CN110894503B - 一种来源于福建金线莲的牻牛儿基焦磷酸合酶基因及其应用 - Google Patents

一种来源于福建金线莲的牻牛儿基焦磷酸合酶基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种来源于福建金线莲的牻牛儿基焦磷酸合酶基因及其应用，涉及基因工程技术领域。该牻牛儿基焦磷酸合酶基因，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明为金线莲品种选育提供了重要依据，也为萜类化合物富集的转基因植物株系研究提供了基础。

Description

一种来源于福建金线莲的牻牛儿基焦磷酸合酶基因及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，且特别涉及一种来源于福建金线莲的牻牛儿基焦磷酸合酶基因及其应用。
背景技术
福建金线莲(Anoectochilus roxburghii)是多年生草本植物，生长在福建地区，属兰科开唇兰属金线莲种。福建金线莲中重要药理活性的物质主要为：甾体类化合物，三萜类化合物，黄酮类化合物，糖类成分，生物碱，强心甙类，酯类，牛磺酸，多种氨基酸，微量元素及无机元素等。在民间素有“药王”、“金草”、“神草”、“鸟人参”等美称。其中，福建金线莲中的甾体、三萜、多糖、黄酮类化合物等被认为是重要的活性物质，这些物质的合成直接影响了福建金线莲的药用价值。
牻牛儿基焦磷酸合酶(Geranyl pyrophosphate synthase，GPPS)是萜类物质合成代谢途径中关键的酶基因，在它的催化下产生牻牛儿基焦磷酸。在萜类物质合成途径中，牻牛儿基焦磷酸位于萜类物质合成的上游。GPPS可以调节碳流，是把合成通道进行转向的关键，是植物萜类物质合成出现分支的关键点。因此GPPS在萜类物质的形成过程中有着非常重要的作用。然而，目前仅在有限的少数几个植物种类中对GPPS蛋白的分离和功能进行过研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于福建金线莲的牻牛儿基焦磷酸合酶基因，此基因编码的氨基酸、含有此基因的重组质粒以及该牻牛儿基焦磷酸合酶基因的应用，为植物中萜类物质的合成代谢研究提供基础。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种来源于福建金线莲的牻牛儿基焦磷酸合酶基因，所述牻牛儿基焦磷酸合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
可选的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
含有上述牻牛儿基焦磷酸合酶基因的重组质粒。
一种上述牻牛儿基焦磷酸合酶基因在萜类物质含量检测中的应用。
本发明实施例的的有益效果是：
(1)本发明提供的牻牛儿基焦磷酸合酶基因是是萜类物质合成代谢途径中关键的酶基因，该基因的成功克隆，为金线莲品种选育提供重要依据，也为萜类化合物富集的转基因植物株系研究提供基础，在福建金线莲中扩展了GPPS基因研究的深度和广度。
(2)本发明使用基于RNA-seq的方法扩增GPPS基因相比原有的RACE技术具有操作简单、容易扩增等优势。
(3)本发明利用扩增的GPPS基因在盐诱导下的表达差异，对下游金线莲中活性成分甾醇的含量富集，提供了以甾醇活性成分为代表的萜类物质富集的诱导方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例4中福建金线莲GPPS基因CDS序列电泳检测结果图；
图2为本发明实施例5中福建金线莲GPPS预测的蛋白三级结构图；
图3为本发明实施例5中福建金线莲GPPS蛋白发生关系树分析图；
图4为本发明实施例6中福建金线莲GPPS基因在100nM NaCl下24h内的表达模式图；
图5为本发明实施例7中福建金线莲GPPS基因代谢产生的总萜在盐诱导下含量变化模式图；
图6为本发明实施例8中三种甾醇混合标准品的HPLC图
图7为本发明实施例8中福建金线莲GPPS基因代谢产生三种甾醇产物在盐诱导下含量变化模式图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例进行具体说明。
在下述各实施例中，将牻牛儿基焦磷酸合酶基因简称为ArGPPS，最终得到来源于福建金线莲的牻牛儿基焦磷酸合酶序列(如SEQIDNO.1所示)及其对应的氨基酸序列(如SEQIDNO.2所示)。
