CN105131097A - 楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因及其蛋白质和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因及其编码的蛋白质和应用。本发明提供一种楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG蛋白质，1)、由SEQ？ID？No.2所示氨基酸组成的蛋白质；或2)、在SEQ？ID？No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明提供了编码上述蛋白质的基因，及其在改造植物花器官中的应用。本发明还提供含有CabuAG基因的表达载体。CabuAG的转基因植物与野生型相比表现出花器官特异发育的性状。

Description

楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因及其蛋白质和应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因，其编码的蛋白质和应用。

背景技术

梓树属(Catalpa)植物在全世界约有13种，主要分布在亚洲东部和美洲。我国主要分布有6种，均为重要用材和观赏树种，包括：楸树、灰楸、滇楸、梓树、藏楸和黄金树，其中滇楸是灰楸的变种，黄金树是引入种。从亲缘关系、形态结构和开花结实的特征分析，将这6种梓树属植物分为2个组，其中楸树、灰楸和滇楸属于楸树组，而梓树、藏楸和黄金树属于梓树组。

楸树(CatalpabungeiC.A.Mey.)是中国特有的重要用材和观赏树种。其木材具有许多优良特征，例如树干和木材纹理通直、材质坚韧致密、坚固耐用、抗冲击韧性较高，自古以来就是我国珍贵用材树种之一。同时，楸树枝干挺拔优美，花色淡红素雅，开花时美丽壮观，具有较高的观赏价值，因此广泛种植于庭院和胜景名园之中，如故宫、颐和园等游览胜地到处可见百年以上的楸树苍劲挺拔风姿。

生殖是植物繁衍种群最重要的行为基础，而花是被子植物特有的生殖器官。木本植物在长期的环境适应和系统进化过程中，通常会产生新的生殖器官并获得新的生殖方式，从而适应生存环境。通过现代分子生物学技术克隆出调控楸树花器官发育的基因，并通过转基因手段对基因功能进行验证，从而定向改变植物的花型，产生的植物变异新材料可应用于观赏和育种。

AGAMOUS基因是调控拟南芥雌雄蕊发育的C类MADS-box基因。在花发育过程中，参与调控花分生组织的形成、雄蕊和雌蕊的发育，并抑制A类MADS-box基因的活性。植物MADS-box基因是调控花器官发育的关键转录因子，其特点是包含M区、I区、K区和C区。M区是一个高度保守的MADS结构域，编码58个氨基酸，具有结合DNA和蛋白质二聚体的功能；I区保守性较低，大约包含30个氨基酸，其功能主要参与蛋白质二聚体的形成；K区的保守性较高，其保守性仅次于M区，大约包含70个氨基酸，其二级结构是由3个α螺旋组成的“卷曲-卷曲”结构；C区位于K区的下游，其序列和长度上变化都较大，主要由疏水氨基酸组成，常包含一些保守的基序，这些基序在蛋白质功能特化、转录激活和复合体形成方面起着重要作用。

目前，AGAMOUS同源基因的研究主要集中在模式植物、主要农作物和重要经济花卉方面。而楸树作为我国重要用材和观赏树种，尚无有关其AGAMOUS同源基因的研究。本发明首次从楸树花芽中克隆了1个调控楸树雄蕊和雌蕊发育相关的CabuAG基因，通过半定量RT-PCR证实了CabuAG基因仅在楸树的雌雄蕊中表达，并利用植物基因工程的手段在植物体内过量表达，来改变植物的花器官结构，为植物遗传改良提供了很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG蛋白，由242个氨基酸组成。

楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG蛋白质为，1)由SEQIDNo.2所示氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码上述蛋白质的基因，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本发明提供的楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG是从楸树花芽中通过RT-PCR分离得到，其cDNA全长为1225bp，编码序列(CDS)为729bp。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白质的突变序列。例如，将第66位的T替换为S，或是将第2至17位(EFKSEQSREMSPQRRN)的氨基酸缺失，或是在第194位的Q后面增加G。

因此，本发明的楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG蛋白质还包括SEQIDNo.2所示氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，具有楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG蛋白质同等活性的由楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG蛋白质衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白质的核苷酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明还提供含有上述楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因或其片段的载体，以及含有该载体的宿主细胞；所述载体为所述楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因的克隆载体或各类表达载体；所述载体优选为pBI121-CabuAG。

