CN114295757B - 一种鼠妇虫hplc特征图谱构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鼠妇虫HPLC特征图谱构建和含量测定方法，包括：A)将鼠妇虫原料采用溶剂溶解，加热回流提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到鼠妇虫HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB‑Aq；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％甲酸水溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇‑0.2％甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，以尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤为参照物，建立了鼠妇虫HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对鼠妇虫的质量进行控制。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其是涉及一种鼠妇虫HPLC特征图谱构建方法。
背景技术
鼠妇虫为我国传统中药材，已有2000多年的使用历史，具有破瘀消癥、通经利水、解毒止痛作用，用于久疟疟母、血瘀经闭、癥瘕、小便不通、惊风撮口、牙齿疼痛、鹅口疮等。该药材主要含有甾醇类、生物碱类、机酸类及脂类化合物，现代药效学研究表明，鼠妇虫具有镇痛、消炎、抗菌、抗凝血、抗肿瘤等作用，且广泛用于多种疣性皮肤病的治疗。
我国对鼠妇虫药材的基础研究较为薄弱，现有文献报道虽对其质量控制方法进行研究，但其标准控制指标简单，难以有效控制药材质量，导致药材及其成药制剂质量良莠不齐等现象长期存在，制约了鼠妇虫药用资源开发与有效利用。本研究对鼠妇虫药材及其制剂的质量评价和资源开发利用提供依据。
目前缺少一种有效手段对其进行质量控制。本发明旨在构建一种鼠妇虫高效液相特征图谱方法和含量测定方法，全面反映鼠妇虫及其相关制剂的质量水平，为鼠妇虫药材、饮片及其相关制剂在质量控制方面提供指导。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种鼠妇虫HPLC特征图谱构建方法，本发明构建的鼠妇虫HPLC特征图谱方法稳定，可靠，可以对鼠妇虫的质量进行控制。
本发明提供了一种鼠妇虫HPLC特征图谱构建和含量测定方法，包括：
A)将鼠妇虫原料采用溶剂溶解，加热回流提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到鼠妇虫HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％甲酸水溶液、0.2％磷酸或0.2冰乙酸水溶液，梯度洗脱。
优选的，还包括制备参照物溶液：分别取尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤，采用水溶解，得到参照物溶液；
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对鼠妇虫HPLC特征图谱的成分进行定性和定量测定。
优选的，所述参照物溶液的浓度具体为：尿嘧啶3.55～709.25μg/mL、腺嘌呤3.79～758.52μg/mL、次黄嘌呤3.4～681.6μg/mL。
优选的，所述梯度洗脱具体为：
0～15min，A相：0～2％、B相：100～98％；
15～25min，A相：2％～27％、B相：98％～73％；
25～40min，A相：27％～45％、B相：73％～55％；
40～60min，A相：45％～53％、B相：55％～47％。
优选的，所述色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq柱，规格为5μm，4.6×250mm；柱温30℃。
优选的，所述流动相流速为0.5mL/min；检测波长为254nm；进样量为10μL。
优选的，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对鼠妇虫HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由9个特征峰构成的鼠妇虫HPLC标准特征图谱，其中峰1为尿嘧啶，峰3为腺嘌呤，峰5为次黄嘌呤。
优选的，在所述标准特征图谱中，以尿嘧啶为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：1.20-峰2、1.29-峰3、1.57-峰4、2.04-峰5、2.16-峰6、2.55-峰7、2.83-峰8、3.16-峰9。
优选的，步骤A)所述溶剂为水；所述加热回流提取的时间为15～45min。
优选的，步骤A)所述鼠妇虫原料的质量g和溶剂的体积mL的比为(0.1～2.0)：(10～50)；
所述鼠妇虫原料为鼠妇虫药材或鼠妇虫配方颗粒制剂。
