CN111440780A

CN111440780A - 一种凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列及其在植物抗旱中的应用

Info

Publication number: CN111440780A
Application number: CN202010483440.2A
Authority: CN
Inventors: 赵大球; 陶俊; 张夏燕; 孙静; 孟家松; 张克亮
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-06-01
Filing date: 2020-06-01
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2040-06-01
Also published as: CN111440780B

Abstract

本发明公开了一种凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列及其在植物抗旱中的应用。所述凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列如SEQ ID NO.6所示。本发明克隆了一个新的凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列，并确定了它的核苷酸序列和由此得出的氨基酸序列。另外将PoCCoAOMT基因的真核表达载体转化到植物中，尤其是烟草中，其植株具有显著增强的耐旱能力。

Description

一种凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列及其在植物抗旱中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列及其在植物抗旱中的应用。

背景技术

近年来由于温室效应，全球变暖日益加剧，不少地方出现了极端干旱灾害，严重威胁了地区的农林业生产。凤丹(Paeonia ostii)属于芍药科芍药属的多年生木本植物，是杨山牡丹的一个变种，具有很高观赏价值、药用价值和油用价值。凤丹在2011年3月22日被卫生部批准为油用牡丹资源，因其易成活、结籽量大、不饱和脂肪酸含量高等优点而在全国二十多个省区推广种植，尤其是山区和沙荒地等干旱或半干旱地区。在干旱或半干旱生境条件下，干旱胁迫是影响凤丹生长的主要非生物胁迫因子，如何缓解干旱胁迫对凤丹的伤害已成为目前亟待解决的问题。

木质素是一种苯丙烷聚合体类物质，填充于陆生植物细胞壁纤维素网状结构中，不仅能赋予细胞壁刚性，而且能增强植物细胞及组织抵御其他逆境的能力(Liu Q,Luo L,Zheng L.Lignins:biosynthesis and biological functions inplants.Int.J.Mol.Sci.2018,19,335)。木质素的生物合成涉及到多种酶，而咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是调控这一途径的关键酶之一(Pagadala NS,Arha M,Reddy PS,et al.Phylogenetic analysis,homology modelling,molecular dynamics and dockingstudies of caffeoyl-CoA-O-methyl transferase(CCoAOMT 1and 2)isoforms isolatedfrom subabul(Leucaena leucocephala).J.Mol.Model.2009,15,203)。前人研究表明，蚕豆CCoAOMT基因在拟南芥上异源表达能够提高植株对镉的吸收与忍耐(Xia Y,Liu J,Wan,Y,et al.Ectopic expression of Vicia sativa Caffeoyl-CoA O-methyltransferase(VsCCoAOMT)increases the uptake and tolerance of cadmium in Arabidopsis.Environ.Exp.Bot.2018,145,47-53.)，而水稻CCoAOMT能够提高植株对过量铜胁迫的忍耐(SuN,Ling F,Xing A,et al.Lignin synthesis mediated by CCoAOMT enzymes isrequired for the tolerance against excess Cu in Oryzasativa.Environ.Exp.Bot.2020.175,104059)。

凤丹的遗传背景比较薄弱，还没有基因组方面的报道。而关于凤丹CCoAOMT基因研究，李果(油用牡丹‘凤丹’DFR基因克隆与功能验证及木质素合成基因发掘，西北农林大学硕士毕业论文，2017)以凤丹种壳与种仁为材料进行转录组测序，共鉴定到13个CCoAOMT基因片段，但并没有描述具体序列，并且未继续通过克隆得到CCoAOMT基因cDNA全长序列，并将凤丹CCoAOMT基因应用于植物抗旱未见报道。而对CCoAOMT基因的深入研究不仅可以丰富该物种的生物信息学资源，拓展凤丹分子生物学研究领域，而且对研究凤丹在特殊生境中的遗传机制有广泛的应用前景。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列及其在植物抗旱中的应用。本发明首次从干旱下凤丹叶片中克隆得到1个PoCCoAOMT基因cDNA全长序列，并确定了它的核苷酸序列和由此得出的氨基酸序列。另外将PoCCoAOMT基因的真核表达载体转化到烟草中，其植株具有显著增强的耐旱能力。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了具体功能的编码咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的新cDNA全长序列和由此推断的氨基酸序列，以及创制耐旱能力强的烟草新种质。