表达载体pBI121-CabuAG的构建方法，具体步骤如下：将楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因构建到pmd18-T载体上，转入大肠杆菌感受态细胞得到pmd18-CabuAG重组质粒，双酶切pmd18-CabuAG重组质粒和pBI121质粒，连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒后，获得表达载体pBI121-CabuAG。

本发明还提供一种楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因在改造植物花器官中的应用，通过在植物体内过量表达楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因，获得特异发育的植物花器官。

本发明从楸树中分离出了CabuAG基因，通过特异性表达定位表明该基因所编码的蛋白质主要分布在雌蕊和雄蕊中。通过农杆菌介导法将楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因转入拟南芥，获得了转基因拟南芥。转基因拟南芥与野生型的区别在于转基因拟南芥开花时，其萼片上异位生长出柱头和胚珠。

附图说明

图1是楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因cDNA全长的核苷酸序列图。

图2是CabuAG基因所编码的蛋白质的氨基酸序列图。

图3是实施例1楸树花芽总RNA的3'-RACE和5'-RACE的电泳照片。其中，a是3'-RACE的电泳照片，M为DNAmarkerⅢ，1为3'-RACEoutPCR产物，2为3'-RACEinnerPCR产物；b是5'-RACE的电泳照片，M为DNAmarkerⅢ，1为5'-RACEoutPCR产物，2为5'-RACEinnerPCR产物；c为CabuAG基因CDS的PCR电泳照片，M为DNAmarkerⅢ，1为CabuAG基因CDS的PCR产物。

图4是实施例3楸树CabuAG基因组织特异性表达电泳照片。

图5是实施例4中CabuAG基因酶切片段和pBI121酶切片段电泳照片。其中a是CabuAG基因酶切片段电泳照片，M是DNAmarkerⅢ，1为pmd18-CabuAG基因酶切产物；b是pBI121酶切片段电泳照片，M是DNAmarkerD15000，1是pBI121酶切产物。

图6是实施例4中pBI121-CabuAG重组质粒的双酶切检测结果。其中M为DNAmarkerⅢ，1是pBI121-CabuAG酶切产物。

图7是实施例6转基因拟南芥ag-1突变体的花朵照片。其中，A为拟南芥ag-1突变体；B和C为转基因拟南芥ag-1突变体。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例中所涉及的试剂主要包括分子生物学实验试剂等，均可从商业途径取得，具体包括：RNA提取试剂盒购自Aidlab生物科技有限公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒快速小提试剂盒和top10大肠杆菌感受态细胞购自天根生化科技有限公司，3'-fullRACECoreSetVer.2.0试剂盒和5'-fullRACEKit试剂盒，M-MLV逆转录酶、LA-taqDNA聚合酶、EX-taqDNA聚合酶、dNTP、DNAmarkerD15000、pmd18-T载体、XbaⅠ和SmaⅠ限制性内切酶、T₄DNA连接酶均购自TaKaRa宝生物工程(大连))有限公司，DNAmarkerⅢ购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；pBI121载体和农杆菌菌株GV1301-90由北京林业大学陆海教授惠赠，引物合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司，sanger测序工作均由华大基因科技股份有限公司完成。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1楸树CabuAG基因cDNA序列的分子克隆

(1)楸树花芽总RNA的提取

取新鲜的长度约5mm的楸树花芽300mg，放入冻存管后，立即在液氮中冷冻。

采用RNA提取试剂盒提取总RNA：将所需花芽从-80℃超低温冰箱取出，放入加有2mLRLT和100μLPLANTaid研钵中，在室温下，充分研磨；将上述研磨液转入2mL的EP管中，13000rpm离心10min后，取500μL上清液，转移到新的2mL离心管中；向上清夜加入250μL无水酒精，吹打混匀；将上述液体加入到吸附柱中，并将吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入500μL漂洗液，13000rpm离心1min后，弃掉收集管中的废液。加入500μL漂洗液，再重复一次；将吸附柱放回空收集管中，13000rpm空离心2min，以便尽量去除漂洗液；取出吸附柱，放回到空的RNase-freeEP管中，加入50μL的RNasefreewater室温放置1min，12000rpm离心2min；将第一次洗脱液加入到吸附柱中，再重复一次。取2μL稀释后的RNA样品，用分光光度计检测RNA的浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

