CN102641328B - 一种补骨脂提取物及其制备和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种补骨脂提取物及其制备和应用方法，该提取物以中药补骨脂为原料提取而成，其中含有补骨脂素和异补骨脂素，质量百分比分别为1.57%-3.3%，异补骨脂素含量为1.1%-2.5%。本发明提取物的制备方法以该提取物中的补骨脂素和异补骨脂素含量、水分含量、炽灼残渣量、重金属含量为指标进行优化得到。本发明可更好的控制补骨脂提取物的质量，保证用药安全性，深度开发质量可控、物质基础明确的补骨脂药物，以顺应中药现代化的要求。

Description

一种补骨脂提取物及其制备和应用方法

技术领域

本发明涉及一种补骨脂提取物，具体地，是以中药补骨脂为原料的提取物及其制备方法和制备治疗慢性阻塞性肺疾病药剂的用途；属于药物领域。

背景技术

市场现有产品补肺活血胶囊（BFHX）经多年临床使用证明，对于慢阻肺有着显著疗效。其药方组成为黄芪、赤芍和补骨脂三味传统中药。中药及其复方制剂多成分、多靶点和整合协同作用的特点，使得补肺活血胶囊在慢阻肺这一缓慢进程性疾病的治疗方面凸显出优势。尽管补肺活血胶囊临床使用有效，可是其生产工艺粗糙，制剂稳定性较差，物质基础不明，质量标准较低，很难适应中药现代化、产业化和国际化进程。基于此，我们拟对其进行深度开发。

前期的预试验显示，补骨脂黄芪、赤芍、三味药材各自单煎的提取物，与三味药材合煎得到的提取物化学成分相同，没有出现单煎时药材成分丢失或者增加的现象。因此我们简化研究对象，先单独研究补骨脂一味药材，后期再合并黄芪、赤芍的研究结果，作为补肺活血胶囊深度开发的一个整体思路。

补骨脂是豆科植物补骨脂的干燥成熟果实，作为我国传统治疗腰膝冷痛，肾虚作喘的中药有着悠久的用药历史。以往研究证明其具有扩张冠状动脉、抗菌、抗肿瘤、增强免疫等生理活性（郭秀芝等.中医药学报，2005，33(5)：52-53）。但是补肺活血胶囊中补骨脂究竟哪些成分起作用，其体内过程如何至今尚不清楚，严重制约了该药物临床使用，加之补骨脂药材质量控制和评价体系尚不完善，生产工艺十分粗糙，导致了已开发产品的市场竞争力较弱，如何提高补骨脂产品质量是亟待解决的问题。

药动学用于中药研究可为中药制剂生产工艺的设计、内在质量的评价与监控提供有效手段和方法。目前口服给药是中药治疗的主要方式，影响口服生物利用度的因素很多，研究药物的吸收对于指导药物给药系统研究有重要意义。评价药物的吸收的模型有很多种，有离体法和在体法，目前较多采用大鼠在体单向肠灌流模型，这种模型以较低的流速某一肠道进行单向灌流，根据进出口处灌流液中的药物浓度差考察药物在该肠段的吸收，其实验条件与口服给药后药物接触的肠道环境较接近，吸收速率稳定，与人体有良好相关性（谭晓斌等.中成药，2007，29（11）：1665-1668）。从药物动力学研究角度，采用相应分析手段对大鼠灌胃给药后收集的血液、尿液等生物样品进行分析，结合大鼠在体肠灌流实验技术，找出中药进入体内的成分，筛选出能反映补骨脂物质作用基础的指标成分，可更好的控制该药物的质量，保证用药安全性，深度开发质量可控、物质基础明确的补骨脂药物，以顺应中药现代化的要求。目前尚无针对本发明标准的补骨脂提取物及其制备和应用方法的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种补骨脂提取物及其制备和应用方法。

一种补骨脂提取物，是以补骨脂为原料提取得到的，所述的补骨脂提取物含有补骨脂素、异补骨脂素，质量百分比分别为补骨脂素1.57%-3.3%，异补骨脂素1.1%-2.5%。

