CN116660408B - 一种元胡止痛口服液指纹图谱构建及其含量测定的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物检测技术领域，公开了一种元胡止痛口服液指纹图谱构建及其含量测定的方法和应用。该方法包括制备元胡止痛口服液供试品溶液和延胡索乙素、紫堇碱对照品溶液；然后进行高效液相色谱分析，再根据色谱图中对照品对应峰的峰面积，计算延胡索乙素、紫堇碱的含量；采用指纹图谱软件处理元胡止痛口服液的色图谱，得到元胡止痛口服液指纹图谱；该方法采用流动相进行梯度洗脱，流动相中A相为乙腈，B相为0.05％‑0.15％冰乙酸。该方法能够同时从定量和定性的角度评价元胡止痛口服液的整体疗效，在不明显增加质量控制成本的基础上，显著提升了元胡止痛口服液的质量控制水平。
Description
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种元胡止痛口服液指纹图谱构建及其含量测定的方法和应用。
背景技术
元胡止痛方是中医临床经典的止痛方剂，由延胡索和白芷二味中药组成。延胡素是活血行气止痛之良药，为本方君药；白芷长于祛风散寒、燥湿止痛，为本方臣药。用于治疗气滞血瘀的胃痛、头痛、胁痛及痛经。目前的元胡止痛方制剂包括：元胡止痛口服液、元胡止痛片、元胡止痛滴丸、元胡止痛胶囊、元胡止痛软胶囊、元胡止痛颗粒。不同剂型的元胡止痛方制剂在功能主治上并无较大差异，且服药方式均为口服，但质量标准却各不相同。
对于中药而言，尤其是复方制剂，任何一种活性成分均不能反映中医用药所体现的整体疗效，这是中药与化学合成药品质量标准的根本区别。因此宏观的综合分析成为必然的发展趋势，也符合中药复杂性和整体性特性。中药指纹图谱已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段之一。中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分和药理学研究为依托，应体现系统性、特征性、重现性三个基本原则。“系统性”是指纹图谱所反映的化学成分应包括中药有效部位所含大部分成分的种类，或指标成分的全部。“特征性”是指指纹图谱中反映的化学成分信息(具体表现为保留时间或位移值)是具有高度选择性的，这些信息的综合结果，将能特征地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的化学条码。“重现性”是指所建立的指纹图谱，在规定的方法与条件下，不同的操作者和不同的实验室应能做出相同的指纹图谱，其误差应在允许的范例内，这样才可以保证指纹图谱的使用具有通用性和实用性，也是作为标准方法所必备的特征之一。
中药色谱指纹图谱的相似度评价是中药质量评价和质量控制研究中的一个重要研究环节。指纹图谱的相似度评价，对中药这一复杂成分体系，从整体上表征其所含化学成分的变化情况起着非常关键的作用，目前人们多通过评价中药指纹图谱之间的相似度来判断中药的质量是否稳定合格。
中药质量标志物(Q-marker)是存在于中药材和中药产品(如中药饮片、中药煎剂、中药提取物、中成药制剂)中固有的或加工制备过程中形成的、与中药的功能属性密切相关的化学物质，作为反映中药安全性和有效性的标示性物质进行质量控制。中药质量标志物具有特有性、有效性、可测性等基本特征，是中药质量控制新概念，中药质量发展新方向。
目前所研究的元胡止痛方的质量控制方法多集中在元胡止痛片、胶囊及滴丸，如元胡止痛胶囊指纹图谱的构建方法，元胡止痛滴丸的指纹图谱分析方法等。但是研究显示，元胡止痛口服液的化学成分与元胡其他剂型不尽相同，相比于片剂、胶囊，口服液中未检测出白芷指标成分欧前胡素、异欧前胡素。由于物质基础差异，胶囊、滴丸等剂型的分析方法并不适用于口服液。此外，虽然已有学者研究了元胡止痛口服液糖类的指纹图谱和多成分定量分析方法，但是糖类并不能反映产品在疼痛临床疗效，基于药效活性成分的多成分定量及定性方法仍有待开发。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种元胡止痛口服液指纹图谱构建及其含量测定的方法和应用。该方法能够分析评价元胡止痛口服液的复杂成分体系，并对元胡止痛口服液中关键活性成分进行定量分析。该方法能够在不明显增加质量控制成本的基础上，显著提升元胡止痛口服液的质量控制水平。
