CN110078805A

CN110078805A - 枇杷EjAG基因及其编码的蛋白与应用

Info

Publication number: CN110078805A
Application number: CN201910317062.8A
Authority: CN
Inventors: 景丹龙; 梁国鲁; 陈薇薇; 郭启高; 夏燕; 吴頔; 王淑明; 党江波
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-04-19
Filing date: 2019-04-19
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2039-04-19
Also published as: CN110078805B

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷雄蕊和雌蕊特征决定的EjAG基因及其编码的蛋白质和应用。该基因的cDNA序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示。本发明中所述EjAG基因仅在枇杷雌蕊和雄蕊中表达，而在叶、萼片、花瓣中不表达。通过农杆菌介导的花芽浸染法将表达载体pBI121‑EjAG导入拟南芥ag‑1突变体中，转基因拟南芥ag‑1突变体开花时，减少了花瓣数目和轮数恢复了雄蕊和雌蕊。本发明为枇杷EjAG基因改造植物花器官奠定了理论依据，并提供了枇杷EjAG基因改良植物花器官的技术方案，枇杷EjAG基因在拟南芥ag‑1突变体中过表达，使其重瓣花表型恢复成正常的表型，具有很好的应用前景。

Description

枇杷EjAG基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷EjAG基因、其编码的蛋白和应用。

背景技术

枇杷(Eriobotrya japonica)为蔷薇科枇杷属亚热带常绿树种，其花序为顶生圆锥状混合花序，由一个主轴和5～10个支轴构成。每一花穗的花朵数因品种及花穗枝的营养状况不同而存在差异，一般70～100朵花，多的可达150～200朵花。枇杷花分化具有独特的特点：分化时间开始于夏秋，从分化到开花，花期较长。枇杷花的雄蕊一般为20多枚，雌蕊花柱短于雄蕊花丝，花柱5根，基部是5心室的子房。枇杷雄蕊和雌蕊的形成和发育对杂交育种非常重要，因此雄蕊和雌蕊特征决定基因的分子调控机制研究具有重要意义。

AGAMOUS(AG)基因编码调控拟南芥花分生组织、雄蕊和雌蕊形成的C类MADS-box转录因子。AG基因首先在花分生组织的中心表达，随后出现在花发育第3阶段的雄蕊和雌蕊原基，最后在花发育的晚期限定于第三轮和第四轮。拟南芥ag突变体完全丢失了雄蕊和雌蕊器官，导致雄蕊转变为花瓣，形成重瓣花。目前，AGAMOUS同源基因的研究主要集中在模式植物拟南芥和金鱼草、主要的农作物和观赏植物。但是，枇杷作为我国重要的园林观赏树种，尚无有关其AG同源基因的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供枇杷EjAG蛋白及其编码的蛋白与应用。

首先，本发明提供枇杷EjAG蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质，其中，所述的由1)衍生的蛋白质包括包括MADS结构域、I结构域、K结构域、C末端结构域以及2个基序AG motif I和AG motif II。

本发明还提供编码所述的枇杷EjAG蛋白的基因。

优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在调控植物雄蕊和雌蕊特征决定中的用途。

在本发明一个实施方案中，将所述基因转入雌雄蕊瓣化的植物的基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物恢复正常的雌雄蕊生殖器官。

本发明还提供一种雌雄蕊瓣化的植物恢复正常的雌雄蕊生殖器官的方法，其为将含有所述基因的载体转入所述植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。

本发明首次从枇杷花芽中克隆了1个调控雄蕊和雌蕊特征决定的EjAG基因，通过实时荧光定量PCR证实了EjAG基因仅在枇杷的雌雄蕊中表达，利用植物基因工程的手段在拟南芥ag-1突变体中过表达，能减少花瓣数目和轮数，恢复雄蕊和雌蕊结构，为植物花器官的定向遗传改良提供了很好的应用前景。

附图说明

图1枇杷花芽总RNA的3'-RACE和5'-RACE的电泳照片。其中，a是3'-RACE的电泳照片，M为DL2000 DNA marker，1为3'RACE out PCR产物，2为3'-RACE inner PCR产物；b是5'RACE的电泳照片，M为DL2000 DNA marker，1为5'RACE PCR产物；c为EjAG基因ORF的PCR电泳照片，M为DL2000 DNA marker，1为EjAG基因ORF的PCR产物。

