CN101810696B

CN101810696B - 一种苹果总三萜的制备方法及用该方法制备的苹果总三萜

Info

Publication number: CN101810696B
Application number: CN2010101635278A
Authority: CN
Inventors: 何祥久; 胡慧; 吴意轩
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2010-04-28
Filing date: 2010-04-28
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2030-04-28
Also published as: CN101810696A

Abstract

本发明为一种苹果总三萜的制备方法及用该方法制备的产品。以苹果为原料，采用醇或含水醇为提取溶剂，提取的浸膏经大孔树脂纯化，得到总三萜含量大于85％的苹果总三萜，其中主要成分为乌苏酸和齐墩果酸，两者的含量之和经HPLC检测大于50％。本发明具有制备工艺简单、可大规模制备且总三萜含量高等优点。本发明制备的苹果总三萜品质优良，具有很强的抑制人癌细胞增殖活性，具有预防和治疗癌症作用和较强的抗炎、抗过敏、抗糖尿病、降脂护肝作用。可广泛应用于医药、保健食品等领域。本发明可直接以苹果皮和苹果渣为原料，是典型的利废环保产品。

Description

一种苹果总三萜的制备方法及用该方法制备的苹果总三萜

技术领域

本发明属于医药及保健食品技术领域，特别涉及一种活性三萜物质的制备方法及用该方法制备的产品。

背景技术

长期以来，苹果大量用于鲜食和果汁生产，随着我国果汁加工业的迅猛发展，苹果汁加工的主要副产品-苹果皮和苹果渣大量产生，而它们正是活性三萜物质的良好来源。但是目前这些资源除少量的被加工成饲料和用于提取苹果多酚外，绝大部分都被当做垃圾扔掉，尤其是生产旺季，大量的苹果皮和苹果渣堆积腐烂，这不仅造成资源的巨大浪费，还严重污染了环境，因此充分利用这些废弃资源不仅具有良好的经济效益还具有社会效益。

目前已报导的苹果总三萜类化合物的提取方法有超声提取法，此法提取总三萜类化合物目前未能应用于大批量生产，同时此法所选用的化学溶剂相对较多，其应用受到一定的限制。

发明内容

本发明的目的就是针对上述背景技术的状况而提供一种工艺简单且大批量制备可行的苹果总三萜的制备方法和用该方法获得的高品质的苹果总三萜。。

本发明方法采用的技术方案是：以苹果为原料通过提取和纯化制备苹果总三萜。其特征在于纯化是对苹果提取物依次进行：

1、大孔树脂吸附和解析；

2、不同浓度的洗脱溶剂洗脱；

3、收集富含三萜类化合物的洗脱液。

其中：大孔树脂可以是极性、中等极性、弱极性或非极性大孔树脂；洗脱溶剂包含有无水或含水乙醇、无水或含水甲醇。

本发明方法的具体步骤可以是：

一、提取：

1、对原料用浓度≥0的醇液进行回流提取，收集提取液；

2、对提取液进行减压浓缩，获取苹果提取物；

其中，醇液包含有无水或含水乙醇、无水或含水甲醇。

二、纯化：

1、用醇液对苹果提取物进行溶解，并将所得溶解液滴加到装有大孔树脂的柱床中后进行静止吸附；

2、用水和不同浓度的醇液对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱分离，收集富含三萜类化合物的洗脱液；

3、对上步收集到的洗脱液进行浓缩，获取苹果总三萜。

为了进一步提高苹果总三萜的性能和质量：

1、提取时：

1)醇液选择浓度为70％的乙醇溶液；

2)醇液和原料的重量比值在3-10的范围内进行选择；

2、纯化时：

1)用浓度95％的乙醇溶液对苹果提取物进行加热超声溶解；

2)苹果提取物溶解液滴加到大孔树脂柱中后的静止吸咐时间≥2小时；

3)对静止吸附样品后的大孔树脂柱进行梯度洗脱的醇液选择为乙醇溶液，其组成梯度的浓度选择为50％、70％、95％，且每一浓度洗脱4个保留体积；

4)收集95％乙醇浓度的洗脱液。

本发明的产品是根据本发明的方法制得的，本发明的产品中的主要成分含量为：总三萜≥85％；乌苏酸≥44％；齐墩果酸≥6％。

经高效液相色谱分析：利用本发明方法制备的苹果总三萜包括多种三萜类成分，其中尤以乌苏酸(Ursolic acid)和齐墩果酸(Oleanolic acid)两个三萜类成分为主要成分，两者的含量之和在苹果总三萜中大于50％。利用比色法对本发明制备的苹果总三萜进行含量测定，以乌苏酸为对照品，其总三萜含量大于85％。