所述的补骨脂提取物提取物还含有补骨脂素苯并呋喃苷和异补骨脂素苯并呋喃苷。

所述的补骨脂来源于豆科植物补骨脂（Psoralen.L）的干燥成熟果实。

所述的补骨脂提取物的水分含量不超过6.0%、炽灼残渣量不超过1.0%、重金属含量不超过0.01‰。

所述的补骨脂提取物用于制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药剂。包括以补骨脂提取物为主要有效成分与多种医用辅料（赋型剂，稀释剂，香味剂、甜味剂、润滑剂等）配合，制成多种剂型的药物使用，如冻干粉针，注射液，大输液，片剂，胶囊，颗粒剂以及口服液等。

一种补骨脂提取物的制备方法，包括如下步骤：

取补骨脂饮片，先用其5-10倍体积量40%-80%乙醇浸泡提取2次，每次30min-1.5h，滤过，合并提取液，减压浓缩、回收乙醇至无醇味，放冷，加水调至浓度为0.5g/mL，即每1mL药液中含生药补骨脂量为0.5g，滤过，然后通过已预处理好的D101型大孔吸附树脂柱，树脂重量与加水调节浓度后的药液重量之比为1∶1，再依次以3倍柱体积的水洗脱，再用7倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，继续浓缩得干膏，经干燥，得补骨脂提取物粉末。

优选包括如下步骤：

取补骨脂饮片，先用其8倍体积量60%乙醇，再用其7倍体积量60%乙醇各提取1次，每次1.5h，过滤，合并提取液；减压浓缩、回收乙醇至无醇味，放冷，加水调至浓度为0.5g/mL，即每1mL药液中含生药补骨脂量为0.5g，过滤后通过已预处理好的D101型大孔吸附树脂柱；树脂重量与加水调节浓度后的药液重量之比为1∶1，流速为1~2mL·min^-1；再依次用3倍柱体积纯水，7倍柱体积70%乙醇洗脱；收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，60℃继续浓缩得干膏，经60℃干燥，得补骨脂提取物粉末。

所述的补骨脂提取物含有补骨脂素、异补骨脂素，质量百分比分别为补骨脂素1.57%-3.3%，异补骨脂素1.1%-2.5%。

所述的补骨脂提取物还含有补骨脂素苯并呋喃苷和异补骨脂素苯并呋喃苷。

所述的补骨脂来源于豆科植物补骨脂（Psoralen.L）的干燥成熟果实。

所述的补骨脂提取物的水分含量不超过6.0%、炽灼残渣量不超过1.0%、重金属含量不超过0.01‰。

本发明提供了一种补骨脂提取物，以中药材补骨脂为原料提取而成。本发明采用大鼠在体肠单向灌流法，比较药材灌胃液灌流前后经小肠吸收减少的成分是否与灌胃给药吸收入血成分一致；灌流结束后采血，检测血浆样品，进一步确定补骨脂药材吸收入血成分有补骨脂素苯并呋喃苷、异补骨脂素苯并呋喃苷、补骨脂素和异补骨脂素，并以这些成分及其含量作为标准。根据其优化提取工艺和富集纯化工艺，最终获得精制而成的本发明提取物，同时水分含量、炽灼残渣量、重金属含量也作为标准，在优化提取工艺和富集纯化工艺时考虑。本发明可更好的控制该药物的质量，保证用药安全性，深度开发质量可控、物质基础明确的补骨脂药物，以顺应中药现代化的要求。。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1补骨脂灌胃液HPLC指纹图谱；

图2大鼠灌胃补骨脂后血浆HPLC典型图谱

a.空白血浆，b.含药血浆；

图3大鼠灌胃补骨脂后尿液HPLC典型图谱；

a.大鼠空白尿样，b.大鼠灌胃给药后0-24h尿样，c.大鼠灌胃给药后24-48h尿样；

图4大鼠灌胃给药前后粪样及提取物灌胃液图谱；

a.空白粪样；b.大鼠灌胃给药后0-48h粪样图谱；c.补骨脂提取物灌胃液。

具体实施方式

实施例1：补骨脂药材中特征成分为主的色谱指纹图谱的建立以及大鼠在体肠灌流方法确定补骨脂吸收成分的方法

1.1材料和仪器

1.1.1药品和试剂

补骨脂饮片购自湖南九芝堂药业，经鉴定为豆科植物补骨脂盐炙的干燥成熟果实。补骨脂素、异补骨脂素和萘普生对照品购自中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯（Tedia公司），乙酸铵等其他试剂为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.2仪器