一种凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列，该序列如SEQ ID NO.6所示。

一种由所述的凤丹PoCCoAOMT基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO.7所示。

克隆所述的凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列的RACE扩增引物，所述扩增引物的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了所述的凤丹PoCCoAOMT基因在调控植物抗旱功能中的应用。

作为优选，所述的植物为烟草。

本发明为了首次从凤丹中克隆得到PoCCoAOMT基因cDNA全长序列，采用RACE技术扩增得到了1条cDNA全长序列，并在此基础上推测得到了其相关的氨基酸序列。所述方法的3'-RACE引物：5'-CGTGAAGTAACCGCAAAA-3'(SEQ ID NO.1)和5'-ATTTCATCTTTGTGGACGCT-3'(SEQ ID NO.2)；所述方法的5'-RACE引物：5'-GGCTACGACAACACCCTATGGAATGGTT-3'(SEQ IDNO.3)。该cDNA全长序列被命名为PoCCoAOMT，开放阅读框为744bp，共编码247个氨基酸，与芍药(AFG17073)、葡萄(XP_002282867)、虾衣花(XP_012836932)、构树(AAT37172)、番薯(XP_019195274)、枣(XP_015869695)、苞叶木(KAF3435425)和莲(XP_010263488.1)等植物CCoAOMT基因编码的氨基酸序列同源性超过90％，并且除了番薯外，它们都具有8个保守的基序。

构建携带PoCCoAOMT的真核表达载体，转入农杆菌EHA105细胞中，利用叶盘法侵染烟草，经过3个月的培养，获得了转入PoCCoAOMT基因的烟草，通过干旱胁迫进行比较，转入PoCCoAOMT基因的烟草显著较野生型烟草耐干旱能力强，表明本发明人克隆获得的PoCCoAOMT基因具有调控耐干旱的功能。所述构建真核表达载体方法的引物F：5'-GAGAACACGGGGGACTGGTACCCGGGGATCCATGGCGAGTAACCAGACA-3'(SEQ ID NO.4)和R：5'-ACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGTCGACGCTGATTCTGCGGCACAG-3'(SEQ ID NO.5)。

有益效果：本发明克隆了一个新的凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列，并确定了它的核苷酸序列和由此得出的氨基酸序列。另外将PoCCoAOMT基因的真核表达载体转化到植物中，尤其是烟草中，其植株具有显著增强的耐旱能力。

附图说明

图1：凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长的RACE结果检测，其中，M：DL 2000 marker；1：3'-RACE扩增产物；2：5'-RACE扩增产物。

图2：凤丹与其他8种植物CCoAOMT基因推测得到的氨基酸序列同源性比对分析，其中，黑色部分为所有物种同源性为100％的序列。

图3：凤丹与其他8种植物CCoAOMT基因推测得到的氨基酸保守基序分析，其中，A图为保守基序在CCoAOMT基因cDNA全长上的位置与分布；B图为8个保守基序的序列。

图4：23天自然干旱胁迫后烟草植株的表型，其中，野生型烟草叶片萎蔫、下垂；转入PoCCoAOMT基因的烟草保持正常生长状态。

图5：23天自然干旱胁迫后烟草植株的相关胁迫生理指标测定，其中，A图为叶片含水量与相对电导率；B图为荧光探针法观测O₂ ^·-积累水平；C图为DAB染色法观测H₂O₂积累水平。

图6：23天自然干旱胁迫后烟草植株的木质素含量。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

实施例1 PoCCoAOMT基因cDNA全长序列的克隆

PoCCoAOMT基因3'端cDNA序列的获得：选用干旱胁迫下凤丹叶片作为材料，采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa)试剂盒提取总RNA。采用3'full RACE CoreSet Ver.2.0(TaKaRa)反转录生产cDNA的第一条链，反转录体系为：1μL RNA、1μL 3'-RACEAdaptor、1μL dNTP Mixture(10mM each)、2μL 5×M-MLV Buffer、0.25μL RNaseInhibitor、0.25μL Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H^-)、4.5μL RNase Free ddH₂O；反转录程序：42℃反应60min，70℃延伸15min。在此基础之上，3'-RACE分别进行两轮PCR扩增。第一轮PCR扩增体系为：2μL cDNA、8μL 1×cDNA Dilution BufferⅡ、2μL 3'-RACEOuter Primer、2μL Gene specific Outer Primer(10μM)(5'-CGTGAAGTAACCGCAAAA-3'(SEQ ID NO.1))、5μL 10×LA PCR BufferⅡ(Mg⁺Plus)、0.5μL LA DNA pdymerase、30.5μLRNase Free ddH₂O。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s，循环20次；72℃延伸10min。第二轮PCR扩增体系为：1μL第一轮PCR扩增产物、8μL dNTPMixture(2.5mM each)、2μL 3'-RACE Inner Primer(5'-ATTTCATCTTTGTGGACGCT-3'(SEQID NO.2))、2μL Gene Specific Inner Primer、5μL 10×LA PCR BufferⅡ(Mg⁺Plus)、0.5μL LA DNA pdymerase、31.5μL RNase Free ddH₂O。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，循环30次；72℃延伸10min。将产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

