CN110927291A - 一种鸡骨草提取物特征图谱的检测方法 - Google Patents

一种鸡骨草提取物特征图谱的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡骨草提取物特征图谱的检测方法，属于中药检测技术领域，包括以下步骤：（1）、供试品溶液的制备；（2）、参照物溶液的制备；（3）、色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为190—600nm；柱温：15°—35°；流速：0.8—1.2mL/min；进样量：10μL；（4）、测试：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到鸡骨草提取物的HPLC特征图谱。本发明具有通用性和专属性，灵敏度高，操作方便，分析时间适中，为鸡骨草提取物质量控制提供了有效保障。

Description

一种鸡骨草提取物特征图谱的检测方法
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种鸡骨草提取物特征图谱的检测方法。
背景技术
中药鸡骨草最早出自《岭南采药录》，自1977年以来各版《中华人民共和国药典》均有收载，2015版《中华人民共和国药典》规定鸡骨草来源为豆科植物广州相思子在我国鸡骨草主要分布在广东、广西等地，并为两广的道地药材。鸡骨草中含有多种化学成分，其中三萜、黄酮、生物碱类物质是鸡骨草的主要有效活性成分。鸡骨草具有保肝护肝、降脂、抗菌和抗病毒、抗氧化、抗炎、免疫调节等作用，并在临床应用中有很好的疗效。因此，研究鸡骨草中的化学成分，有利于进一步开发和利用鸡骨草。
现有方法只能控制药材，不能控制提取物等，在2015年版《中国药典》中对鸡骨草的质量控制仅有显微鉴别、薄层鉴别及浸出物3种方式，无含量测定及指纹测定，对鸡骨草的质量不能进行有效的控制。查阅大量文献发现，现有的研究，只有含量测定，即单一成分的检测，控制不全面，不能整体体现，对药效物质基础的研究还远远不够，这大大影响了鸡骨草的进一步开发利用。
发明内容
为解决前述问题，本发明提供了一种鸡骨草提取物特征图谱的检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种鸡骨草提取物特征图谱的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）、供试品溶液的制备：取鸡骨草提取物，用体积比为(100～50) mL∶(0～50) mL甲醇/水混合溶液溶解，超声提取20—40min，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含8—12mg的溶液备用；
（2）、参照物溶液的制备：取夏佛塔苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.3 mg的溶液；
（3）、色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm，内径为4.6 mm，硅胶粒径为5 μm；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为190—600nm；柱温：15°—35°；流速：0.8—1.2mL/min；
（4）、测试：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到鸡骨草提取物的HPLC特征图谱。
优选的，步骤（1）所述供试品溶液的制备步骤如下：取鸡骨草提取物，用50％甲醇/水混合溶液溶解，超声提取30min，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含10mg的溶液。
优选的，步骤（2）所述参照物溶液的制备步骤如下：取夏佛塔苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.3mg的溶液。
优选的，所述色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm，内径为4.6 mm，硅胶粒径为5 μm；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为300nm；柱温：30°；流速：1.0mL/min。
优选的，所述梯度洗脱的过程为：0～45min，流动相A为24～28％，流动相B为76～72％；45～65min，流动相A为28～40％，流动相B为72～60％；65～70min，流动相A为40％，流动相B为60％。
优选的，在鸡骨草提取物特征图谱中，以夏佛塔苷为参照峰，各特征峰的相对保留时间如下：峰1：0.567、峰2：0.876、峰3：1、峰4：1.421、峰5：1.474；其中，峰1、峰2及峰4的相对保留时间在上述值的±5％之内，峰5的相对保留时间在上述值的±10％之内。
本技术方案的有益效果如下：
本发明还提供了一种鸡骨草提取物的鉴定方法，将根据上述检测方法得到的待测样品特征图谱与根据上述检测方法得到的标准特征图谱进行比较。本发明提供的鸡骨草提取物特征图谱的检测方法，通过以甲醇-0.1％甲酸/水混合溶液为流动相，采用梯度洗脱并结合紫外检测器检测的液相色谱分析得到鸡骨草提取物特征图谱的检测方法，在本发明特定的检测条件下，得到的鸡骨草提取物色谱峰分布均匀，夏佛塔苷对参照峰与相邻峰分离度良好，色谱峰信息完整。本发明的检测方法操作简单、稳定可靠、精密度高、专属性强、分离度好。将待测样品根据本发明方法得到的特征图谱与标准特征图谱进行比较，只要待测样品的特征图谱中出现本发明所指定的特征图谱，即可确认待测样品为鸡骨草提取物，确保了成药的质量。将鸡骨草药材（饮片）按照本发明方法处理后，检测得到的特征图谱与对应鸡骨草提取物特征图谱进行比较，可以对鸡骨草提取工艺进行监控。本发明具有较好的通用性和专属性，灵敏度高，操作方便，分析时间适中，为鸡骨草提取物质量控制提供了有效保障，保证了用药安全，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为溶剂考察对比图；
