CN110297060A - 一种山苦荬药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱 - Google Patents

一种山苦荬药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药材的指纹图谱技术领域，具体涉及一种山苦荬药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱，包括以下步骤：（1）混合对照品溶液的制备，（2）供试品溶液的制备，(3)HPLC检测，(4)对照指纹图谱的建立，(5)指纹图谱的质量控制。利用本发明山苦荬药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱能够监控山苦荬药材的质量及鉴别真伪，确保药材的真实、安全、有效、稳定和一致性，为山苦荬质量控制提供全面的评价方法和山苦荬药材资源的开发提供科学依据，完善山苦荬药材的质量评价体系。

Description

一种山苦荬药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱
技术领域
本发明涉及中药材的指纹图谱技术领域，具体涉及一种山苦荬药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱。
背景技术
中药虽然已经有几千年的应用发展历史，但如何有效的评价中药材质量的好坏，一直是中药材研究与应用的重点和难点。随着科技的发展，指纹图谱质控技术在中药领域被提出并得到广泛认可，其在中药材质控中的应用也越来越多；中药材指纹图谱是指中药材经过适当处理后，采用一定的分析手段和检测仪器得到的，能够标示该中药材特性的图谱，它是现阶段可以较全面地反映中药材内在质量的最有效的手段之一，也得到了国际社会的认可。
山苦荬又名黄鼠草、苦碟子、小苦苣、败酱草、小苦荬、苦荬菜等。山苦荬（Ixeridium chinense (Thunb.) Tzvel.）为菊科小苦荬属多年生草本植物，它广泛分布在我国的大部分地区，并广泛分布在平原和山区。人们经常把它当作野菜来吃。开花期收集，然后用附近的流水冲洗除去土壤，除去枯叶和茎干，阴干，用整株草作药；具有镇痛消肿、消炎凉血、清热解毒、抗肿瘤等功效。用于医治无名肿痛、阑尾炎、肺炎、关节炎、腹腔脓肿、痢疾等多种疾病。近10年来，小苦荬属植物的化学成分和生物活性研究取得了很大的进展，从该属植物中已经分离鉴定出许多化合物，山苦荬中主要含有三萜类、倍半萜类、黄酮类、甾醇类等化学成分。药理研究方面,周黎等首次报道了中药中华苦荬菜提取物Chinensiolide A在体外可有效的抑制肺腺癌A549细胞、肝癌Ble-7402细胞及Lo Vo细胞的生长,具有较强的抗肿瘤活性。药理实验证明，该类化合物不仅对各种类型的肝炎有明显疗效，在太文杰的研究中还发现山苦荬具有抗氧化作用。对于治疗糖尿病及其并发症也有一定效果。
山苦荬分布广泛，野生资源丰富，是我国中药中重要且常用的一味，药用价值高，而其质量的好坏与人们的健康利益密切相关。目前，关于山苦荬的指纹图谱研究的报道相对较少。中药指纹图谱是控制天然药物质量的有效方式之一，指纹图谱全面整体地反映了药材的内在质量，能为中药的质量评价和控制提供一个有效的参考方法。因此为了更全面、准确、有效地控制山苦荬药材的质量及合理利用山苦荬，保证临床疗效，有必要建立山苦荬药材的指纹图谱检测方法，弥补山苦荬药材质量控制的不足，对更好的控制产品的质量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种山苦荬（Ixeridium chinense (Thunb.) Tzvel.）药材指纹图谱检测方法及其指纹图谱。利用该指纹图谱检测方法能够监控山苦荬药材的质量及鉴别真伪，确保药材的真实、安全、有效、稳定和一致性，为山苦荬质量控制提供全面的评价方法和山苦荬药材资源的开发提供科学依据，为进一步开发、制定其中药材标准提供参考依据，规范、保障临床用药。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种山苦荬药材指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