PoCCoAOMT基因5'端cDNA序列的获得：采用SMARTer^TM RACE cDNA AmplificationKit User Manual(Clontech)反转录生产cDNA的第一条链，反转录反应分为三步，首先进行体系一：1μL RNA、1μL 5'-RACE CDS Ptimer A、9μL Deionized H₂O。反应程序为：72℃反应3min后，42℃反应2min。然后进行体系二：11μL体系一的反应液、4μL 5×Frist-standBuffer、0.5μL Dithiothreitol(100mM)、1μL dNTP Mixture(20mM each)、0.5μL RNaseInhibitor、2μL SMAR Tscribe Reverse Transcriptase、1μL SMARTER IIAOligonudeatide。反应程序为：42℃反应90min后，70℃反应10min。最后进行体系三：20μL体系二的反应液、50μL Tricine-EDTA Buffer。反应程序为：25℃条件下静置15min，稀释cDNA。在此基础之上，5'-RACE进行PCR扩增，反应体系为：2.5μL 5'cDNA、25μL 2×SeqAmpBuffer、1μL SeqAmp DNA Polymerase、5μL 10×UPM、1μL 5'Gene Specific Primer(5'-GGCTACGACAACACCCTATGGAATGGTT-3'(SEQ ID NO.3))、15.5μL RNase Free ddH₂O。反应条件为：94℃反应30s、72℃反应3min，循环5次；94℃反应30s、70℃反应30s、72℃反应3min，循环5次；94℃反应30s、68℃退火30s、72℃延伸3min，循环25次。将产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

实施例2凤丹与其他8种植物CCoAOMT基因推测得到的氨基酸序列同源性比对分析

将凤丹与其他8种植物CCoAOMT基因推测得到的氨基酸序列分别用FASTA格式表示，保存为TXT文件，再载入DNAMAN5.2.2软件中进行同源性比对，可以观察到它们最同源的氨基酸序列，结果见图2。

实施例3凤丹与其他8种植物CCoAOMT基因推测得到的氨基酸保守基序分析

将凤丹与其他8种植物CCoAOMT基因推测得到的氨基酸序列分别用FASTA格式表示，保存到为1个FASTA文件,再载入MEME在线工具分析CCoAOMT蛋白的保守基序，按照默认条件设置，可以观察到8个保守基序，结果见图3。

