CN113189248B - 银花泌炎灵片的hplc指纹图谱构建和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种银花泌炎灵片的HPLC指纹图谱构建和检测方法，属于中成药的指纹图谱分析方法。包括银花泌炎灵片供试品溶液的制备，混和对照品溶液制备，分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，将获得的银花泌炎灵片供试品溶液的指纹图谱导出，生成银花泌炎灵片的对照指纹图谱。本发明所建立的银花泌炎灵片指纹图谱方法简便、具有相似度高、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

Description

银花泌炎灵片的HPLC指纹图谱构建和检测方法

技术领域

本发明涉及一种中成药的指纹图谱分析方法，具体涉及银花泌炎灵片指纹图谱的建立方法，以及由此方法得到的银花泌炎灵片指纹图谱。

背景技术

银花泌炎灵片是由金银花、半枝莲、萹蓄、瞿麦、石韦、川木通、车前子、淡竹叶、桑寄生、灯心草等10味中药炮制而成，本品为薄膜衣片，除去薄膜衣后显深褐色，味微苦、涩。主治益气活血，散结止痛。用于具有清热解毒、利湿通淋之功效。用于治疗急性肾盂肾炎、急性膀胱炎等下焦湿热证，症见：发热恶寒、尿频急、尿道刺痛或尿血、腰痛等。

目前，银花泌炎灵片含量测定有三种方法，测定木犀草素、野黄芩苷、绿原酸的含量；中药指纹图谱是一种综合的,可量化的鉴定手段,它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量,进而对药品质量进行整体描述和评价。因此,建立银花泌炎灵片的指纹图谱以及建立一种银花泌炎灵片的高效液相色谱鉴别方法，对于银花泌炎灵片的质量控制，提高银花泌炎灵片的质量标准以及用药安全等将具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种银花泌炎灵片的HPLC指纹图谱构建和检测方法。

本发明采取的技术方案是，包括下列步骤：

(1)、银花泌炎灵片供试品溶液的制备：

取十三批不同号的银花泌炎灵片，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇溶液，超声提取，滤过后，将滤液蒸干后，取滤渣加入甲醇溶液，超声溶解，定容，得供试品溶液；

(2)、混和对照品溶液制备

精密野黄芩苷对照品、木犀草素对照品、绿原酸对照品、芒果苷对照品、槲皮素对照品混合置于5ml量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，超声至溶解，摇匀，作为混合对照品备用液；

(3)、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

(4)、将步骤(3)中获得的银花泌炎灵片供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择十三批不同批号银花泌炎灵片的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰用平均值计算法，生成银花泌炎灵片的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并根据对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

本发明步骤1中银花泌炎灵片供试品溶液的制备方法为，取十三批不同批号的银花泌炎灵片各3.0g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入30ml80％浓度甲醇溶液,超声提取45min，过滤，将滤液蒸干后，取残渣加入80％浓度甲醇溶液，超声溶解，定容5ml，得供试品溶液。

本发明步骤2中混合对照品溶液的制备，精密称定：野黄芩苷对照品、木犀草素对照品、绿原酸对照品、芒果苷对照品、槲皮素对照品，混合置于5ml量瓶中，加入80％浓度甲醇溶解，并定容至刻度线，超声至溶解，摇匀，作为混合对照品备用液。

本发明步骤3中液相色谱条件：色谱柱为ApolloC18色谱柱，其规格为色谱柱内径为4.6mm，色谱柱长度250mm，色谱柱填料颗粒直径5μm，流动相C为乙腈，流动相A为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，进行梯度洗脱，程序为：0min～18min，流动相为7％C上升至8％C、93％A下降至92％A，18min～30min，8％C上升至12％C、92％A下降至88％A；30min～50min，12％C上升至15％C、88％A下降至85％A；50min～60min，15％C上升至18％C，60min～65min，18％C上升至23％C，85％A下降至77％A，65min～70min，23％C上升至25％C，77％A下降至75％A，70min～90min，25％C上升至30％C，75％A下降至70％A，90min～100min，30％C下降至7％C，70％A上升至93％A，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，柱温：35℃，检测波长：340nm；