经DPPH烷自由基测定方法测试表明：本发明的产品具有很强的清除烷自由基能力，具有抗氧化作用；经MTT法测试表明：本发明的产品具有很强的抑制人癌细胞增殖活性，具有预防和治疗癌症作用；不仅如此，还具有较强的抗炎、抗过敏、抗糖尿病、降脂护肝作用。可广泛应用于医药、保健食品及化妆品等领域。

本发明不仅工艺简单、可大规模生产：而且可直接利用苹果产业的废弃原料(苹果皮和苹果渣)，从中提取苹果总三萜，变废为宝。

附图说明

图1为本发明所述苹果总三萜的HPLC图谱；

图2为相同条件下乌苏酸的HPLC图谱；

图3为相同条件下齐墩果酸的HPLC图谱；

图4为本发明所述苹果总三萜类化合物的HPLC指纹图谱。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步阐述本发明。

实施例一：

一、制备苹果总三萜：

取未经加工处理的新鲜红富士苹果皮，经充分清洗干净后，置于70℃鼓风干燥箱中充分干燥后用3倍量的70％乙醇回流提取，提取4次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩得苹果浸膏。取浸膏3.0g用20ml 95％乙醇加热超声溶解，以5ml/min的速度将样品溶液滴加在已装好的D-101大孔树脂上，静止吸附2h，依次用水、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集95％乙醇洗脱液浓缩得所述苹果总三萜0.14g。

二、含量测定及指纹图谱分析

一)含量测定：

1、总三萜含量测定：

1)溶液配制：

a、5％香草酸-冰醋酸溶液：精确称取香草醛0.5g，迅速用适量冰醋酸溶解并转入10ml容量瓶中，冰醋酸定溶，摇匀，以备当日使用。

b、乌苏酸对照品溶液：精密称取乌苏酸10.2mg，色谱甲醇定容于25ml容量瓶中，即得0.408mg/ml的乌苏酸标准溶液。

c、样品溶液：准确称取实施例一中所得总三萜类化合物10.0mg，用甲醇定容于25ml容量瓶中，即得0.40mg/ml的样品溶液。

2)测定含量：

使用分光光度法测定样品中总三萜含量：精密吸取乌苏酸对照品溶液0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8ml，分别加入新鲜配制的5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml和1ml高氯酸，摇匀，在60℃恒温水浴下反应20min后，冰水冷却，再加入5ml冰醋酸，摇匀，以试剂空白为参比，在550nm波长下测定体系的吸光度，以乌苏酸对照品的质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，作图得标准工作曲线，测得总三萜的含量为93.0％±4.2％。

2、主要成分乌苏酸和齐墩果酸含量测定

精密称取实施例一中所得总三萜类化合物12.5mg，用流动相(甲醇∶水∶三氟乙酸＝900∶100∶1)溶解定容到25ml容量瓶中，过0.45μm微孔滤膜，即得所述总三萜类化合物溶液；

取乌苏酸对照品12.5mg，以流动相(甲醇∶水∶三氟乙酸＝900∶100∶1)溶解定容，制成0.5mg/ml的标准品溶液；将其配成系列0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mg/ml的梯度溶液，制备标准曲线。

分别精密吸取上述梯度标准品溶液和总三萜类化合物溶液10μl，参照2010版《中国药典》一部附录中规定的高效液相含量测定方法，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，测定条件为：色谱柱：

100RP-100e(5μm)；检测波长：210nm；流动相：CH₃OH-H₂O-CF₃COOH＝900∶100∶1；流速：0.6ml/min；柱温：40℃。记录色谱图，计算乌苏酸含量为45.1％。

取齐墩果酸对照品2.6mg，以流动相溶解定容，制成0.26mg/ml的标准品溶液；将其配成系列0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07mg/ml的梯度溶液，制备标准曲线。