实施例4凤丹PoCCoAOMT真核表达载体在烟草中的表达

凤丹PoCCoAOMT真核表达载体构建：将已获得的PoCCoAOMT基因全长序列送武汉思特进科技发展有限公司进行全基因合成，再进行PCR扩增，体系为：1μL dNTP Mixture(25mMeach)、PoCCoAOMT-Forward Primer(5'-GAGAACACGGGGGACTGGTACCCGGGGATCCATGGCGAGTAACCAGACA-3'(SEQ ID NO.4))和PoCCoAOMT-Reverse Primer(5'-ACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGTCGACGCTGATTCTGCGGCACAG-3'(SEQ ID NO.5))各2μL、5μL 10×pfu Buffer、0.4μLPfu高温聚合酶(5U/μL)、40μL RNase Free ddH₂O。扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环35次；72℃延伸6min。将目的片段切下，进行胶回收，检测无误后与载体进行连接。随后，对目的基因及表达载体pCAMBIA1301-GFP进行双酶切反应。分别对载体pCAMBIA1301-GFP和扩增片段PoCCoAOMT分别用BamH I和Sal I进行酶切。载体酶切体系为：10μL质粒(300μg/mL)、1μL BamH I(10U/μL)、1μL Sal I(10U/μL)、5μL 10×Buffer、33μL ddH₂O。扩增片段酶切体系为：43μL PCR产物、1μL BamH I(10U/μL)、1μL SalI(10U/μL)、5μL 10×Buffer。以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应3h。对酶切的产物进行胶回收，洗脱后备用。再将目的片段与表达载体进行连接、转化，连接体系为：6μL酶切目的片段(50ng)、8μL酶切载体(100ng)、2μL 10×T4 DNA ligase Buffer、1μL T4 DNA ligase、3μL RNase Free ddH₂O，然后16℃水浴2h即可。重组产物取10μL加入200μL预冷的DH5α感受态中，42℃热击90s，冰上静置2min，加入9mL无抗生素的LB液体培养基，37℃下100rpm培养1h，铺板后放入恒温培养箱，37℃倒置培养18h。挑取培养基上的单菌株放入3mL LB液体培养基(50mg/L Kan)中，37℃下200rpm过夜培养后进行菌液PCR验证。PCR验证体系：2.5μL 10×PCR BufferⅡ(Mg²⁺)、2μL dNTP Mixture(2.5mM each)、2μL质粒DNA、1.25μL ForwardPrimer(5'-GGACTGGTACCCGGGGATCCATGGCGAGTAACCAGACA-3'(SEQ ID NO.8))、1.25μLReverse Primer(5'-CCCTTGCTCACCATGTCGACGCTGATTCTGCGGCACAG-3'(SEQ ID NO.9))、0.25μL LA Taq DNA聚合酶(5U/μL)、15.75μL ddH₂O。反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸10min。对PCR反应液进行电泳检测以验证扩增片断大小。最后提取质粒进行双酶切验证，体系为：1μL BamH I、1μL Sal I、10μL上一步提取的质粒DNA、2μL 10×K Buffer、6μL ddH₂O，37℃反应1.5h，直至凤丹PoCCoAOMT真核表达载体构建成功。

凤丹PoCCoAOMT真核表达载体转化烟草：将100mL的YEB固体培养基(Kan 50mg/L、Rif 50mg/L)分装至6个培养皿，用接种针蘸取农杆菌菌液，在培养基上分区划线，暗培养36-48h；挑选单菌落，放入YEB液体培养基(Kan 50mg/L、Rif 50mg/L)中，28℃下200rpm过夜培养后取2mL菌液加入50mL YEB液体培养基(Kan 50mg/L、Rif 50mg/L)中，28℃下200rpm培养到OD₆₀₀＝0.3-0.4；摇好的菌液倒入50mL的离心管中，25℃下5,000rpm离心10min，倒掉上清液；小三角瓶灭菌后依次加入400μL AS(20mg/mL)和5mL MS₀液体培养基(不用调pH，不要加入蔗糖、琼脂)，用枪打匀菌体，倒入上述小三角瓶中，然后加MS₀液体培养基至50mL；纱布灭菌，然后用橡皮筋绑紧覆盖在烧杯口；将50mL MS₀倒入另一个灭过菌的小三角瓶中备用；把烟草无菌苗叶片切成1cm×1cm小块，切100-150片，放入含有50mL MS₀的小三角瓶中，然后把叶片倒入烧杯中，再把过滤后的叶片放到含有菌液的小三瓶中，不断摇动，侵染8min；过滤菌液，取出叶片，用无菌滤纸吸干表面的菌液，接种在共培养的培养基[MS₀+NAA(0.1mg/L)+6-BA(3.0mg/L)+6.66％琼脂+蔗糖(30g/L)]中，暗培养3d左右；共培养结束以后，转入到抗性芽筛选分化培养基[MS₀+NAA(0.1mg/L)+6-BA(3.0mg/L)+蔗糖(30g/L)+6.66％琼脂+Hyg(25mg/L)+Cb(100mg/L)]中，大概两周继代一次，直至分化出芽；当分生不定芽长到2cm以上时，用刀切下不定芽，转接到生根筛选培养基[1/2MS+6.66％琼脂+蔗糖(30g/L)+Cb(50mg/L)+IBA(3.0mg/L)+Hyg(8mg/L)]进行生根筛选。经过3个月的培养，可获得转PoCCoAOMT基因烟草。