本发明指纹图谱中选择27个共有峰作为银花泌炎灵片指纹图谱的特征峰，以这个特征峰的峰面积作为质量评价的变量指标，27个共有峰中绿原酸为4号峰、保留时间19.092为分钟，芒果苷为8号峰、保留时间为30.6274分钟，野黄芩苷为22号峰、保留时间为64.9090分钟，木犀草素为23号峰、保留时间为68.5231，槲皮素为26号峰、保留时间为78.3765。

本发明筛选出了最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速、检测波长、色谱柱、柱温等分析条件，建立了银花泌炎灵片的指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价银花泌炎灵片的质量，为保证临床疗效具有重要意义。

本发明所建立的银花泌炎灵片指纹图谱方法简便、具有相似度高、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

用本发明所提供的方法所建立的银花泌炎灵片指纹图谱，能有效地体现出银花泌炎灵片指纹特征峰的位置及数目,从整体上控制银花泌炎灵片的质量及成分，既可避免因测定个别化学成分而判定银花泌炎灵片质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

附图说明

图1是甲醇-水流动相色谱图；

图2是甲醇-0.05％甲酸水流动相色谱图；

图3是乙腈-水流动相色谱图；

图4是乙腈-0.05％醋酸水流动相色谱图；

图5是乙腈-0.1％甲酸水流动相色谱图；

图6是流速为0.5ml/min色谱图；

图7是流速为0.8ml/min色谱图；

图8是流速为1.0ml/min色谱图；

图9是对照指纹图谱(R)；

图10是混合对照品(S1)和对照指纹图谱(R)；

图11是十三批不同批号银花泌炎灵片HPLC指纹图谱。

具体实施方式

包括下列步骤：

步骤1、银花泌炎灵片供试品溶液的制备：

取十三批不同号的银花泌炎灵片，精密称定，置锥形瓶中，精密加入80％浓度甲醇溶液，超声，提取，滤过后，将滤液蒸干后，取滤渣加入80％浓度甲醇溶液，超声溶解，定容，得供试品溶液；

步骤2、混和对照品溶液制备

精密称定野黄芩苷对照品、木犀草素对照品、绿原酸对照品、芒果苷对照品、槲皮素对照品、混合置于5ml量瓶中，加入80％浓度甲醇溶解，并定容至刻度线，超声至溶解，摇匀，作为混合对照品备用液；

步骤3、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4、将步骤3中获得的银花泌炎灵片供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择十三批不同批号银花泌炎灵片的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰用平均值计算法，生成银花泌炎灵片的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并根据对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

本发明步骤1中银花泌炎灵片供试品溶液的制备方法为，取十三批不同批号的银花泌炎灵片内容物各3.0g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入30ml80％浓度甲醇溶液,超声提取45min，过滤，将滤液蒸干后，取残渣加入80％浓度甲醇溶液，超声溶解，定容5ml，得供试品溶液。

本发明步骤2中混合对照品溶液的制备，精密称定：野黄芩苷对照品0.0018g、木犀草素对照品0.0011g、绿原酸对照品0.0014g、芒果苷对照品0.0012g、槲皮素对照品0.0015g混合置于5ml量瓶中，加入80％浓度甲醇溶解，并定容至刻度线，超声至溶解，摇匀，作为混合对照品备用液。

本发明步骤3中液相色谱条件：色谱柱为ApolloC18色谱柱，其规格为色谱柱内径为4.6mm，色谱柱长度250mm，色谱柱填料颗粒直径5μm，流动相C为乙腈，流动相A为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，进行梯度洗脱，程序为：0min～18min，流动相为7％C上升至8％C、93％A下降至92％A，18min～30min，8％C上升至12％C、92％A下降至88％A；30min～50min，12％C上升至15％C、88％A下降至85％A；50min～60min，15％C上升至18％C，60min～65min，18％C上升至23％C，85％A下降至77％A，65min～70min，23％C上升至25％C，77％A下降至75％A，70min～90min，25％C上升至30％C，75％A下降至70％A，90min～100min，30％C下降至7％C，70％A上升至93％A，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，柱温：35℃，检测波长：340nm；