(2)楸树花芽总RNA的3'-RACE实验

以楸树花芽总RNA为模板，使用3'-RACEAdaptor引物进行逆转录反应，合成第一链cDNA：

取总RNA2.5μL，DEPC-ddH2O3μL，3'-RACEAdaptor1μL，混匀，在70℃，变性10min；冰浴2min；反应结束后，依次加入5×M-MLVbuffer2μL，10mMdNTP1μL，RNaseinhibitor0.25μL，M-MLV0.25μL，混匀后，置于42℃条件下，反应60min；接着，70℃条件下，反应15min；冰浴2min，然后置于-20℃条件下，待用。以第一链3'-RACE逆转录产物为模板，使用高保真酶EX-taq，上游外侧特异性引物GSPAGF1:5′-AAGATCGAGATCAAACGGATCGAAAACA-3′(如SEQIDNo.3所示)和3'-RACEOuterPrimer：5'-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'(如SEQIDNo.4所示)，进行第1步PCR反应，反应条件为94℃4min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，进行30个循环；72℃10min。

反应结束后，以第1步OutPCR产物为模板，使用高保真酶EX-taq，上游内侧引物GSPAGF2:5′-TATGAATTGTCTGTGCTTTGTGATGCTGA-3′(如SEQIDNo.5所示)和3′RACEInnerPrimer:5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3′(如SEQIDNo.6所示)，进行第2步PCR反应。反应条件为94℃4min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，进行30个循环；72℃10min。

反应结束后，通过1％琼脂糖凝胶电泳(见图3)，切下目的片段，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pmd18-T载体后，转入top10大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序。

(3)楸树花芽RNA的5'-RACE实验

按照说明书要求，对楸树花芽总RNA中裸露的5'磷酸基团进行“去磷酸化反应”和“去帽子”反应，接着进行5'-RACEAdaptor接头的连接反应，得到楸树的LigatedRNA。吸取LigatedRNA6μL，Random9meter0.5μL，置于70℃条件下，冰上放置2min；接着，加入5×M-MLVbuffer2μL，dNTP1μL，RNAInhibitor0.25μL，M-MLV0.25μL10μL，反应程序：30℃10min，42℃1h，70℃15min。反应结束后，可置于-20℃；以第一链5'-RACE逆转录产物为模板，使用高保真酶LA-taq，5'-RACEOuterPrimer：5'-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′(如SEQIDNo.7所示)和下游外侧特异性引物AGGSPR1:5′-CTAAAGATTCACCAAGCATGTTC-3′(如SEQIDNo.8所示)，进行第1步PCR反应，反应条件为94℃4min；94℃45s，58℃45s，72℃45s，进行30个循环；72℃10min。

反应结束后，以第1步5'-RACEOutPCR产物为模板，使用高保真酶LA-taq，5'-RACEInnerPrimer:5'-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3′(如SEQIDNo.9所示)和下游内侧引物AGGSPR2:5′-GATGCCTCTTGTTGGTAGTACTGAG-3′(如SEQIDNo.10所示)；进行第2步PCR反应。反应条件为94℃4min；94℃45s，57℃45s，72℃45s，进行30个循环；72℃10min。反应结束后，通过1％琼脂糖凝胶电泳后(见图1)，切下目的片段，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pmd18-T载体后，转入top10大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序。

(4)对3'-RACE和5'-RACE的PCR测序结果，进行分析和拼接，得到楸树CabuAG基因的cDNA序列全长，长度为1225bp，序列如SEQIDNo.1所示，其中编码序列(CDS)为729bp，cDNA序列全长及CDS序列见图1。

实施例2楸树CabuAG基因编码的蛋白质序列

使用primer5软件，对楸树CabuAG基因的cDNA序列全长，进行蛋白质序列翻译，cDNA序列全长为1225bp，CDS为729bp，除去终止密码子，共编辑242个氨基酸。得到SEQIDNO:2，并根据MADS-box基因特点，楸树CabuAG蛋白质序列进行M区、I区、K区、C区和2个基序AGmotifI和AGmotifII的划分，具体见图2。