本发明提供了一种元胡止痛口服液指纹图谱构建及其含量测定的方法。
具体地，一种元胡止痛口服液指纹图谱构建及其含量测定的方法，包括以下步骤：
制备元胡止痛口服液供试品溶液；
配制延胡索乙素对照品溶液和紫堇碱对照品溶液；
将所述元胡止痛口服液供试品溶液进行高效液相色谱分析，得到元胡止痛口服液的色图谱；将所述延胡索乙素对照品溶液和所述紫堇碱对照品溶液进行高效液相色谱分析，得到对照品的色谱图；
根据色谱图中对照品对应峰的峰面积，计算延胡索乙素、紫堇碱的含量；
采用指纹图谱软件处理所述元胡止痛口服液的色图谱，得到元胡止痛口服液指纹图谱；
在所述高效液相色谱分析中，采用流动相进行梯度洗脱，所述流动相为：A相为乙腈，B相为0.05％-0.15％冰乙酸。
需要说明的是，在所述B相中，0.05％-0.15％冰乙酸是指体积分数为0.05％-0.15％。
研究发现，B相中冰乙酸体积分数的控制是实现元胡止痛口服液指纹图谱构建的关键，当冰乙酸体积分数小于0.05％，或者冰乙酸体积分数大于0.15％时，虽然可以使胡索乙素、紫堇碱得到基本分离，但是无法使元胡止痛口服液中的其他峰实现良好分离，无法构建指纹图谱。只有在控制B相中冰乙酸体积分数为0.05％-0.15％时，才能同时实现元胡止痛口服液指纹图谱的构建及其关键活性成分含量的测定。
优选地，在所述高效液相色谱分析中，所述流动相为：A相为乙腈，B相为0.08％-0.12％冰乙酸；进一步优选地，在所述高效液相色谱分析中，所述流动相为：A相为乙腈，B相为0.10％冰乙酸。
优选地，所述B相的pH值为4-6.5，采用三乙胺调节pH值。
优选地，所述梯度洗脱的过程为：
0-10min，所述流动相中乙腈的体积百分比由15％-25％升至28％-35％；
10-25min，所述流动相中乙腈的体积百分比由28％-35％升至38％-42％；
25-40min，所述流动相中乙腈的体积百分比由38％-42％升至45％-53％；
40-60min，所述流动相中乙腈的体积百分比由45％-53％升至55％-63％。
进一步优选地，所述梯度洗脱的过程为：
0-10min，所述流动相中乙腈的体积百分比由18％-22％升至28％-32％；
10-25min，所述流动相中乙腈的体积百分比由28％-32％升至38％-42％；
25-40min，所述流动相中乙腈的体积百分比由38％-42％升至48％-52％；
40-60min，所述流动相中乙腈的体积百分比由48％-52％升至58％-62％。
更优选地地，所述梯度洗脱的过程为：
0-10min，所述流动相中乙腈的体积百分比由20％升至30％；
10-25min，所述流动相中乙腈的体积百分比由30％升至40％；
25-40min，所述流动相中乙腈的体积百分比由40％升至50％；
40-60min，所述流动相中乙腈的体积百分比由50％升至60％。
优选地，制备所述元胡止痛口服液供试品溶液的过程为采用甲醇溶解元胡止痛口服液。
进一步优选地，制备所述元胡止痛口服液供试品溶液的过程为：精密量取所述元胡止痛口服液，加入甲醇，超声处理，放置，取上清液，过滤取滤液，即得。
优选地，在所述元胡止痛口服液供试品溶液中，所述元胡止痛口服液的体积分数为10％-30％；进一步优选地，在所述元胡止痛口服液供试品溶液中，所述元胡止痛口服液的体积分数为15％-25％。
优选地，在所述延胡索乙素对照品溶液中，所述延胡索乙素的质量浓度为0.3-1.0mg/mL；进一步优选地，在所述延胡索乙素对照品溶液中，所述延胡索乙素的质量浓度为0.5-0.8mg/mL。
优选地，在所述紫堇碱对照品溶液中，所述紫堇碱的质量浓度为0.3-1.0mg/mL；进一步优选地，在所述紫堇碱对照品溶液中，所述紫堇碱的质量浓度为0.5-0.8mg/mL。
优选地，在所述高效液相色谱分析中，所述色谱柱为Waters Xselect HSS T3(4.6mm×250mm，5μm)。
优选地，在所述高效液相色谱分析中，所述流动相的流速为1mL/min；色谱柱柱温为30℃；检测波长为280nm；进样体积为20μL。
本发明还提供了一种元胡止痛口服液指纹图谱构建及其含量测定的方法的应用。