本发明指纹图谱中选择27个共有峰作为银花泌炎灵片指纹图谱的特征峰，以这些特征峰作为质量评价的变量指标，27个共有峰中绿原酸为4号峰、保留时间19.092为分钟，芒果苷为8号峰、保留时间为30.6274分钟，野黄芩苷为22号峰、保留时间为64.9090分钟，木犀草素为23号峰、保留时间为68.5231，槲皮素为26号峰、保留时间为78.3765。

下面将结合实验例对本发明的实施方案进行详细描述，实验例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1.实验材料与仪器设备：

1.1样品

银花泌炎灵片由吉林华康药业股份有限公司提供，13批药品批号依次为2000603、200612、200625、200628、200629、200702、200704、200708、200709、200722、200712、200713、200715

1.2试剂与标准品

乙腈、甲醇(色谱级，美国Fisher试剂公司)；水为纯净水(娃哈哈)；其他试剂均为分析纯。

野黄芩苷(202010)、木犀草素(202006)、绿原酸(201907)、芒果苷(201704)、槲皮素(201610)购买自中国食品药品检定研究院(中国，北京)

1.3仪器设备

岛津LC2030型HPLC、紫外检测器(AmericanWaters公司)；METTLERTOLEDOXS105DU型十万分之一电子分析天平(瑞士mettlertoledo公司)；HH-6恒温水浴锅(常州市江南实验仪器制造厂)；KQ-600DE型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

实验例、一种银花泌炎灵片的HPLC指纹图谱检测方法，包括下列步骤：

步骤1、银花泌炎灵片供试品溶液制备方法为，取十三批不同批号的银花泌炎灵片内容物各3.0g，精密称定,置锥形瓶中,精密加入30ml80％浓度甲醇溶液,超声提取45min，过滤，将滤液蒸干后，取残渣加入80％浓度甲醇溶液,超声溶解,定容5ml，得供试品溶液。

步骤2、野黄芩苷对照品0.0018g、木犀草素对照品0.0011g、绿原酸对照品0.0014g、芒果苷对照品0.0012g、槲皮素对照品0.0015g混合置于5ml量瓶中，加入80％浓度甲醇溶解，并定容至刻度线，超声至溶解，摇匀，作为混合对照品备用液。

步骤3、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液,注入高效液相色谱仪,记录色谱图，液相色谱条件：色谱柱为色谱柱为ApolloC18色谱柱，其规格为色谱柱内径为4.6mm，色谱柱长度250mm，色谱柱填料颗粒直径5μm，流动相C为乙腈，流动相A为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，进行梯度洗脱，程序为：0min～18min，流动相为7％C上升至8％C、93％A下降至92％A，18min～30min，8％C上升至12％C、92％A下降至88％A；30min～50min，12％C上升至15％C、88％A下降至85％A；50min～60min，15％C上升至18％C，60min～65min，18％C上升至23％C，85％A下降至77％A，65min～70min，23％C上升至25％C，77％A下降至75％A，70min～90min，25％C上升至30％C，75％A下降至70％A，90min～100min，30％C下降至7％C，70％A上升至93％A，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，柱温：35℃，检测波长：340nm；

运用国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”分别对步骤3得到的13批药品色谱图进行指纹图谱分析,采用多点校正后进行自动匹配(时间窗为0.15)，提取吸收信号较强、峰形明显、稳定性较好的27个共有色谱峰生成对照图谱R,以4号峰绿原酸为S峰，保留时间和峰面积为1,计算其他各特征峰的相对保留时间和相对峰面积值,结果见表2和表3。将27个共有色谱峰生成对照图谱R，见图9。与对照品溶液图谱对照可知：绿原酸为4号峰、芒果苷为8号峰、野黄芩苷为22号峰、木犀草素为23号峰、槲皮素为26号峰，见图10。13批银花泌炎灵片HPLC叠加指纹图谱见图11。将13批银花泌炎灵片样品所得指纹图谱分别导入相似度价系统计算各个批次指纹图谱与生成的对照图谱的相似性系数,结果显示,10批银花泌炎灵片样品与生成的对照图谱的相似度分别为：0.947，0.949，0.947，0.949，0.949，0.969，0.951，0.958，0.951，0.951，0.962，0.936，0.964见表1。