与现有技术相比，本发明提供了一种鼠妇虫HPLC特征图谱构建和含量测定方法，包括：A)将鼠妇虫原料采用溶剂溶解，加热回流提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到鼠妇虫HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAXSB-Aq；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％甲酸水溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇-0.2％甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，以尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤为参照物，建立了鼠妇虫HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对鼠妇虫的质量进行控制。
附图说明
图1为本发明实施例1提取方法考察结果图；
图2为本发明实施例1提取溶剂考察结果图；
图3为本发明实施例1提取时间考察结果图；
图4为实施例2色谱峰指认图；
图5为实施例3的对照特征图谱；
图6为本发明实施例4供试品及对照品色谱图；
图7为本发明对比例1不同梯度条件结果色谱图；
图8为本发明对比例2的不同检测波长下的检测色谱图；
图9为本发明流动相考察结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种鼠妇虫HPLC特征图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种鼠妇虫HPLC特征图谱构建和含量测定方法，包括：
A)将鼠妇虫原料采用溶剂溶解，加热回流提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到鼠妇虫HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％甲酸水溶液，梯度洗脱。
本发明提供的一种鼠妇虫HPLC特征图谱构建方法首先将取鼠妇虫原料，溶剂溶解，加热回流提取，得到待测液。所述溶剂优选为水。
具体为将鼠妇虫内容物，溶剂溶解，加热回流提取，放冷，摇匀，滤过，即得。
所述加热水流提取的时间优选为15～45min；更优选为20～40min；最优选为30min。
其中，所述鼠妇虫原料的质量g和溶剂的体积mL的比优选为(0.1～2.0)：(10～50)；更优选为(0.5～0.7)：(22～25)；最优选为0.5：25。
本发明所述鼠妇虫原料为鼠妇虫药材或鼠妇虫配方颗粒制剂。本发明对其不进行限定，上述原料皆可通过本发明的方法进行质量控制和定性定量检测。
本发明还包括制备参照物溶液：分别取尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤，采用水溶解，得到参照物溶液；
其中，所述参照物溶液的浓度具体为：尿嘧啶3.55～709.25μg/mL、腺嘌呤3.79～758.52μg/mL、次黄嘌呤3.4～681.6μg/mL。
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，分别得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对鼠妇虫HPLC特征图谱的成分进行定性和定量测定。
本发明所述流动相A为甲醇，流动相B为0.2％甲酸水溶液，梯度洗脱。
本发明所述梯度洗脱优选具体为：
0～15min，A相：0～2％、B相：100～98％；
15～25min，A相：2％～27％、B相：98％～73％；
25～40min，A相：27％～45％、B相：73％～55％；
40～60min，A相：45％～53％、B相：55％～47％。
本发明在上述洗脱梯度下基线分离好，各个峰分离度好，基线平稳。
Agilent ZORBAX SB-Aq柱，规格为5μm，4.6×250mm；柱温30℃。
流动相流速优选为0.5min。
本发明发现流速0.5ml/min下各色谱峰分离较好，峰形较对称，作为最优选方案。
本发明柱温优选为30℃。
本发明检测波长优选为254nm。
本发明人发现，在254nm处色谱信息丰富，各成分均有较好吸收，响应值适中，各峰分离度较好，基线平稳。
本发明进样量为10～15μL；优选为10μL。
本发明的有益效果是，一个液相色谱条件下，以特征图谱控制鼠妇虫的物质群，以尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤对特征图谱进行定位；能够大大降低检测的成本，实现定性检测。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对鼠妇虫HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由9个特征峰构成的鼠妇虫HPLC标准特征图谱，其中峰1为尿嘧啶，峰3为腺嘌呤，峰5为次黄嘌呤。
在所述标准特征图谱中，以尿嘧啶为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：1.20-峰2、1.29-峰3、1.57-峰4、2.04-峰5、2.16-峰6、2.55-峰7、2.83-峰8、3.16-峰9。
质量判断标准：取鼠妇虫样品，按上述同法操作，得到鼠妇虫特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版对鼠妇虫标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.90。