转PoCCoAOMT基因烟草耐干旱能力鉴定：将烟草植株置于22℃、10h光照条件下进行自然干旱胁迫，23天后可以观察到野生型烟草叶片出现萎蔫、下垂等干旱伤害症状，而转PoCCoAOMT基因烟草并未出现上述的干旱伤害症状，仍然保持正常的生长状态，表明转PoCCoAOMT基因烟草具有较强的耐干旱能力，结果见图4。

实施例5干旱胁迫下烟草植株相关性指标测定

干旱胁迫下烟草植株的相关胁迫生理指标测定：(1)叶片相对含水量：取适量新鲜叶片称重并记为鲜重(FW)，而后将其在烘箱(9423A，上海精宏实验设备有限公司)中105℃处理5min，再在65℃处理2h以上，将烘干恒重的样品称量并记为干重(DW)，并按下列公式计算叶片相对含水量：叶片相对含水量(％)＝(FW-DW)/FW×100％。(2)相对电导率：称取0.1g用直径1cm打孔器获得的叶片圆片，放入含有适量去离子水的注射器中，堵住注射器前端抽真空直至叶片沉入水下。然后一起倒入玻璃试管中，加去离子水至总体积达为20mL。室温静置4h，摇匀后用电导率仪(DDS-307A，上海雷磁仪器有限公司)测定溶液电导率C1。接下来将试管封口，沸水浴30min，等温度冷却至室温后测定此时溶液电导率为C2。每个处理按下列公式计算叶片REC：REC(％)＝C1/C2×100％。(3)O₂ ^·-积累水平：采用荧光探针法观察O₂ ^·-积累量，具体操作参照活体细胞氧化应激ROS原位染色试剂盒(上海哈灵公司)说明书并稍作修改，具体步骤如下：①滴100μL清理液于载玻片上，捏紧2片不锈钢双面剃须刀片快速切割滤纸上的新鲜叶片，避开主叶脉；②用细头毛笔沾取切好的样品放于载玻片清理液中，并调整好位置；③叶片样品全部放好后将载玻片上清理液尽量吸取干净，然后加入10μL荧光染色剂二氢溴化乙啶(DHE)，37℃孵育20min；④在荧光显微镜(Axio Imager D2，ZEISS，德国)下观察并且拍照。(4)H₂O₂积累水平：采用二氨基联苯胺(DAB)染色法观察H₂O₂的积累量。使用50mM的Tris-acetate缓冲液来配制浓度为0.1mg/mL、pH为5.0的DAB染色液。用染色液在黑暗中充分浸泡叶片24h后，取出叶片放入95％(v/v)酒精中进行沸水浴，在15min后进行拍照。从图5可以看出，与野生型烟草相比，转PoCCoAOMT基因烟草具有显著较高的叶片相对含水量、较低的相对电导率、O₂ ^·-和H₂O₂积累水平，表明转PoCCoAOMT基因烟草在干旱胁迫下受到的伤害少。

干旱胁迫下烟草植株的木质素含量测定：采用木质素含量试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定烟草植株木质素含量，具体步骤如下：将样品80℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛后称取干重DW约10mg记为W，放入10mL玻璃试管中；将分光光度计预热30min，用蒸馏水调零，将波长设置为280nm；在空白管中依次加入2500μL试剂一和100μL高氯酸，在测定管中依次加入10mg样本、2500μL试剂一和100μL高氯酸；将试剂加入10mL玻璃试管，用封口膜密封，充分混匀，80℃水浴40min，每隔10min震荡一次；自然冷却后在空白管和测定管中加入2500μL试剂二，充分混匀；吸取20μL上清液与980μL试剂三混匀，取200μL于96孔板，测定280nm处吸光值A；计算公式：ΔA＝A测定管-A空白管，木质素含量(mg/g DW)＝0.147×(ΔA-0.0068)÷W×50。从图6可以看出，与野生型烟草相比，转PoCCoAOMT基因烟草的根、茎、叶均具有显著较高的木质素，表明凤丹PoCCoAOMT基因能够调控木质素合成。

综上所述，本发明获得了1个凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列，并通过将构建的PoCCoAOMT基因真核表达载体转化到烟草中进行表达，提高了烟草植株木质素合成，创制了耐旱能力强的烟草新种质。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列及其在植物抗旱中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtgaagtaa ccgcaaaa 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atttcatctt tgtggacgct 20

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggctacgaca acaccctatg gaatggtt 28

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagaacacgg gggactggta cccggggatc catggcgagt aaccagaca 49