图2是本发明枇杷雄蕊和雌蕊特征决定的EjAG基因cDNA核苷酸序列图。

图3为本发明中EjAG基因所编码蛋白质的氨基酸序列、结构域和基序划分图。

图4是枇杷EjAG基因在枇杷的叶、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊中的表达量。

图5转基因拟南芥ag-1突变体植株的PCR鉴定。

图6为EjAG基因在拟南芥ag-1突变体中的表达分析，其中A为拟南芥ag-1突变体；B和C为转基因植株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中所使用的试剂主要包括分子生物学实验试剂、耗材和试剂盒等，均可通过商业途径获得，具体包括：RNA提取试剂盒和质粒快速小提试剂盒均购自Aidlab生物科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；3'-Full RACECore Set with PrimeScript RTase试剂盒和SMARTer RACE 5'Kit试剂盒，M-MLV逆转录酶、LA-taq DNA聚合酶、EX-taq DNA聚合酶、dNTP、pMD19-T载体、XbaⅠ和SmaⅠ限制性内切酶、T₄DNA连接酶，大肠杆菌感受态细胞均购自TaKaRa(宝生物工程(大连))有限公司；引物合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司；测序工作均由华大基因科技股份有限公司完成。本发明实施例中所提供的方法如果没有特殊说明均为常规方法。

实施例1枇杷EjAG基因cDNA序列的克隆

(1)枇杷花芽总RNA的提取

采集新鲜露白期的枇杷花芽，放入冻存管，在液氮中速冻，放入-80℃超低温冰箱待用。利用RNA提取试剂盒提取总RNA：将材料从-80℃冰箱取出0.2mg，放入加有2mL裂解液和200μL PLANTaid研钵中，充分研磨；将研磨液转入2mL的EP管中，13000rpm离心10min后，取500μL上清液，转移至新的1.5mL离心管；向上清夜加入250μL无水酒精，吸打混匀；将上述液体加入到吸附柱，并将吸附柱放入收集管；向吸附柱中加入500μL漂洗液，13000rpm离心2min后，丢弃收集管中的废液。加入500μL漂洗液，重复一次；将吸附柱放回空收集管，13000rpm空离心2min，去除漂洗液；取出吸附柱，放回到空的RNase-free EP管中，加入50μL的RNase free water室温放置2min，13000rpm离心2min；将第一次洗脱液加入到吸附柱中，再重复一次。取2μL稀释后的RNA样品，用分光光度计检测RNA浓度。

(2)枇杷花芽总RNA的3'RACE实验

以枇杷花芽总RNA为模板，使用3'RACE Adaptor引物进行逆转录反应，合成第一链cDNA；取总RNA 2.5μL，3'RACE Adaptor 1μL，DEPC-ddH₂O 3μL，混匀，在70℃条件下，变性10min；冰浴2min；反应结束后，依次加入5×M-MLV buffer 2μL，10mM dNTP 1μL，RNaseinhibitor 0.25μL，M-MLV 0.25μL，混匀后，在42℃条件下，反应60min；70℃条件下，反应15min；冰浴2min；置于-20℃保存备用。以第一链3'RACE逆转录产物为模板，使用高保真酶EX-taq，从NCBI网站下载枇杷近缘物种AG同源基因序列，并进行序列比对，在序列比对的保守区(比对区域的序列一致)设计上游外侧和内侧特异性。上游外侧特异性引物3REjAGF1:5′-TCCGATCCAAAAAGAATGAGCT-3′和3'RACE Outer Primer：5'-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'，进行第1步PCR反应，反应条件为94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。

以第1步Out PCR产物为模板，使用高保真酶EX-taq，上游内侧引物3REjAGF2：5′-CAACAATAACCAGCTCCTACGAGCA-3′和3′RACE Inner Primer:5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3′，进行第2步PCR反应。反应条件为94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳(图1a)，用胶回收试剂盒回收PCR产物，连接到pMD19-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，送样测序。

(3)枇杷花芽RNA的5'RACE实验

根据3'RACE的测序结果，利用oligo7.0软件设计5'RACE实验的特异引物5REjAGR1引物：5′-AGCTATCTTTGCTCGTAGGAGC-3′和5REjAGR2引物：5′-TGGTAGTACTGAGTACTAGC-3′。首先配制Buffer Mix，即依次加入5×First-strand Buffer 2.0μL，DTT(20mM)1.0μL，dNTPMix(10mM)1.0μL，混合均匀，室温下放置待用。在200μL的eppendorf管，加入总RNA 1.0μL，5’-CDS primer A 1.0μL，H₂O 1.75μL，混合均匀，瞬时离心后，72℃3min，然后冷却至42℃2min，冷却后，14000g离心20s，加入SMARTER IIA oligo 1μL，Buffer Mix 4.0μL，RNaseinhibitor(400U/μL)0.25μL，SMARTscrube Reverse Transcriptese(100U)1.0μL，总体积10μL，混合均匀，离心后，42℃反应90min，70℃变性10min，获得control 5’-RACE-ReadycDNA。