（1）混合对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品11.59mg，咖啡酸对照品6.72mg、木樨草苷对照品13.60mg，分别置25ml量瓶中，加适量甲醇超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取上述绿原酸贮备液1.5ml、咖啡酸贮备液1.5ml和木樨草苷贮备液6.0ml，置同一10ml量瓶中并用甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液；
（2）供试品溶液的制备：取山苦荬样品2g，精密称定，置于150mL锥形瓶中，分别精密加入体积浓度为80%的甲醇溶液20mL，称定重量，进行超声提取60min，用体积浓度为80%的甲醇溶液补足损失重量，滤过，取续滤液过0.45nm微孔滤膜，即得；
(3)HPLC检测：色谱条件为用Atlantis T3 C18，4.6mm×250mm,5μm色谱柱；以甲醇-0.2%磷酸水溶液为流动相，流速：1.0mL•min-1，进样量：10µL，柱温为25℃，检测波长为330nm；采用以下梯度洗脱的条件进行梯度洗脱：
(4)对照指纹图谱的建立：按照色谱条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，以木犀草苷峰作为参照峰，测定10批山苦荬药材的指纹图谱，对所得色谱数据进行处理，得到由其共有特征峰构成的山苦荬药材的对照指纹图谱，以确定的参照峰的保留时间和峰面积为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间与相对峰面积，所述对照指纹图谱中，共有峰有16个，其中10号峰为木犀草苷峰；
(5)指纹图谱的质量控制：取待测药材制备供试品溶液，按上述色谱条件，将供试品溶液注入高效液相色谱仪检测，将所得色谱图与上述山苦荬药材的对照指纹图谱比较，计算相似度，识别所具有的共同吸收峰的数量，确定相似度，实现对山苦荬药材进行鉴别及质量控制。
上述的山苦荬药材指纹图谱检测方法，步骤（1）制备得到的每1ml混合对照品溶液中含绿原酸66.9 ug，咖啡酸40.35 ug，木樨草苷306.78 ug。
本发明的另一目的是提供上述的山苦荬药材指纹图谱检测方法步骤（4）中所构建得到的山苦荬药材的对照指纹图谱，该山苦荬药材的对照指纹图谱具有16个共有特征峰，以参照物峰即10号峰相应的峰为S峰，所述16个共有特征峰的相对保留时间如下：峰1：0.2985，峰2：0.3837，峰3：0.5063，峰4：0.7413，峰5：0.7887，峰6：0.8354，峰7：0.8707，峰8：0.8943，峰9：0.9734，峰S：1.0000，峰11：1.0340，峰12：1.1367，峰13：1.1553，峰14：1.5518，峰15：1.7250，峰16：1.7703。
本发明的有益效果为：
本发明提供的山苦荬（Ixeridium chinense (Thunb.) Tzvel.）药材指纹图谱检测方法，具有重现性好、精密度高、稳定性好的特点，本发明构建得到山苦荬药材的对照指纹图谱，出峰多、分离度良好，通过比较指纹图谱中共有峰的有无，能有效地鉴别山苦荬药材的真伪及产地，用于反映山苦荬药材质量的优劣，完善山苦荬药材的质量评价体系。通过本发明山苦荬药材指纹图谱检测方法，可较全面地对山苦荬药材的内在质量进行控制与评价，监控山苦荬药材的质量及鉴别真伪，确保药材的真实、安全、有效、稳定和一致性，为进一步开发、制定其中药材标准提供参考依据，规范、保障临床用药，为山苦荬药材资源的开发提供科学依据。
附图说明
图1为色谱柱Agilent ZORBAX SB C18 (4.6mm×250mm,5μm)的HPLC色谱图；
