CN109879918B - 天麻中活性化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种天麻中活性化合物及制备方法和应用。将干燥的天麻根茎粉碎后，置于甲醇水溶液中浸提过滤和浓缩，将浸提物分离纯化得一个酚苷类活性化合物。本发明的化合物能显著延长酵母细胞的复制性寿命和时序性寿命，具有潜在的抗衰老功能。研究发现其是通过调节Sod1，Sod2，Skn7，Sir2和Uth1基因的表达，以及提高酵母的抗氧化能力，其中包括提高酵母在氧化应激下的生存率，减少酵母细胞中活性氧和丙二醛的水平，同时增加过氧化氢酶和总谷胱甘肽过氧化物酶活性，从而发挥抗衰老的目的。可在制备抗衰老药物或保健品中的应用。化合物结构式如下：

Description

天麻中活性化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，涉及天麻中活性化合物及其制备方法和应用。

背景技术

伴随着老龄化人口的激增，老年性相关疾病的发病率也在不断的增高，因此寻找延缓衰老的药物已经成为当务之急。自19世纪末应用实验方法研究衰老以来，先后提出许多种学说，包括程序衰老说、体细胞突变说、错误成灾说，自由基说、神经内分泌说、免疫衰老说等等，但仍未形成统一的衰老理论。由此可见，衰老是一个十分复杂的过程，而我国中药资源丰富，有着长达几千年的用药经验，因此从传统的中药材中寻找延缓衰老的物质是我们的优势。

天麻是一种传统的中药材，其药用价值和食用价值都很高。天麻富含天麻素、香草醛、4-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲酸等多种活性化合物等活性化合物，作用于中枢神经系统和心血管系统，具有抗癫痫，抗悸厥，抗风湿；镇静，镇痉，镇痛，补虚，平肝息风的功效。

发明内容

本发明的目的是提供一个天麻中活性化合物bis(4-hydroxy benzyl)ethermono-β-L-galactopyranoside(化合物1)，其结构式如下：

上述化合物1的理化性质为：淡黄色粉末；分子式为C₂₀H₂₄O₈；高分辨率质谱ESI-TOF-MS m/z 410.1813[M+NH₄]⁺,¹H和¹³C NMR如表1所示。

本发明的另一个目的是提供所述天麻中活性化合物的制备方法，通过以下步骤实现：

(1)取干燥的天麻根茎，粉碎后，置于80％的甲醇水溶液中浸提两次，合并提取液，过滤浓缩，获得浸提物；

(2)将浸提物用水溶解，用乙酸乙酯对水溶物进行萃取，得到水层和乙酸乙酯层两个组分；

(3)对水层进行分离纯化，获得上述的天麻活性化合物。

作为优选，步骤(1)中，所述浸提的温度为25～30℃，时间为0.5～24h。更优选，所述浸提的温度为25℃，时间为24h。

进一步地，步骤(3)中，所述分离纯化的过程包括：

(a)以甲醇:水溶剂系统作洗脱剂，对浸提物进行第一次分离，获得目标馏分I；

(b)以二氯甲烷:甲醇溶剂系统作洗脱剂，对所述目标馏分I进行分离，获得活性馏分II；

(c)以甲醇:水溶剂系统作洗脱剂，对所述目标馏分II进行分离，获得目标馏分III；

(d)以甲醇水溶液为流动相，利用反相HPLC对目标馏分III进行纯化，获得目标馏分IV；

(e)以乙腈水溶液为流动相，利用反相HPLC对目标馏分IV进行纯化，获得所述纯的天麻活性化合物1。

步骤(a)中，采用反向硅胶柱层析进行分离；甲醇：水溶剂系统按体积比15:85,20:80,25:75,30:70,35:65,40:60,70:30和100:0依次洗脱，体积比35:65,30:70洗脱的馏分为目标馏分I。

步骤(b)中，采用正向硅胶柱层析进行分离；二氯甲烷:甲醇溶剂系统按照体积比10:0,9:1,8:2,6:4,5:5,4:6,3:7,2:8和0:10依次洗脱，体积比8:2洗脱的馏分为目标馏分II。

步骤(c)中,采用反向硅胶柱层析进行分离；甲醇：水溶剂系统按体积比20:80,25:75,30:70,35:65和100:0依次洗脱，体积比20:80洗脱的馏分为目标馏分III。