5'RACE扩增体系：PCR-Grade water 15.5μL，2×SeqAmp^TMBuffer 25.0μL，SeqAmpDNA Polymerase 1.0μL，control 5’-RACE-Ready cDNA 2.5μL，5REjAGR1引物1.0μL，UPM(10×)5.0μL。降落PCR的程序为：94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，70℃30s，5个循环；72℃3min，94℃30s，68℃30s，30个循环；72℃5min。

以第1步PCR产物为模板，使用高保真酶LA-taq，通用引物和5REjAGR2引物，进行第2步PCR反应。反应条件为94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。

PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测5'RACE反应结果(图1b)。切下目的片段，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD19-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，进行测序。

(4)对3'RACE和5'RACE的PCR测序结果，进行分析和拼接，并对EjAG基因进行扩增验证(图1c)，得到枇杷EjAG基因的cDNA序列全长(SEQ ID No.1和图2)。

使用primer 5软件，对枇杷EjAG基因的cDNA序列全长，进行蛋白质序列翻译，并根据MADS-box基因特点，枇杷EjAG蛋白质序列进行MADS结构域、I结构域、K结构域、C末端结构域以及2个基序AG motif I和AG motif II的划分(SEQ ID No.2和图3)。

实施例2枇杷EjAG基因表达的组织特异性

分别提取枇杷幼叶、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊的总RNA，去除总RNA中微量的DNA后，逆转录成cDNA，作为模板。根据枇杷EjAG基因的cDNA序列全长，利用oligo 6.0软件设计实时荧光定量引物qEjAGF:5'-CAATCGTCAAGTGACCTTCTGCA-3'和qEjAGR:5'-TTTCACTATCTGCGCACGCAGTT-3'。在PCR特异性扩增前提下，进行实时荧光定量PCR。

以枇杷actin基因为内参基因，引物为qEjactinF：5'-AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC-3'和qEjactinR：5'-TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA-3'。采用三步法进行扩增，每个反应3个生物学重复。PCR反应程序为:94℃预变性3min；94℃20s，55℃20s，72℃20s，40个循环；收集溶解曲线。

根据得到的Ct值，利用2^-ΔΔCT方法，分别计算EjAG基因在幼叶、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊的表达量。结果表明。EjAG基因仅在枇杷雌蕊和雄蕊中表达，而在叶、萼片、花瓣中不表达(图4)。

实施例3枇杷EjAG基因的表达载体pBI121-EjAG构建

利用PCR扩增引入酶切位点的引物：上游引物EjAG-F5′-ATCCCGAAAGCTTTCTAGAATGG-3′(引入XbaⅠ酶切位点)，下游引物EjAG-R：5′-CAAGCACCCGGGTTAAACTAGTT-3′(引入SmaⅠ酶切位点)。

以枇杷花芽总RNA逆转录的cDNA为模板，使用高保真酶EX-taq，进行PCR反应。PCR扩增程序：94℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s，进行30个循环；72℃10min。反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶和回收。将回收后的PCR产物与pMD19-T载体进行连接，转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆后，送样测序。引入酶切位点的序列分析正确后，提取质粒，分别使用XbaⅠ和SmaⅠ限制性内切酶对含有目的片段pMD19-EjAG重组质粒和pBI121载体，分别进行双酶切后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测和回收。使用T₄DNA连接酶将EjAG基因与pBI121连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，获得植物的表达载体pBI121-EjAG基因。利用PCR检测后，送样测序，分析序列正确性，表明EjAG基因已经与pBI121载体连接在一起。

实施例4含pBI121-EjAG的农杆菌转入拟南芥ag-1突变体

取2μg纯化后的pBI121-EjAG质粒DNA，迅速加入到200μL农杆菌感受态细胞中，混合均匀；冰浴5min，转入液氮，冷冻1min，迅速置于37℃，水浴4min；加入800μL的LB液体培养基，28℃、250rpm振荡5h；将菌液移至LB(50mL LB+50μg/mL Rif+50μg/mL Kan)固体选择培养基中，均匀涂布，在28℃培养2d。