图2为色谱柱Atlantis T3 C18(4.6mm×250mm,5μm) 的HPLC色谱图；
图3为甲醇-0.2%磷酸水溶液流动相系统等度洗脱HPLC色谱图；
图4为甲醇-0.2%磷酸水溶液流动相系统梯度洗脱HPLC色谱图；
图5为 330nm波长扫描色谱图；
图6为25℃色谱图；
图7为流速为0.8 mL•min-1的色谱图；
图8为流速为1.0 mL•min-1的色谱图；
图9为流速为1.2mL•min-1的色谱图；
图10为超声提取的色谱图；
图11为回流提取的色谱图；
图12为80%甲醇溶液作为提取溶剂的的色谱图；
图13为采用20mL80%甲醇溶液提取的色谱图；
图14为 采用80%甲醇溶液提取60min的色谱图；
图15为参照物HPLC色谱图，图中1为绿原酸，2为咖啡酸，3为木犀草苷；
图16为供试品HPLC色谱图，图中2为绿原酸，3为咖啡酸，10为木犀草苷；
图17 为10批不同产地山苦荬药材HPLC图谱匹配图；
图18为山苦荬药材的对照指纹图谱；
图19为山苦荬样品聚类分析图。
具体实施方式
实施例1山苦荬药材指纹图谱的建立
1仪器与实验材料
1.1试药
实验所用山苦荬药材收集于广西各产地。取山苦荬药材，去除杂草、树枝、泥土等杂物以及发霉变质的药材，保留花、叶、茎、根等药用部位，打碎成粗粉（过2号筛）。样品经广西中医药大学药学院韦松基教授鉴定为菊科小苦荬属山苦荬。产地见表1。
1.2试剂
实验所用对照品及试剂见表2-1～表2-2。
1.3仪器
实验所用仪器见表3
2 实验方法
按照如下方法建立山苦荬药材指纹图谱：
2.1色谱条件的考察
2.1.1色谱柱的选择
取山苦荬S7号样品约2g，精密称定，置于150mL锥形烧瓶中，精密加入体积浓度80%甲醇溶液20mL，称定重量，超声提取60分钟，用80%甲醇溶液补足失重，过滤，取续滤液，过0.45nm微孔滤膜，得到供试品溶液。
HPLC法中为了适应不同的样品分离，应用的柱子种类繁多，因此，用不同的C18色谱柱测定山苦荬药材也可能得出不同的指纹图谱。比较不同制造商生产的C18色谱柱，选择最佳色谱柱。选用 Agilent1260高效液相色谱议，使用以下 2 种不同的色谱柱进行洗脱：
①Agilent ZORBAX SB C18 (4.6mm×250mm,5μm);
②Atlantis T3 C18(4.6mm×250mm,5μm);
选用甲醇-0.2%磷酸水溶液作为流动相，在330nm吸收波长下进行扫描。结果如图1和图2所示。根据色谱图，实验结果表明，当使用Atlantis T3 C18柱（250mm×4.6mm，5μm）时，每个峰的分离度良好，基线稳定。
2.1.2洗脱程序的选择
准备供试品溶液，选用 Agilent1260高效液相色谱议，甲醇-0.2%磷酸水溶液流动相系统分别用于等度洗脱（甲醇体积分数：30％）和梯度洗脱（见表4）的比较，选择适当的洗脱程序，检测波长设定为330nm。结果如图3和图4所示，根据色谱图，选用梯度洗脱程序，因为使用等度洗脱分离度不好。
2.1.3检测波长的选择
准备供试品溶液，选用 Agilent1260高效液相色谱议，使用甲醇-0.2%磷酸水溶液流动相系统进行梯度洗脱，设定在检测波长230nm，254nm，280nm，330nm下进行扫描。流速1mL•min-1，柱温25℃，注入体积为10µL。根据所得色谱图发现，在330nm下有较多的峰信息，且信号较好，分离度高、所得谱图具有更好的峰形和更稳定的基线，综合考虑选择检测波长330nm。330nm波长扫描色谱图见图5所示。
2.1.4柱温及流速的选择
2.1.4.1柱温的选择
准备供试品溶液，使用 Agilent1260高效液相色谱议，使用甲醇-0.2%磷酸水溶液流动相系统进行梯度洗脱，流速设置为1mL•min-1，检测波长为330nm。分别设定25℃，30℃，35℃三个不同的柱温进行比较。根据比较所得色谱图可知，25℃时峰较好，保留时间适宜，且出于保护仪器的目的，所以最后确定柱温为25℃。25℃色谱图见图6 所示。
2.1.4.2流速的选择