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acagctcctc gcccttgctc accatgtcga cgctgattct gcggcacag 49

<210> 6

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tactaccaaa taaggatcac aagaagataa ttttatcgat aaaaaatggc gagtaaccag 60

acacagcagg aaggccaagc tggtagacac caggaagttg gccacaagag tcttttacag 120

agtgatgctc tttaccagta tatccttgaa accagcgttt atccaagaga gcctgaaccc 180

atgaaagaat tgcgtgaagt aaccgcaaaa catccatgga atatcatgac aacctctgct 240

gatgaaggac agttcttgaa catgcttatt aaggtcataa acgctaaaaa cacaatggag 300

attggtgtct acactggtta ctctctcctt gctactgctc tggcccttcc tgatgatgga 360

aagatattgg ccatggatat caaccgagaa aactacgaac tgggtcttcc catcattgaa 420

aaggccggtg ttgctcacaa gatcgacttc agagaaggcc ccgccctgcc tgttcttgat 480

caaatgatcc aagacggaaa atatcacgag acatttgatt tcatctttgt ggacgctgac 540

aaggataact atattaacta ccacgagagg ctgattgatc ttgtcaaagt tggaggagtg 600

atcggctacg acaacaccct atggaatggt tcggtggtcg cgccacctga tgcgcctctt 660

aggaagtacg taaggtatta cagggatttc gtgttggagc tcaacaaggc cttggctgct 720

gatcagagga tcgagatttg tcagctccct gttggggatg ggatcactct gtgccgcaga 780

atcagctgat cacatcattg ccctagaaac agagggagcc cgggaacatt tttatgtttg 840

ttaattgttg tatctttttg attaaatact ggttaaacat aaaataaatg caattaagcc 900

actaggctgg ggggagtgca accttgtaat gttaaatttg catggaaaaa aatgcagctc 960

atatatatta tagccaaaaa aaaaaaa 987

<210> 7

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Ser Asn Gln Thr Gln Gln Glu Gly Gln Ala Gly Arg His Gln

1 5 10 15

Glu Val Gly His Lys Ser Leu Leu Gln Ser Asp Ala Leu Tyr Gln Tyr

20 25 30

Ile Leu Glu Thr Ser Val Tyr Pro Arg Glu Pro Glu Pro Met Lys Glu

35 40 45

Leu Arg Glu Val Thr Ala Lys His Pro Trp Asn Ile Met Thr Thr Ser

50 55 60

Ala Asp Glu Gly Gln Phe Leu Asn Met Leu Ile Lys Val Ile Asn Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Met Glu Ile Gly Val Tyr Thr Gly Tyr Ser Leu Leu Ala

85 90 95

Thr Ala Leu Ala Leu Pro Asp Asp Gly Lys Ile Leu Ala Met Asp Ile

100 105 110

Asn Arg Glu Asn Tyr Glu Leu Gly Leu Pro Ile Ile Glu Lys Ala Gly

115 120 125

Val Ala His Lys Ile Asp Phe Arg Glu Gly Pro Ala Leu Pro Val Leu

130 135 140

Asp Gln Met Ile Gln Asp Gly Lys Tyr His Glu Thr Phe Asp Phe Ile

145 150 155 160

Phe Val Asp Ala Asp Lys Asp Asn Tyr Ile Asn Tyr His Glu Arg Leu

165 170 175

Ile Asp Leu Val Lys Val Gly Gly Val Ile Gly Tyr Asp Asn Thr Leu

180 185 190

Trp Asn Gly Ser Val Val Ala Pro Pro Asp Ala Pro Leu Arg Lys Tyr

195 200 205

Val Arg Tyr Tyr Arg Asp Phe Val Leu Glu Leu Asn Lys Ala Leu Ala

210 215 220

Ala Asp Gln Arg Ile Glu Ile Cys Gln Leu Pro Val Gly Asp Gly Ile

225 230 235 240

Thr Leu Cys Arg Arg Ile Ser

245

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggactggtac ccggggatcc atggcgagta accagaca 38

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cccttgctca ccatgtcgac gctgattctg cggcacag 38

Claims

1.一种凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列，该序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一种由权利要求1所述的凤丹PoCCoAOMT基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.克隆权利要求1所述的凤丹PoCCoAOMT基因cDNA全长序列的RACE扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求1所述的凤丹PoCCoAOMT基因在调控植物抗旱功能中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的植物为烟草。