Agilent Technologies 1200（Agilent Chemstation工作站，DAD检测器）；Finnigan LCQAdvantage MAX；Kromasil 100-5C18（250×4.6mm，5μm）；JA2003H型千分之一天平（上海精密科学仪器有限公司）；CP225D型十万分之一电子天平（Sartorious）；KL-RO-10型艾柯超纯水机（台湾艾柯）；WH-2微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；MTN-2800D氮气吹干仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；RE-5298A系列旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；3700M071型代谢笼（Tecniplast公司）；DDB-320多功能电子蠕动泵(上海之信仪器有限公司)。

1.1.3实验动物

SD大鼠（清洁级），雄性，体重180-220g，购于中南大学湘雅医学院实验动物学部。

1.2溶液配制

（1）K-R液（Krebs-Ringer’s液）的配制：

分别称取氯化钠7.8g、葡萄糖1.4g、碳酸氢钠1.37g、氯化钙0.37g、氯化钾0.35g、磷酸二氢钠0.32g、氯化镁0.02g，加适量蒸馏水溶解，加水稀释至1000mL，超声混匀即得K-R液。

（2）补骨脂提取物肠灌流供试品溶液的配制：

参照文献（中国专利申请号02135035.3），取补骨脂饮片适量，加入10倍量水，加热回流1h，过滤，再加入8倍量纯水，继续加热回流1h，滤液合并、浓缩至一定密度，再加入乙醇至含醇量约为60%，静置24h，过滤，挥去乙醇，浓缩得补骨脂稠膏。按100∶60（W∶V）溶于一定量的纯水中，涡旋混匀，制得补骨脂灌胃液，每毫升补骨脂灌胃液约相当于0.6g补骨脂药材。补骨脂灌胃液按体积比1∶9加入K-R液，混和摇匀即得灌流样品。

1.3色谱条件、质谱条件

色谱条件：色谱柱：Kromasil 100-5C18（250×4.6mm，5μm）；流动相：0-5min，A:30%；5-30min，A:30%-60%；30-55min，A:60%-95%；55-60min，A：95%-5%，其中A为甲醇，B为0.1%甲酸、10mmol·L^-1乙酸铵水溶液；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃；DAD扫描范围190-400nm；检测波长：320nm，245nm；进样量：20μL。

质谱条件：电喷雾离子化源（ESI），源电压3.5KV，干燥气流速10L·min^-1，干燥气温度350℃，喷雾气压力30psi，目标离子分子量366，化合物稳定性100%，MS2打碎电压1.0V，扫描的范围为150-1000。采集正离子模式下的MS和MS2图谱。数据分析采用软件FinniganLCQ Advantage MAX Xcalibur。

1.4样品收集、处理

禁食12h的SD大鼠6只称重后，按0.3mL/100g腹腔注射10%的水合氯醛，麻醉后将大鼠分别固定在手术板上，沿腹中线剪开腹部，在十二指肠上部及回肠下部结扎，在结扎的两端开口后肠管插管，用37℃的生理盐水冲净肠内容物，经乳胶管接通蠕动泵，构成循环回路，并用经37℃生理盐水浸渍的纱布覆盖创口。

1只大鼠灌流空白K氏液，5只大鼠用K-R液配制成的补骨脂供试药液灌流。先将药液快速泵入肠段，使肠段内充满药液，后将流速降至(0.2mL/min)，同时开始记时，进口处用已知质量的装有供试液的小瓶进行灌流，于出口处收集流出的灌流液直至实验结束，记录流出液质量并将所灌流的肠段内残液冲出。灌流结束后，大鼠心脏取血。所取灌流液样品高速离心，经0．45μm微孔滤膜过滤，取续滤液进行HPLC分析，血浆样品经处理后进样分析，比较灌流液中药物减少成分是否与血浆中入血成分一致。

1.5结果

1.5.1补骨脂灌胃液指纹图谱的建立

补骨脂水提醇沉提取物320nm处补骨脂灌胃液图谱色谱峰指纹信息最多，60min内可完成所有成分的分析，且补骨脂各成分峰分离良好，相互间没有干扰，保留时间适中。其中主要成分峰A、B、C、D的保留时间分别为10.7min，13.0min，25.5min，27.0min，按峰面积归一化法计算，峰面积总和达到90%以上(见图1)。