将pBI121-EjAG阳性克隆农杆菌在25mL固体平板培养基(含有25μg/mL Kan+25μg/mL Rif)上划线，倒置培养48h；挑取单克隆，在超净工作台中，接种到10mL液体LB培养基(含有10μg/mL Rif+10μg/mL Kan)中；在28℃、200rpm条件下，振荡培养过夜至OD＝0.7-0.8。取1mL培养菌液均匀涂布在25mL固体平板培养基(含有25μg/mL Rif+25μg/mL Kan)上，28℃，倒置培养48h；在超净工作台中，使用无菌的玻璃三角棒将固体培养基上的农杆菌刮下来，将菌块重悬于5％蔗糖和3％Silwet L-77的1/2MS液体培养基中，使其OD＝0.2，用于转基因。

将拟南芥种子放在湿润滤纸上，并置于4℃条件下，浸泡48h，使种子快速吸胀吸水，然后播种到营养土(营养土：蛭石：珍珠岩＝5:4:1)中，在适宜的条件下(温度22℃，湿度75％，14h黑暗/10h光照循环)培养；将鉴定的拟南芥ag-1突变体的野生型和纯合体拔除，留下ag-1杂合体拟南芥；并且转基因的前一天，将拟南芥浇透水；在浸染前，将待用的拟南芥上的角果剪掉，将花序浸入pBI121-EjAG农杆菌浸染液中60s左右，用作浸染转化；罩上封口膜，并保持膜内的高温、高湿环境，暗培养1-2d后，揭开薄膜；上述方法侵染3-4次，间隔时间为7d。

收获的转基因拟南芥种子，将种子放在种子筛中处理干净。置于4℃冰箱中14d，进行春化处理；在超净台中，将种子放入收集管中，向种子中加入800μL无水乙醇，摇动5min；离心4000rpm，2min；倒去收集管中的酒精，加入800μL 70％乙醇，摇晃5min；离心4000rpm，2min；晾干种子；均匀铺在1/2MS培养基(含50μg/mL的Kan，3％蔗糖和0.8％琼脂，PH＝5.8)平板上。将接种后的平板再次倒置到4℃冰箱，进行再春化处理2d；将春化后的平板置于人工气候箱，正常培养。待其长出4片真叶后，将其移至营养土中，经过炼苗、壮苗后，按照常规的水肥管理，直至开花。

提取转基因拟南芥DNA，取1小片拟南芥的叶片置于1.5mL的EP管中，液氮速冻，研磨；加入600μL提取缓冲液，涡旋震荡后，置于冰上；将所有样品置于65℃水浴中，温浴25min；将样品从水浴中取出，放置到室温，待冷却到室温后，加入340μL乙酸钾溶液，涡旋震荡，冰浴20min；12000rpm，高速离心10min，上清液转移至新的离心管中；加等量体积的异丙醇，快速4℃高速离心、20min，弃上清液，并立即用冰无水乙醇漂洗；沉淀依次用70％、100％乙醇漂洗；沉淀吹干后，溶于50μL无菌水。

以野生型拟南芥DNA作为对照，使用载体构建的引物EjAG-F和EjAG-R，对转基因拟南芥的阳性植株DNA进行PCR筛选。PCR扩增程序：94℃4min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，进行30个循环；72℃10min。取反应后的产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中检测，共获得13株有表型的转基因拟南芥植株(图5)。

对转基因拟南芥ag-1拟南芥纯合体进行表型分析，并在Leica体式显微镜下，对拟南芥的开花表型进行拍照。结果显示：EjAG基因导入拟南芥ag-1突变体中，一共获得13株转基因拟南芥植株，其中有2株(15.38％)转基因拟南芥ag-1突变体开花时，减少了花瓣数目和轮数(图6a)；同时，有11株(84.62％)转基因拟南芥恢复了雄蕊和雌蕊器官(图6b,c)，该转基因拟南芥变异材料可用于植物观赏和育种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 枇杷EjAG基因及其编码的蛋白与应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1126