实施例1
本实施例提供了金线莲总叶片RNA的提取，采用大连宝生物有线公司的Trizol提取试剂盒，包括下述步骤：
(1)100mg金线莲新鲜叶片，研磨成粉末后装入(1)1.5mL离心管，然后立即加入1mLRNAiso Plus，颠倒混匀，得到匀浆液。
(2)将充分混匀的匀浆液在室温静置5min，然后12000g，4℃离心5min。
(3)吸取上清液800ml转入新的离心管中，切勿吸取沉淀，然后加入上清液体积200ml氯仿，并剧烈振荡混匀至匀浆液乳化呈乳白色，然后室温静置5min，得到混合液。
(4)将混合液在12000g，4℃离心15min，此时匀浆液分为三层。从上至下分别是：上清液(含RNA)、中间的白色层(大部分为DNA)及有颜色的下层有机相。
(5)吸取步骤(4)中的上清液400ml转移至新的离心管中，切勿触碰中间层。然后加入400ml的异丙醇并颠倒混匀，然后室温下静置10min。
(6)将步骤(5)中静置后的溶液在12000g，4℃离心10min，此时可见白色絮状的RNA。小心弃掉上清液并加入1mL 75％乙醇，上下颠倒洗涤RNA后弃去上清液。
(7)打开离心管盖室温干燥RNA几分钟后，加入30μl的RNase-free水溶解RNA。
(8)使用超微量分光光度计(Bio-Rad，美国)测定A260的值来计算总RNA的浓度，读取OD260/OD280的值来估计总RNA纯度和完整性。用1.2％琼脂糖凝胶电泳，135V快速检测RNA质量。
实施例2
本实施例提供了福建金线莲的转录组测序方法，包括以下步骤：
提取福建金线莲叶片的总RNA，检测RNA提取质量，满足建库要求(RNA浓度>250ng/μL，总量>20μg，OD260/OD280在1.8～2.2之间，完整性良好，RIN>6.5)。然后，用磁珠富集poly(A)mRNA打断成段片段，以此为模板，依次合成第1条cDNA链和第2条cDNA链，经过纯化、洗脱、末端修复、加poly(A)后连接测序接头。选择200bp～700bp大小的片段进行PCR扩增，建立cDNA测序文库，用IIIumina HiSeq 2000进行测序。该部分实验委托美因科技服务有线公司完成。
使用短reads组装软件Trinity(v2.4.0)做De novo组装，得到不含N的Contig组装片段后，使用tgicl(v2.1)进行去冗余，除去序列中质量低、不确定的序列。利用transdecoder(v2.0.1)对上述拼接结果进行基因结构预测，预测结构后用于后续分析。
实施例3
本实施例提供福建金线莲cDNA第一链的合成方法，包括以下步骤：
以实施例1所得的纯化的金线莲叶片总RNA作为模板，以oligo(dT)18为逆转录引物，采用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase(TakaRa China)按照SMARTTMPCR cDNASynthesis Kit(Clontech USA)操作说明进行cDNA第一链的合成。反应体系总体积为20μL。
(1)按照下表1在0.2mL PE管中配制逆转录混合液1；
(2)按照下表1中的试剂在另一0.2mL PE管中配制逆转录混合液2；
(3)将步骤(1)中的逆转录混合液1在65℃保温5min后迅速在冰上急冷2min，离心数秒钟使模板RNA、引物等的混合液聚集于PE管底部；
(4)将步骤(2)中的逆转录混合液2加入步骤(3)的反应后的逆转录混合液1中，用移液枪轻轻混合后42℃反应90min；
(5)80℃保温5min后冰上冷却，得到的cDNA溶液。
表1逆转录混合液1
Figure BDA0002262482280000061
表2逆转录混合液2
Figure BDA0002262482280000062
实施例4
本实施例提供了GPPS基因的克隆方法，包括以下步骤：
(1)引物设计
在实施例2中通过对福建金线莲转录组测序拼接得到GPPS基因的CDS序列的基础上，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，设计好的引物在Oligo6.0中分析物引物的特异性。其中，
上引物：GPPSF:5'-ATGGCTTCCTTCGCTCAGTTCA-3'；
下引物：GPPSR:5'-CTACTTCTGCCTGTATGCGATA-3'。
(2)PCR反应