采用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次鼠妇虫的质量，使其质量稳定，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。
本发明建立的鼠妇虫特征图谱以尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤，为参照物，注重各个特征峰的顺序和与药材及中间产品的相关性，能全面评价产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。
本发明提供了一种鼠妇虫HPLC特征图谱构建和含量测定方法，包括：A)将鼠妇虫原料采用溶剂溶解，加热回流提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到鼠妇虫HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％甲酸水溶液，梯度洗脱。本发明首次建立高效液相特征图谱方法用于鼠妇虫药材及其相关制剂的检测。本发明在建立鼠妇虫的特征图谱过程中，确认了9个共有特征峰，并对其相对保留时间和相对峰面积进行了研究，保证了其化学组成稳定性和使用安全性。建立鼠妇虫的含量测定方法，确立了3个指标成分，克服了单一成分含量测定难以反映整体含量的缺陷，可以从整体上、宏观上控制鼠妇虫及其相关制剂的内在质量，保证了药物的疗效，使药材及其相关制剂得到了更为正规的质量控制。本发明方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种鼠妇虫HPLC特征图谱构建方法进行详细描述。
实施例1供试品制备考察
Waters e2695高效液相色谱仪，Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱(250×4.6mm，5μm)，万分之一天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)，百万分之一天平(XP26，梅特勒-托利多公司)，超纯水系统(Mocell 1820A型，Molecular)。
试剂：甲醇(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)、甲酸(成都市科隆化学品有限公司)、三氟乙酸(成都市科隆化学品有限公司)、磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、冰乙酸(成都市科隆化学品有限公司)、无水乙醇(成都市金山化学试剂有限公司)，水为超纯水(实验室自制)。
试药：尿嘧啶对照品(批号：100469-201302，含量：99.6％，中国食品药品检定研究院)；
腺嘌呤对照品(批号：110886-201102，含量：99.4％，中国食品药品检定研究院)；
次黄嘌呤对照品(批号：140661-201706，含量：100％，中国食品药品检定研究院)。
供试品溶液的制备取供试品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，加热回流30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，建立高效液相特征图谱：
色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq(250×4.6mm，5μm)，以甲醇为流动相A，以0.2％甲酸为流动相B，按下表梯度进行洗脱，柱温：30℃；流速：0.5ml/min；检测波长为254nm，进样量10μL；理论板数按尿嘧啶峰计算应不低于3000。
方法与结果
1.1提取方式考察
取供试品两份，精密称定0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入水25ml，分别加热回流30分钟、超声处理(功率600W，频率40kHZ)30分钟，放冷，摇匀，过滤，取续滤液，检测结果如图1所示，图1为本发明实施例1提取方法考察结果图。由图1可以看出，回流处理的供试品溶液色谱峰信息比超声提取更丰富，提取效率更高，因此供试品溶液提取方式选择回流提取。
1.2提取溶剂考察
取供试品3份，精密称定0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入水、70％乙醇、无水乙醇25ml，加热回流处理30分钟，放冷，摇匀，过滤，取续滤液，检测结果如图2，图2为本发明实施例1提取溶剂考察结果图；由图2可以看出，水较其余溶剂提取效果，峰分离度良好，因此，本技术方案供试品提取溶剂为水。
1.3提取时间考察
取供试品3份，精密称定0.5g，置具塞锥形瓶中，加入水25ml，分别加热回流处理15分钟、30分钟、45分钟，放冷，摇匀，过滤，取续滤液，检测结果如图3；图3为本发明实施例1提取时间考察结果图；由图3可以看出，15～45min提取时间，峰分离度无明显差异，为保证溶液中目标峰能充分提取，因此，供试品溶液的提取时间最优选择为30min。
实施例2方法学考察
2.1色谱峰指认
参照物溶液的制备：取尿嘧啶对照品、腺嘌呤对照品、次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.1mg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备：取供试品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，加热回流30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