步骤(d)中，采用色谱柱5C18-MS-II,(10×250mm)进行分离，所述流动相为20％甲醇水溶液；得到目标馏分IV。

步骤(e)中，采用色谱柱5C18-MS-II,(10×250mm)进行纯化，所述流动相为15％乙腈水溶液；得到纯的天麻活性化合物1。

本发明的再一个目的是提供所述天麻中一个具有活性的新化合物在制备抗衰老药物或保健品中的应用。研究表明，化合物1在抗衰老化合物的体外筛选模型中，可以显著延长酵母细胞的复制性寿命和时序性寿命。

为了进一步探究化合物1在抗衰老方面的作用机理，我们通过氧化应激实验对化合物1进行了抗衰老机理初步研究，发现该化合物1在双氧水存在的条件下可以提高酵母的生存率。进一步，我们发现化合物1能减少酵母细胞中的活性氧和丙二醛水平，并且能增加过氧化氢酶和总谷胱甘肽过氧化物酶的活性。同时也发现该化合物是通过调节Sod1、Sod2、Sir2、Uth1和Skn7的基因表达，提高酵母的抗氧化能力，从而实现延缓衰老目的。

根据氧化自由基学说，氧化压力是导致衰老的主要原因。即使在正常条件下线粒体也会产生有害的代谢产物—活性氧(ROS)，在机体自身障碍或外界因素影响下，活性氧水平可能急剧上升，损伤核酸、蛋白质和脂质等生物大分子，产生断裂核酸、交联蛋白质和丙二醛等有害物质，进而破坏细胞的功能，引起衰老和死亡。

过氧化氢酶可以催化双氧水分解为水与氧气，使得双氧水不至于与氧气在铁螯合物作用下反应生成非常有害的羟基。谷胱甘肽过氧化物酶是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，它能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进双氧水的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。

超氧化物歧化酶1和2具有清除氧自由基，延缓衰老的作用，它们分别由Sod1和Sod2基因编码。Uth1是酵母的衰老基因，参与氧化应激反应。在营养缺乏的状态下删除Uth1基因能延长酵母的寿命，降低对氧化损伤的敏感。Skn7是转录因子，位于Uth1基因的上游，能感受到氧化压力并激活响应氧化应激的基因。化合物1不能延长敲除Sod1、Sod2、Uth1和Skn7后的酵母的复制性寿命，进而证明1是通过调节Sod1、Sod2、Uth1和Skn7基因的表达，从而实现酵母细胞复制性寿命的延长的。

Sir2是一个高度保守的长寿基因，有研究表明，提高Sir2基因的表达水平能延长多种生物模型的寿命。化合物1能增加酵母中Sir2的基因表达，降低Uth1的基因表达，更加证明Sir2和Uth1两个基因在1发挥抗衰老作用中非常重要。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)在酵母衰老模型K6001酿酒酵母细胞中，本发明从天麻中提取出的化合物1能够显著延长酵母细胞的复制性寿命，同时在YOM36酿酒酵母细胞中，化合物1能显著延长酵母细胞的时序性寿命，具有很强的抗衰老能力。

(2)本发明天麻活性化合物对延缓衰老及治疗衰老性疾病方面的新药研发进行基础性研究，具有重要的现实意义。

附图说明

图1为实施例2中制备获得的天麻活性化合物1对酵母K6001复制性寿命的影响结果；其中，C(Control)表示阴性对照；Res(Resveratrol)为阳性对照白藜芦醇(10μM)；1表示浓度为1μM的1，3表示浓度为3μM的1，10表示浓度为10μM的1。

图2为实施例3中活性化合物1对酵母YOM36时序性寿命的影响结果；其中，Control表示阴性对照；1(1μM)表示浓度为1μM的1，1(3μM)表示浓度为3μM的1。

图3为实施例4中活性化合物1抗氧化应激活性定性实验结果；其中，Control表示阴性对照；Resveratrol为阳性对照白藜芦醇(10μM)；1μM表示浓度为1μM的1，3μM表示浓度为3μM的1，10μM表示浓度为10μM的1。

图4为实施例5中活性化合物1抗氧化应激活性定量实验结果；其中，Control表示阴性对照；Res(Resveratrol)为阳性对照白藜芦醇(10μM)；1表示浓度为1μM的1，3表示浓度为3μM的1，10表示浓度为10μM的1。

图5为实施例6中活性化合物1对酵母中活性氧水平的影响结果；其中，Control表示阴性对照；Res(Resveratrol)为阳性对照白藜芦醇(10μM)；1表示浓度为1μM的1，3表示浓度为3μM的1，10表示浓度为10μM的1。

