CN110579547B - 一种威灵仙药材hplc指纹图谱的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种威灵仙药材HPLC指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：对照品溶液的制备；供试品溶液的制备；以异阿魏酸为参照峰的标准指纹图谱的制定；指纹图谱的质量控制；将待检测的威灵仙药材指纹图谱与上述标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别所具有的共同指纹峰的数量，确定相似度。本发明建立了威灵仙药材指纹图谱的方法，通过该方法可获得威灵仙药材的标准指纹图谱，比较指纹图谱中共有峰的有无，能有效地监控威灵仙药材的质量，完善了威灵仙药材的质量评价体系，避免与混淆品混用，为威灵仙药材质量的全面、有效控制提供了理论和实践基础。
Description
技术领域
本发明涉及药材指纹图谱技术领域，尤其涉及一种威灵仙药材HPLC指纹图谱的检测方法。
背景技术
威灵仙为毛莨科植物威灵仙(Clematis chinensis Osbeck.)、棉团铁线莲(Clematis hexapetala Pall.)、东北铁线莲(Clematis manshurica Rupr.)的干燥根及根茎，临床用于治疗风湿痹痛，肢体麻木，筋脉拘挛，屈伸不利等症状。威灵仙中化学成分复杂，主要包括皂苷、黄酮、香豆素、生物碱等，其中齐墩果酸型皂苷类化合物被认为是威灵仙的重要活性成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎镇痛等作用。目前2015版《中国药典》以水解后的齐墩果酸作为鉴别和含量测定指标的唯一依据，但该方法存在样品前处理方法繁琐，且齐墩果酸为常见的中药成分等不足之处，因此，方法专属性有待提高。考虑到中药里的成分繁多，且各个成分间容易相互影响，仅以一个有效成分的含量难以全面评价中药的真实质量。
目前对于威灵仙的指纹图谱已有的研究中，以液相色谱对威灵仙醇提部分建立指纹图谱，但是未对色谱图中共有峰进行标定，导致该方法的专属性不好。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种有效监控威灵仙药材的质量，完善了威灵仙药材的质量评价体系的威灵仙药材HPLC指纹图谱的检测方法。
技术方案：本发明所述的威灵仙药材HPLC指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：称取有机酸对照品，加甲醇溶解并定容摇匀；
(2)供试品溶液的制备：称取多批次威灵仙药材粉末，分别加纯水，超声提取，过滤，离心后上清液定容，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得各批次供试品溶液；
(3)标准指纹图谱的制定：提取对照品溶液及各批次的供试品溶液，进行HPLC检测，记录色谱图，依据所得的各批次批威灵仙药材的指纹图谱，制定标准指纹图谱，确定该标准指纹图谱中的指纹峰，选定参照峰；
(4)指纹图谱的质量控制：将待检测的威灵仙药材指纹图谱与上述标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别所具有的共同指纹峰的数量，确定相似度。
其中，所述步骤(1)中有机酸对照品包括：新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异阿魏酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C中的一种或多种混合。
进一步的，所述步骤(2)中威灵仙药材选择不同地区获取的多个批次药材，实际操作时选取的威灵仙药材批次越多，越分散，最后测得的指纹图谱越具备代表性。
进一步的，所述步骤(2)制备时每批次威灵仙药材粉末质量为2.5～5.0g，纯水体积为20～50ml，超声提取时间为10～60min，离心后上清液定容250ml，微孔滤膜的规格为0.22μm。
进一步的，所述步骤(3)中，所选的参照峰为异阿魏酸、绿原酸等有机酸里面的一种，HPLC检测时色谱条件：色谱柱为Venusil XBP C18柱；柱温为24～36℃；检测波长为280nm-330nm；流动相A为乙腈或甲醇，流动相B为0.1～0.5％醋酸水或甲酸水溶液，总流速为0.6～1.2ml/min；分析时间70分钟。采用梯度洗脱，具体为0～5min：5％流动相A，其余为流动相B；5～25min：5％～18％流动相A，其余为流动相B；25～30min：18％流动相A，其余为流动相B；30～45min：18％～27％流动相A，其余为流动相B；45～48min：27％流动相A，其余为流动相B；48-70min：90％流动相A，其余为流动相B。
进一步的，所述流动相A为乙腈，流动相B为0.5％醋酸水溶液；所述总流速为1ml/min；所述检测波长为280nm。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点为：首先，本发明建立了威灵仙药材指纹图谱的方法，通过该方法可获得威灵仙药材的标准指纹图谱，比较指纹图谱中共有峰的有无，能有效地监控威灵仙药材的质量，完善了威灵仙药材的质量评价体系，避免与混淆品混用，为威灵仙药材质量的全面、有效控制提供了理论和实践基础；其次，本发明威灵仙药材指纹图谱检测方法对样品的前处理方法简单，特征性强，溶液稳定，再而，本发明中的高效液相色谱方法精密度较高、重现性良好，具有良好的专属性。
附图说明
图1为本发明供试品溶液制备的方式一色谱图；
图2为本发明供试品溶液制备的方式二色谱图；
