差异(P＞0.05)。

3.2特异性免疫功能实验(对二硝基氯苯(DNCB)致小鼠迟发型皮肤过敏反应的影响)

取健康、体重为22±2g的小鼠90只，雌雄各半，按体重分层，随机分为9组，即空白组、模型组、西阳组、A药高剂量组、A药中剂量组、A药低剂量组、B药高剂量组、B药中剂量组、B药低剂量组，每组10只，各受试药物组小鼠均按表16设计的剂量以20ml/kg的给药容量灌胃给药，空白组和模型组给予等容量的蒸馏水，预给药3天。

各组小鼠于开始给药的第3天给药后1小时后，每鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg进行免疫低下模型的造模。第4天给药后1小时以8％硫化钠溶液脱毛剂在小鼠腹部脱毛，脱毛范围3×3cm²，将5％DNCB(二硝基氯苯，用丙酮溶解配制)在脱毛处致敏，每鼠10μl，涂匀。各组小鼠继续给药致敏后第6天用2.5％DNCB，10μl均匀涂抹于小鼠的左耳两面进行攻击，24小时后颈椎脱臼处死小鼠，立即剪下左右两耳郭，用打孔器在两耳相同部位取下直径5mm的耳片称重，以左右耳片重量之差值(mg)做为小鼠迟发型超敏反应的指标。结果见下述表18。

表18药物对小鼠DNCB迟发型皮肤过敏反应的影响(x±s)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

表18结果表明：模型组小鼠的左右耳片重量之差值低于空白组(P＜0.05)，表明造模成功。

A、B药物均有一定的增强免疫低下小鼠细胞免疫功能的趋势，尤其是A药物中剂量组和B药物中剂量组均有一定的增强细胞免疫功能的趋势(P＞0.05)。

A、B药物相同剂量间比较无明显差异(P＞0.05)。

3.3药物对小鼠脾虚模型的影响

取小鼠110只，体重18-22g，雌雄各半，随机分为空白组、模型组、中阳组、A药高剂量组、A药中剂量组、A药低剂量组、B药高剂量组、B药中剂量组、B药低剂量组共九组，每组12-14只。除空白组外，各组小鼠每日每只灌服100％大黄水浸液0.8ml，模型组给予等量的蒸馏水，连续8日，体征变化表现为小鼠出现便溏、泄泻、纳呆、食欲减退、活动减少、行动迟缓、微寒肢冷(杂堆起暖)、毛散无华、脱肛(部分)等脾虚症状，且个别小鼠出现死亡。表明造模成功。观察并记录造模成功前的小鼠的体重。并于造模成功后，即第9天起，分别按设计剂量灌胃给予药物或蒸馏水进行治疗，连续8日，给药期间除空白组外其余各组继续灌胃给予100％大黄水浸液0.4ml(即早上9点钟灌胃给药，晚上9点钟灌胃给予100％大黄水浸液每只0.4ml)观察，然后于第8日晚禁食20小时，次日灌胃给药一次，给药后30min，每只小鼠灌服10％活性炭生理盐水溶液，20分钟后脱颈椎处死小鼠，打开腹腔，分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉直，以直尺测量肠管的长度为“小肠总长度”，从幽门至炭末前沿的距离为“炭末在肠内的推进距离”，计算炭末推进百分率，结果进行统计学处理，比较各组差异。结果见下述表19。

灌胃给予大黄水煎液8天，小鼠出现便溏、泄泻、纳呆、食欲减退、活动减少、行动迟缓、微寒肢冷(杂堆起暖)、毛散无华、脱肛(部分)等脾虚症状，表明造模成功。

表19药物对小鼠脾虚模型小肠运动作用的影响(x±s)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；A、B药物相同剂量间比较，#P＜0.05.