分别精密吸取上述梯度标准品溶液和总三萜类化合物溶液10μl，参照2010版《中国药典》一部附录中规定的高效液相含量测定方法，用高效液相色谱仪进行色谱分析，测定条件：色谱柱：

100RP-100e(5μm)；检测波长：210nm；流动相：CH₃OH-H₂O-CF₃COOH＝900∶100∶1；流速：0.6ml/min；柱温：40℃。记录色谱图，计算齐墩果酸含量为6.5％。

结果表明：本实施例制备的苹果总三萜中乌苏酸和齐墩果酸的总含量占51.6％。

二)指纹图谱分析

样品的指纹图谱分析条件为色谱柱：100RP-100e(5μm)；检测波长：210nm；流动相：CH₃OH-H₂O-CF₃COOH＝800∶200∶1；流速：0.6ml/min；柱温：40℃。

苹果总三萜的指纹图谱见附图4。

三、抗氧化活性测试(对烷自由基DPPH·影响试验)

一)溶液及样品配置

1、DPPH储备液：称5mg DPPH，用甲醇溶解至浓度约100mg/L。

2、样品：用DMSO溶解成不同浓度

二)实验过程

1、取995μl DPPH储备液，加入5μl样品溶液，混匀，室温避光20min后在546nm测OD值。

2、调零组以甲醇+DMSO代替DPPH+药物

3、空白组以甲醇代替DPPH

4、对照组以DMSO代替药物

5、

三)实验结果

样品	IC₅₀(μg/ml)
		苹果总三萜	20.2±2.4
乌苏酸	17.2±2.1
		齐墩果酸	41.3±4.1
槲皮素(阳性对照)	35.5±2.8

实验结果表明，本实施例制备的苹果总三萜具有很强的清除烷自由基DPPH·的活性。其中的乌苏酸和齐墩果酸均表现出很强的作用，苹果总三萜和乌苏酸清除烷自由基DPPH·的活性强于槲皮素。

四、抗癌活性测试

一)MTT法

在96孔培养板中每孔加入200μl(含有2.5×10⁴个肿瘤细胞)含10％FBS的RPMI 1640培养基的细胞悬液，置37℃5％CO₂培养箱中培养24h后，实验组分别加入最终浓度100、50、25、12.5和6.25μg/ml实施例一中所述的化合物，对照组则加入等体积溶剂，每组4孔，重复4次。置37℃，5％CO₂培养箱培养2天后，弃去上清液，加入200μl/孔新鲜配制的含50mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4h。弃去上清液，加入200μl DMSO，震荡混匀后，在酶标仪上以波长为492nm，参比波长为450nm测定OD值。计算结果并利用CalcuSyn软件计算出IC₅₀值。

按下式计算药物对肿瘤细胞生长得抑制率：

二)、实验结果

结果表明，本实施例制备的苹果总三萜对人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7及人结肠癌细胞Caco-2等增殖有很强的抑制作用。其中的乌苏酸和齐墩果酸均表现出很强的作用，他们的抑制作用比顺铂更强或接近。

实施例二：

一、制备苹果总三萜：

新鲜红富士苹果榨汁后的苹果渣，放于70℃鼓风干燥箱中充分干燥后用5倍量的70％甲醇回流提取，提取3次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩得苹果浸膏。取浸膏5.0g用50ml 95％乙醇加热超声溶解，以5ml/min的速度将样品溶液滴加在已装好的D-101大孔树脂上，静止吸附2h，依次用水、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集95％乙醇洗脱液浓缩得所述总三萜类化合物成分0.19g。

二、含量测定：

1、总三萜含量测定：

总含量测定过程同实施例1，测定总三萜的含量为91.2％±6.0％。

2、主要成分乌苏酸和齐墩果酸含量测定

精密称取实施例二中所得总三萜类化合物12.7mg，用流动相(甲醇∶水∶三氟乙酸＝900∶100∶1)溶解定容到25ml容量瓶中，过0.45μm微孔滤膜，即得所述总三萜类化合物溶液。

乌苏酸和齐墩果酸的含量测定过程同实施例1，测得乌苏酸含量为44.7％，齐墩果酸含量为6.1％。

结果表明：本实施例制备的苹果总三萜中乌苏酸和齐墩果酸的总含量占50.8％.