实施例3楸树CabuAG基因表达的组织特异性

根据楸树CabuAG基因的cDNA序列全长，利用oligo6.0软件设计半定量试验的引物RTAGF:5'-CCTTCAACTCCTACTTATTACCA-3'(如SEQIDNo.11所示)和RTAGF:5'-CCATTCTGCTCGTTCTTACTTAT-3'(如SEQIDNo.12所示)。用PCR对其特异性进行检测，在确保引物只对相应的基因进行特异性扩增前提下，方可使用。以楸树actin基因为半定量试验的阳性对照，actin基因的引物为CabuactinF：5'-TCACACTGGTGTGATGGTTG-3'(如SEQIDNo.13所示)和CabuactinR：5'-AGTTCTTCTCCACAGCAGAG-3'(如SEQIDNo.14所示)。并通过幼叶、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊的第1链cDNA模板量的比例来调整检测条带亮度。半定量PCR反应程序：94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，进行25个循环；72℃10min。反应结束后，用含GoldenView的1％琼脂糖凝胶进行电泳。电泳结束后，在BIO-RADGelDocXR+凝胶成像系统中进行DNA条带的亮度检测，并拍照，结果见图4，表明CabuAG基因的组织特异性表达部位是楸树的雌蕊和雄蕊。

实施例4楸树CabuAG基因的表达载体pBI121-CabuAG构建

利用PCR扩增引入酶切位点所用的引物：上游引物CabuAG-F:5′-GATcTaGaAGCAGAAATGGAATT-3′(如SEQIDNo.15所示)(引入XbaⅠ酶切位点)，下游引物CabuAG-R：5′-GTACCCGGGTTTATTTCAGACTAAC-3′(如SEQIDNo.16所示)(引入SmaⅠ酶切位点)。以楸树花芽总RNA逆转录第1链cDNA为模板，用高保真酶EX-taq，进行PCR反应。PCR扩增程序：94℃4min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，进行30个循环；72℃10min。

取反应后的产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中检测、切胶和回收。将回收后的PCR产物与pmd18-T载体进行连接，转入top10大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆后，送样测序。对引入酶切位点的序列分析正确后，提取质粒，分别使用XbaⅠ和SmaⅠ双限制性内切酶对含有目的片段pmd18-CabuAG重组质粒和pBI121载体，分别进行双酶切后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图5)和回收。使用T₄DNA连接酶将CabuAG基因与pBI121连接后，转入top10大肠杆菌感受态细胞，获得植物的表达载体pBI121-CabuAG基因。该表达载体含有楸树CabuAG基因，以及位于基因上游的35S组成型启动子。

进一步使用XbaⅠ和SmaⅠ内切酶对植物的表达载体pBI121-CabuAG基因进行双酶切后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图6)，证明CabuAG基因已经与pBI121载体连接在一起。

实施例5含pBI121-CabuAG的农杆菌转入拟南芥获得突变体

取2μg纯化后的pBI121-CabuAG质粒DNA，迅速加入到200μL农杆菌感受态细胞中，混合均匀；冰浴5min，转入液氮，冷冻1min，迅速置于37℃，水浴4min；加入800μL的LB液体培养基，28℃、250rpm振荡5h；将菌液移至LB(50mLLB+50μg/mLKan+50μg/mLRif)固体选择培养基中，均匀涂布，在28℃培养1-2d。

在长有单克隆菌落的平板上，挑取有抗性的单克隆菌落。接种到10mL的液体LB培养基(含有10μg/mLKan+10μg/mLRif)中，在28℃、200rpm条件下，振荡培养过夜后，进行PCR鉴定，将筛选出来的pBI121-CabuAG阳性克隆农杆菌保存(保存方法是300μL无菌甘油+700μL菌液)。

将pBI121-CabuAG阳性克隆农杆菌在25mL固体平板培养基(含有25μg/mLKan+25μg/mLRif)上划线，倒置培养48h；选取单克隆，在超净工作台中，接种到10mL的液体LB培养基(含有10μg/mLKan+10μg/mLRif)中；在28℃、200rpm条件下，振荡培养过夜至OD＝0.7-0.8。取1mL的培养菌液均匀涂布在25mL的固体平板培养基(含有25μg/mLKan+25μg/mLRif)上，28℃，倒置培养48h；在超净工作台中，使用无菌的玻璃三角棒将固体培养基上的农杆菌刮下来，将菌块重悬于5％蔗糖和3％SilwetL-77的1/2MS液体培养基中，使其OD＝0.2，用于转基因。