方法学考察结果显示，以湖北补骨脂药材的提取物为供试品，分别于0、2、4、6、8、10、12h测定，各色谱峰的保留时间漂移在±0.15min范围内，各色谱峰面积的RSD值不超过3.6%，说明供试品溶液在12h内稳定。以湖北补骨脂药材的提取物为供试品，连续进样6次，结果表明，各色谱峰的保留时间漂移在±0.15min范围内，各色谱峰面积的RSD值不超过2.9%。该分析方法具有较好的精密度和重现性。

1.5.2补骨脂提取物肠灌流结果

补骨脂提取物灌流液各成分在在空白灌流液中至少4h内稳定。补骨脂提取物给予大鼠单向肠灌流2-3h后，灌流液中多种成分均有所减少，其中保留时间分别为10.7min、13.0min、25.8min和27.5min的主要成分A、B、C、D均有不同程度的吸收。确定其为SD大鼠进行补骨脂提取物肠灌流时小肠吸收的主要成分，且极有可能是补骨脂吸收入血发挥补肺活血作用的有效成分。经对照品峰位及光谱核对、液质联用结合化学成分转化性质的方法，判断其分别是补骨脂素苯并呋喃苷、异补骨脂素苯并呋喃苷、补骨脂素和异补骨脂素。

实施例2：补骨脂提取物血清药物化学研究

2.1材料和仪器

同实施例1。

2.2大鼠血样、尿样、粪样采集

2.2.1补骨脂灌胃液的制备

参照文献（中国专利申请号02135035.3），制得补骨脂稠膏。按100∶60（W∶V）溶于一定量的纯水中，涡旋混匀，制得补骨脂灌胃液，每毫升补骨脂灌胃液约相当于0.6g补骨脂药材。

2.2.2灌胃给药，收集血浆、尿样、粪样

取6只大鼠，实验前禁食12h，自由饮水。补骨脂提取物按1.6g生药/100g的剂量给与大鼠灌胃。将灌胃后采集血浆与自身灌胃前采集的空白血浆进行对比。即分别于补骨脂提取物灌胃前（0min）和灌胃后30min、60min、90min、120min、180min、240min于大鼠眼眶采血约1mL，置于1.5mL肝素化EP管中，12000rpm离心10min，分取血浆置于1.5mLEP管中，-20℃保存。

另取2只SD大鼠置于代谢笼中，收集其空白尿。以2g补骨脂生药/100g体重的剂量灌胃给药，收集灌胃给药后0-24h、24-48h尿样。同时收集大鼠空白粪样和灌胃给药后0-48h粪样。2.3大鼠血浆、尿样、粪样的处理

取灌胃给药后3h大鼠血浆样品400μL，加入3倍量乙腈，涡旋2min混匀，12000rpm离心10min除去蛋白。离心得到的上清液转移至玻璃离心管中，60℃微弱氮气吹干。加入100μL流动相复溶，涡旋振荡3min，转移至1.5mLEP管，12000rpm离心10min，取上清液进样检测。血药浓度浓缩至原先的4倍。

每个大鼠尿样分别给予离心、乙酸乙酯萃取两种不同方式处理。对比SD大鼠空白尿样、给药后尿样色谱图，分析吸收入血后经代谢由尿样排泄的补骨脂成分。

粪样自然风干，研成粉末，称取一定量，加甲醇超声30min，静置6h后，经0.45μm滤膜过滤，续滤液进HPLC检测。

2.4结果

2.4.1血浆分析

补骨脂药材主成分峰A、B、C、D在给药后血浆的色谱图中都有出现。这一结果与大鼠小肠单向灌流试验中灌流液主要减少成分相吻合。不同大鼠血浆色谱峰的个数和峰位一致，峰面积有所变化。提示我们，A、B、C、D成分以原型进入大鼠体内，且大鼠对于补骨脂药材提取物吸收代谢等体内过程，存在个体间差异。肠灌流大鼠血浆样品与灌胃给药大鼠血浆样品共有峰的峰位相吻合，进一步验证了SD大鼠肠灌流试验中减少的成分，是由大鼠吸收入血而引起。初步认定药材中4种主要成分A、B、C、D是补骨脂发挥药效的物质基础，也是后续研究所要追踪的目标成分。典型图见图2。

