CN109738531B

CN109738531B - 一种克白合剂指纹图谱检测方法

Info

Publication number: CN109738531B
Application number: CN201811615925.1A
Authority: CN
Inventors: 黄巧玲; 童菊华; 王迅; 康斯丹; 冯瑛; 陈丹菲
Original assignee: Zhejiang Research Institute Of Traditional Chinese Medicine Co ltd; Hangzhou Third Hospital
Current assignee: Zhejiang Research Institute Of Traditional Chinese Medicine Co ltd; Hangzhou Third Hospital
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN109738531A

Abstract

本发明公开了一种克白合剂指纹图谱质量控制方法，该方法采用高效液相色谱法，首先将克白合剂待测产品溶液的制备方法及色谱条件进行了优化，包括流动相体系、流动相梯度、提取溶剂等，使得色谱图分离较好、谱峰较多、给出的色谱峰信息量较大；然后优化了检测波长，得到基线较平稳的克白合剂样品色谱图。该方法为克白合剂的内部质量控制提供了一种有效的检测手段，可使克白合剂的质量更加稳定，检测更为科学。

Description

一种克白合剂指纹图谱检测方法

技术领域

本发明属于指纹图谱分析技术领域，特别涉及一种克白合剂指纹图谱检测方法。

背景技术

克白合剂系用现代先进工艺提炼精制而成的一种中药复方制剂，由何首乌、枸杞子、补骨脂、菟丝子、女贞子、白芷等16味中药配伍而成的医院制剂，具有养血祛风、滋补肝肾的功效，杭州市第三人民医院在临床上用于气滞血瘀、肝肾阴虚型白癜风的治疗，取得较好的疗效。克白合剂临床用量比较大，但产品的质量控制手段比较少，检测水平比较低，目前该产品执行的质量标准为《浙江省医疗机构制剂规范》2005年版，该标准中的检验项目限于何首乌、枸杞子的薄层鉴别，以及pH值、相对密度检查等常规检验项目，缺乏对该产品有效成分的量化评价，不能全面有效地控制制剂质量。

因此，采用高效液相色谱法检测产品的主要有效成份(指标成份)，综合成有效的指纹图谱，使该制剂的质量控制手段更严密、更精准和科学，为进一步探索和研究制剂的质量提供科学依据。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种克白合剂指纹图谱检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种克白合剂指纹图谱质量控制方法，具体步骤为：(1)制备10批次以上的待测产品溶液，每批次待测产品溶液的制备过程如下：精密量取克白合剂10mL，加入流动相(乙腈-0.2vol％磷酸10:90)稀释，定容至25mL量瓶中，摇匀，离心，取上层清液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液，即得该批次待测产品溶液；

(2)采用高效液相色谱法，以浓度为0.2vol％磷酸溶液A和乙腈B为流动相，分别获取所有批次的待测产品溶液的高效液相指纹图谱；色谱条件为：采用ZORBAX SB C₁₈色谱柱，色谱柱长度为250mm，色谱柱内径为4.6mm，填料粒径为5μm；线性梯度洗脱程序为：0～3min内，流动相中B的体积分数为10％；3～20min内流动相中B的体积分数为10％～15％；20～42min，流动相中B的体积分数为15％～25％；42～60min内，流动相中B的体积分数为25％～48％；60～70min内，流动相中B的体积分数为48％～55％；70～75min内，流动相中B的体积分数为55％～10％；流动相流速为1.0mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；检测波长为246nm；

(3)质量稳定性评价：将步骤(2)得到的所有批次的待测产品溶液的指纹图谱，分别以串行方式融合成一张指纹图谱，以所有批次待测产品溶液的平均指纹图谱为对照指纹图谱，采用相关系数法计算各批次的相似度，相似度均≥0.9的样品评价为质量稳定的产品。该步骤可以在“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2.0版”中分析计算得到。