图6为实施例7中活性化合物1对酵母中丙二醛水平的影响结果；其中，Control表示阴性对照；Res(Resveratrol)为阳性对照白藜芦醇(10μM)；1表示浓度为1μM的1，3表示浓度为3μM的1，10表示浓度为10μM的1。

图7为实施例8中活性化合物1对酵母中过氧化氢酶活性的影响结果；其中，Control表示阴性对照；Res(Resveratrol)为阳性对照白藜芦醇(10μM)；1表示浓度为1μM的1，3表示浓度为3μM的1。

图8为实施例9中活性化合物1对酵母中总谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响结果；其中，Control表示阴性对照；Res(Resveratrol)为阳性对照白藜芦醇(10μM)；1表示浓度为1μM的1，3表示浓度为3μM的1。

图9为实施例10中活性化合物1对酵母中基因表达的影响结果；其中，C(Control)表示阴性对照；1表示浓度为1μM的1，3表示浓度为3μM的1；Sir2，Uth1，TORC1分别表示Sir2，Uth1，TORC1基因的表达。

图10为实施例11中活性化合物1对酵母突变菌株Δsod1，Δsod2，Δuth1，Δskn7复制性寿命的影响结果；其中，Control(K6001)表示未添加活性化合物1的K6001酵母；Res(10μM，K6001)表示添加阳性对照白藜芦醇(10μM)的K6001酵母；1(3μM，K6001)表示添加3μM活性化合物1的K6001酵母；Control(Δsod1)，Control(Δsod2)，Control(Δuth1)，Control(Δskn7)分别表示未添加活性化合物1的K6001酵母突变菌株Δsod1，Δsod2，Δuth1，Δskn7；1(3μM，Δsod1)，1(3μM，Δsod2)1(3μM，Δuth1)1(3μM，Δskn7)分别表示添加3μM活性化合物1的K6001酵母突变菌株Δsod1，Δsod2，Δuth1，Δskn7。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1

1、天麻中活性化合物1的制备，具体步骤如下：

(1)将1.2kg干燥的天麻根茎置于80％的甲醇水溶液中，室温下浸提两次，每次24小时(震荡)；经抽滤浓缩后，得到浸提物121g。

(2)将得到的浸提物用水溶解，用乙酸乙酯对水溶物进行萃取，得到水层和乙酸乙酯层两个组分。

(3)将水层用反向硅胶柱层析进行分离，以甲醇：水溶剂系统作洗脱剂，甲醇：水溶剂系统按体积比15:85,20:80,25:75,30:70,35:65,40:60,70:30和100:0依次洗脱，取体积比35:65,30:70洗脱的馏分1.8g。

(4)将步骤(3)所得馏分用正向硅胶柱层析进行分离，二氯甲烷:甲醇溶剂系统按照体积比10:0,9:1,8:2,6:4,5:5,4:6,3:7,2:8和0:10依次洗脱，取体积比8:2洗脱的馏分90mg。

(5)将步骤(4)所得馏分用反向硅胶柱层析进行分离，甲醇：水溶剂系统按体积比20:80,25:75,30:70,35:65和100:0依次洗脱，体积比20:80洗脱的馏分9.5mg。

(6)将步骤(5)所得馏分用反向HPLC进行分离纯化，色谱条件：色谱柱5C18-MS-II,(10×250mm)，流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为20％甲醇水溶液，得到目标馏分IV。

(7)将步骤(6)得目标馏分IV用反向HPLC再次进行纯化，色谱条件：色谱柱5C18-MS-II,(10×250mm)，流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为15％乙腈水溶液，得到纯的活性化合物1 1.6mg(保留时间为20.7min)。

2、活性化合物1的理化特征及化学结构分析

经¹³C NMR、¹H NMR、HRMS、HSQC、HMBC、NOESY分析，结果如下：

化合物1的理化性质：淡黄色粉末，分子式为C₂₀H₂₄O₈；高分辨率质谱ESI-TOF-MS m/z 410.1813[M+NH₄]⁺。¹H NMR和¹³C NMR的数据见下表1。

表1 1 ¹H NMR和¹³C NMR数据(CD₃OD；δ/ppm,J/Hz).