2.4.2尿样分析

对比空白尿样可知，给药后0-24h、24-48h的尿样中均出现了药材A、B、C、D四种主成分峰。可初步推断这些成分为补骨脂灌胃液进入大鼠体内经肾脏代谢后以原型排出的成分，典型图见图3。

2.4.3粪样分析

之前肠灌流试验、以及血样尿样图谱推断吸收入血的药材A、B、C、D4个主要成分中，A这一药材中含量最高、血浆样品中含量却极少的成分在粪样中没有出现，排除了经过肠道不吸收而直接排出体外的可能性，从另一个角度佐证了A成分经胃肠道吸收进入体内。

综合之前灌流试验以及灌胃大鼠血浆、尿样分析结果，A、B、C、D这4种成分均吸收入血，且入血的比例都较高，极有可能是补骨脂吸收入血发挥补肺活血作用的有效成分。经对照品峰位及光谱核对、液质联用结合化学成分转化性质的方法，判断其分别是补骨脂素苯并呋喃苷、异补骨脂素苯并呋喃苷、补骨脂素和异补骨脂素。

实施例3：本发明补骨脂提取物的制备

根据实施例1和2的结果用补骨脂素苯并呋喃苷、异补骨脂素苯并呋喃苷、补骨脂素和异补骨脂素为指标成分，正交试验法优化补骨脂提取物提取工艺。

依据提取预试验结果，采用L₉（3⁴）正交试验表进行设计，对提取时的乙醇浓度、提取溶媒用量和提取时间等因素进行考察，每个因素设置3个水平。因素水平见表1。

将补骨脂药材混匀，称取18份（每个试验平行操作2份），每份20g，按表2安排实验，D项为空白项，用来做方差分析。

以提取液中补骨脂素苯并呋喃苷与异补骨脂素苯并呋喃苷的峰面积、补骨脂素与异补骨脂素的含量作为考察指标，进行数据分析。试验数据用SPSS13.0软件统计，结果见表2-表6。

表1正交实验因素水平表

表2L₉（3⁴）实验安排、实验结果表

表3补骨脂素L₉（3⁴）方差分析表

表4异补骨脂素L₉（3⁴）方差分析表

表5补骨脂素苯并呋喃苷L₉（3⁴）方差分析表

表6异补骨脂素苯并呋喃苷L₉（3⁴）方差分析表

将结果进行方差分析结果表明：醇浓度C和提取时间T二因素，对补骨脂素、异补骨脂素提取试验结果的影响有统计学意义（P＜0.05），溶媒体积V对补骨脂素、异补骨脂素提取效率的影响无统计学意义。C、V、T对补骨脂素苯并呋喃苷、异补骨脂素苯并呋喃苷提取的影响均无统计学意义（P＞0.05）。

单因素统计结果显示：对于补骨脂素、异补骨脂素成分而言，最佳提取工艺为C2V3T3，即补骨脂药材依次用10倍量、9倍量60%乙醇回流提取两次，每次1.5h；对于补骨脂素苯并呋喃苷、异补骨脂素苯并呋喃苷而言，最佳提取工艺为C₁V₂T₃，即补骨脂药材依次用8倍量、7倍量40%乙醇回流提取两次，每次1.5h。考虑到醇浓度对补骨脂素苯并呋喃苷、异补骨脂素苯并呋喃苷提取效率的影响无统计学意义，选择对于补骨脂素、异补骨脂素提取最适宜的60%乙醇作为提取溶剂。又因提取溶剂对四种目标成分的提取效率均无显著影响，从节约成本的角度考虑，选择两次提取时依次加入8倍量、7倍量60%乙醇。

考察大孔吸附树脂富集纯化最佳工艺如下。

取补骨脂饮片，先用其8倍体积量乙醇，再用其7倍体积量60%乙醇各提取1次，每次1.5h，过滤，合并提取液；减压浓缩、回收乙醇至无醇味，放冷，加水调至浓度为0.5g/mL，即每1mL药液中含生药补骨脂量为0.5g，过滤后通过已预处理好D101型大孔吸附树脂柱；树脂重量与加水调节浓度后的药液重量之比为1∶1，流速为1~2mL·min^-1；吸附平衡两小时后，再依次用3倍柱体积纯水，7倍柱体积70%乙醇洗脱；收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，60℃继续浓缩得干膏，经60℃干燥，得补骨脂提取物粉末。