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 1

aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg gattttctgc ttatctcctc gtttggattt 60

gtggagaaag aaagatagaa aaagacctga gaaaaatccc gaaagcttgc aactatggcc 120

aatgaaaaca aatccatgtc aatcgactct ccccagagaa aattgggtag gggaaagatc 180

gagatcaagc ggatcgaaaa cacgaccaat cgtcaagtga ccttctgcaa gaggcgcaat 240

gggttgctca agaaggccta tgaactctct gtgctctgtg atgcagaggt tgctctcata 300

gtcttctcta accgcggccg cctctatggg tatgccaaca acagtgttaa agcaacagtt 360

gagaggtaca agaaggcatg tgcagattct tcaactactg gatcagtttc cgaagctagt 420

actcagtact accagcaaga agctgcgaaa ctgcgtgcgc agatagtgaa attgcagaat 480

gacaaccgga atatgatggg tgatgcattg agtagtatgt ctgtcaagga cctgaagagc 540

ctggagaata aactggagaa aggaattagc agaatccgat ccaaaaagaa tgagctcttg 600

tttgccgaaa ttgagtacat gcagaaaagg gaactggact tgcacaacaa taaccagctc 660

ctacgagcaa agatagctga gaatgagagg gaccagcaga acataaatgt gatggctgta 720

ggaggaactt caagctatga catcctgcag tctcagccat acgactctcg gaactatttc 780

caagtgaacg cgttacaacc caatcatcag tacaatcccc gccacgatca gatttctctt 840

caactagttt aatatatatg cttggactgt atcgcttctg ctgatttagt tttctatggt 900

gtgtgtgtat aatgacacca gatgaatgat ccagattgct ttgggaatga agaccgttac 960

caagtacgta ggtatacgta cgtatattag ttgatggaag gggatttctt gtctgtattg 1020

ttgtatttat gcctcctaca acgtgtacta ctaagacttc tgtgaggcat taccctaaca 1080

agttcttcca actttcatgt gattgaatct tcacaaaaaa aaaaaa 1126

<210> 2

<211> 245

<212> PRT

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 2

Met Ala Asn Glu Asn Lys Ser Met Ser Ile Asp Ser Pro Gln Arg Lys

1 5 10 15

Leu Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Thr Thr Asn

20 25 30

Arg Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

35 40 45

Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

50 55 60

Ser Asn Arg Gly Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Asn Asn Ser Val Lys Ala

65 70 75 80

Thr Val Glu Arg Tyr Lys Lys Ala Cys Ala Asp Ser Ser Thr Thr Gly

85 90 95

Ser Val Ser Glu Ala Ser Thr Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu Ala Ala Lys

100 105 110

Leu Arg Ala Gln Ile Val Lys Leu Gln Asn Asp Asn Arg Asn Met Met

115 120 125

Gly Asp Ala Leu Ser Ser Met Ser Val Lys Asp Leu Lys Ser Leu Glu

130 135 140

Asn Lys Leu Glu Lys Gly Ile Ser Arg Ile Arg Ser Lys Lys Asn Glu

145 150 155 160

Leu Leu Phe Ala Glu Ile Glu Tyr Met Gln Lys Arg Glu Leu Asp Leu

165 170 175

His Asn Asn Asn Gln Leu Leu Arg Ala Lys Ile Ala Glu Asn Glu Arg

180 185 190

Asp Gln Gln Asn Ile Asn Val Met Ala Val Gly Gly Thr Ser Ser Tyr

195 200 205

Asp Ile Leu Gln Ser Gln Pro Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Phe Gln Val

210 215 220

Asn Ala Leu Gln Pro Asn His Gln Tyr Asn Pro Arg His Asp Gln Ile

225 230 235 240

Ser Leu Gln Leu Val

245

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 3

tccgatccaa aaagaatgag ct 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 4

taccgtcgtt ccactagtga ttt 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 5

caacaataac cagctcctac gagca 25

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 6

cgcggatcct ccactagtga tttcactata gg 32

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 7

agctatcttt gctcgtagga gc 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 8

tggtagtact gagtactagc 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 9

caatcgtcaa gtgaccttct gca 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 10

tttcactatc tgcgcacgca gtt 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 11

aatggaactg gaatggtcaa ggc 23

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 12

tgccagatct tctccatgtc atccca 26

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 13

atcccgaaag ctttctagaa tgg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 14

caagcacccg ggttaaacta gtt 23

Claims

1.枇杷EjAG蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质，其中，所述的由1)衍生的蛋白质包括MADS结构域、I结构域、K结构域、C末端结构域以及2个基序AG motif I和AG motif II。

2.编码权利要求1所述的枇杷EjAG蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

7.权利要求2或3所述基因在调控植物雄蕊和雌蕊特征决定中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述基因转入雌雄蕊瓣化的植物的基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物恢复正常的雌雄蕊生殖器官。

9.一种使雌雄蕊瓣化的植物恢复正常的雌雄蕊生殖器官的方法，其特征在于，将含有权利要求2或3所述基因的载体转入所述植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。