实施例2天麻中活性化合物1延长复制性寿命分析

目前，用于抗衰老研究的生物模型主要有酵母，果蝇，线虫和老鼠。本实施例选择酿酒酵母作为抗衰老研究的活性系统；因为酵母是单细胞的真核生物，生命周期短，已获其完整的基因组数据，是目前常用的衰老模型生物。

与此同时，以白藜芦醇作为阳性对照，白藜芦醇是目前众所周知的、在多种动物模型上显示抗衰老作用的小分子化合物。

分析方法的步骤如下：

(1)从-30℃冰箱取出K6001酵母菌株，用PBS洗涤三次，每次5ml，除去其中的甘油；再加入1ml PBS，吹打，使其悬浮后加入到5ml液体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，3％的半乳糖)中；28℃振摇(180r/min)培养24小时。

(2)培养结束后，用5ml PBS洗涤三次，除去其中的液体培养基，用血球计数板计数，计算酵母的浓度。

(3)采用无水乙醇作溶剂，配制1μM，3μM和10μM的1，10μM的白藜芦醇，备用。

(4)在灭菌的培养皿中加入5ml的固体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％的琼脂粉)，待培养基凝固后，向其中分别加入步骤(3)中配制好的样品，溶剂挥发后加入4000个酵母，用涂布器涂抹均匀，28℃恒温培养48小时。

(5)显微镜下每个皿随机数出40个母细胞分别产生的子细胞个数，并记录、作图分析，结果见图1。

由图1可知，阴性对照(未添加样品，Control)的平均寿命为7.35±0.44，阳性对照(添加10μM的白藜芦醇，Resverstrol)是10.57±0.67**；1μM，3μM和10μM浓度的1分别是9.93±0.62*,10.13±0.65**,9.69±0.61*。(*p<0.05,**p<0.01)。

因此，1能延长酵母的复制性寿命。

实施例3天麻中活性化合物1延长时序性寿命分析

(1)第-3天：从-30℃冰箱取出YOM36酵母菌株，用PBS洗涤三次，每次5ml，除去其中的甘油；再加入1ml PBS，吹打，稀释一定倍数并用细胞计数板计数。

(2)玻璃培养皿灭菌后，向直径为9cm的培养皿中倒入20mL灭菌后且高温的固体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％的琼脂粉)，待培养基凝固后，根据稀释倍数，加入一定体积的酵母溶液，使每个皿的酵母数量为200个左右，用涂布器将其涂布均匀，放入28℃恒温培养箱中培养2天，使其恢复生长能力。

(3)第-1天：从固体培养基上挑去一个单一的酵母菌落，接种至液体培养基(0.17％酵母氮源(不含氨基酸和硫酸铵)，0.5％硫酸铵，2％葡萄糖)中，28℃振摇(180r/min)培养24小时。

(4)第0天：吸取适量酵母培养液，加入至新的液体培养基(0.17％酵母氮源(不含氨基酸和硫酸铵)，0.5％硫酸铵，2％葡萄糖)中，使初始OD值(OD₆₀₀，吸光度)为0.01，并分别加入阴性或1μM和3μM的1，28℃振摇(180r/min)培养。

(5)每2或4小时测定并记录各组的OD值，绘制酵母的生长曲线。

(6)第3天：酵母进入稳定生长期，分别取50μL的各组酵母培养液，稀释一定倍数，并用细胞计数板计数，根据稀释倍数进行稀释，在固体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％的琼脂粉)上，加入40μL的酵母溶液，使其数量为200个左右，每组4个重复。用灭菌后的涂布器将其涂布均匀，放入28℃恒温箱中培养48小时。48小时后，计数个培养皿中的菌落数，取平均值。

(7)第5天：重复步骤(6)的操作。

(8)第7天：重复步骤(6)的操作后，分别添加阴性或1μM和3μM的1至各组酵母培养液中。

(9)随后，每隔2天重复步骤(6)的操作，直至生存率降为0％。

(10)计算生存率：将第3天的菌落数生存率计为100％，其余生存率＝第n天的菌落数/对应组第3天的菌落数x 100％，并绘制曲线。

由图2可知，阴性对照(未添加样品，Control)生存率为0％时的天数是11天，1μM和3μM浓度的1分别是11天和17天。

因此，1能延长酵母的时序性寿命。

实施例4天麻中化合物1提高酵母抗氧化应激活性定性分析

(1)将-30℃保存的野生型酵母BY4741用5ml PBS洗涤三次，除去其中的甘油；加入1ml无菌水，吹打使其悬浮，加入到5ml葡萄糖培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖)中；将其放入摇床，28℃振摇(180r/min)培养24小时，使其恢复生长能力。

(2)将BY4741接种到25mL新的葡萄糖培养基，调整OD₆₀₀值为0.1，然后分别与1、3、10μM的1和阳性对照品(10μM的白藜芦醇，Resverstrol)孵育，28℃振摇(180r/min)培养12小时。