本发明的有益效果是：该方法为克白合剂的内部质量控制提供了一种简单、有效的方法，可使克白合剂质量的有效性、稳定性、均一性得到科学评价。

附图说明

图1为连续进样6次获取同一供试品溶液的指纹图谱；

图2为重复6次获取同一批次的供试品溶液的指纹图谱；

图3为同一供试品溶液放置不同时间后的指纹图谱；

图4为210nm波长下的克白合剂样品色谱图；

图5为224nm波长下的克白合剂样品色谱图；

图6为246nm波长下的克白合剂样品色谱图；

图7为254nm波长下的克白合剂样品色谱图；

图8为330nm波长下的克白合剂样品色谱图；

图9为360nm波长下的克白合剂样品色谱图；

图10为甲醇-水体系下得到的克白合剂样品色谱图；

图11为乙腈-水体系下得到的克白合剂样品色谱图；

图12为乙腈-0.1％磷酸水溶液体系下得到的克白合剂样品色谱图；

图13为乙腈-0.2％磷酸水溶液体系下得到的克白合剂样品色谱图；

图14为流动相梯度1条件下得到的克白合剂样品色谱图；

图15为流动相梯度2条件下得到的克白合剂样品色谱图；

图16为流动相梯度3条件下得到的克白合剂样品色谱图；

图17为流动相梯度4条件下得到的克白合剂样品色谱图；

图18为方法(1)提取条件下得到的克白合剂样品色谱图；

图19为方法(2)提取条件下得到的克白合剂样品色谱图；

图20为方法(3)提取条件下得到的克白合剂样品色谱图；

图21为本发明测得的10批次的杭州市第三人民医院的克白合剂的指纹图谱；

图22为本发明测得的10批次的杭州市第三人民医院的克白合剂的指纹图谱的对照图谱。

具体实施方式

实施例1

(1)精密量取克白合剂10mL，加入流动相(乙腈-0.2vol％磷酸溶液10:90)稀释，定容至25mL量瓶中，摇匀，离心，取上层清液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液，即得待测产品溶液。

(2)重复6次获取上述溶液的指纹图谱，得到6个指纹图谱，指纹图谱的获取方法为：以浓度为0.2vol％磷酸溶液A和乙腈B为流动相，分别获取所有批次的待测产品溶液的高效液相指纹图谱；色谱条件为：采用ZORBAX SB C₁₈色谱柱，色谱柱长度为250mm，色谱柱内径为4.6mm，填料粒径为5μm；线性梯度洗脱程序为：0～3min内，流动相中B的体积分数为10％；3～20min内流动相中B的体积分数为10％～15％；20～42min，流动相中B的体积分数为15％～25％；42～60min内，流动相中B的体积分数为25％～48％；60～70min内，流动相中B的体积分数为48％～55％；70～75min内，流动相中B的体积分数为55％～10％；流动相流速为1.0mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；检测波长为246nm。

(3)质量稳定性评价：步骤2得到的6个指纹图谱结果见图1，图谱的相关数据见表1-1和表1-2；各峰相对保留时间RSD小于0.32％，各共有峰的相对峰面积RSD小于2.78％。以第一次分析所得指纹图谱为对照，其他5次分析所得色谱图与对照指纹图谱比较，相似度计算结果为：0.998、1.000、1.000、1.000、1.000，表明该方法的精密度良好。

表1-1精密度实验结果(相对保留时间)

表1-2精密度实验结果(相对峰面积)

实施例2

(1)制备同一批次中6份克白合剂供试品溶液，每份供试品溶液的制备过程如下：精密量取克白合剂10mL，加入流动相(乙腈-0.2vol％磷酸溶液10:90)稀释，定容至25mL量瓶中，摇匀，离心，取上层清液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液，即得6份待测产品溶液。

(2)获取上述6份待测产品溶液的指纹图谱，得到6个指纹图谱，获取方法为：采用ZORBAX SB C₁₈色谱柱，色谱柱长度为250mm，色谱柱内径为4.6mm，填料粒径为5μm；线性梯度洗脱程序为：0～3min内，流动相中B的体积分数为10％；3～20min内流动相中B的体积分数为10％～15％；20～42min，流动相中B的体积分数为15％～25％；42～60min内，流动相中B的体积分数为25％～48％；60～70min内，流动相中B的体积分数为48％～55％；70～75min内，流动相中B的体积分数为55％～10％；流动相流速为1.0mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；检测波长为246nm。

