CN106860771B - 一种天麻精制组分的制备方法及天麻精制组分和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种天麻有效组分的制备方法及其在制备防治血管痴呆疾病的药物中的用途。本发明报道的有效组分为天麻精制组分，以中药天麻为原料，经提取、柱分离等工艺制备而得；其特征为该有效组分主要包括8种有效成分，组成明确且具有较好的抗血管痴呆作用，可用于制备防治血管痴呆的药品或保健品。

Description

一种天麻精制组分的制备方法及天麻精制组分和应用
技术领域
本发明属于药物领域。具体涉及一种由中药天麻中提取并精制的有效组分的制备方法，及其在制备增强记忆、益智药物或防治血管痴呆等疾病药物中的用途。
背景技术
血管性痴呆(Vascular dementia,VD)是由脑血管疾病导致的一系列智能损害综合症，为老年痴呆的主要类型之一，发病率可达3％-6％。其病因病机十分复杂，目前尚无特效药。中药组分具有多成分、多靶点的作用特点，针对痴呆病程长、成因复杂具有独特的优势，从中开发疗效独特的现代中药具有坚实的理论及应用基础。
天麻为治疗脑血管疾病的常用中药，以之开发的多种制剂有良好的抗痴呆作用，如天麻复方制剂天麻醒脑胶囊和天智颗粒均为2015版药典收载品种；石建功等报道天麻中的派立辛类(parishin含量>35％)(中国专利200810132404.0)，具有较好的抗血管痴呆作用；林青等报道天麻乙酸乙酯萃取物及其中的酚类可通过减少脂质过氧化和减轻钙超载而具有脑保护作用(中国专利201010039156.2)。以上研究表明，文献中报道较多的天麻抗血管痴呆的活性部位为parishin部位和乙酸乙酯萃取部位，对于其有效成分研究较少，活性成分局限于派立新类、天麻素(高冬丽等，贵阳医学院学报，2009，)和N6-羟苄腺苷(Huang,N.,et al.,J Nat.Prod.2007,70(4):571-574)等，对于其它活性部位或活性成分研究较少。
我们课题组采用PC12细胞模型及乙酰胆碱酯酶抑制酶学实验对天麻的不同提取部位及分离得到的多种天麻化学成分进行了较系统筛选，研究结果表明，在上述两个模型上活性均较好的化合物为对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、3,5-二羟基苯甲醛等。鉴于有效成分主要集中在天麻脂溶性部位，因此，通过硅胶柱和大孔吸附树脂柱分离工艺优化，成功制备了一种天麻精制组分，该组分组成明确，涵盖了天麻主要8个活性成分，即甲基柠檬酸酯、乙基柠檬酸酯、3,4-二羟基苯甲醛、对羟基苯甲醇、羟苄基柠檬酸酯、对羟基苯甲醛、天麻醚苷和4,4’-二羟基二苄醚。并且精制组分中有效成分总含量大于50％可知，具有良好的药品及保健品开发前景。此外，结合大鼠血清药物化学实验，进一步评测了该组分的成药性，研究结果表明，在大鼠血浆中以上8种成分均能检出，提示该精制组分具有良好的成药性，因此，本发明制备的天麻精制组分，可用于开发增强记忆、益智药物或防治血管性痴呆等疾病的药物或保健品。
发明内容
本发明提供了一种制备防治血管痴呆疾病的药物的天麻有效组分，由中药天麻中提取及精制分离而得，该组分主要包括8种有效成分，组成明确，具有较好的抗血管痴呆作用。
具体内容为：天麻药材用不低于50％的乙醇溶液提取，回流或渗滤提取，得天麻粗提物。天麻粗提物经硅胶柱分离，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯(9:1～3:7，v/v)的流份；或采用大孔吸附树脂柱分离方法，以乙醇水溶液为洗脱剂，梯度洗脱，收集乙醇-水(7:3～10:0，v/v)的流份。该精制组分包括8种有效成分：甲基柠檬酸酯、乙基柠檬酸酯、3,4-二羟基苯甲醛、对羟基苯甲醇、羟苄基柠檬酸酯、对羟基苯甲醛、天麻醚苷和4,4’-二羟基二苄醚。并且精制组分中8种有效组分总含量大于组分干重的50％，符合中药五类新药的申报要求，具有良好的成药性及开发前景。
以本发明所制备的天麻精制组分相较文献具有如下优点和进步：
1)本发明报道的天麻有效组分和文献报道最多的parishin类成分不同，虽然二者活性均较好，但后者属于极性成分，生物利用度较差，而本发明报道的主要活性成分为脂溶性成分，生物利用度较好。具有更好的成药性。
2)本发明所报道的组分为精制组分，组成非常明确，主要有8种有效成分组成，并且精制组分中有效成分总含量大于50％可知，易于开发高水平的现代制剂。
附图说明
图1天麻精制组分的质谱图；1.甲基柠檬酸酯 2.乙基柠檬酸酯 3.3,4-二羟基苯甲醛 4.羟苄基柠檬酸酯 5.对羟基苯甲醇 6.对羟基苯甲醛 7.天麻醚苷 8.4,4’-二羟基二苄醚。
具体实施方式
现结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
实施例1天麻精制组分的提取分离
提取：天麻饮片100g,以70％乙醇回流提取两次，第一次，8倍溶剂，1.5小时；第二次6倍溶剂提取1小时，合并两次提取液，减压浓缩得天麻浸膏。
柱分离：上述浸膏用硅胶(100-200目)拌样后采用硅胶(硅胶300-400目)柱进行分离，首先以3倍柱体积的石油醚洗脱除去杂质，此后以3倍柱体积的石油醚-乙酸乙酯(5:5)为洗脱剂，收集石油醚-乙酸乙酯(5:5)洗脱部分，减压干燥得天麻精制组分(图1)。由图1可知，该精制组分主要包括8种成分，组成非常明确，其总含量约为61％。