反应程序为：95℃预变性3min；之后按95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min扩增38个循环。PCR反应采用50μL体系，如表3所示。
表3PCR反应体系
Figure BDA0002262482280000071
*：为实施例3提供的cDNA第一链，稀释3-10倍。
取所得扩增产物50ul经1％非变性琼脂糖凝胶180V电泳30min，GoLdenView染色后紫外线检查扩增片段，结果如图1所示。
(3)目的片段的回收
将步骤(2)所得扩增出来的特异条带用干净的刀片在紫外灯下快而准的从琼脂糖中挖出，置于1.5ml离心管中，用凝胶回收试剂盒(OMEGA公司的E.Z.N.A.TM GelExtraction Kit)回收胶中的DNA片段。
(4)连接反应
将回收的DNA片段克隆于TaKaRa公司的Pmd19-T载体中。连接反应采用连接试剂盒(TaKaRa公司)，连接体系总体积10ul，16℃连接过夜。
(5)感受态细胞的制备：
从LB平板上挑取新活化的E.coLiDH5a单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃，225r/min振荡培养12h左右，直至对数生长后期。将该菌液悬浮液以1：:10-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD600＝0.35-0.5左右。
将培养液转入离心管，冰上放置10min，然后于4℃下3000r/min离心10min.
弃去上清液，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min后，4℃下3000r/min离心10min。
弃上清液，加入4ml预冷含15％甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬浮液。
感受态细胞分装成100ul的小份，贮存于-70℃可保存半年。
(6)质粒DNA的转化：
从-70℃冰箱中取出一管步骤(5)中大肠杆菌感受态细胞DH5a，置于冰上融化。然后在无菌条件下加入10ml连接反应液，轻轻震荡混匀后，在冰上放置30min。42℃水浴热击90s，不要摇动，之后迅速放入冰浴冷却2-3min。加入890ul无Amp的LB液体培养基，混匀后，37℃、150r/min摇床振摇培养，温育1h，得到已转化的菌液。
取100ul已转化的菌液涂于一个LB Amp的培养平板上，正面朝上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住，然后倒转培养皿，37℃避光培养12-16h；随后筛选阳性菌落。
(7)重组菌落的鉴定和保存
从外观上看，一般白色且圆的菌落为阳性，通过菌液PCR进行进一步鉴定，包括以下步骤：
在过夜培养的平板上用灭菌的小枪头挑取几个白色菌落，分别点种于0.1g/L Amp的LB液体培养基的1.5ml离心管中，37℃，150r/min振摇培养4-6h。
取1ul菌悬液作为模板，用引物GPPSF/GPPSR进行PCR扩增，PCR反应条件中裂解时间延长至5min，用1％的非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。如果产物为目的条带时，此菌落为阳性克隆，否则为阴性。同时设不加菌悬液的阴性对照。
取已经鉴定的阳性克隆的菌落悬浮液750ul，加入250ul的灭菌甘油，混匀后，用液氮速冻，置于-70℃冰箱中保存备用。
(8)测序(RNA-seq)
将步骤(7)中保存的菌落悬浮液送英俊生物技术公司测序，所得序列在NCBI的BLastn进行比对分析，验证克隆片段正确。
扩增得到的产物为ArGPPS基因cDNA中间片段，通过包括下述步骤的方法克隆测序，得到核苷酸序列SEQ ID NO.1所述，氨基序列SEQ ID NO.2所述。
实施例5
本实施例提供了ArGPPS的蛋白生物信息学分析方法，包括以下步骤：
使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)对ArGPPS的物理和化学性质进行分析。福建金线莲GPPS基因全长1092bp，编码363个氨基酸。采用InterProScan在线工具预测金线莲GPPS蛋白的保守结构域有11个，包括类异戊二烯合酶结构域超家族位点、聚异戊烯合成酶位点和聚异戊烯合成酶的保守位点。
