CN106018629B - 一种虎杖叶指纹图谱hplc方法及其在虎杖叶胶囊质量控制中的应用 - Google Patents
一种虎杖叶指纹图谱hplc方法及其在虎杖叶胶囊质量控制中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种虎杖叶指纹图谱HPLC方法，包括制备待测样品及用HPLC检测样品，用HPLC方法同时检测虎杖叶原药及其制品中的没食子酸、绿原酸、阿魏酸、虎杖苷、芦丁、异槲皮苷、槲皮苷、白藜芦醇、槲皮素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等12种指标成分，本发明提供的虎杖叶指纹图谱HPLC方法具有色谱峰分离度高，不同样品间保留时间稳定的特点；能够解决虎杖叶胶囊的质量控制问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药质量控制方法，更具体的说涉及虎杖叶指纹图谱HPLC方法及其在虎杖叶胶囊质量控制中的应用。
技术背景
蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.,主要为温带亚洲分布,在中国广布于秦岭、长江以南,达南岭和西南,东北达朝、韩、日,多在2000m以下的常绿林或中生混交林林下溪边,环境适应性极强。中药虎杖为P.cuspidatum的干燥根及根茎,有利湿退黄,清热解毒,散瘀止痛,止咳化痰之功效；虎杖叶在民间有悠久的药食两用历史,具有祛风湿,解热毒之功效。在《救荒本草》中记载酸桶笋(虎杖叶)“生密县韶华山山涧边。初发笋叶，其后分生茎叉，科苗高四五尺，茎秆似水鱿茎，而红赤色，其叶似白模叶而涩，又似山格刺菜叶亦涩，纹脉亦粗。味甘微酸。”食用方法为“采嫩笋叶煤熟，水浸去邪味，淘净，油盐调食。”根据我们的调查，至今虎杖嫩叶在中国一些地方如福建，江西，云南和河南仍常做一种野菜食用。虎杖嫩叶，味酸而鲜，在晚春和早夏可用来炒菜或做汤。云南彝族人民常通过咀嚼虎杖叶来避免头晕目眩。虎杖叶做鲜蔬可以用来防治风湿性关节炎，萎缩性牙周炎，中耳炎，肝炎，结肠炎等疾病。据记载晒干的虎杖叶在日本和印度还有做烟草的历史。然而当前对于虎杖叶的主治以及功效总结还是实践积累的经验，处在经验医学阶段，对虎杖叶用药的安全性，有效性及剂量，用法，尚缺乏相应的科学依据。虎杖活性成分及作用机制需要进一步研究，来促进虎杖叶高价值的开发利用。虎杖叶胶囊，是以虎杖叶的提取物为活性成分的民族药，彝医哦格米壳。中医平肝潜阳。用于肝阳上亢引起的眩晕，症见头晕，头昏，头痛等症，高血压属上述证候者。
发明内容
为了解决虎杖叶胶囊的质量控制问题，本发明提供了一种虎杖叶指纹图谱HPLC方法，包括制备待测样品及用HPLC检测样品，用HPLC方法同时检测虎杖叶原药及其制品中的没食子酸、绿原酸、阿魏酸、虎杖苷、芦丁、异槲皮苷、槲皮苷、白藜芦醇、槲皮素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等12种指标成分，其HPLC条件为：检测波长：270nm；色谱柱：C18，5μm，250×4.6mm，柱温：30℃；流动相为乙腈-0.4％冰醋酸水溶液，流速：1mL/min，进样量：10μL；梯度洗脱条件：
0-10min,10-13％乙腈；
10-30min，13-15％乙腈；
30-45min，15-16％乙腈；
45-50min，16-20％乙腈；
50-75min，20-25％乙腈；
75-95min，25-30％乙腈；
95-105min，30-65％乙腈；
105-120min，65-70％乙腈；
120-125min，70-95％乙腈；
125-127min，95-10％乙腈；
127-142min，10％乙腈。
所述制备待测样品为：称取虎杖叶原药及其制品的待测样品0.1-0.8g，至100mL磨口锥形瓶中，精密加入体积比4:1的甲醇和25％盐酸50mL，称重，回流1h，放至室温，补重，滤过，精密量取滤液5mL，至50mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，离心，即得待测样品。
上述所述虎杖叶指纹图谱HPLC方法在虎杖叶胶囊质量控制中的应用。
本发明的有益技术效果是：本发明提供的虎杖叶指纹图谱HPLC方法具有色谱峰分离度高，不同样品间保留时间稳定的特点；能够解决虎杖叶胶囊的质量控制问题。
说明书附图
图1虎杖叶的HPLC图谱；
图2虎杖叶的HPLC图谱的局部放大图。
具体实施方式
实施例1虎杖叶指纹图谱HPLC方法的建立
1.样品
表1 样品信息一览表
2.对照品
表2 对照品信息一览表
2样品配制
2.1药材虎杖叶1-3号，称取0.2500g至100mL磨口锥形瓶中，加80％甲醇20mL，称重，超声(功率200W，频率40kHz)30min，补足重量，离心10min，即得，备用。
2.2对照品取槲皮苷对照品，精密称定1.73mg至10mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每mL含0.173mg的溶液，即得。取虎杖苷、白藜芦醇、槲皮素及大黄素对照品，精密称定5.70、5.36、5.39、5.61mg，分别至25mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每mL含0.2280、0.2144、0.2156、0.2244mg的溶液，即得；上述4种对照品溶液，各精密量取1mL，摇匀，制成每mL含0.0570、0.0536、0.0539、0.0561mg，即得混合对照品溶液。