图2为鸡骨草237-3-8浸膏粉色谱信息图谱；
图3为波长确立图谱；
图4为15批鸡骨草提取物（浸膏粉）特征图谱对比图；
图5为鸡骨草提取物拟合对照（峰3：夏佛塔苷）；
图6为表1；
图7为表2；
图8为237-1-1四相关的色谱图集合；
图9为237-3-8四相关的色谱图集合；
图10为237-5-10四相关的色谱图集合；
图11为专属性考察试验色谱记录图；
图12为表3；
图13为表4；
图14为表5；
图15为表6；
图16为表7；
图17为表8；
图18为表9；
图19为鸡骨草特征耐用性考察试验色谱记录图。
具体实施方式
下面通过几个具体的实施例来进一步说明实现本发明目的技术方案，需要说明的是，本发明要求保护的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
供试品溶液提取考察：取鸡骨草浸膏粉粉末0.5 g，精密称定2份，置于不同的具塞锥形瓶中，分别精密加入50%的甲醇/水混合溶液20 ml和甲醇20ml，密塞，称定重量；超声处理30分钟（功率900W，频率60kHz），放至室温，再称定重量，分别用50%的甲醇/水混合溶液和甲醇补足减少的重量；摇匀，滤过，取续滤液，备用。
色谱条件为：检测波长300 nm； Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（4.6mm × 250 mm × 5 μm）；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱如下：0～45min，流动相A为24～28％，流动相B为76～72％；45～65min，流动相A为28～40％，流动相B为72～60％；65～70min，流动相A为40％，流动相B为60％。
采用超声处理的提取方式，分别以50%的甲醇/水混合溶液和甲醇作为提取溶剂，对样品浸膏粉的前处理方法进行考察，结果见图1。从图1可以看出，50%甲醇与甲醇作溶剂特征峰无明显差异，但50%甲醇/水混合溶液作溶剂时，样品溶剂峰较甲醇小，故选择50%甲醇/水混合溶液作为浸膏粉的提取溶媒。
实施例2
检测波长的考察：调取参考文献（侯小涛，周江煜，周兰萍，等.高效液相色谱法同时测定鸡骨草肝炎颗粒中原儿茶酸、原儿茶醛及没食子酸的含量[J].中国医院药学杂志，2011,31（02）：168-170）波长275 nm波长下供试品色谱图和3D图，结果如图2所示。结果表明，供试品色谱峰主要集中在50 min前，色谱峰分离度较差，需对波长做进一步筛选并优化色谱条件。
色谱条件: 检测波长190-600 nm；Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm × 5 μm）；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱如下： 0～45min，流动相A为24～28％，流动相B为76～72％；45～65min，流动相A为28～40％，流动相B为72～60％；65～70min，流动相A为40％，流动相B为60％。
鸡骨草237-3-8浸膏粉溶液的制备条件: 取鸡骨草提取物，用50％甲醇/水混合溶液溶解，超声提取30min，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含10mg的溶液。
如图3所示，调取鸡骨草237-3-8浸膏粉的保留时间-响应值-波长3D图分析，结果表明，300 nm波长处，供试品的色谱峰个数最多、各峰与参比峰的相对峰高较为合适，各峰之间的分离度较好，且夏佛塔苷能被检出，故选择300 nm作为鸡骨草特征图谱的检测波长。
实施例3
提取时间确定：取鸡骨草提取物，用50％甲醇/水混合溶液溶解，分别超声处理20分钟、30分钟和40分钟，放冷至室温，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含10mg的溶液。
色谱条件: 检测波长300nm；Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm × 5 μm）；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱如下：0～45min，流动相A为24～28％，流动相B为76～72％；45～65min，流动相A为28～40％，流动相B为72～60％；65～70min，流动相A为40％，流动相B为60％。
按照上述提取方式分别制备平行样样品，进样10μl，同一条件测定。结果表明，超声30 min制得的样品呈现出的指纹图谱中各峰分离度良好，特征峰无干扰，故确定提取时间为30min。
实施例4
柱温、流速确定：取鸡骨草提取物，用50％甲醇/水混合溶液溶解，分别超声处理30分钟，放冷至室温，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含10mg的溶液。
色谱条件: 检测波长300nm；Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm × 5 μm）；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱如下： 0～45min，流动相A为24～28％，流动相B为76～72％；45～65min，流动相A为28～40％，流动相B为72～60％；65～70min，流动相A为40％，流动相B为60％。
按照上述提取方式分别制备平行样样品，进样10μl，在不同的柱温（15℃、30℃、35℃）、流速（0.8ml/min、1.0 ml/min 、1.2 ml/min）进行测定。结果表明，在柱温30℃、流速1.0 ml/min条件下制得的样品呈现出的指纹图谱中各峰分离度良好，特征峰无干扰，故确定柱温为30℃、流速1.0 ml/min。