(3)取各组含有相同酵母细胞的培养液5μL滴在含有9mM H₂O₂的葡萄糖固体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％琼脂)上；28℃培养4天后观察酵母的生长状况并照相，观察结果见图3。

由图3可见，与阴性对照相比，在含有9mM H₂O₂的葡萄糖固体培养基上，能观察到1μM、3μM和10μM的化合物1明显提高了酵母的抗氧化应激能力，从而提高酵母的生存率。

实施例5天麻中化合物1提高酵母抗氧化应激活性定量分析

(1)将-30℃保存的野生型酵母BY4741用5ml PBS洗涤三次，除去其中的甘油；加入1ml无菌水，吹打使其悬浮，加入到5ml葡萄糖培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖)中；将其放入摇床，28℃振摇(180r/min)培养24小时，使其恢复生长能力。

(2)将BY4741接种到25mL新的葡萄糖培养基，调整OD₆₀₀值为0.1，然后分别与1、3、10μM的1和阳性对照品(10μM的白藜芦醇，Resverstrol)孵育，28℃振摇(180r/min)培养12小时。

(3)准备固体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％的琼脂粉)并灭菌，灭菌后将其放入50℃的水浴锅中，将其分为两组。待温度稳定，其中一组加入一定量的双氧水，使双氧水的终浓度为5mM，混匀后倒入无菌的6cm的培养皿，另一组直接倒入无菌的6cm的培养皿。待培养基凝固后，制成两组不同的固体平板，分别含0mM或5mM的双氧水。

(4)将各组酵母培养液分别稀释一定倍数，并用细胞计数板计数，随后向两组固体平板中加入200个不同样品处理的酵母细胞，用涂布器涂布均匀，放入培养箱培养3天。

(5)计数每个皿中的菌落数，求出各样品处理组的生存率(5mM双氧水组的菌落数/0mM双氧水组的菌落数x 100％)，作图分析。

由图4可见，阴性对照(未添加样品，Control)的生存率为48.41％±0.80，阳性对照(添加10μM的白藜芦醇，Resverstrol)是59.27％±0.70***；1μM，3μM和10μM浓度的1分别是59.06％±0.46***,71.31％±0.99***,65.58％±0.95***。(***p<0.001)。

因此，化合物1能提高酵母抗氧化应激活性，从而提高酵母的生存率。

实施例6天麻中活性化合物1减少酵母中活性氧分析

(1)将-30℃保存的野生型酵母BY4741用5ml PBS洗涤三次，除去其中的甘油；加入1ml无菌水，吹打使其悬浮，加入到5ml葡萄糖培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖)中；将其放入摇床，28℃振摇(180r/min)培养24小时，使其恢复生长能力。

(2)将BY4741接种到25mL新的葡萄糖培养基，调整OD₆₀₀值为0.1，然后分别与1、3、10μM的化合物1和阳性对照品(10μM的白藜芦醇，Resverstrol)孵育，28℃振摇(180r/min)培养23小时。

(3)23小时后，取出酵母培养液，混匀，分别从各组取出1mL培养液，并分别加入DCFH-DA至各组培养液，使其终浓度为10μM。

(4)将上述各组含DCFH-DA的酵母培养液放置于黑暗环境中，振摇培养，期间每隔15分钟振荡混匀一次，保证DCFH-DA与酵母细胞充分接触。

(5)1h后，用PBS离心12000rpm，2min，清洗上述酵母培养液三次，再加入220μLPBS，混匀，取出200μL加至避光的96孔板中，在激发光488nm，发射光525nm时测定DCF荧光强度。

(6)剩余的酵母培养液稀释后，用血球计数板计数；

(7)计算1x 10⁷个酵母细胞所发射的荧光强度。

由图5可见，阴性对照(未添加样品，Control)中1x 10⁷个酵母细胞所发射的荧光强度为2.43±0.24，阳性对照(添加10μM的白藜芦醇，Resverstrol)是1.19±0.17***；1μM，3μM和10μM浓度的1分别是1.13±0.19***,1.27±0.22**,1.38±0.13**。(**p<0.01，***p<0.001)。

因此，化合物1能降低酵母细胞中活性氧的水平。

实施例7天麻中活性化合物1减少酵母中丙二醛分析

(1)将-30℃保存的野生型酵母BY4741用5ml PBS洗涤三次，除去其中的甘油；加入1ml无菌水，吹打使其悬浮，加入到5ml葡萄糖培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖)中；将其放入摇床，28℃振摇(180r/min)培养24小时，使其恢复生长能力。