使用GOR V(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsagor4.html)对GPPS基因的二级结构进行预测。二级结构在线预测的结果表明，α-螺旋(Alpha helix)，占总氨基酸的47.38％，伸展链(Extended strand)，占所有氨基酸的12.12％，无规则卷曲(Random coil)，占总氨基酸的45.50％。
通过SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)来对于福建金线莲的GPPS基因进行蛋白三级结构的预测，通过PyMOL Viewer作图，三维模型见图2。
最后先找到同源性较高植物的GPPS氨基酸序列，利用ClustalW方法进行氨基酸序列的比对，通过MEGA7.0构建Neighbor-joining系统进化树如图3。
实施例6
本实施例为ArGPPS盐诱导表达检测，包括如下步骤：
(1)材料处理
将培养4个月的福建金线莲组培苗移至带孔的塑料泡沫板上，用Hoagland营养液培养3～5d，选长势均匀一致的幼苗进行苯丙氨酸和盐胁迫处理。
处理步骤为：将NaCl加入Hoagland营养液至终浓度100mmol/L，分别处理0h、6h和12h。每个各处理重复3次，在各处理时间点立即取样，液氮速冻后-70℃保存。
(2)RNA提取
取上述3种胁迫处理及对照组幼苗的叶片，分别液氮速冻研磨，使用总RNA提取试剂盒Trizol(TaKaRa，大连)并按照其说明书提取总RNA，步骤如实施例1。
(3)cDNA第一链合成
以提取的RNA为模板，按照表4体系加样，42℃反应2min，去除可能的基因组DNA(gDNA)，用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa，大连)，按表5体系加样，37℃温浴30min，85℃保持5s终止反应以反转录合成cDNA，并于-20℃保存备用。
表4 gDNA去除反应体系
Figure BDA0002262482280000111
表5 cDNA合成体系
Figure BDA0002262482280000112
(4)qRT-PCR引物的特异性检测
以苯丙氨酸和盐胁迫处理0h的cDNA样品3倍稀释后用作qRT-PCR反应的模板，采用50～65℃的退火温度梯度进行qRT-PCR反应来确定最佳的退火温度，采用20μL反应体系(表6)。萜类物质合成代谢途径中关键酶基因的引物序列如表7。
表6 qRT-PCR反应体系
Figure BDA0002262482280000113
表7 qRT-PCR引物序列
Figure BDA0002262482280000121
反应管采用百乐硅化后的0.2mL PCR板。qRT-PCR在iQTM5thermal cycler(Bio-RadUSA)进行。反应程序为：95℃预变性10s；然后按95℃变性10s，50～65℃退火20s，72℃延伸20s，并在此温度收集荧光，读板(Plate read)的程序进行46个循环。之后从50℃开始，以每步0.5℃的温度梯度升高至95℃，每步温度保持5s。
(5)qRT-PCR反应
将步骤(3)中逆转录的cDNA样品3倍稀释后用作qRT-PCR扩增的模板，反应管采用硅化后的0.2mL的PCR板，采用20μL反应体系(表6)，并设立以ddH2O为模板的阴性对照，单个逆转录的cDNA样品设三次重复。
qRT-PCR反应程序为：95℃预变性10s，然后按95℃变性10s，最适退火温度退火20s，72℃延伸20s，并在此温度收集荧光，读板(Plate read)的程序进行46个循环。之后最后从50℃开始，以每步0.5℃的速度升高至95℃，每个温度保持5s，绘制熔解曲线。
(6)qRT-PCR数据分析
本实验采用双标准曲线法对黄酮代谢合成途径中的关键酶基因的表达水平进行相对定量。采用ΔΔCT(Normalized Gene Expression)法计算基因的相对表达量。
0h对照与处理间的表达差异以及各处理间的表达差异用SPSS(version10.0Inc.Chicago，IL)统计分析软件进行分析。设立P＝0.05和P＝0.01两个差异显著性水平。福建金线莲GPPS基因在100nM NaCl下24h内的表达模式图如图4所示。
实施例7
本实施例为诱导条件下ArGPPS基因下游总萜类物质含量检测，具体包括如下步骤：
(1)材料处理
参考实施例6进行材料处理，然后将样品在50℃下烘干至恒重，磨成粉末过60目筛后装入玻璃瓶。