图3为本发明供试品溶液制备的方式三色谱图；
图4为本发明选择检测波长时不同检测波长的色谱图；
图5为本发明选择梯度洗脱条件时不同梯度的色谱图；
图6为本发明混合对照品溶液色谱图；
图7为本发明16批威灵仙药材原始指纹图谱；
图8为本发明标准指纹图谱。
具体实施方式
本发明的实施所采用的实验仪器：
Agilent 1100型高效液相色谱仪(G1379A型脱气机，G1311A型四元泵、G1313A型自动进样器、G1316A型柱温箱、G1315B型DAD检测器)；FA2004型电子天平(上海图新电子科技有限公司)；Q/320683AFA02-2005型调温电热器(上海苏达实验仪器有限公司)；Allegra X-30型多功能台式高速离心机(美国Beckman Coulter公司)；歌能G-100S型超声波清洗机超声清洗仪(深圳市歌能清洗设备有限公司)；JP-100A-2型高速多功能粉粹机(上海市久品工贸有限公司)；TS-DI10-L/H型实验室超纯水机(陶氏水处理设备工程有限公司)。
本发明的一种威灵仙药材HPLC指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
1、对照品溶液的制备：
称取有机酸对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；所述有机酸对照品包括：新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异阿魏酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C中的一种或多种混合；其中，绿原酸(批号YZ20181008)、异阿魏酸(批号YZ180804)购于南京源植生物科技有限公司，新绿原酸(批号RP190418)、隐绿原酸(批号RP190226)、异绿原酸A(批号RP180903)、异绿原酸B(批号RP180514)、异绿原酸C(批号RP180704)购于成都麦德生科技有限公司，咖啡酸(批号HL-190106)购于陕西汇林生物制品，纯度均大于98％。色谱纯乙腈(Merck公司)，冰乙酸(江苏永丰化学试剂厂)；水为实验室自制超纯水；其他试剂均为分析纯。
2、供试品溶液的制备：
称取多批次威灵仙药材粉末(过四号筛)置锥形瓶中，分别加纯水，超声提取，过滤，离心后上清液定容到250ml，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得各批次供试品溶液；其中，药材粉末质量为2.5～5.0g，纯水体积为20～50ml，超声提取时间为10～60min，微孔滤膜的规格为0.22μm。进一步的，一共选取16批威灵仙药材，来源见表1：
表1 16批威灵仙药材
本发明设计了三种威灵仙药材的提取方式：
方式一、取威灵仙样品粉碎，精密称取5.0g，精密加入水50ml，超声30min，提取三次，离心过滤，定容到250ml，过0.22μm滤膜即可。结果如图1所示。
方式二、取威灵仙样品粉碎，精密称取2.5g，精密加入水25ml，超声50min，提取三次。离心过滤，定容到250ml，过0.22μm滤膜即可。结果如图2所示。
方式三、取威灵仙样品粉碎，精密称取4.0g，精密加入水30ml，超声10min，提取三次。离心过滤，定容到250ml，过0.22μm滤膜即可。结果如图3所示。
根据上述三种方法给出的色谱图，发现提取方式一中提取的成分最多，且包含主要指标成分绿原酸(色谱峰2)和异阿魏酸(色谱峰12)，因此选为供试品制备的最佳条件。
3、以异阿魏酸为参照峰的标准指纹图谱的制定：
提取对照品溶液20μl及各批次的供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，进行HPLC检测，记录色谱图，依据所得的16批次批威灵仙药材的指纹图谱，制定标准指纹图谱，确定该标准指纹图谱中的16个指纹峰，选定12号峰异阿魏酸为参照峰；HPLC检测时色谱条件：色谱柱为Venusil XBP C18柱；柱温为24～36℃；检测波长为280nm-330nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1～0.5％醋酸水溶液，总流速为0.6～1.2ml/min；分析时间70分钟。
具体的，色谱条件的选择：
检测波长的选择：采用PDA检测器扫描测定190～360nm范围内的HPLC谱图，提取液在254nm、280nm、320nm、360nm进行液相测定，结果表明HPLC谱图中的谱峰数目越多，越能全面反映出成分的组成，综合考虑设定检测波长为280nm，结果如图4所示。
流动相的选择：以乙腈(A)-0.5％醋酸(B)为基础溶剂，进行不同梯度的洗脱，其结果如图5所示，考虑到保留时间与分离度对洗脱条件的影响，最终确定梯度4为最佳流动相条件：0～5min：5％A，95％B；5～25min：5％～18％A，95％～82％B；25～30min：18％A，82％B；30～45min：18％～27％A，82％～73％B；45～48min：27％A，73％B；48-70min：90％A，10％B。
色谱条件优选：色谱柱为Venusil XBP C18柱；柱温为30℃；检测波长为280nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％醋酸水溶液，总流速为1.0ml/min。
进一步对照品溶液的制备时：称取有机酸对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1ml含0.8mg的对照品储备液，临用前分别吸取适量对照品溶液混合后，加水定容至10ml容量瓶，进行液相分析；见图6，图中各色谱峰分别为：1.新绿原酸；2.绿原酸；3.隐绿原酸；4.咖啡酸；5.异阿魏酸；6.异绿原酸B；7.异绿原酸A；8.异绿原酸C。