实施例5
鸡骨草提取物特征图谱的检测：取夏佛塔苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.3mg的溶液；取鸡骨草提取物，用50％甲醇/水混合溶液溶解，分别超声处理30分钟，放冷至室温，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含10mg的溶液。
色谱条件: 检测波长300nm；Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm × 5 μm）；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱如下：0～45min，流动相A为24～28％，流动相B为76～72％；45～65min，流动相A为28～40％，流动相B为72～60％；65～70min，流动相A为40％，流动相B为60％。
制备15批鸡骨草提取物的供试品溶液，分别进样检测，结果如图4所示。
实施例6
鸡骨草提取物特征图谱的建立：将15鸡骨草提取物色谱图结果导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（国家药典委员会2012.130723版本）》进行分析：时间窗宽度设置为0.1，对照图谱生成方法为各图谱的中位数，采用多点校正及全峰匹配，结果见图5。
实施例7
鸡骨草药材与对应提取物特征图谱比较：取三批具有编号相关的饮片、标准汤剂、浸膏粉、提取物，用50％甲醇/水混合溶液溶解，分别超声处理20分钟、30分钟和40分钟，放冷至室温，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含10mg的溶液。
色谱条件: 检测波长300nm；Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm × 5 μm）；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱如下：
0～45min，流动相A为24～28％，流动相B为76～72％；45～65min，流动相A为28～40％，流动相B为72～60％；65～70min，流动相A为40％，流动相B为60％。
取三批具有编号相关的饮片、标准汤剂、浸膏粉、提取物的特征图谱进行相关性分析，并计算5个特征峰的相对保留时间及相对峰面积，详见表1、表2、图9、图10和图11。
从表1可看出，标记的5个特征峰在各样品中的相对保留时间结果RSD%小于3%，表明在鸡骨草不同样品中，各峰均能稳定呈现。表2中各个特征峰的相对峰面积差异较为明显，说明不同来源、水煎煮工艺及生产工艺等因素对鸡骨草中的化学成分间的配比影响较大。从图9、10和11可看出，从饮片至提取物5个特征峰均能得到呈现。相关性对比图可明显看出，编号为237-1-1和237-3-8的样品间呈现的相关性良好。
以下通过试验例的方式进一步说明本发明的有益效果：
试验例：鸡骨草提取物特征图谱检测分析方法验证
1、专属性试验
取鸡骨草提取物及相应辅料（根据提取物成品处方比例），用50％甲醇/水混合溶液溶解，分别超声处理20分钟、30分钟和40分钟，放冷至室温，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含10mg的溶液，并与空白溶剂、相应对照分别进样检测。
如图12所示，结果表明阴性样品及空白溶剂在色谱条件: 检测波长300nm；Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm × 5 μm）；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱如下：0～45min，流动相A为24～28％，流动相B为76～72％；45～65min，流动相A为28～40％，流动相B为72～60％；65～70min，流动相A为40％，流动相B为60％；检测未出峰，说明鸡骨草特征方法专属性良好。
2、精密度试验
取鸡骨草提取物，用50％甲醇/水混合溶液溶解，分别超声处理20分钟、30分钟和40分钟，放冷至室温，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含10mg的溶液。
在色谱条件: 检测波长300nm；Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（4.6mm × 250 mm × 5 μm）；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱如下：0～45min，流动相A为24～28％，流动相B为76～72％；45～65min，流动相A为28～40％，流动相B为72～60％；65～70min，流动相A为40％，流动相B为60％；进样检测。连续进样5次，每次10 μl，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，所得特征峰的相对保留时间的RSD均小于3.0%，相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明该仪器精密度良好。详情见表3、4。
3、重复性试验
取鸡骨草提取物，用50％甲醇/水混合溶液溶解，分别超声处理20分钟、30分钟和40分钟，放冷至室温，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含10mg的溶液，制备9份供试品溶液，在色谱条件: 检测波长300nm；Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（4.6 mm ×250 mm × 5 μm）；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱如下：0～45min，流动相A为24～28％，流动相B为76～72％；45～65min，流动相A为28～40％，流动相B为72～60％；65～70min，流动相A为40％，流动相B为60％，分别进样检测。进样量为10 μl，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，所得特征峰的相对保留时间的RSD均小于3.0%，相对峰面积的RSD均小于5.0%，结果表明该方法重复性良好。详情见表5、6。