(3)质量稳定性评价：步骤2得到的6个待测产品溶液的指纹图谱结果见图2，图谱的相关数据见表2-1和表2-2；各峰相对保留时间RSD小于0.37％，各共有峰的相对峰面积RSD小于2.84％。以其中一色谱图为标准指纹图谱，其他色谱图与该指纹图谱比较，相似度分别为0.998、1.000、1.000、0.999、1.000，表明该方法具良好重现性。

表2-1重现性实验结果(相对保留时间)

表2-2重现性实验结果(相对峰面积)

实施例3

(2)将该份待测产品溶液，分别在室温放置0h、3h、6h、9h、12h、24h后进样分析，色谱分析方法同实施例2，得到6份指纹图谱，结果见图3，相关数据见表3-1和3-2。结果各峰相对保留时间RSD小于1.12％，各共有峰的相对峰面积RSD小于2.91％。以0时分析所得指纹图谱为对照，其他时间分析所得色谱图与该指纹图谱比较，相似度分别为1.000、0.997、1.000、0.999、0.999，表明通过该方法提取的克白合剂供试品溶液在室温24h内样品稳定性良好。

表3-1稳定性实验结果(相对保留时间)

表3-2稳定性实验结果(相对峰面积)

实施例4：检测波长选择

考虑到克白合剂为复方制剂，成分复杂，检测波长的选择应兼顾各类化学组分，经多波长扫描及对比分析，再根据该复方制剂君臣佐使的配伍原则，女贞子的主要有效成分最大吸收波长为224nm，补骨脂的主要有效成分最大吸收波长为246nm，独活的主要有效成分最大吸收波长为330nm。同时考察了210、224、246、254、330、360nm波长下的克白合剂样品色谱图，结果如图4～图9所示，以210、224nm波长下的色谱图色谱峰数最多，但色谱图基线波动较大；254、246nm波长下的色谱图色谱峰数差别不大，但246nm下基线稍平稳；330、360nm波长下的克白合剂样品色谱图中许多峰缺失。因此选择246nm为克白合剂分析用检测波长。

实施例5：流动相体系选择

比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1vol％磷酸溶液、乙腈-0.2vol％磷酸溶液四种流动相体系，所得色谱图见图10～图13所示。结果甲醇-水体系、乙腈-水体系在246nm波长下，峰的分离效果差，而乙腈-0.1vol％磷酸溶液体系、乙腈-0.2vol％磷酸溶液体系下的色谱图峰分离较好，二者在246nm波长下基线较平稳，分离情况差异不大，考虑色谱峰峰型的对称性，选择乙腈-0.2vol％磷酸溶液体系为克白合剂色谱分离用流动相体系。

实施例6：流动相梯度选择

采用ZORBAX SB C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流速：1.0mL/min；检测波长：246nm；柱温：30℃；进样量：10μL；以0.2vol％磷酸溶液A和乙腈B为流动相，考察了多种梯度洗脱条件，其中的四个线性梯度(梯度1～梯度4)条件如下：