准备供试品溶液，选用 Agilent1260高效液相色谱议，使用甲醇-0.2%磷酸水溶液流动相系统进行梯度洗脱，柱温设定为25℃，检测波长设置为330nm。分别设定0.8mL•min-1，1.0mL•min-1，1.2mL•min-1不同流速。结果见图7～图9，根据色谱图可知，流速为1.0mL•min-1时保留时间比较合适，分离效果好，且流速1.0mL•min-1为常用流速，所以最后确定流速为1.0mL•min-1。
2.1.5色谱条件的确定
色谱条件见表5-1；梯度洗脱条件见表5-2。
2.2供试品制备条件的选择
2.2.1提取方法的选择
取山苦荬S7号样品约2g，精密称定，放入150mL锥形烧瓶中，精密加入20mL80%甲醇溶液，称重，分别用超声波提取和水浴回流提取，提取时间60min，用80％甲醇溶液弥补损失重量，滤过，取续滤液过0.45nm微孔滤膜，并根据2.1.6中的色谱条件测定。结果见图10-图11，根据色谱图，回流提取和超声提取得到的峰数相似，超声提取峰面积较大、峰形较好，且超声提取较方便，故选用超声提取。
2.2.2提取溶剂的选择
取山苦荬S7号样品约2g，精密称定，置于150mL锥形瓶中，分别加入30%甲醇溶液、50%甲醇溶液、80%甲醇溶液及纯甲醇各20mL，称定重量，进行超声提取60min，损失重量用相应的提取溶液补足，过滤，取续滤液过0.45nm微孔滤膜，并根据2.1.5中的色谱条件测定。收集色谱图，根据色谱图，在不同体积浓度甲醇溶液的提取中，体积浓度为80%的甲醇溶液具有更多的峰和更好的整体峰形，因此选择80%甲醇溶液作为提取溶剂。80%甲醇溶液作为提取溶剂的的色谱图见图12。
2.2.3提取料液比的选择
取山苦荬S7号样品约2g，精密称量，分别置于150mL锥形烧瓶中，精确加入80%甲醇溶液10mL（1:5），20mL（1:10），30mL（1:15），40mL（1:20），50mL（1；25），称重，60分钟超声波提取，用80%甲醇溶液弥补损失重量，过滤，将续滤液过0.45nm微孔滤膜，按2.1.5项下色谱条件进行测定。收集所得色谱图，根据所得色谱图可知，在不同料液比中，加入80%甲醇溶液20mL，30mL提取的峰数量较多,整体峰面积较高，峰形较好，综合考虑选择加入20mL80%甲醇溶液。制备供试品溶液采用20mL80%甲醇溶液提取的色谱图见图13。
2.2.4提取时间的选择
取山苦荬S7样品约2g，精密称定，置于150mL锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液20mL，称定重量，分别进行超声提取30min、45min、60min、90min、120min，用80%甲醇溶液补足损失重量，滤过，取续滤液过0.45nm微孔滤膜，按2.1.5项下色谱条件进行测定。收集所得色谱图，根据所得色谱图可知，在不同提取时间60min,90min,120min提取的峰数目较多,整体峰面积较高，综合考虑选择时间较短且结果差距不大的60min为提取时间。制备供试品溶液采用80%甲醇溶液提取60min色谱图见图14。
2.2.5供试品制备条件的确定
取山苦荬样品约2g，精密称定，置于150mL锥形瓶中，分别精密加入80%甲醇溶液20mL，称定重量，进行超声提取60min，用80%甲醇溶液补足损失重量，滤过，取续滤液过0.45nm微孔滤膜，即得。
3指纹图谱的方法学考察
3.1精密度实验
取山苦荬S7号样品约2g，精密称定，根据2.2.5下制备供试样品的方法制备供试品溶液。根据2.1.5下色谱条件，连续进样6次，得到山苦荬样品图谱及数据。计算了各色谱峰相对保留时间和相对峰面积，对实验仪器的精密度进行了研究。计算结果见表6-1～表6-2，结果表明各色谱峰的相对保留时间RSD值在0.004%～0.1%之间；各色谱峰相对峰面积RSD值在0.1%～2.5%之间，表明仪器的精密度良好。
3.2重复性实验
取S7号样品约2g，精密称定，根据2.2.5项下供试品制备的方法制备供试品溶液，并根据2.1.5项下色谱条件，连续进样6次，获得了山苦荬样品图谱及数据。对各色谱峰相对保留时间及相对峰面积进行计算，对实验方法的重复性进行了研究。计算结果示于表7-1～表7-2，结果表明，在6份样品中，各色谱峰的相对保留时间RSD值在0.005%～0.04%之间，各色谱峰相对峰面积RSD值在1.0%～4.4%之间，表示实验的重复性良好。