(2)萜类物质提取
提取条件：采用超声波手段对金线莲粉末进行甾醇提取，根据实验室条件，采用额定功率300W的超声波清洗机，体积浓度为95％的乙醇溶剂，液料比为15:1，三个生物学重复。
提取步骤：称取过60目筛的金线莲粉末1g放入锥形瓶中，加入乙醇后放置在超声波清洗机中，在室温下，用超声波清洗机(额定功率300W)提取30分钟(为保持温度恒定，超声15分钟后关闭，冷却一段时间再开启15分钟)。使用真空泵进行真空抽滤得到滤液，用旋转蒸发仪蒸发溶剂浓缩，浓缩后的浓溶液最终用乙醇定容在5ml的容量瓶中，得到萜类物质提取液。
(3)标准曲线制作
精密称取熊果酸标准品1.2mg于10mL的容量瓶中，用体积分数为95％的乙醇溶液溶解、定容，得到120μg/mL的熊果酸标准液。分别取熊果酸标准液配置浓度为24、4.8、0.96、0.192、0.0384μg/mL的系列对照品溶液。在210nm处测定各溶液的紫外光谱，以纵坐标y表示吸光度，横坐标x代表样品浓度，绘制标准曲线，其回归方程为y＝00689x+0.0638，R2＝0.9925。
(4)总萜物质含量测定
取制备好的总萜类物质提取液，稀释后，在210nm处测吸光度。由回归方程，计算出福建金线莲总萜的含量。
其中，总萜的含量＝[(提取总萜质量/福建金线莲样品的质量)]×稀释倍数×100％。
如图5所示，将标准曲线带入计算，在三个时间点下盐诱导的金线莲植株粉末通过超声波提取，总萜物质在盐诱导0h、6h、12h平均含量分别为119.071mg·g-1、170.595mg·g-1、160.677mg·g-1。
实施例8
本实施例为诱导条件下ArGPPS基因下游三种萜类物质含量检测，具体包括如下步骤：
(1)甾醇为代表的萜类物质质谱分析
使用优化后的较优提取条件，并依据高效液相色谱仪的使用说明对样品、标准品进行上样和测定：以实施例7中的萜类物质提取液为样品，以麦角甾醇，豆甾醇，β-谷甾醇为标准品，称取各3.2mg，使用无水乙醇将其初步溶解，难以溶解的部分使用超声波助溶，定容至10ml容量瓶中。即配制成3.2mg/ml的甾醇混合标准品溶液，放在-20℃冰箱保存备用。
准确吸取三种甾醇混合标准品溶液0.2ml，0.5ml，1ml，1.5ml，2ml，3ml。分别定容至10ml容量瓶中超声溶解，通过微孔滤膜过滤后按照液相色谱仪的操作规程分别上样进行测定，流动相为甲醇，流速0.8ml/min，柱温30℃，分两段检测：0-11min检测波长为282nm，测麦角甾醇。11-15分钟检测波长为210nm，测豆甾醇和β-谷甾醇。进样量为20μL。以甾醇浓度为横坐标，峰面积的积分值作为纵坐标，通过回归分析绘制出三种甾醇标准品的标准曲线。
对回收率实验和精密度实验后，使用优化的提取条件，流动相为甲醇，流速0.8ml/min，柱温30℃，分两段检测：0-11min检测波长为282nm，测麦角甾醇。11-15分钟检测波长为210nm，测豆甾醇和β-谷甾醇。进样量为20μL。对盐诱导处理后0h(空白对照)，6h，12h的金线莲粉末进行植物甾醇进行提取，重复三次。取适量提取液用微孔滤膜过滤后，按照高效液相色谱仪的操作说明进行上样，获得色谱图后进行分析，利用标准曲线计算得到样品中甾醇的含量。
(2)以甾醇为代表的萜类物质含量分析
根据HPLC检测方法，试验得到甾醇混合标准品的HPLC图谱如图5，并标定了麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇所对应的位置。9，12，14分钟的峰分别为麦角甾醇，豆甾醇，β-谷甾醇成分的特征指纹峰。由图6可知，标准品的色谱图杂峰较少且杂峰的面积且不占优势，说明甾醇纯度较高，因此可以以6个不同浓度混合标准品的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标绘制标准曲线，并对曲线进行回归分析，找到回归方程分别为：y＝3027.3C-44.823，R＝0.999(麦角甾醇)；y＝1322.8C-9.2995，R＝0.999(豆甾醇)；y＝935.88C-9.8228，R＝0.999(β-谷甾醇)。