具体地，将上述元胡止痛口服液指纹图谱构建及其含量测定的方法应用于元胡止痛口服液质量评价中。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供的元胡止痛口服液指纹图谱构建及其含量测定的方法，能够准确定量元胡止痛口服液中关键活性成分延胡索乙素、紫堇碱(质量标志物)，且构建的指纹图谱包含约21个共有峰，能够同时辨识元胡止痛口服液中7个成分。该方法能够同时从定量和定性的角度评价元胡止痛口服液的整体疗效，在不明显增加质量控制成本的基础上，显著提升了元胡止痛口服液的质量控制水平。
附图说明
图1为10批元胡止痛口服液样品的HPLC指纹图谱；
图2为元胡止痛口服液样品和六个标准品混合溶液的色谱图；
图3为海罂粟碱裂解图；
图4为海罂粟碱二级碎片图；
图5为元胡止痛口服液的高效液相色谱图；
图6为延胡索乙素、紫堇碱标准品的高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例
1、指纹图谱研究
1.1实验材料
量筒、烧杯、玻璃棒、容量瓶、1mL一次性无菌注射器、2mL进样瓶、0.22μm微孔滤膜(Pall Corporation)、流动相瓶1L、Waters Xselect HSS T3色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。
1.2药品与试剂
元胡止痛口服液批号分别为22020121、22020221、22020321、22020421、22020521、22020621、20090121、21090121、21090221、21090321，由河南福森药业有限公司提供。延胡索乙素标准品(购自中国食品药品检定研究院，批号：110726-202020)；紫堇碱标准品(购自北京百欧博伟有限公司，批号：21111803)；欧前胡素标品(购自上海源叶生物科技有限公司，批号：D07S10E97290)；原阿片碱标准品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：Y-050-131227)；α-别隐品碱标准品(PureChem Standard，批号：141109)，各对照品纯度均大于98％。
甲醇和乙腈为色谱纯，美国Fisher公司；水为纯净水，屈臣氏集团香港有限公司；冰醋酸为色谱级(天津市大茂化学试剂厂)；三乙胺为分析级(福晨化学试剂有限公司)。
1.3主要仪器
抽滤装置(抽滤瓶、抽滤泵)；Ultimate 3000戴安高效液相色谱仪(包括LPG-3400分析泵，WPS-3000SL自动进样器，TCC-300柱温箱和DAD-3000二极管阵列检测器，ThermoFisher公司)；XS105DU型十万分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；赛多利斯PH计(德国sartorius公司)。
1.4色谱条件
色谱柱：Waters Xselect HSS T3(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈为流动相A，0.1％冰醋酸水溶液(三乙胺调pH至6.16)为流动相B，梯度洗脱(0-10min，20％→30％A；10-25min，30％→40％A；25-40min，40％→50％；40-60min，50％→60％)；流速1mL/min；柱温30℃；检测波长280nm；进样体积20μL。
1.5样品准备
对照品溶液的制备如下所述，分别精密称取延胡索乙素、紫堇碱对照品适量，置5mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为680μg/mL、772μg/mL的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备如下所述，取元胡止痛口服液10mL，置50mL容量瓶中，加甲醇30mL，超声处理(功率300W，频率40kHz)10分钟，取出，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，放置，取上清液，采用0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得。
1.6方法学考察
1.6.1线性关系考察