实施例4：

采用薄层鉴别、指纹图谱、含量测定、水分、炽灼残渣、重金属含量等为指标。

4.1性状

本品为淡棕黄色至棕褐色粉末；气香；味微苦。

4.2薄层鉴别

取本品粉末0.5g，加乙酸乙酯20mL，超声处理15min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液。另取补骨脂素、异补骨脂素对照品加乙酸乙酯制成每1mL各含2mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各2-4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干喷以10%氢氧化钾甲醇溶液，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位里上，显相同的两个蓝白色荧光斑点。

4.3补骨脂提取物含量测定

4.3.1指标成分的选择

补肺活血胶囊中补骨脂的物质基础研究结果表明，补骨脂素、异补骨脂素及其各自的苯并呋喃糖苷，是补骨脂治疗慢性阻塞性肺炎时吸收入体内的主要活性成分，因目前只有补骨脂素、异补骨脂素的对照品，其糖苷在本课题研究中不便使用，故选择这两种成分作为补骨脂提取物质量标准含量测定部分的指标成分。

4.3.2色谱条件

色谱柱：Agilent-C18（250×4.6mm，5μm）；流动相：0-5min，A:30%；5-30min，A:30%-60%；30-55min，A:60%-95%；55-60min，A：95%-5%，其中A为甲醇，B为0.1%甲酸、10mmol·L^-1乙酸铵水溶液；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃；DAD扫描范围190-400nm；检测波长：245nm；进样量：20μL。

4.3.3补骨脂素、异补骨脂素储备液和混合标准溶液的配制

精密称取减压干燥至恒重的补骨脂素对照品10.16mg，置于10mL容量瓶中，用少量甲醇溶解后，用甲醇定容至刻度线，摇匀，即得浓度为1.016mg·mL^-1的补骨脂素对照品贮备液。精密称取减压干燥至恒重的异补骨脂素对照品10.20mg，置10mL容量瓶中，用少量甲醇溶解后，用甲醇定容至刻度线，摇匀，即得浓度为1.020mg·mL^-1的异补骨脂素对照品贮备液。

精密吸取1.016mg·mL^-1补骨脂素对照品贮备液2.5mL、1.020mg·mL^-1异补骨脂素对照品贮备液2.5mL至同一25mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容，配制成含101.6μg·mL^-1补骨脂素和102.0μg·mL^-1异补骨脂素的对照品混合溶液。将其依次用甲醇对半稀释成含补骨脂素质量浓度0.40-101.60μg·mL^-1与异补骨脂素质量浓度0.40μg·mL^-1-102.00μg·mL^-1的一系列对照品混合液。

4.3.4供试品溶液的制备

取补骨脂提取物6份，每份约10mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，涡旋摇匀，超声提取20min，提取液用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

4.3.5线性范围考察

将系列对照品混合溶液以峰面积值对其相应对照品质量浓度进行最小二乘法线性拟合，即以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。目标成分峰面积值（Y）与其理论浓度（X）之间存在很好的线性相关性。补骨脂素直线回归方程为Y=137.6895X+1.9964，相关系数r=0.99995；异补骨脂素直线回归方程为Y=125.5776X+1.7292，相关系数r=0.99994。结果表明，补骨脂素、异补骨脂素在0.4μg·mL^-1-100μg·mL^-1浓度范围内，线性关系均良好。

4.3.6精密度试验

4.3.6.1系统适应性试验

取同一份对照品溶液，其中补骨脂素浓度为12.70μg·mL^-1，异补骨脂素浓度为12.75μg·mL^-1，精密吸取20μL，在“2.2.2”色谱条件下重复进样6次测定，记录色谱峰面积及性能参数。

计算结果表明，补骨脂素峰面积RSD为0.42%（n=6），异补骨脂素峰面积RSD为0.37%（n=6），均小于5%，符合要求。测定数据见表7、表8。系统适应性试验结果表明，仪器精密度良好。