2.3.色谱条件
流动相：乙腈、0.4％甲酸、0.6％甲酸；
仪器：SHIMADZU公司2010HT型高效液相仪，紫外双波长检测器，LCsolution色谱工作站；检测波长：270nm；
色谱柱：Gemini-NX C18，5μm，250*4.6mm；(SN：759764-1)；
柱温：20、25、30℃；
流速：1mL/min；
进样量：10μL。
3.梯度条件优化
通过考察流动相乙腈-甲酸水溶液的比例、色谱柱柱温、甲酸浓度、检测波长等因素，优化虎杖叶的HPLC梯度条件，考察了47个梯度条件，最终确定梯度条件1(柱温20℃)作为药材、成品及指纹图谱的HPLC条件，色谱图见图1～2。
表3
梯度条件34(柱温20℃)
实施例2虎杖叶药材的UPLC-MS研究
1.样品
虎杖叶3号药材样品。
2.UPLC-MS条件
2.1UPLC梯度条件
利用Shimadzu Method Tranfer软件将实施例1中HPLC方法中(柱温：20℃)转换为UPLC条件(柱温：20℃)，
2.2质谱条件
3.结果及分析
通过对虎杖叶3号样品的UPLC-MS检测，经分析，初步鉴定了20个成分，见表4。
表4 主要成分保留时间、MS数据和化合物鉴定情况
实施例3虎杖叶及胶囊的指纹图谱研究
1.样品名称
指纹图谱分析样品包括6批虎杖叶、2批虎杖和3批虎杖叶胶囊，见“实施例1中的样品及对照品”中表1。
2.样品配制
2.1药材采用实施例1中HPLC条件优化及含量测定中含量测定中配制好的药材溶液。
2.2成品采用“实施例1中HPLC条件优化及含量测定中含量测定中配制好的成品溶液。
3.3对照品虎杖苷、槲皮苷、白藜芦醇、槲皮素及大黄素混合对照品溶液，浓度依次为0.0570、0.0346、0.0536、0.0539、0.0561mg/mL；其余对照品均为甲醇溶解，详见表5。
表5 对照品配制信息一览表
3.色谱条件
流动相：乙腈-0.4％甲酸(梯度条件34柱温20℃)；
仪器：SHIMADZU公司2010HT型高效液相仪，紫外双波长检测器，LCsolution色谱工作站；检测波长：270nm；
色谱柱：Gemini-NX C18，5μm，250*4.6mm；(SN：759764-1)；
柱温：20℃；流速：1mL/min；进样量：10μL。
4.样品测定
按“2.样品配制”方法制备HPLC样品和对照品，按“3.色谱条件”测定样品，记录125min色谱图。对样品的HPLC图谱中的色谱峰进行比较和编号。通过对照品在HPLC图谱中的保留时间，确定药材及成品中相应位置是否有对应成分，结果见表6。从表6可知，以保留时间作为判断依据，药材中含有大黄素-1-O-β-D-葡萄糖苷，而成品中不含；在药材和成品中均含有其余12个对照品，即选定具有代表性的12个共有色谱峰作为特征峰，共有峰保留时间见表7，色谱峰面积见表8。以“虎杖叶3号”样品中的12个色谱峰峰面积积分值为参照，比较各样品中12个色谱峰折算后峰面积相对值的差异，结果见表9。
表6 对照品、药材及成品对应成分一览表
表7 12个色谱峰保留时间一览表
表8 12个色谱峰峰面积一览表
表9 12个色谱峰折算后峰面积相对值一览表(以“虎杖叶3号”为参照)
Claims (3)
1.一种虎杖叶指纹图谱HPLC方法，包括制备待测样品及用HPLC检测样品，其特征在于：用HPLC方法同时检测虎杖叶原药及其制品中的指标成分没食子酸、绿原酸、阿魏酸、虎杖苷、芦丁、异槲皮苷、槲皮苷、白藜芦醇、槲皮素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚，其HPLC条件为：检测波长：270nm；色谱柱：C18，5μm，250×4.6mm，柱温：30℃；流动相为乙腈-0.4％冰醋酸水溶液，流速：1mL/min，进样量：10μL；梯度洗脱条件：
0-10min,10-13％乙腈；
10-30min，13-15％乙腈；
30-45min,15-16％乙腈；
45-50min,16-20％乙腈；
50-75min,20-25％乙腈；
75-95min,25-30％乙腈；
95-105min,30-65％乙腈；
105-120min，65-70％乙腈；
120-125min,70-95％乙腈；
125-127min,95-10％乙腈；
127-142min,10％乙腈。
2.根据权利要求1所述虎杖叶指纹图谱HPLC方法，其特征在于：所述制备待测样品为：称取虎杖叶原药及其制品的待测样品0.1-0.8g，至100mL磨口锥形瓶中，精密加入体积比4:1的甲醇和25％盐酸50mL，称重，回流1h，放至室温，补重，滤过，精密量取滤液5mL，至50mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，离心，即得待测样品。
3.权利要求1或2所述虎杖叶指纹图谱HPLC方法在虎杖叶胶囊检测中的应用。
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