将拟南芥种子放在湿润的滤纸上，并置于4℃条件下，浸泡48h，使其快速吸胀吸水，然后播种到营养土(营养土：蛭石：珍珠岩＝5:4:1)中，在适宜的条件下(温度22℃，湿度75％，14h黑暗/10h光照循环)培养；将鉴定的拟南芥ag-1突变体的野生型和纯合体拔除，留下ag-1杂合体拟南芥；并且转基因的前一天，将拟南芥浇透水；在浸染前，将待用的拟南芥上的角果剪掉，将花序浸入pBI121-CabuAG农杆菌浸染液中60s左右，用作浸染转化；罩上封口膜，并保持膜内的高温、高湿环境，暗培养1-2d后，揭开薄膜；上述方法侵染3-4次，间隔时间为7d。

实施例6：转基因拟南芥的筛选和鉴定

收获的转基因拟南芥种子，在种子筛中，将种子处理干净。置于4℃冰箱中2周时间，进行春化处理；在超净台中，将种子放入收集管中，向种子中加入1mL无水乙醇，摇动5min；离心4000rpm，2min；倒去收集管中的酒精，向收集管中加入1mL70％乙醇，摇晃5min；离心4000rpm，2min；晾干种子；均匀铺在1/2MS培养基(PH＝5.8，含50μg/mL的Kan，3％蔗糖和0.8％琼脂)平板上。将接种后的平板再次放入到4℃冰箱，进行再春化处理2d；将春化后的平板置于人工气候箱中，正常培养。待其长出4片真叶后，将其移至营养土中，经过炼苗、壮苗后，按照常规的水肥管理，直至开花。

提取转基因拟南芥DNA，取1小片拟南芥的叶片置于1.5mL的EP管中，液氮速冻，研磨；加入600μL提取缓冲液，涡旋震荡后，置于冰上；将所有样品置于65℃水浴中，温浴25min；将样品从水浴中取出，放置到室温，待冷却到室温后，加入340μL乙酸钾溶液，涡旋震荡，冰浴20min；12000rpm，高速离心10min，上清液转移至新的离心管中；加等量体积的异丙醇，快速4℃高速离心、20min，弃上清液，并立即用冰无水乙醇漂洗；沉淀依次用70％、100％乙醇漂洗；沉淀吹干后，溶于50μL无菌水中。

以野生型拟南芥DNA作为对照，使用载体构建的引物CabuAG-F和CabuAG-R，对转基因拟南芥的阳性植株DNA进行PCR筛选。PCR扩增程序：94℃4min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，进行30个循环；72℃10min。取反应后的产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中检测。

对转基因拟南芥ag-1拟南芥纯合体进行表型分析，并在Leica体式显微镜下，对拟南芥的开花表型进行拍照。结果显示：CabuAG基因导入拟南芥ag-1突变体中，转基因拟南芥ag-1突变体开花时，其萼片上异位生长出柱头和胚珠(图7)，该转基因拟南芥变异材料可用于植物观赏和育种。

以上实施例表明CabuAG基因与雌蕊、雄蕊的发育相关，可应用于对植物花器官的改造。

Claims (9)

1.一种楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG蛋白质，其为：

1)由SEQIDNo.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.权利要求4所述的载体，其特征在于，其为表达载体pBI121-CabuAG。

6.制备权利要求5所述表达载体pBI121-CabuAG的方法，其特征在于，将楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因构建到pmd18-T载体上，转入大肠杆菌感受态细胞得到pmd18-CabuAG重组质粒，双酶切pmd18-CabuAG重组质粒和pBI121质粒，连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，提取质粒后，获得表达载体pBI121-CabuAG。

7.含有权利要求4或5所述载体的宿主细胞。

8.权利要求2或3所述的基因在改造植物花器官中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用是在植物体内过量表达楸树雌雄蕊发育相关的CabuAG基因，获得特异发育的植物花器官。