(2)将BY4741接种到25mL新的葡萄糖培养基，调整OD₆₀₀值为0.1，然后分别与阴性对照，1、3、10μM的化合物1和阳性对照品(10μM的白藜芦醇，Resverstrol)孵育，28℃振摇(180r/min)培养24小时。

(3)培养结束后，离心后去除上清液，下层酵母用PBS清洗三次后，采用多次超声和反复冻融的方法破裂细胞，提取酵母蛋白。

(4)按照BCA蛋白定量试剂盒方法，测定蛋白质浓度。

(5)按照MDA试剂盒方法，测定各组的MDA含量。

(6)计算各组每毫克蛋白的MDA含量。

由图6可见，阴性对照(未添加样品，Control)中每毫克蛋白的MDA含量为0.62±0.01，阳性对照(添加10μM的白藜芦醇，Resverstrol)是0.53±0.01**；1μM，3μM和10μM浓度的化合物1分别是0.54±0.02**,0.53±0.02**,0.53±0.02**。(**p<0.01)。

因此，化合物1能减少酵母细胞中丙二醛的含量。

实施例8天麻中活性化合物1提高酵母中过氧化氢酶活性分析

(1)将-30℃保存的野生型酵母BY4741用5ml PBS洗涤三次，除去其中的甘油；加入1ml无菌水，吹打使其悬浮，加入到5ml葡萄糖培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖)中；将其放入摇床，28℃振摇(180r/min)培养24小时，使其恢复生长能力。

(2)将BY4741接种到25mL新的葡萄糖培养基，调整OD₆₀₀值为0.1，然后分别与阴性对照，1、3μM的化合物1和阳性对照品(10μM的白藜芦醇，Resverstrol)孵育，28℃振摇(180r/min)培养24小时。

(3)培养结束后，离心后去除上清液，下层酵母用PBS清洗三次后，采用多次超声的方法破裂细胞，提取酵母蛋白。

(4)按照BCA蛋白定量试剂盒方法，测定蛋白质浓度。

(5)按照过氧化氢酶检测试剂盒方法，测定各组的过氧化氢酶活力。

(6)计算各组每毫克蛋白的过氧化氢酶酶活力。

由图7可见，阴性对照(未添加样品，Control)中每毫克蛋白过氧化氢酶活力为2.49±0.01，阳性对照(添加10μM的白藜芦醇，Resverstrol)是2.84±0.01*；1μM，3μM浓度的化合物1分别是2.98±0.01**,3.31±0.02***。(*p<0.05，**p<0.01，***p<00.01)。

因此，化合物1能提高酵母细胞中过氧化氢酶活性。

实施例9天麻中活性化合物1提高酵母中总谷胱甘肽过氧化物酶活性分析

(1)将-30℃保存的野生型酵母BY4741用5ml PBS洗涤三次，除去其中的甘油；加入1ml无菌水，吹打使其悬浮，加入到5ml葡萄糖培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖)中；将其放入摇床，28℃振摇(180r/min)培养24小时，使其恢复生长能力。

(2)将BY4741接种到25mL新的葡萄糖培养基，调整OD₆₀₀值为0.1，然后分别与阴性对照，1、3μM的化合物1和阳性对照品(10μM的白藜芦醇，Resverstrol)孵育，28℃振摇(180r/min)培养24小时。

(3)培养结束后，离心后去除上清液，下层酵母用PBS清洗三次后，采用多次超声的方法破裂细胞，提取酵母蛋白。

(4)按照BCA蛋白定量试剂盒方法，测定蛋白质浓度。

(5)按照总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒方法，测定各组的总谷胱甘肽过氧化物酶活力。

(6)计算各组每毫克蛋白的总谷胱甘肽过氧化物酶活力。

由图8可见，阴性对照(未添加样品，Control)中每毫克蛋白总谷胱甘肽过氧化物酶活力为95.27±6.60，阳性对照(添加10μM的白藜芦醇，Resverstrol)是120.53±4.5*；1μM，3μM浓度的化合物1分别是119.32±6.20*,116.06±4.03*。(*p<0.05)。

因此，化合物1能提高酵母细胞中总谷胱甘肽过氧化物酶活性。

实施例10天麻中活性化合物1对酵母基因表达分析

(1)将-30℃保存的野生型酵母BY4741用5ml PBS洗涤三次，除去其中的甘油；加入1ml无菌水，吹打使其悬浮，加入到5ml葡萄糖培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖)中；将其放入摇床，28℃振摇(180r/min)培养24小时，使其恢复生长能力。