分别精密吸取1.5项下混合对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置10mL容量瓶，用甲醇分别定容至刻度线，得到不同浓度的混合对照品溶液。按照1.4项下色谱条件测定，以对照品浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得到线性回归方程分别为延胡索乙素Y＝0.1747X+0.0102，R2＝0.9997，表明在34.0-170.0μg/mL范围内延胡索乙素浓度与峰面积线性关系良好；紫堇碱线性回归方程及相关系数为Y＝0.1746X+0.4918，R2＝0.9985，表明在38.6-193.0μg/mL范围内紫堇碱浓度与峰面积线性关系良好。
1.6.2精密度考察
取批号22020121元胡止痛口服液样品，按1.5项下方法制备供试品溶液，在1.4项下色谱条件重复进样6次，记录延胡索乙素、紫堇碱峰面积和保留时间和峰面积，并计算RSD值。结果延胡索乙素、紫堇碱峰面积的RSD分别为0.51％、0.31％，保留时间的RSD分别为0.05％、0.04％，表明仪器精密度良好。
1.6.3稳定性考察
取批号22020121元胡止痛口服液样品，按1.5项下方法制备供试品溶液，在1.4项下色谱条件分别于供试品溶液制备后的0、2、4、8、18、24h进样测定，记录延胡索乙素、紫堇碱峰面积和保留时间，并计算RSD值。结果延胡索乙素、紫堇碱峰面积的RSD分别为0.32％、0.27％，保留时间的RSD分别为0.12％、0.08％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
1.6.4重复性考察
取批号22020121元胡止痛口服液样品，按1.5项下方法平行制备6份供试品溶液，在1.4项下色谱条件进样6次，记录延胡索乙素、紫堇碱峰面积和保留时间，并计算RSD值。结果延胡索乙素、紫堇碱峰面积的RSD分别为0.85％、0.93％，保留时间的RSD分别为0.15％、0.10％，表明此方法重复性良好。
1.6.5回收率考察
分别称取延胡索乙素6.15mg，紫堇碱5.18mg，置于同一500mL容量瓶中，用甲醇溶剂定容，得含有混合标准品的溶液(延胡索乙素浓度12.3μg/mL，紫堇碱10.36μg/mL)。取同一批次元胡止痛口服液(批号22020121)5mL，共6份，分别置于50mL容量瓶中，加入混合对照品溶液定容。
按1.5项下方法处理6份样品溶液，在1.4项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率与RSD。结果表明，延胡索乙素和紫堇碱的平均加样回收率分别为101.0％、96.6％，RSD分别为1.3％、1.8％，表明该方法准确度良好，见表1、表2。
表1延胡索乙素加样回收率测定结果(n＝6)
注：n表示本次实验所用样品量。
表2紫堇碱加样回收率测定结果(n＝6)
注：n表示本次实验所用样品量。
1.7指纹图谱的生成及相似度评价
随机取10批元胡止痛口服液每批次各一支，按照1.5项下方法制备供试品溶液，按照1.4项下色谱条件进样分析，将色谱结果导出为AIA格式，将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)》，得到指纹图谱。选取分离度、峰形均较好的21个峰为共有峰，经校准后，软件即生成“对照指纹图谱R”，如图1所示。
结果分析显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0％。对10批元胡止痛口服液HPLC色谱图与对照指纹图谱进行相似度评价，结果S1-S10号样品与对照指纹图谱的相似度范围为0.825-0.991，见表3。结果表明不同批次口服液样品化学成分含量基本相同，差异较小。
表3 10批元胡止痛口服液样品HPLC指纹图谱相似度评价
1.8指纹图谱色谱峰指认结果
取批号22020121元胡止痛口服液样品，按1.5项下方法制备元胡止痛口服液样品溶液；元胡止痛口服液样品、六个标准品混合溶液分别在1.4项下色谱条件进样，元胡止痛口服液色谱如图2中A所示、六个标准品混合溶液色谱如图2中B所示。在口服液色谱图中标识出10个共有色谱峰，经过进单个标准品溶液，根据各峰保留时间不同，指认出6个色谱峰，分别为峰1为原阿片碱，峰2为α-别隐品碱，峰6为盐酸小檗碱，峰7为去氢紫堇碱，峰9为延胡索乙素，峰10为紫堇碱。经过查阅文献并结合液质紫外图、化合物解析结果，推测峰8为海罂粟碱，裂解规律如图3所示，二级碎片如图4所示。