3.3稳定性实验
取S7号样品约2g，精密称定，按照2.2.5项下供试品制备的方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、10、12、20小时，按2.1.5项下色谱条件进行检测，获得了山苦荬样品图谱及数据。对各色谱峰相对保留时间及相对峰面积进行计算，对实验方法的稳定性进行了研究。计算结果见表8-1～表8-2，结果表明，各色谱峰的相对保留时间RSD值在0.003%～0.07%之间，各色谱峰的相对峰面积RSD值在0.1%～2.5%之间，表明供试品在20h内稳定性良好。
4特征指纹图谱的建立
4.1各产地山苦荬的指纹图谱采集
取广西各产地的山苦荬样品（S1～S10）粉末约2g，精密称定，按2.2.5项下供试品制备方法进行制备，按2.1.5项下色谱条件进行测定，记录10个批次山苦荬药材HPLC色谱图，得到各批次样品的图谱。
4.2参照色谱峰的建立
利用对照品对照法对共有峰进行指认，精密称取绿原酸对照品11.59mg，咖啡酸对照品6.72mg、木樨草苷对照品13.60mg，分别置25ml量瓶中，加适量甲醇超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取上述绿原酸贮备液1.5ml、咖啡酸贮备液1.5ml和木樨草苷贮备液6.0ml，置同一10ml量瓶中并用甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液（每1ml溶液中含绿原酸66.9μg，咖啡酸40.35μg，木樨草苷306.78μg）。精密吸取10µL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。3种对照品的保留时间分别与特征色谱图中的2，3，10号峰保留时间一致，并通过在线DAD紫外吸收光谱对照发现2，3，10号峰分别与绿原酸、咖啡酸和木犀草苷对照品峰一致，所以可以判断为2号峰号峰是绿原酸、3号峰是咖啡酸、10号峰是木犀草苷。 这些特征峰可作为控制山苦荬药材质量的指标之一，取10号峰作为参照峰。
在本实验研究中，木犀草苷是山苦荬药材中已知的成分，木犀草苷是黄酮类化合物的代表物质之一,它的药理活性有解热镇痛、杀菌消炎等。这与山苦荬的主要功效是一致的,可推测木犀草苷是山苦荬的活性成分之一。此外，木犀草苷在指纹图谱中的保留时间适中。因此，选择木犀草苷（10号峰）作为参照峰，计算相对保留时间和相对峰面积，满足指纹图谱建立的要求。根据2.1.5的指纹色谱条件，分别注入混合参比溶液（混合对照品溶液）和试验溶液。结果如图15～16所示。
4.3 山苦荬色谱图的导出及相似度的计算
目前，相似度计算方法已开发成为软件，并广泛应用于指纹研究。相似性评估软件的出现大大简化了计算过程。每个指纹相似度算法都有自己的特点和适用范围。在中药质量控制过程中，只有根据相应合理的评价指标，结合聚类分析、主成分分析等化学模式识别，制定不同的评价方法，整个评价研究对中药质量控制才有现实意义。
本实验使用了《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，标定了匹配数量均为10的16个色谱峰作为共有指纹峰，结果见表9-1～表9-2与图17。结果表明，S1号、S5号、S10号样品的相似度在指纹图谱相似度计算结果中较低，最低为0.847，其余7个批次的山苦荬样品与对照指纹图谱（SR）的相似度均大于0.9，表明各批次山苦荬样品具有相似性，构建的山苦荬对照指纹图谱（SR）具有一定的代表性，符合HPLC指纹图谱技术要求，相似度分析可以体现不同产地来源山苦荬之间的差异。
4.4指纹图谱与共有峰的确定
使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，山苦荬药材指纹图谱的参照图谱设定为S1，选择中位数法作为对照指纹图谱(SR)的生成方法,时间窗宽度设定为0.1min，以此进行谱峰识别和谱峰匹配。系统根据山苦荬样品的共有模式,生成山苦荬药材的对照指纹图谱（图18）,并计算其相似度,保证共有峰确定的公正和客观。