如图7所示，将标准曲线带入计算，在三个时间点下盐诱导的金线莲植株粉末通过超声波提取，麦角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇在优化的提取条件下测定的麦角甾醇在0h，6h，12h平均含量分别为1.088mg·g-1、1.279mg·g-1、0.951mg·g-1。豆甾醇在三个时间点下平均含量为0.982mg·g-1、1.398mg·g-1、1.080mg·g-1。β-谷甾醇在三个时间点下的平均含量为1.312mg·g-1、1.552mg·g-1、1.816mg·g-1。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 三明学院
<120> 一种来源于福建金线莲的牻牛儿基焦磷酸合酶基因及应用
<130> 1192138
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1092
<212> DNA
<213> 牻牛儿基焦磷酸合酶基因
<400> 1
atggcttcct tcgctcagtt cacgcctcac acagttggga catgggccct cctatcttcc 60
caccgatccc ctttctttcc cccaaccttg gccgccgtcc gacccccatt ccgctacctc 120
tcccgccgct gcttccagtc cgccaaggcg gtggagatca aggctaaccc ttcctcctcg 180
gatgccatgg ccgactttga cttcaagggt tacatgttag gaaaggcagc atccgtaaat 240
cgagccctcg atcttgcggt tccccttatc cacccgaagc tgatgcacga agcgatgcga 300
tactccctcc tcgccggcgg aaagcgcgtc cgtcccatcc tctgcattgc tgcttgcgag 360
ctagtcggcg gtgatgaggc ctgcgcgatg ccttccgcct gcgccgtcga gattgtccac 420
accatgtccc tcatccacga cgacctaccc tgcatggaca acgacgagtt ccgcagaggt 480
cagcccgctt gccacatcgc ctacggagaa gccctcgcca ttcttgccgg cgacgcgctt 540
ctctccctcg ccttccatcg gattgccaat atcgacaact acccatcaag ggttcctgca 600
accgccattc ttcgagctac ggccgagctt ggccgctgca tcggcgctga agggctcgtc 660
gccggccagg tcgttgacat ggagtccacc ggcctcgacc agcctgttga tattgatcgg 720
ctcgagttca ttcaccttca taaaactgca gcgctactcg agggttcggt ggtgattggg 780
gcaatcatag gaggcggttc cgaaggggag atcgagcgac tgaggcgtta tgcacggtgt 840
atcgggatgc tgtttcaggt ggtggacgac atcctagatg tgaccaaatc ttcgcaggag 900
ttagggaaaa ccgctgctaa ggacttggcc agtgacaaga ccacctaccc gaagctttta 960
gggatggaga agtcaaggga gctcgcggag gagctgctcc atgatgcaaa gtctcagatt 1020
gagggttttg atccgctgaa ggcagccccg ttgcttcaac tcgcagatta tatcgcatac 1080
aggcagaagt ag 1092
<210> 2
<211> 363
<212> PRT
<213> 牻牛儿基焦磷酸合酶基因
<400> 2
Met Ala Ser Phe Ala Gln Phe Thr Pro His Thr Val Gly Thr Trp Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ser Ser His Arg Ser Pro Phe Phe Pro Pro Thr Leu Ala Ala
20 25 30
Val Arg Pro Pro Phe Arg Tyr Leu Ser Arg Arg Cys Phe Gln Ser Ala