表1指纹图谱相似度评价

表2共有指纹峰相对保留时间

表3共有指纹峰相对峰面积

2.供试品制备方法考察

2.1供试品制备

本实验采用50％、70％和100％甲醇分别对3g银花泌炎灵片内容物进行超声波提取30min，经考察，100％甲醇提取物液相色谱图基线平稳，响应值较高；以80％浓度甲醇为提取溶剂，考察了超生波提取30min、45min、60min，观察其色谱峰的数目及其响应值，结果其45min和60min色谱峰数目及响应值基本一致，表明45min超声波提取基本完全。

2.2波长的选择

将供试品溶液进行190-400nm紫外-可见光全波长扫描发现在320nm和340nm处下各色谱峰的数目及丰度较好,经考察，当检测波长为320nm时，色谱峰基线不平稳，峰形差，检测波长为340nm时，基线平稳，分离度较好，适合指纹图谱研究,故本研究选择340nm为检测波长。

2.3流动相的考察

(1)以甲醇为流动相A-水溶液为流动相B,梯度洗脱:0min～90min，10％A上升至100％A，90％B下降至0％B；90min～100min,100％A，0％B。(2)甲醇为流动相A-0.05％甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱:0min～40min，10％A上升至30％A，90％B下降至70％B；40min～90min,30％A上升至68％，70％B下降至32％B，90min～95min,68％A上升至85％A，32％B下降至15％B，95min～100min,85％A上升至100％A,10％B下降至0％。(3)乙睛为流动相A-水溶液为流动相B,梯度洗脱：梯度洗脱:0min～20min，10％A，90％B；20min～50min,10％A上升至20％，90％B下降至80％B，50min～70min,20％A上升至30％A，80％B下降至70％B，70min～100min,30％A，70％B。(4)乙睛为流动相A-0.25％醋酸水溶液为流动相B,梯度洗脱：梯度洗脱:0min～20min，2％A，98％B；20min～30min,2％A上升至5％，98％B下降至95％B，30min～45min,5％A上升至10％A，95％B下降至90％B，45min～75min,10％A上升至20％，90％B下降至80％B，75min～95min,20％A上升至30％A，80％B下降至70％B，95min～100min，30％A，70％B。(5)：0min～18min，流动相为7％C上升至8％C、93％A下降至92％A，18min～30min，8％C上升至12％C、92％A下降至88％A；30min～50min，12％C上升至15％C、88％A下降至85％A；50min～60min，15％C上升至18％C，60min～65min，18％C上升至23％C，85％A下降至77％A，65min～70min，23％C上升至25％C，77％A下降至75％A，70min～90min，25％C上升至30％C，75％A下降至70％A，90min～100min，30％C下降至7％C，70％A上升至93％A；上述百分含量均为体积百分比,其它色谱条件相同。结果见图1、图2、图3、图4、图5。

从上述结果可见,采用(5)流动相系统谱图上各主要色谱峰分离度好,保留时间适中,且能保证所有成分色谱峰在分钟内全部出完,因此确定(5)为本法流动相。

2.4流速的选择

在其他色谱条件一致的情况下，对流速条件进行了考察，分别设定流动相流速为0.5ml/min、0.8ml/min及1ml/min时，经考察，流速为1ml/min时，色谱图整体分离效果较好，适合指纹图谱研究，见图6、图7、图8。

2.5进样量的考察

分别取同一供试品溶液5μl、10μl及20μl进样，记录其色谱图，经比较5μl及10μl进样量，其色谱峰响应值较低，10μl进样量响应值较好，故选择10μl进样量。

2.6柱温的考察

在其他色谱条件一致的情况下，对其柱温进行考察，分别设定柱温30℃、35℃、40℃对其色谱图进行分析，结果表明，柱温30℃时，色谱峰基线平稳、分离度较好、响应值较好，适合指纹图谱研究。

3.方法学考察

3.1精密度试验

取同一供试品溶液(批号160501)，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图。以重现性和分离度都较好的4号峰绿原酸峰为参照峰S，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各特征峰相对保留时间RSD为0.17％～0.96％，相对峰面积RSD为0.51％～7.11％，表明方法精密度良好。数据见表4和5。

表4指纹图谱精密度相对保留时间数据(批号：200625)

表5指纹图谱精密度相对峰面积数据(批号：200625)