性能参数显示，以样品溶液中补骨脂素苷、异补骨脂素苷、补骨脂素、异补骨脂素的色谱峰计算，理论塔板数均不低于5000，其分离度均大于1.5。

表7补骨脂素系统适应性试验

表8异补骨脂素系统适应性试验

4.3.6.2精密度试验

按“4.3.4”项下方法，制备一份补骨脂提取物的供试品溶液，HPLC重复进样6次测定，记录色谱峰面积。

计算结果表明：补骨脂素峰面积RSD为0.61%（n=6），异补骨脂素峰面积RSD为0.64%（n=6），均小于5%，符合要求。测定数据见表9、表10。精密度试验结果表明，该测定方法精密度良好。

表9补骨脂素精密度试验

表10异补骨脂素精密度试验

4.3.6.3重复性试验

精密称取同一批样品6份，按“4.3.4”项下供试品溶液制备方法平行处理，HPLC分别进样测定，记录各自的色谱峰面积。

计算结果表明：补骨脂素峰面积RSD为1.20%（n=6），异补骨脂素峰面积RSD为1.14%（n=6），均小于5%，符合要求。测定数据见表11、表12。重复性试验结果表明，该测定方法重复性良好。

表11补骨脂素重复性试验

表12异补骨脂素重复性试验

4.3.7稳定性试验

取补骨脂提取物1份，按“4.3.4”项下供试品溶液的制备方法配制供试液，避光放置，分别于0h、2h、4h、8h、12h、18h、24h取样测定，共7次，记录补骨脂素、异补骨脂素峰面积值。

计算结果表明：补骨脂素峰面积RSD为0.78%（n=7），异补骨脂素峰面积RSD为0.97%（n=7）。测定数据见表13。稳定性考察试验结果表明，供试品溶液在24h内稳定。

表13供试品稳定性试验

4.3.8加样回收率试验

为验证本方法的准确度，吸取已知含量的补骨脂提取物同一供试液，9份，每份200μL，分别加入低、中、高浓度的补骨脂素、异补骨脂素对照品混合液200μL，每个浓度平行3份，涡旋混合均匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液进样，测定供试品、对照品L、对照品M、对照品H、实测样品中的目标成分含量，记录峰面积。按公式计算补骨脂素、异补骨脂素回收率。结果见表14、表15。

回收率（%）=（实测样品量（mg）-供试品所含被测成分量（mg））/加入对照品的量（mg）×100%

表14补骨脂素（pso）加样回收率试验结果

表15异补骨脂素（iso）加样回收率试验结果

4.3.9三个批次补骨脂提取物含量测定

按“4.3.4”项下供试品溶液制备方法，制备3批补骨脂提取物的供试品溶液，依“4.3.2”项下色谱条件进样检测，计算其中补骨脂素、异补骨脂素含量，结果见表16。

表16三批补骨脂提取物补骨脂素、异补骨脂素含量测定结果（n=3）

由表可知不同来源的三批供试品中补骨脂补骨脂素、异补骨脂素含量差异较大。提示在进一步开发研究中应考虑规范药材来源。

4.4检查

4.4.1水分

按《中国药典》2010年版一部附录ⅨH中的第一法项下操作，取本品粉末约1.0g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度<10mm，精密称定，打开瓶盖100～105℃干燥5h，将瓶盖盖好，移至干燥器中冷却30min，精密称定，同样温度下再干燥1h移至干燥器中冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量和称样量，计算供试样品中水分含量(%)，结果见表17。

表17水分测定结果

3批补骨脂提取物的水分的平均含量为5.63%。将补骨脂提取物的水分含量标准暂定为不得超过6.0%。

4.4.2炽灼残渣

按《中国药典》2010年版一部附录ⅨJ项下操作，取补骨脂提取物约1.0g，置已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，放冷至室温。加硫酸1.0mL使润湿，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在500~600℃炽灼，使其完全灰化，移至干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500~600℃炽灼至恒重，即得。结果见表18。