4、溶液稳定性试验
取鸡骨草提取物用50％甲醇/水混合溶液溶解，分别超声处理20分钟、30分钟和40分钟，放冷至室温，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含10mg的溶液。
色谱条件: 检测波长300nm；Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm × 5 μm）；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱如下：0～45min，流动相A为24～28％，流动相B为76～72％；45～65min，流动相A为28～40％，流动相B为72～60％；65～70min，流动相A为40％，流动相B为60％，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h进样检测，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，所得特征峰的相对保留时间的RSD均小于3.0%，相对峰面积的RSD均小于5.0%，结果表明供试品溶液稳定性良好。详情见表7、8。
5、耐用性试验
按确定的方法，取同一批鸡骨草提取物供试品溶液用50％甲醇/水混合溶液溶解，分别超声处理20分钟、30分钟和40分钟，放冷至室温，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含10mg的溶液。
色谱条件: 检测波长300nm；Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm × 5 μm）；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱如下：
0～45min，流动相A为24～28％，流动相B为76～72％；45～65min，流动相A为28～40％，流动相B为72～60％；65～70min，流动相A为40％，流动相B为60％，考察特征方法在不同品牌仪器(2台)相同品牌的同一色谱柱、同一品牌仪器不同品牌色谱住(3根)的耐用性，记录70分钟色谱图，结果如图19所示。
由图19可知，供试品在不同仪器、色谱柱上的色谱图轮廓基本一致，5个特征峰均有呈现且容易指认。
计算各特征峰与S峰的相对保留时间，结果如表9所示。所得1、2、3号特征峰的相对保留时间均在平均值的±5%以内，其余峰的相对保留时间均在其平均值的±10%以内，表明鸡骨草特征方法耐用性良好。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种鸡骨草提取物特征图谱的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）、供试品溶液的制备：取鸡骨草提取物，用体积比为(100～50) mL∶(0～50) mL甲醇/水混合溶液溶解，超声提取20—40min，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含8—12mg的溶液备用；
（2）、参照物溶液的制备：取夏佛塔苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.3mg的溶液；
（3）、色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为190—600nm；柱温：15°—35°；流速：0.8—1.2mL/min；
（4）、测试：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到鸡骨草提取物的HPLC特征图谱。
2.根据权利要求1所述的一种鸡骨草提取物特征图谱的检测方法，其特征在于：步骤（1）所述供试品溶液的制备步骤如下：取鸡骨草提取物，用50％甲醇/水混合溶液溶解，超声提取30min，冷却，过0.45μm滤膜，取滤液，制成每1mL含10mg的溶液。
3.根据权利要求1所述的一种鸡骨草提取物特征图谱的检测方法，其特征在于：步骤（2）所述参照物溶液的制备步骤如下：取夏佛塔苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.3mg的溶液。
4.根据权利要求1所述的一种鸡骨草提取物特征图谱的检测方法，其特征在于：所述色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为300nm；柱温：30°；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。
5.根据权利要求1所述的一种鸡骨草提取物特征图谱的检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱的过程为：0～45min，流动相A为24～28％，流动相B为76～72％；45～65min，流动相A为28～40％，流动相B为72～60％；65～70min，流动相A为40％，流动相B为60％。
6.根据权利要求1所述的一种鸡骨草提取物特征图谱的检测方法，其特征在于：在鸡骨草提取物特征图谱中，以夏佛塔苷为参照峰，各特征峰的相对保留时间如下：峰1：0.567、峰2：0.876、峰3：1、峰4：1.421、峰5：1.474；其中，峰1、峰2及峰4的相对保留时间在上述值的±5％之内，峰5的相对保留时间在上述值的±10％之内。
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