(2)将BY4741接种到25mL新的葡萄糖培养基，调整OD₆₀₀值为0.1，然后分别与阴性对照，1、3μM的化合物1和阳性对照品(10μM的白藜芦醇，Resverstrol)孵育，28℃振摇(180r/min)培养24小时。

(3)培养结束后，用PBS清洗酵母细胞，3000rpm离心三次，每次各15min，去除上清液，将酵母细胞分别转移至EP管，并加入TES缓冲液，涡旋混匀。

(4)用热苯酚法提取RNA。具体操作如下：各EP管加入苯酚-氯仿(5：1)混合液400μL，充分涡旋混匀；然后将上述EP管置于65℃水浴中20min，每5min涡旋混匀样品，每次持续1min，水浴后放于-30℃冰箱中30min。

(5)12000rpm离心15min，取出水层至新的EP管，并加入苯酚-氯仿(5：1)混合液400μL，涡旋混匀3次，每次30s，之后12000rpm离心15min。

(6)重复步骤(5)3次，最后取出水层，加入300μL氯仿，涡旋混匀3次，每次30s，并以12000rpm的转速离心3min。

(7)移出水层，加入600μL无水乙醇。

(8)按照RNA纯化试剂盒的方法纯化RNA。

(9)用酶标仪测定各组的RNA浓度。

(10)根据RNA浓度，用RNase free水稀释RNA，使其体积为7μL，含量为5μg。

(11)按照cDNA第一链合成试剂盒，配制反应体系。

(12)混匀并离心后，42℃水浴50min，70℃水浴15min，随后快速离心，置于冰上冷却；

(13)100℃水浴10min，使酶灭活变性。

(14)用RNase free水将cDNA模板稀释一倍。

(15)用TE缓冲液稀释引物至10μM。

(16)按下表2配制不同的反应体系(以tubulin为例)。

表2

(17)混合后，将不同的反应体系各25μL分别加至96孔板，按照相应条件进行real-time PCR，反应条件如下：

(18)引物序列如下：

(18)数据处理：使用2^-ΔΔCt的方法处理数据，以TUB(tubulin,微管蛋白)作为内参，得到基因表达的相对水平并进行显著性分析。

由图9可见，阴性对照(未添加样品，Control)的Sir2基因表达水平为1.08±0.14，1μM，3μM浓度的化合物1分别是1.57±0.11*,1.58±0.10*；阴性对照(未添加样品，Control)的Uth1基因表达水平为1.03±0.11，1μM，3μM浓度的化合物1分别是0.68±0.06**,0.70±0.02*；阴性对照(未添加样品，Control)的TORC1基因表达水平为1.03±0.14，1μM，3μM浓度的化合物1分别是1.23±0.07,1.24±0.08(*p<0.05，**p<0.01)。

因此，化合物1能增加酵母细胞中SIR2的基因表达，且能降低UTH1的基因表达，但是对TORC1的基因表达没有显著差异。

实施例11天麻中活性化合物延长突变株复制性寿命分析

1、测试化合物1在3μM的活性浓度下是否能够延长敲除了Sod1和Sod2基因的K6001酵母突变菌株Δsod1和Δsod2的复制性寿命以及分别敲除了Uth1基因和Skn7基因的K6001酵母突变菌株Δuth1和Δskn7的复制性寿命。

分析方法的步骤如下：

(1)从-30℃冰箱取出K6001酵母菌株和K6001酵母突变菌株Δsod1和Δsod2，用PBS洗涤三次，每次5ml，除去其中的甘油；再加入1ml PBS，吹打，使其悬浮后加入到5ml液体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，3％的半乳糖)中；28℃振摇(160r/min)培养24小时。

(2)培养结束后，用5ml PBS洗涤三次，除去其中的液体培养基，用血球计数板计数，计算酵母的浓度。

(3)采用无水乙醇作溶剂，配制3μM的化合物1，备用。

(4)在灭菌的培养皿中加入5ml的固体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％的琼脂粉)，待培养基凝固后，向其中分别加入步骤(3)中配制好的样品，溶剂挥发后。加入4000个酵母(K6001酵母菌株或者K6001酵母突变菌株Δsod1，Δsod2，Δuth1，Δskn7用涂布器涂抹均匀，28℃恒温培养48小时。