进行方法学考察：
精密度实验
取同一供试品溶液(S7)，在上述液相色谱条件下，进样分析，连续进样6次，测得各峰相对保留时间RSD均小于0.15％，相对峰面积RSD均小于1.63％，表明该方法精密度良好。
稳定性实验
取同一供试品溶液(S7)，在上述液相色谱条件下，进样分析。分别在0、2、4、6、8、16、24h检测，测得各峰相对保留时间RSD均小于0.65％，相对峰面积RSD均小于1.78％，表明供试品在24h内稳定。
重复性实验
取同一批样品(S7)，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，进样分析。测得各峰相对保留时间RSD均小于0.66％，相对峰面积RSD均小于1.38％，表明该方法重复性良好。
制定标准指纹图谱时，精密吸取上述对照品溶液20μl、供试品溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪中，照高效液相色谱法测定，记录色谱图；将所得16批威灵仙药材的HPLC色谱图转为“AIA格式”后输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统中，得16批威灵仙指纹图谱，如图7。将16批威灵仙样品选取“时间窗宽度”为0.5min，采用多点校正、色谱峰匹配等操作，生成威灵仙对照指纹图谱，如图8，得出16个指纹峰。标定其中8个色谱峰，分别为：2.新绿原酸；4.绿原酸；5.隐绿原酸；6.咖啡酸；12.异阿魏酸；13.异绿原酸B；15.异绿原酸A；16.异绿原酸C。
4指纹图谱的质量控制：
将待检测的威灵仙药材指纹图谱与上述标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别所具有的共同指纹峰的数量，确定相似度，结果见表3；以异阿魏酸为参照峰，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，见表4-5。
表3 16批威灵仙药材HPLC指纹图谱相似度评价结果
由相似度评价结果可知，16批样品相似度在0.816～0.996之间，其中，药店9批药材的相似度均大于0.96，表明药店来源的药材质量稳定性高；药材市场采购的7批药材，相似度介于0.816～0.994之间，相似度差异较大，说明药材市场来源的药材质量稳定性低。说明药店和药材市场来源的药材质量存在一定的差异。
指纹峰的标定及相关性分析
通过与对照品比对，标定了8个指纹峰，结果见图6。比较各批次药材的HPLC谱图发现，所有药材均含有咖啡酸和异阿魏酸，药店来源均不含有新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸。药材市场来源除棉团铁线莲外，均含有上述三种有机酸。结合相似度评价结果和相关性分析结果，可通过HPLC指纹图谱区分药店来源和药材市场来源的药材。
表4样品HPLC指纹峰的相对保留时间
表5样品HPLC指纹峰的相对峰面积
Claims (2)
1.一种威灵仙药材HPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：称取有机酸对照品，加甲醇溶解并定容摇匀；
(2)供试品溶液的制备：称取多批次威灵仙药材粉末，分别加纯水，超声提取，过滤，离心后上清液定容，用微孔滤膜滤过，取续滤液，得各批次供试品溶液；
(3)标准指纹图谱的制定：提取对照品溶液及各批次的供试品溶液，进行HPLC检测，记录色谱图，依据所得的各批次威灵仙药材的指纹图谱，制定标准指纹图谱，确定该标准指纹图谱中的指纹峰，选定参照峰；
(4)指纹图谱的质量控制：将待检测的威灵仙药材指纹图谱与上述标准指纹图谱进行比较，计算相似度，识别所具有的共同指纹峰的数量，确定相似度；
所述步骤(1)中有机酸对照品包括：新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异阿魏酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C中的一种或多种混合；
所述步骤(2)中威灵仙药材选择不同地区获取的多个批次药材；
所述步骤(2)制备时每批次威灵仙药材粉末质量为2.5～5.0g，纯水体积为20～50ml，超声提取时间为10～60min，离心后上清液定容250ml，微孔滤膜的规格为0.22μm；
所述步骤(3)中，所选的参照峰为异阿魏酸、绿原酸里面的一种，HPLC检测时色谱条件：色谱柱为Venusil XBP C18柱；柱温为24～36℃；检测波长为280nm-330nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％醋酸水溶液，总流速为1ml/min；分析时间70分钟；
采用梯度洗脱，具体为0～5min：5％流动相A，其余为流动相B；5～25min：5％～18％流动相A，其余为流动相B；25～30min：18％流动相A，其余为流动相B；30～45min：18％～27％流动相A，其余为流动相B；45～48min：27％流动相A，其余为流动相B；48-70min：90％流动相A，其余为流动相B。
2.根据权利要求1所述的威灵仙药材HPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于：所述检测波长为280nm。
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