三、抗氧化活性测试(对烷自由基DPPH·影响试验)

按照实施例一中的抗氧化测定方法，对实施例二中的苹果总三萜及其主要成分乌苏酸和齐墩果酸进行了测定，测定结果如下：

样品	IC₅₀(μg/ml)
		苹果总三萜	22.0±2.1
乌苏酸	15.1±1.4
		齐墩果酸	40.2±3.2
槲皮素(阳性对照)	35.5±2.8

四、抗癌活性测试

按照实施例一中的抗癌活性测定方法，对实施例二中的苹果总三萜及其主要成分乌苏酸和齐墩果酸进行了测定，测定结果如下：

实验结果表明，本实施例制备的苹果总三萜对人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7及人结肠癌细胞Caco-2等增殖有很强的抑制作用。其中的乌苏酸和齐墩果酸均表现出很强的作用，他们的抑制作用比顺铂更强或接近。

实施例三：

一、制备苹果总三萜：

取未经加工处理的红富士苹果皮，经充分清洗干净后，放于70℃鼓风干燥箱中充分干燥后用10倍量的70％乙醇回流提取，提取3次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩得苹果浸膏。取浸膏2.36g用20ml 95％乙醇加热超声溶解，以5ml/min的速度将样品溶液滴加在已装好的LXAB-8大孔树脂上，静止吸附2h，依次用水、50％乙醇、70％乙醇、95％乙醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱4个保留体积，收集95％乙醇洗脱液浓缩得所述总三萜类化合物成分0.15g。

二、含量测定：

1、总三萜含量测定：

总含量测定过程同实施例1，测定总含量为93.5％±5.1％。

2、主要成分乌苏酸和齐墩果酸含量测定

精密称取实施例三中所得总三萜类化合物12.7mg，用流动相(甲醇∶水∶三氟乙酸＝900∶100∶1)溶解定容到25ml容量瓶中，过0.45μm微孔滤膜，即得所述总三萜类化合物溶液；

乌苏酸和齐墩果酸的含量测定过程同实施例1，测得乌苏酸含量为46.7％，齐墩果酸含量为6.2％。

结果表明：本实施例制备的苹果总三萜中乌苏酸和齐墩果酸的总含量占52.9％。

三、抗氧化活性测试(对烷自由基DPPH·影响试验)

按照实施例一中的抗氧化测定方法，对实施例三中的苹果总三萜及其主要成分乌苏酸和齐墩果酸进行了测定，测定结果如下：

样品	IC₅₀(μg/ml)
		苹果总三萜	20.1±1.7
乌苏酸	15.1±1.4
		齐墩果酸	40.2±3.2
槲皮素(阳性对照)	35.5±2.8

4、抗癌活性测试

按照实施例一中的抗癌活性测定方法，对实施例三中的苹果总三萜及其主要成分乌苏酸和齐墩果酸进行了测定，测定结果如下：

Claims

1.一种苹果总三萜的制备方法，以苹果为原料进行提取和纯化，其特征在于：

所述的提取是依次进行：

a、对原料用浓度＞0的醇液进行回流提取，收集提取液；

b、对提取液进行浓缩，获取苹果提取物；

所述的纯化是对苹果提取物依次进行：

a、用浓度95％的乙醇对苹果提取物进行加热超声溶解；

b、将苹果提取物溶解液滴加到大孔树脂柱中后静止吸咐2小时以上；

c、对静止吸附样品后的大孔树脂柱用浓度分别为50％、70％、95％的乙醇溶液进行梯度洗脱，且每一浓度洗脱4个保留体积；

d、收集95％乙醇浓度的洗脱液。

2.根据权利要求1所述的一种苹果总三萜的制备方法，其特征在于：

所述的提取中：

a、醇液为浓度70％的乙醇溶液；

b、醇液和原料的重量比值为3-10。

3.一种利用权利要求1或2所述方法制备的苹果总三萜，其特征在于主要成分含量：

1)总三萜≥85％；

2)乌苏酸≥44％；

3)齐墩果酸≥6％。