将参照峰S（10号峰）的保留时间和峰面积设定为1，分别计算共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果如表10-1～表10-2所示，不同批次的山苦荬样品的共有峰相对保留时间的RSD在0.02%～0.4%之间，而相对峰面积RSD差异较大。中药中化学成分的含量受多种因素的影响，故不同样品之间含量也有差异。本实验中不同批次的山苦荬样品出现相同的色谱行为，证明实验所用方法可行。
4.5聚类分析
将广西不同产地的山苦荬样品高效液相指纹图谱的16个共有峰的峰面积作为特征，得到10×16阶的原始数据矩阵，运用SPSS19.0分析软件采用组间连接法对样品进行聚类分析，结果见图19。从图中可以看出，10批次山苦荬样品总共可以聚为3大类，其中，S4、S6、S9、S10聚为第1类；S1、S2、S3、S7、S8聚为第2类；S5单独聚为第3类。表明不同批次的药材由于地理位置等环境的影响，所含化学成分有一定的差异。
5小结
实验中完成了提取方法考察与色谱条件考察，确定了指纹图谱建立方法，并进行了指纹图谱的方法学考察，结果证明实验所用方法精密度、重复性、稳定性良好。本实验建立的方法可用于山苦荬的整体性评价。利用建立得到的指纹图谱能够监控山苦荬药材的质量及鉴别真伪，确保药材的真实、安全、有效、稳定和一致性，为山苦荬质量控制提供全面的评价方法和山苦荬药材资源的开发提供科学依据，为进一步开发、制定其中药材标准提供参考依据，规范、保障临床用药。
实施例2
一种山苦荬药材指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
（1）混合对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品11.59mg，咖啡酸对照品6.72mg、木樨草苷对照品13.60mg，分别置25ml量瓶中，加适量甲醇超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取上述绿原酸贮备液1.5ml、咖啡酸贮备液1.5ml和木樨草苷贮备液6.0ml，置同一10ml量瓶中并用甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液；制备得到的每1ml混合对照品溶液中含绿原酸66.9 ug，咖啡酸40.35 ug，木樨草苷306.78 ug；
（2）供试品溶液的制备：取山苦荬样品2g，精密称定，置于150mL锥形瓶中，分别精密加入体积浓度为80%的甲醇溶液20mL，称定重量，进行超声提取60min，用体积浓度为80%的甲醇溶液补足损失重量，滤过，取续滤液过0.45nm微孔滤膜，即得；
(3)HPLC检测：色谱条件为用Atlantis T3 C18，4.6mm×250mm,5μm色谱柱；以甲醇-0.2%磷酸水溶液为流动相，流速：1.0mL•min-1，进样量：10µL，柱温为25℃，检测波长为330nm；采用以下梯度洗脱的条件进行梯度洗脱：
(4)对照指纹图谱的建立：按照色谱条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，以木犀草苷峰作为参照峰，测定10批山苦荬药材的指纹图谱，对所得色谱数据进行处理，得到由其共有特征峰构成的山苦荬药材的对照指纹图谱，以确定的参照峰的保留时间和峰面积为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间与相对峰面积，所述对照指纹图谱中，共有峰有16个，其中10号峰为木犀草苷峰；以参照物峰即10号峰相应的峰为S峰，所述16个共有特征峰的相对保留时间如下：峰1：0.2985，峰2：0.3837，峰3：0.5063，峰4：0.7413，峰5：0.7887，峰6：0.8354，峰7：0.8707，峰8：0.8943，峰9：0.9734，峰S：1.0000，峰11：1.0340，峰12：1.1367，峰13：1.1553，峰14：1.5518，峰15：1.7250，峰16：1.7703；