阴性对照溶液的制备：按供试品溶液制备方法同法制备阴性对照溶液，即得。
对特征峰进行指认，所得结果见图4，图4为实施例2色谱峰指认图；其中峰1为尿嘧啶，峰3为腺嘌呤，峰5为次黄嘌呤，以尿嘧啶对照品参照物相应的峰为S峰，在后续的方法学考察中，对供试品图谱中的9个峰进行考察。
2.2精密度试验
取供试品粉末，按前述的特征图谱的构建方法连续进样六次，每次10μl，计算相对保留时间及相对峰面积，所得结果如下表1-表2。
表1精密度特征峰相对保留时间
表2精密度特征峰相对峰面积
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD为0.00％～0.04％，各特征峰相对峰面积的RSD为0.00％～0.87％，表明该方法精密度试验符合要求。
2.3重复性考察
取供试品六份，按前述的特征图谱的构建方法进行供试品溶液制备及测定，所得结果如下表3-表4。
表3重复性考察特征峰相对保留时间
表4重复性考察特征峰相对峰面积
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD为0.00％～0.03％，各特征峰相对峰面积的RSD为0.00％～1.05％，表明该方法重复性良好。
2.4中间精密度考察(不同人员和时间)
基于前述的特征图谱的构建方法，分别在不同人员(A、B)和不同时间(T1、T2)条件下称取供试品各两份，制备供试品溶液，测定，所得结果如下表5-表6。
表5中间精密度特征峰相对保留时间
表6中间精密度特征峰相对峰面积
结果表明：由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，各特征峰相对保留时间的RSD为0.00％～0.03％，各特征峰相对峰面积的RSD为0.00％～2.87％，表明该方法中间精密度较好。
2.5稳定性考察
基于前述的特征图谱的构建方法，取同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h时测定，所得结果如下表7-表8所示。
表7稳定性特征峰相对保留时间
表8稳定性特征峰相对峰面积
结果表明，其相对应的特征峰相对保留时间的RSD在0.00％～0.07％，各特征峰相对峰面积的RSD为0.00％～1.32％，表明样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述：各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法重复性良好，并将上述9个特征峰纳入后续考察。
实施例3特征图谱验证
采用前述的特征图谱的构建方法，对15批鼠妇虫药材(SFC001～SFC015)及3批鼠妇虫配方颗粒制剂(2108001、2108002、2108003)进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积，规定各特征峰保留时间，建立对照特征图谱。验证结果如下表9-表12所示。
表9 15批鼠妇虫药材验证批特征峰相对保留时间
表10 15批鼠妇虫药材验证批特征峰相对峰面积
表11 3批鼠妇虫配方颗粒验证批特征峰相对保留时间
表12 3批鼠妇虫配方颗粒验证批特征峰相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了9个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明：以峰1为S峰时，15批药材供试品特征峰相对保留时间RSD为0.00％～0.04％，相对峰面积RSD为0.00％～10.99％；3批配方颗粒供试品特征峰相对保留时间RSD为0.00％～0.04％，相对峰面积RSD为0.00％～14.66％，相对保留时间较为稳定，予以纳入标准，相对峰面积波动范围较大，不予以纳入标准。
因此，最终规定：供试品色谱中应呈现9个特征峰，其中峰1、峰3、峰5应分别与尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤对照品参照物保留时间相对应。以尿嘧啶对照品参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间；各峰的相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：1.20(峰2)、1.29(峰3)、1.57(峰4)、2.01(峰5)、2.16(峰6)、2.55(峰7)、2.83(峰8)、3.16(峰9)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对三批供试品进行合成，建立了特征图谱的对照特征图谱，可以较为准确地整体控制供试品的质量，如图5所示，图5为实施例3的对照特征图谱。
实施例4含量的测定
4.1色谱条件及供试品制备
参考特征图谱图谱方法，选择色谱柱Agilent ZORBAX SB-Aq(250×4.6mm，5μm)，以甲醇为流动相A，以0.2％甲酸为流动相B，按下表梯度进行洗脱，柱温：30℃；流速：0.5ml/min；检测波长为254nm，理论板数按尿嘧啶峰计算应不低于3000。