35 40 45
Lys Ala Val Glu Ile Lys Ala Asn Pro Ser Ser Ser Asp Ala Met Ala
50 55 60
Asp Phe Asp Phe Lys Gly Tyr Met Leu Gly Lys Ala Ala Ser Val Asn
65 70 75 80
Arg Ala Leu Asp Leu Ala Val Pro Leu Ile His Pro Lys Leu Met His
85 90 95
Glu Ala Met Arg Tyr Ser Leu Leu Ala Gly Gly Lys Arg Val Arg Pro
100 105 110
Ile Leu Cys Ile Ala Ala Cys Glu Leu Val Gly Gly Asp Glu Ala Cys
115 120 125
Ala Met Pro Ser Ala Cys Ala Val Glu Ile Val His Thr Met Ser Leu
130 135 140
Ile His Asp Asp Leu Pro Cys Met Asp Asn Asp Glu Phe Arg Arg Gly
145 150 155 160
Gln Pro Ala Cys His Ile Ala Tyr Gly Glu Ala Leu Ala Ile Leu Ala
165 170 175
Gly Asp Ala Leu Leu Ser Leu Ala Phe His Arg Ile Ala Asn Ile Asp
180 185 190
Asn Tyr Pro Ser Arg Val Pro Ala Thr Ala Ile Leu Arg Ala Thr Ala
195 200 205
Glu Leu Gly Arg Cys Ile Gly Ala Glu Gly Leu Val Ala Gly Gln Val
210 215 220
Val Asp Met Glu Ser Thr Gly Leu Asp Gln Pro Val Asp Ile Asp Arg
225 230 235 240
Leu Glu Phe Ile His Leu His Lys Thr Ala Ala Leu Leu Glu Gly Ser
245 250 255
Val Val Ile Gly Ala Ile Ile Gly Gly Gly Ser Glu Gly Glu Ile Glu
260 265 270
Arg Leu Arg Arg Tyr Ala Arg Cys Ile Gly Met Leu Phe Gln Val Val
275 280 285
Asp Asp Ile Leu Asp Val Thr Lys Ser Ser Gln Glu Leu Gly Lys Thr
290 295 300
Ala Ala Lys Asp Leu Ala Ser Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Lys Leu Leu
305 310 315 320
Gly Met Glu Lys Ser Arg Glu Leu Ala Glu Glu Leu Leu His Asp Ala
325 330 335
Lys Ser Gln Ile Glu Gly Phe Asp Pro Leu Lys Ala Ala Pro Leu Leu
340 345 350
Gln Leu Ala Asp Tyr Ile Ala Tyr Arg Gln Lys
355 360

Claims (3)

1.一种来源于福建金线莲的牻牛儿基焦磷酸合酶基因，其特征在于，所述牻牛儿基焦磷酸合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的牻牛儿基焦磷酸合酶基因，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
3.含有权利要求1所述的牻牛儿基焦磷酸合酶基因的重组质粒。
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登录号：KX237682.1;Hsiao YY等;《GenBank》;20170131;第1-1071位 *
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