(5)指纹图谱的质量控制：取待测药材制备供试品溶液，按上述色谱条件，将供试品溶液注入高效液相色谱仪检测，将所得色谱图与上述山苦荬药材的对照指纹图谱比较，计算相似度，识别所具有的共同吸收峰的数量，确定相似度，实现对山苦荬药材进行鉴别及质量控制。

Claims (4)

1.一种山苦荬药材指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）混合对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品11.59mg，咖啡酸对照品6.72mg、木樨草苷对照品13.60mg，分别置25ml量瓶中，加适量甲醇超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取上述绿原酸贮备液1.5ml、咖啡酸贮备液1.5ml和木樨草苷贮备液6.0ml，置同一10ml量瓶中并用甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液；
（2）供试品溶液的制备：取山苦荬样品2g，精密称定，置于150mL锥形瓶中，分别精密加入体积浓度为80%的甲醇溶液20mL，称定重量，进行超声提取60min，用体积浓度为80%的甲醇溶液补足损失重量，滤过，取续滤液过0.45nm微孔滤膜，即得；
(3)HPLC检测：色谱条件为用Atlantis T3 C18，4.6mm×250mm,5μm色谱柱；以甲醇-0.2%磷酸水溶液为流动相，流速：1.0mL•min-1，进样量：10µL，采用以下梯度洗脱的条件进行梯度洗脱：
(4)对照指纹图谱的建立：按照色谱条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，以木犀草苷峰作为参照峰，测定10批山苦荬药材的指纹图谱，对所得色谱数据进行处理，得到由其共有特征峰构成的山苦荬药材的对照指纹图谱，以确定的参照峰的保留时间和峰面积为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间与相对峰面积，所述对照指纹图谱中，共有峰有16个，其中10号峰为木犀草苷峰；
(5)指纹图谱的质量控制：取待测药材制备供试品溶液，按上述色谱条件，将供试品溶液注入高效液相色谱仪检测，将所得色谱图与上述山苦荬药材的对照指纹图谱比较，计算相似度，识别所具有的共同吸收峰的数量，确定相似度，实现对山苦荬药材进行鉴别及质量控制。
2.根据权利要求1所述的山苦荬药材指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤（1）制备得到的每1ml混合对照品溶液中含绿原酸66.9 ug，咖啡酸40.35 ug，木樨草苷306.78 ug。
3.根据权利要求1所述的山苦荬药材指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤（3）HPLC检测中，柱温为25℃，检测波长为330nm。
4.根据权利要求1所述的山苦荬药材指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤（4）中所构建得到的山苦荬药材的对照指纹图谱具有16个共有特征峰，以参照物峰即10号峰相应的峰为S峰，所述16个共有特征峰的相对保留时间如下：峰1：0.2985，峰2：0.3837，峰3：0.5063，峰4：0.7413，峰5：0.7887，峰6：0.8354，峰7：0.8707，峰8：0.8943，峰9：0.9734，峰S：1.0000，峰11：1.0340，峰12：1.1367，峰13：1.1553，峰14：1.5518，峰15：1.7250，峰16：1.7703。
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