3.2重现性试验

精密称取同一供试品溶液(批号200625)5份，按“2.2”项下平行制备5份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，进样，记录色谱图。以重现性和分离度都较好的4号峰绿原酸峰为参照峰S，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果显示，各特征峰相对保留时间RSD为0.07％～0.90％，相对峰面积RSD为0.32％～8.3％，表明方法重复性良好。数据见表6和表7。

表6指纹图谱重复性相对保留时间数据(批号：200625)

表7指纹图谱重复性相对峰面积数据(批号：200625)

3.3稳定性试验

精密称取同一供试品溶液(批号200625)，按“2.1”项下色谱条件，分别于0h，2h，4h，8h，12h、24h进样，记录色谱图。以重现性和分离度都较好的4号峰绿原酸峰为参照峰S，计算各主要色谱峰相对峰面积和相对保留时间结果显示，各特征峰相对保留时间RSD为0.34％～2.03％，相对峰面积RSD为0.05％～2.46％，表明方法在24h内稳定性良好。数据见表8和9。

表8指纹图谱稳定性相对保留时间数据(批号：200625)

表9指纹图谱稳定性相对峰面积数据(批号：200625)

以上实验结果表明,本发明提供的银花泌炎灵片指纹图谱检测方法,稳定性好,精密度高,重复性好,能全面客观评价银花泌炎灵片的质量,为保证临床疗效具有重要的意义。以上实施例仅为本发明的示例性实施例,不用于限制本发明,本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内,对本发明做出各种修改或等同替换,这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种银花泌炎灵片的HPLC指纹图谱构建和检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）、银花泌炎灵片供试品溶液的制备：

取十三批不同号的银花泌炎灵片，精密称定，置锥形瓶中，精密加入80%浓度甲醇溶液，超声提取，滤过后，将滤液蒸干后，取滤渣加入80%浓度甲醇溶液，超声溶解，定容，得供试品溶液；

（2）、混合 对照品溶液制备

精密称定：野黄芩苷对照品、木犀草素对照品、绿原酸对照品、芒果苷对照品、槲皮素对照品，混合置于5ml量瓶中，加入80%浓度甲醇溶解，并定容至刻度线，超声至溶解，摇匀，作为混合对照品备用液；

（3）、分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；其中液相色谱条件：色谱柱为ApolloC18色谱柱，其规格为色谱柱内径为4.6mm，色谱柱长度250mm，色谱柱填料颗粒直径5μm，流动相C为乙腈，流动相A为体积分数为0.1%的甲酸水溶液，进行梯度洗脱，程序为：0min～18min，流动相为7%C上升至8%C、93%A下降至92%A，18min～30min，8%C上升至12%C、92%A下降至88%A；30min～50min，12%C上升至15%C、88%A下降至85%A；50min～60min，15%C上升至18%C，60min～65min，18%C上升至23%C，85%A下降至77%A，65min～70min，23%C上升至25%C，77%A下降至75%A，70min～90min，25%C上升至30%C，75%A下降至70%A，90min～100min，30%C下降至7%C，70%A上升至93%A，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，柱温：35℃，检测波长：340nm；

（4）、将步骤（3）中获得的银花泌炎灵片供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择十三批不同批号银花泌炎灵片的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰用平均值计算法，生成银花泌炎灵片的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，并根据对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

2.根据权利要求1所述的一种银花泌炎灵片的HPLC指纹图谱构建和检测方法，其特征在于：步骤（1）中银花泌炎灵片供试品溶液的制备方法为，取十三批不同批号的银花泌炎灵片各3.0g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入30ml80%浓度甲醇溶液,超声提取45min，过滤，将滤液蒸干后，取残渣加入80%浓度甲醇溶液，超声溶解，定容5ml，得供试品溶液。

3.根据权利要求1所述的一种银花泌炎灵片的HPLC指纹图谱构建和检测方法，其特征在于：指纹图谱中选择27个共有峰作为银花泌炎灵片指纹图谱的特征峰，以这个特征峰的峰面积作为质量评价的变量指标，27个共有峰中绿原酸为4号峰、保留时间19.092为分钟，芒果苷为8号峰、保留时间为30.6274分钟，野黄芩苷为22号峰、保留时间为64.9090分钟，木犀草素为23号峰、保留时间为68.5231分钟，槲皮素为26号峰、保留时间为78.3765分钟。

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