梯度1：

0～12min：流动相中B体积分数为10％～15％；

12～35min：流动相中B体积分数为15％～30％；

35～60min：流动相中B体积分数为30％～48％；

60～70min：流动相中B体积分数为48％～65％；

70～75min：流动相中B体积分数为65％～10％；

梯度2：

0～5min：流动相中B体积分数为15％；

5～30min：流动相中B体积分数为15％～30％；

30～65min：流动相中B体积分数为30％～55％；

65～75min：流动相中B体积分数为55％～65％；

75～80min：流动相中B体积分数为65％～15％；

梯度3：

0～12min：流动相中B体积分数为8％～12％；

12～35min：流动相中B体积分数为12％～20％；

35～55min：流动相中B体积分数为20％～25％；

55～70min：流动相中B体积分数为25％～48％；

70～80min：流动相中B体积分数48％～65％；

80～85min：流动相中B体积分数65％～80％；

85～90min：流动相中B体积分数80％～8％；

梯度4：

0～3min：流动相中B体积分数为10％；

3～20min：流动相中B体积分数为10％～15％；

20～42min：流动相中B体积分数为15％～25％；

42～60min：流动相中B体积分数为25％～48％；

60～70min：流动相中B体积分数48％～55％；

70～75min：流动相中B体积分数55％～10％；

梯度1-梯度4条件下得到的图谱如图14～图17所示，从图中可以看出，以梯度4得到的色谱图分离较好而且谱峰较多，可给出较大的信息量，基线较平稳，故选定以梯度4作为克白合剂指纹图谱分析的色谱条件。

实施例7：提取溶剂选择

取同一批次克白合剂样品，通过以下方法进行提取：

方法(1)：精密量取克白合剂10mL，加甲醇稀释，定容至25mL量瓶中；

方法(2)：精密量取克白合剂10mL，加水稀释，定容至25mL量瓶中；

方法(3)：精密量取克白合剂10mL，加流动相(乙腈-0.2vol％磷酸溶液10:90)稀释，定容至25mL量瓶中；

以上样品溶液摇匀后，离心，取上层清液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液进行色谱分析，结果见图18～图20，由图可知，以流动相(乙腈-0.2vol％磷酸溶液10:90)为溶剂提取的峰型较好，故选择流动相(乙腈-0.2vol％磷酸溶液10:90)为提取溶剂。

应用实施例1：杭州市第三人民医院自制的克白合剂稳定性评价

(1)取10批次克白合剂样品(杭州市第三人民医院)，按照以下方法制备10批次的待测产品溶液：精密量取克白合剂10mL，加流动相(乙腈-0.2vol％磷酸溶液10:90)稀释，定容至25mL量瓶中，摇匀，离心，取上层清液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液，即得待测产品溶液。

(2)以浓度为0.2vol％磷酸溶液A和乙腈B为流动相，分别获取所有批次的待测产品溶液的高效液相指纹图谱；色谱条件为：采用ZORBAX SB C₁₈色谱柱，色谱柱长度为250mm，色谱柱内径为4.6mm，填料粒径为5μm；线性梯度洗脱程序为：0～3min内，流动相中B的体积分数为10％；3～20min内流动相中B的体积分数为10％～15％；20～42min，流动相中B的体积分数为15％～25％；42～60min内，流动相中B的体积分数为25％～48％；60～70min内，流动相中B的体积分数为48％～55％；70～75min内，流动相中B的体积分数为55％～10％；流动相流速为1.0mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；检测波长为246nm。

(3)质量稳定性评价：将步骤(2)得到的10批次待测产品溶液的指纹图谱(如图21)，分别以串行方式融合成一张叠加指纹图谱，以10批次克白合剂平均指纹图谱为对照指纹图谱(如图22)，采用相关系数法计算各批次的相似度，结果，各批次克白合剂指纹图谱相似度分别为0.994、0.982、0.998、0.987、0.984、0.983、0.938、0.980、0.965、0.980。相似度均大于0.90，结果表明：杭州市第三人民医院生产的克白合剂各批次间质量均一、稳定。

Claims

1.一种克白合剂指纹图谱检测方法，其特征在于，具体步骤为：

(1)制备10批次以上的待测产品溶液，每批次待测产品溶液的制备过程如下：量取克白合剂10mL，加入流动相稀释，所述流动相为乙腈与0.2vol％磷酸溶液按照体积比10:90组成的混合溶液，定容至25mL量瓶中，摇匀，离心，取上层清液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液，即得该批次待测产品溶液；

(3)质量稳定性评价：将步骤(2)得到的所有批次的待测产品溶液的指纹图谱，分别以串行方式融合成一张指纹图谱，以所有批次待测产品溶液的平均指纹图谱为对照指纹图谱，采用相关系数法计算各批次的相似度，相似度均≥0.90的样品评价为质量稳定的产品。