实施例2天麻精制组分的提取分离
提取：天麻饮片100g,以80％乙醇回流提取两次，第一次，8倍量溶剂，1.5小时；第二次6倍量溶剂提取1小时，合并两次提取液，减压浓缩得天麻浸膏。
柱分离：上述浸膏用30％乙醇加热溶解，过滤后上大孔吸附树脂柱HPD-100，以3倍柱体积的水洗脱除杂，此后以5倍柱体积的70％乙醇水溶液为洗脱剂，收集70％乙醇洗脱部分，减压干燥得天麻精制组分，该精制组分主要包括8种成分，组成明确，其总含量约为55％。
实施例3天麻精制组分及成分对H2O2损伤大鼠肾上腺铬瘤细胞(PC12)存活率的影响
(1)埋板：设立空白对照组，正常对照组，模型对照组，4个给药组及1个阳性对照组，每组设5个复孔。空白对照组加入100μL空白培养液(DMEM/F12-10％血清)，其余各列加入100μL细胞浓度为8000个细胞/mL的PC12单细胞悬液，接种好的培养板置于CO2培养箱培养。
(2)给药：培养24h后，空白组、正常组和模型组每孔加入100μL培养液，各给药组分别加入终浓度为27μM的各含药培养液100μL，分别为3,4-二羟基苯甲醛、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲醇，天麻组分浓度为50μg/mL。阳性对照组加入含尼莫地平13μM的培养液100μL，轻轻震荡摇匀，继续培养24h。
(3)损伤：小心吸弃各孔中原培养液，空白组和正常对照组加入200μL新培养液，模型组、给药组和阳性对照组每孔均加入200μL浓度为100μM新鲜配制的H2O2-DMEM/F12培养液。损伤2h。各孔小心吸弃原培养液，沿孔壁边缘缓慢加入DMEM/F12培养液200μL，置于CO2培养箱内继续培养24h。
(4)MTT检测：每孔加入浓度为5mg/mL的MTT液20μL，继续孵育4h，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μL DMSO，振荡10min，酶标仪测定各孔吸光度。
细胞活力/％＝处理组OD值/空白对照组OD值×100％。
细胞存活率检测结果如表3所示：待测组分及组合物3,4-二羟基苯甲醛、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲醇均有一定程度的神经保护作用。
表1天麻组分对H2O2损伤PC12细胞存活率的影响(x±s，n＝5)
Figure BDA0000873623550000031
**P<0.001，与正常组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组组比较。
实施例4天麻组合物对乙酰胆碱酯酶抑制活性
采用Ellman’s经典反应体系:140μL 0.1mol/L PBS(pH 8.0)，20μL酶液(0.22U/mL)，20μL样品溶液依次加入96孔酶标板，震荡混匀，4℃孵育20min后，加入10μL DTNB(5'5-二硫代双硝基苯甲酸，3nmol/L)，再加入10μL ATCI(碘化硫代乙酰胆碱后反应开始，37℃孵育20min后，用酶标仪在415nm测量吸光度(A)。Ellman方法测抑制率的计算公式：
抑制率＝[1-(A实验-A实验对照)/(A空白-A空白对照)]×100％
其中，空白组用20μL PBS代替20μL样品溶液；空白对照组用20μL PBS代替20μL样品溶液，再用20μL PBS代替20μL酶液；实验空白组用20μL PBS代替20μL酶。实验以毒扁豆碱(Eserine)为阳性对照，所有实验重复3次。
表2天麻组分及成分对乙酰胆碱酯酶的抑制活性(n＝3)
Figure BDA0000873623550000032
结果如表2所示：天麻组分、3,4-二羟基苯甲醛、对羟基具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性，但均低于阳性药毒扁豆碱。

Claims (3)

1.一种天麻精制组分的制备方法，其特征为：以中药天麻为原料，经提取、柱分离制备而得天麻精制组分，该组分主要包括8种有效成分，8种有效组分包括甲基柠檬酸酯、乙基柠檬酸酯、3,4-二羟基苯甲醛、对羟基苯甲醇、羟苄基柠檬酸酯、对羟基苯甲醛、 天麻醚苷和4,4’-二羟基二苄醚；
柱分离过程为天麻提取物经硅胶柱分离得精制组分；
硅胶柱分离是以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，梯度洗脱，先采用洗脱剂中石油醚的体积含量为大于90%到100%洗脱除杂，然后收集石油醚-乙酸乙酯的流份，其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为9:1~3:7；
所述8种有效组分组成明确且其总含量大于组分干重的50%；
天麻药材用质量浓度50%-100%的乙醇溶液提取，提取为回流提取或渗滤提取，提取液或提取液浓缩物为天麻粗提物。
2.一种权利要求1所述制备方法得到的天麻精制组分。
3.一种权利要求2所述制备方法得到的天麻精制组分在制备防治血管痴呆疾病的药物或保健品中的应用。
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