表18炽灼残渣检查结果

由表可知，3批补骨脂提取物炽灼残渣的平均量为0.91%。将补骨脂纯化物炽灼残渣的标准暂定为不得超过1.0%。

4.4.3重金属检查

按附录ⅨE重金属检查第二法，取“4.4.2”炽灼残渣检查项下遗留的残渣，加硝酸0.5mL，蒸干，至氧化氮蒸气除尽后，放冷，加盐酸2mL，至水浴上蒸干后加水15mL，滴加氨试液至对酚酞指示液显微粉红色，再加醋酸铅缓冲盐（pH3.5）2mL，微热溶解后，移至纳氏比色管中，加水稀释成25mL，作为甲管；另取配制供试品溶液的试剂，置瓷皿中蒸干后，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2mL与水15mL，微热溶解后，移至纳氏比色管中，加标准铅溶液一定量，再加水稀释成25mL，作为乙管；再在甲、乙两管中分别加硫代乙酰胺试液各2mL，摇匀，放置2min，同置白纸上，自上向下透视，比较标准管与供试品管的颜色，以判断供试品管中重金属的含量，结果见表19。

表19重金属检查结果

重金属检查试验表明，3批自制的补骨脂提取物供试品均浅于标准管（重金属含量均小于0.01‰）。

Claims (8)

1.一种补骨脂提取物，其特征在于：是以补骨脂为原料提取得到的，所述的补骨脂提取物含有补骨脂素、异补骨脂素，质量百分比分别为补骨脂素1.57%-3.3%，异补骨脂素1.1%-2.5%；

所述的补骨脂提取物的制备方法如下：取补骨脂饮片，先用其5-10倍体积量40%-80%乙醇浸泡提取2次，每次30min-1.5h，滤过，合并提取液，减压浓缩、回收乙醇至无醇味，放冷，加水调至浓度为0.5g/mL，即每1mL药液中含生药补骨脂量为0.5g，滤过，然后通过已预处理好的D101型大孔吸附树脂柱，树脂重量与加水调节浓度后的药液重量之比为1:1，再依次以3倍柱体积的水洗脱，再用7倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，继续浓缩得干膏，经干燥，得补骨脂提取物粉末。

2.根据权利要求1所述的补骨脂提取物，其特征在于：所述的补骨脂提取物提取物还含有补骨脂素苯并呋喃苷和异补骨脂素苯并呋喃苷。

3.根据权利要求1所述的补骨脂提取物，其特征在于：所述的补骨脂来源于豆科植物补骨脂（Psoralen.L）的干燥成熟果实。

4.根据权利要求1所述的补骨脂提取物，其特征在于：所述的补骨脂提取物的水分含量不超过6.0%、炽灼残渣量不超过1.0%、重金属含量不超过0.01‰。

5.一种补骨脂提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

取补骨脂饮片，先用其5-10倍体积量40%-80%乙醇浸泡提取2次，每次30min-1.5h，滤过，合并提取液，减压浓缩、回收乙醇至无醇味，放冷，加水调至浓度为0.5g/mL，即每1mL药液中含生药补骨脂量为0.5g，滤过，然后通过已预处理好的D101型大孔吸附树脂柱，树脂重量与加水调节浓度后的药液重量之比为1:1，再依次以3倍柱体积的水洗脱，再用7倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，继续浓缩得干膏，经干燥，得补骨脂提取物粉末；所述的补骨脂提取物含有补骨脂素、异补骨脂素，质量百分比分别为补骨脂素1.57%-3.3%，异补骨脂素1.1%-2.5%。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

取补骨脂饮片，先用其8倍体积量60%乙醇，再用其7倍体积量60%乙醇各提取1次，每次1.5h，过滤，合并提取液；减压浓缩、回收乙醇至无醇味，放冷，加水调至浓度为0.5g/mL，即每1mL药液中含生药补骨脂量为0.5g，过滤后通过已预处理好的D101型大孔吸附树脂柱；树脂重量与加水调节浓度后的药液重量之比为1:1，流速为1～2mL·min^-1；再依次用3倍柱体积纯水，7倍柱体积70%乙醇洗脱；收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，60℃继续浓缩得干膏，经60℃干燥，得补骨脂提取物粉末。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：所述的补骨脂提取物还含有补骨脂素苯并呋喃苷和异补骨脂素苯并呋喃苷。

8.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：所述的补骨脂提取物的水分含量不超过6.0%、炽灼残渣量不超过1.0%、重金属含量不超过0.01‰。

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