(5)显微镜下每个皿随机数出40个母细胞分别产生的子细胞个数，并记录、作图分析，结果见图3。

由图10可知，K6001菌株上阴性对照(未添加样品，Control)的平均寿命为7.55±0.44，阳性对照(添加10μM的白藜芦醇，Resverstrol)是10.28±0.67**，3μM浓度的化合物1是10.28±0.60**；K6001酵母突变菌株Δsod1上阴性对照(未添加样品，Control)的平均寿命为7.18±0.32，3μM浓度的化合物1是7.05±0.31；K6001酵母突变菌株Δsod2上阴性对照(未添加样品，Control)的平均寿命为7.82±0.38，3μM浓度的化合物1是6.90±0.40。K6001酵母突变菌株Δuth1上阴性对照(未添加样品，Control)的平均寿命为9.10±0.49，3μM浓度的化合物1是10.13±0.49；K6001酵母突变菌株Δskn7上阴性对照(未添加样品，Control)的平均寿命为7.53±0.50，3μM浓度的化合物1是6.40±0.36。(**p<0.01)

因此，化合物1在3μM的活性浓度下不能够延长敲除了Sod1和Sod2基因的K6001酵母突变菌株Δsod1和Δsod2的复制性寿命以及分别敲除了Uth1基因和Skn7基因的K6001酵母突变菌株Δuth1和Δskn7的复制性寿命。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 天麻中活性化合物及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 根据酵母sir2基因设计的pcr检测上游引物序列(人工序列Unknown)

<400> 1

cgttccccaa gtcctgatta 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 根据酵母sir2基因设计的pcr检测上游引物序列(人工序列Unknown)

<400> 2

ccacattttt gggctaccat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 根据酵母torc1基因设计的pcr检测上游引物序列(人工序列Unknown)

<400> 3

ttggtacaag gcatggcata 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 根据酵母torc1基因设计的pcr检测下游引物序列(人工序列Unknown)

<400> 4

taccgtcaat ccgcacatta 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 根据酵母uth1基因设计的pcr检测上游引物序列(人工序列Unknown)

<400> 5

cgcctcttct tcctcctctt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 根据酵母uth1基因设计的pcr检测下游引物序列(人工序列Unknown)

<400> 6

accatcggaa ggttgttcag 20

Claims (8)

1.一种天麻中活性化合物，其特征在于，所述天麻活性化合物的结构式如下：

。

2.权利要求1所述的一种天麻中活性化合物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）取干燥的天麻根茎，粉碎后，置于80%甲醇水溶液中震荡浸提两次，过滤浓缩，获得浸提物，温度为25℃，次数为2次，每次时间为24 h；

（2）对浸提物进行溶剂分配，得到水层和乙酸乙酯层两个组分；

（3）对浸提物进行分离纯化，获得所述的天麻活性化合物，分离纯化通过以下步骤实现：

（a）以甲醇 : 水溶剂系统作洗脱剂，对浸提物进行第一次分离，获得目标馏分I；

（b）以二氯甲烷 : 甲醇溶剂系统作洗脱剂，对所述目标馏分I进行分离，获得目标馏分II；

（c）以甲醇 : 水溶剂系统作洗脱剂，对所述目标馏分II进行分离，获得目标馏分III；

（d）以甲醇水溶液为流动相，利用反相HPLC对目标馏分III进行纯化，获得目标馏分IV；

（e）以乙腈水溶液为流动相，利用反相HPLC对目标馏分IV进行纯化，获得所述纯的天麻活性化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（a）中，采用反向硅胶柱层析进行分离；甲醇：水溶剂系统按体积比 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 70:30和 100:0依次洗脱，体积比 35:65,30:70洗脱的馏分为目标馏分I。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（b）中，采用正向硅胶柱层析进行分离；二氯甲烷 : 甲醇溶剂系统按照体积比10:0, 9:1, 8:2, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8和 0:10依次洗脱，体积比 8:2洗脱的馏分为目标馏分II。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（c）中，采用反向硅胶柱层析进行分离；甲醇：水溶剂系统按体积比 20:80, 25:75, 30:70, 35:65 和 100:0依次洗脱，体积比 20:80洗脱的馏分为目标馏分III。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（d）中，采用色谱柱 5C18-MS-II，10 × 250 mm进行分离，所述流动相为 20%甲醇水溶液；得到目标馏分IV。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（e）中，采用色谱柱 5C18-MS-II，10 × 250 mm进行纯化，所述流动相为 15%乙腈水溶液；得到纯的天麻活性化合物 1。

8.根据权利要求1所述的一种天麻活性化合物在制备抗衰老药物或保健品中的应用。

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