表19结果表明：模型组小鼠炭末推进率明显低于空白组(P＜0.001)，表明造模成功。

A药高剂量、A药中剂量、B药高剂量能明显促进脾虚小鼠的肠推进功能(P＜0.01或P＜0.001)。

A、B药相同剂量间比较A药中剂量较B药中剂量有明显的促进脾虚小鼠肠推进的功能(P＜0.05)。

本发明中所使用的各种溶液，当其纯度不为100％时，在未作特别说明时，均是指水溶液；液体与液体混合形成的溶液中其比例均为体积比，固体与液体形成的溶液中其比例均为重量体积比。

Claims (5)

1.一种黄芪颗粒，按照包括下述主要步骤的方法制备而得：

(1)制取黄芪清膏：

取黄芪药材，加水煎煮提取2次，每次煎煮1.5～2.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至70～80℃温度下相对密度为1.20～1.30的黄芪清膏；

(2)制备黄芪颗粒：

在上述黄芪清膏中加入蔗糖和/或其他制备颗粒剂的糖类辅料，其加入量以1000g黄芪原生药材制得1000g颗粒计算，混匀后制粒，干燥，分装，灭菌，即制得所述的黄芪颗粒。

2.根据权利要求1所述的黄芪颗粒，其特征在于：

所述的步骤(1)“制取黄芪清膏”过程中，采用下述减压浓缩方法对滤过后的滤液进行浓缩：压力-0.06mpa～-0.09mpa、温度55～65℃。

3.一种权利要求1所述的黄芪颗粒的质量控制方法，其特征在于：

以黄芪甲苷和/或总皂苷的含量测定作为质量控制的评价指标，其中：所述的黄芪颗粒中，黄芪甲苷含量为0.2～1.0mg/g；总皂苷含量以黄芪甲苷计为0.6～4.4mg/g。

4.根据权利要求3所述的黄芪颗粒的质量控制方法，其特征在于：所述的黄芪甲苷的含量测定采用包括下述主要步骤的高效液相色谱法：

(1)对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释成每1ml含0.45～0.55mg的溶液，即得；

(2)供试品溶液的制备：取黄芪颗粒，研细，精密称定4.5～5.5g，取置具塞瓶中，加浓度≥90％的甲醇溶液或甲醇75～250ml，超声处理30～40分钟，放冷，滤过，用相同溶剂分次洗涤瓶、滤纸和滤渣，洗液并入滤液中，滤液置水浴上蒸干；残渣加水10～15ml，使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4～5次，每次30～40ml，合并正丁醇液；用氨试液充分洗涤2～3次，每次40～50ml，分别合并正丁醇液、氨试液，正丁醇液备用；将氨试液用30～50ml水饱和正丁醇反提至少1次，分离所得的正丁醇层并入上述备用的正丁醇液中；置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10～20ml的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

(3)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为32∶68的乙腈-水为流动相，用蒸发光散射检测器检测，漂移管温度：40℃，载气压力：3.5bar，流速：1.0ml/min；

(4)测定法：精密吸取对照品溶液5μl，10μl，供试品溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，得黄芪颗粒中黄芪甲苷的含量。

5.根据权利要求3所述的黄芪颗粒的质量控制方法，其特征在于：所述的总皂苷的含量测定采用包括下述主要步骤的紫外-可见分光光度法：

(1)对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml含0.4～0.6mg的溶液，即得；

(2)供试品溶液的制备：取黄芪颗粒，研细，精密称定4.5～5.5g，取置具塞瓶中，加浓度≥90％的甲醇溶液或甲醇75～250ml，超声处理30～40分钟，放冷，滤过，用相同溶剂分次洗涤瓶、滤纸和滤渣，洗液并入滤液中，滤液置水浴上蒸干；残渣加水10～15ml，使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4～5次，每次30～40ml，合并正丁醇液；用氨试液充分洗涤2～3次，每次40～50ml，分别合并正丁醇液、氨试液，正丁醇液备用；将氨试液用30～50ml水饱和正丁醇反提至少1次，分离所得的正丁醇层并入上述备用的正丁醇液中；置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10～20ml的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，精密量取续滤液，置量瓶中，加甲醇稀释至5倍，摇匀，即得；

(3)测定法：精密量取对照品溶液与供试品溶液各1ml，分别置具塞试管中，置水浴上挥干，精密加入5％香草醛冰醋酸溶液1ml和高氯酸4ml，混匀，置60℃水浴中加热15～40分钟，立即用水冷却，精密加入冰醋酸15ml，混匀，采用紫外-可见分光光度法，在530nm波长处测定吸光度，计算，即得黄芪颗粒中总皂苷的含量。