2、延胡索乙素和紫堇碱含量测定
紫堇属植物延胡索是一种重要的抗菌，抗病毒，抗癌活性的中药。延胡索在促进血液循环，加强生命力，减轻头痛、胸痛、上腹部疼痛、腹痛、背疼、关节痛以及创伤等一系列疼痛上发挥重要作用。延胡索主产浙江，一年生作物，药用部位为块茎。块茎里面包含的叔胺碱和季铵碱是它的主要生物活性成分。
2.1材料
同上元胡止痛口服液指纹图谱研究中1.1实验材料。
2.2方法与结果
随机取10批元胡止痛口服液每批次各一支，按照上文1.5项下方法制备供试品溶液，按照上文1.4项下色谱条件进样分析。将所得图谱与延胡索乙素、紫堇碱对照品保留时间对比，确定10批口服液指纹图谱中化合物延胡索乙素、紫堇碱的峰位置，并记录峰面积。其中元胡止痛口服液的高效液相色谱图如图5所示，延胡索乙素和紫堇碱的高效液相色谱图如图6所示。在图5和图6中，其中标号1为延胡索乙素标准品，标号2为紫堇碱标准品，采用外标法计算各批次样品中两种化合物含量。含量测定结果见表4。
表4元胡止痛口服液中延胡索乙素和紫堇碱的含量测定(mg/mL)
由上可知，本发明提供的元胡止痛口服液指纹图谱构建及其含量测定的方法，构建的指纹图谱包含21个峰为共有峰，共标识出10个共有色谱峰，能够同时辨识元胡止痛口服液中7个成分。且能够准确定量元胡止痛口服液中关键活性成分延胡索乙素、紫堇碱(质量标志物)。
以上所述实施例仅表达了本发明的1种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种元胡止痛口服液指纹图谱构建及其含量测定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用甲醇溶解元胡止痛口服液，制得元胡止痛口服液供试品溶液；
配制延胡索乙素对照品溶液和紫堇碱对照品溶液；
将所述元胡止痛口服液供试品溶液进行高效液相色谱分析，得到元胡止痛口服液的色图谱；将所述延胡索乙素对照品溶液和所述紫堇碱对照品溶液进行高效液相色谱分析，得到对照品的色谱图；
根据色谱图中对照品对应峰的峰面积，计算延胡索乙素、紫堇碱的含量；
采用指纹图谱软件处理所述元胡止痛口服液的色图谱，得到元胡止痛口服液指纹图谱；
在所述高效液相色谱分析中，检测波长为280nm；色谱柱为Waters Xselect HSS T3，采用流动相进行梯度洗脱，所述流动相为：乙腈为流动相A，0.1％冰醋酸水溶液为流动相B，所述流动相B采用三乙胺调pH至6.16；
所述梯度洗脱的过程为：
0-10min，所述流动相中乙腈的体积百分比由20%升至30%；
10-25min，所述流动相中乙腈的体积百分比由30%升至40%；
25-40min，所述流动相中乙腈的体积百分比由40%升至50%；
40-60min，所述流动相中乙腈的体积百分比由50%升至60%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述元胡止痛口服液供试品溶液中，所述元胡止痛口服液的体积分数为10%-30%。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述元胡止痛口服液的体积分数为15%-25%。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在所述延胡索乙素对照品溶液中，所述延胡索乙素的质量浓度为0.3-1.0mg/mL。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在所述紫堇碱对照品溶液中，所述紫堇碱的质量浓度为0.3-1.0mg/mL。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在所述高效液相色谱分析中，所述流动相的流速为1mL/min；色谱柱柱温为30℃；进样体积为20µL。
7.权利要求1-6中任一项所述的元胡止痛口服液指纹图谱构建及其含量测定的方法在元胡止痛口服液质量评价中的应用。
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