参照物溶液的制备：取尿嘧啶对照品、腺嘌呤对照品、次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.1mg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备：取供试品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，加热回流30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，建立高效液相特征图谱，如图6所示，图6为本发明实施例4供试品及对照品色谱图。
4.2方法学考察
4.2.1精密度考察
取供试品粉末，精密称定，按上述确定的供试品制备方法制备供试品，按上述确定的色谱条件连续进样6次，进行检测，结果见表13。
结果表明，方法精密度良好。
表13精密度考察
4.2.2重复性考察
取供试品粉末，分取6份，精密称定，按上述确定的供试品制备方法制备供试品，按上述确定的色谱条件进行检测，结果见表14。
结果表明，方法重复性良好。
表14重复性考察
4.2.3中间精密度考察(不同人员和时间)
取供试品粉末，分别在不同人员(A、B)和不同时间(T1、T2)条件下称取供试品各两份，精密称定，按上述确定的供试品制备方法制备供试品，按上述确定的色谱条件进行检测，结果见表15。
结果表明，方法中间精密度良好。
表15中间精密度考察
4.2.4线性考察
分别精密称取尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤7.121mg、7.631mg、6.816mg置于10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得混合对照品储备液。分别精密吸取对照品储备液适量，分别稀释0、5、20、50、100、200倍，即得系列混合对照品溶液。精密吸取系列混合对照品溶液10μl，按上述色谱调价进行分析，记录色谱峰峰面积，以对照品浓度为横坐标(X)，以色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制响应曲线，结果见表16。
表16线性关系考察
4.2.5稳定性考察
取供试品粉末，精密称定，按上述确定的供试品制备方法制备供试品，按上述确定的色谱条件分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h时进行检测，结果见表17。
结果表明，供试品在24小时内稳定。
表17稳定性考察峰面积(mAU)
4.2.6准确度考察
取已知含量的供试品(批号：SFC001，尿嘧啶0.68％、腺嘌呤0.31％、次黄嘌呤0.65％)约0.25g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的混合对照品，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见
表18。计算公式如下：
结果表明，尿嘧啶回收率平均值为96.08％，腺嘌呤回收率平均值为95.10％，次黄嘌呤回收率平均值为96.61％，本方法准确度良好。
表18准确度测定
实施例5含量测定的验证
5.1药材验证
以15批鼠妇虫药材为供试品，按拟定的方法制备供试品溶液并测定，记录峰面积，计算尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤的含量，结果见表19。
结果表明，鼠妇虫药材尿嘧啶的含量平均值为0.66％，平均值加减30％的限量为0.46％～0.85％；腺嘌呤的含量平均值为0.29％，平均值加减30％的限量为0.20％～0.38％；次黄嘌呤的含量平均值为0.66％，平均值加减30％的限量为0.46％～0.86％。
表19 15批鼠妇虫药材含量测定验证
综上所述，暂定鼠妇虫药材含量范围为每g中含有尿嘧啶不得少于0.46％，腺嘌呤不得少于0.20％，次黄嘌呤不得少于0.46％。
5.2配方颗粒验证
以3批鼠妇虫配方颗粒制剂2108001、2108002、2108003，采用前述的含量测定的构建方法及相同的供试品制备方法对三批鼠妇虫配方颗粒剂进行含量测定，记录峰面积，计算尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤的含量，结果见表20。
结果表明，鼠妇虫配方颗粒尿嘧啶的含量平均值为3.29mg/g，平均值加减30％的限量为2.30～4.28mg/g；腺嘌呤的含量平均值为1.55mg/g，平均值加减30％的限量为1.09～2.02mg/g；次黄嘌呤的含量平均值为2.53mg/g，平均值加减30％的限量为1.77～3.29mg/g。
表20 15批鼠妇虫药材含量测定验证
综上所述，暂定鼠妇虫配方颗粒含量范围为每g中含有尿嘧啶2.30～4.28mg，腺嘌呤1.09～2.02mg，次黄嘌呤1.77～3.29mg。
对比例1
方法1：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq柱，规格为5μm，4.6×250mm；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％甲酸水溶液，柱温30℃，流速为0.5mL/min；检测波长为254nm；进样量为10μL。梯度洗脱条件：
0～10min，A相：2～5％、B相：98～95％；
10～15min，A相：5％～30％、B相：95％～70％；
15～60min，A相：30％～90％、B相：70％～10％。
方法2：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq柱，规格为5μm，4.6×250mm；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％三氟乙酸水溶液，柱温30℃，流速为0.5mL/min；检测波长为254nm；进样量为10μL。梯度洗脱条件：
0～15min，A相：0～5％、B相：100～95％；
15～30min，A相：5％～40％、B相：95％～60％；
30～60min，A相：40％～70％、B相：60％～30％。
方法3：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq柱，规格为5μm，4.6×250mm；流动相A为甲醇，流动相B为0.2％甲酸水溶液，柱温30℃，流速为0.5mL/min；检测波长为254nm；进样量为10μL。梯度洗脱条件：
0～15min，A相：0～3％、B相：100～97％；
15～20min，A相：3％～35％、B相：98％～73％；
20～35min，A相：35％～45％、B相：73％～55％；
35～60min，A相：45％～60％、B相：55％～47％。
色谱结果无论是色谱信息丰富度还是色谱峰分离度都不如本发明，如图7所示，图7为本发明对比例1不同梯度条件结果色谱图。
对比例2不同检测波长下的对比结果：
取供试品1份，精密称定0.5g，置具塞锥形瓶中，加入水25ml，加热回流处理30分钟，放冷，摇匀，过滤，取续滤液，分别在检测波长为210nm，230nm，254nm，270nm，300nm时进行检测，结果如图8所示，图8为本发明对比例2的不同检测波长下的检测色谱图；由下图可以看出，检测波长在210～270nm时，色谱峰信息较多，且均有较好的分离度，最优选择为254nm。
对比例3
按实例1色谱条件，分别考察了甲醇-水、甲醇-0.5％三氟乙酸、甲醇-0.2％甲酸、甲醇-0.2％磷酸、甲醇-0.2％冰乙酸、乙腈-0.2％甲酸对色谱峰分离效果的影响，结果如图9所示，图9为本发明流动相考察结果图：
结果表明，以上流动相比例对供试品均有一定的分离程度，甲醇-水、甲醇-0.5％三氟乙酸，色谱峰信息相对较少，影响准确定量；甲醇-0.2％甲酸、甲醇-0.2％磷酸、甲醇-0.2％冰乙酸、乙腈-0.2％甲酸对色谱峰分离效果较好，故流动相采用甲醇-0.2％甲酸、甲醇-0.2％磷酸、甲醇-0.2％冰乙酸、乙腈-0.2％甲酸均可。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种鼠妇虫HPLC特征图谱构建和含量测定方法，包括：
A )将鼠妇虫原料采用溶剂溶解，加热回流提取，得到待测液；
B）将待测液采用高效液相色谱法测定，得到鼠妇虫HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq；流动相A为甲醇，流动相B为0.2%甲酸水溶液、0.2%磷酸或0.2冰乙酸水溶液，梯度洗脱；
还包括制备参照物溶液：分别取尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤，采用水溶解，得到参照物溶液；
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对鼠妇虫HPLC特征图谱的成分进行定性和定量测定；
所述梯度洗脱具体为：
0～15min，A相：0～2%、B相：100～98%；
15～25min，A相：2%～27%、B相：98%～73%；
25～40min，A相：27%～45%、B相：73%～55%；
40～60min，A相：45%～53%、B相：55%～47%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述参照物溶液的浓度具体为：尿嘧啶3.55~709.25μg/mL、腺嘌呤3.79~758.52μg/mL、次黄嘌呤3.4~681.6μg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq柱，规格为5μm，4.6×250mm；柱温30℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相流速为0.5mL/min；检测波长为254nm；进样量为10μL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对鼠妇虫HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由9个特征峰构成的鼠妇虫HPLC标准特征图谱，其中峰1为尿嘧啶，峰3为腺嘌呤，峰5为次黄嘌呤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述标准特征图谱中，以尿嘧啶为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：1.20-峰2、1.29-峰3、1.57-峰4、2.04-峰5、2.16-峰6、2.55-峰7、2.83-峰8、3.16-峰9。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A）所述溶剂为水；所述加热回流提取的时间为15~45min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A）所述鼠妇虫原料的质量g和溶剂的体积mL的比为（0.1~2.0）：（10~50）；
所述鼠妇虫原料为鼠妇虫药材或鼠妇虫配方颗粒制剂。
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