CN112094859A

CN112094859A - 一种凤丹PoFBA基因、表达载体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112094859A
Application number: CN202011021180.3A
Authority: CN
Inventors: 赵大球; 陶俊; 方紫雯; 孟家松; 孙静; 张克亮
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2040-09-25
Also published as: CN112094859B

Abstract

本发明公开了一种凤丹果糖‑1,6‑二磷酸醛缩酶基因PoFBA基因、表达载体及其制备方法和应用，所述凤丹PoFBA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明克隆了凤丹PoFBA基因cDNA全长序列，并确定了它的核苷酸序列和由此得出的氨基酸序列。并通过将构建的PoFBA基因真核表达载体转化到植物中，尤其是烟草中，其植株具有显著增强的耐旱能力。

Description

一种凤丹PoFBA基因、表达载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种凤丹PoFBA基因、表达载体及其制备方法和应用。

背景技术

干旱是影响植物生长发育的一个主要环境因素，它对植物的伤害主要表现为对植物细胞膜的通透性和细胞内外正常的渗透压平衡的破坏。凤丹（Paeoniaostii）属于芍药科芍药属的多年生木本植物，具有较高的结实性，目前主要用于以提取籽油为目的而栽培的一种新型油料作物。凤丹虽为肉质根，但干旱仍会对其正常生长发育产生不利影响（Zhao等，Physiological and transcriptomicanalysis of tree peony (Paeonia sectionMoutan DC.) in response to drought stress，Forests，2019，10：135）。

果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（fructose-1,6-bisphosphate aldolase，FBA）既存在于糖酵解和糖异生途径中, 同时也存在于磷酸戊糖循环和卡尔文循环中，是调控光合作用速率的重要酶之一，对植物的非生物胁迫响应起着至关重要的调控作用。目前，花生（陈娜等，花生果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因AhFBA1的克隆与表达，作物学报，2014，40(5)：934-941）、油菜（谢小玉等，油菜FBA基因克隆、表达分析及其与抗旱性的关系，生态学报，2020，40(16)：5708-5717）、紫花苜蓿（龙瑞才等，紫花苜蓿果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因全长克隆及分析，西北植物学报，2010，30(6)：1075-1082）、甘薯（苏在兴等，甘薯果糖-1,6-二磷酸醛缩酶5基因（IbFBA5）的克隆与生物信息学分析，分子植物育种，2015，13(11)：2469-2476）等多种植物的FBA基因相继被克隆，并且研究不断深入。而凤丹的遗传背景比较薄弱，尚未见到关于凤丹FBA基因的报道。对凤丹FBA基因的深入研究不仅可以拓展凤丹分子生物学研究领域，而且对于制备耐旱转基因植物具有广泛的应用前景。

发明内容

目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种凤丹PoFBA基因、表达载体及其制备方法和应用。

本发明的目的之一是提供一种凤丹果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的目的之二是提供上述凤丹PoFBA基因编码的蛋白质PoFBA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的目的之三是提供一种带有上述凤丹PoFBA基因的真核表达载体。进一步，由序列如SEQ ID NO.1所示的凤丹PoFBA基因与中间植物表达载体pCAMBIA1301构成。

本发明的目的之四提供一种上述凤丹PoFBA基因、上述真核表达载体在制备耐旱转基因植物中的应用。

本发明的目的之五是提供一种含有上述凤丹PoFBA基因的耐旱转基因植物的制备方法，包括：

（1）真核表达载体的构建：合成凤丹PoFBA基因cDNA全长序列，设计引物，PCR扩增目的片段，对目的片段及表达载体pCAMBIA1301进行双酶切反应，再将目的片段与表达载体的酶切产物进行连接、转化，重组产物转化至大肠杆菌感受态细胞，经卡那霉素筛选获得成功重组的真核表达载体；

（2）农杆菌介导的转化：将构建成功的真核表达载体质粒转化至农杆菌，将阳性克隆接种至YEB液体培养基中培养到OD₆₀₀=0.3-0.4，离心后用乙酰丁香酮和MS₀液体培养基重悬沉淀，再将烟草无菌苗叶片块浸泡在侵染培养基中，而后取出叶片接种在共培养的培养基中进行共培养，而后转入到抗性芽筛选分化培养基中，不断继代，直至分化出芽，将不定芽转接到生根筛选培养基进行生根筛选，直至获得完整植株；

（3）转基因株系的筛选：将获得的植株先后进行RT-PCR和qRT-PCR验证，最后获得含耐旱基因PoFBA的烟草植株。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案：

本发明采用RACE技术克隆了凤丹耐旱基因果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA，所述耐旱基因PoFBA具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其中，序列表中的SEQ ID NO.1由1321个碱基组成。该凤丹果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA能够编码PoFBA蛋白，此种蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其中，序列表中的SEQ ID NO.2由357个氨基酸组成。

本发明中PoFBA基因编码的蛋白与番茄（NP_001296956）、马铃薯（XP_006346102）、博落回（OVA05112）、油橄榄（XP_022857619）等植物同源蛋白的同源性超过90%。

可用现有的植物双元表达载体pCAMBIA1301构建含有PoFBA基因的重组表达载体。将携带有本发明基因PoFBA的植物表达载体转入农杆菌EHA105细胞中，再通过叶盘法转化到植物组织中，被转化的宿主植物是烟草。进一步的，构建真核表达载体中设计的引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。

通过RT-PCR和qRT-PCR验证来筛选转化的烟草植株。进一步的，进行RT-PCR的上游引物为SEQ ID NO.8，下游引物为SEQ ID NO.9。进行qRT-PCR检测，以烟草Actin为内参基因，设计引物为：上游引物NtActin-F：5'-TCCTCATGCAATTCTTCG-3'（SEQ ID NO.10）；下游引物NtActin-R：5'-ACCTGCCCATCTGGTAAC-3'（SEQ ID NO.11）；设计PoFBA基因引物为：上游引物PoFBA-F：5'-CGTGTCGCCCTTCTAATA-3'（SEQ ID NO.12）；下游引物PoFBA-R：5'-CTGCTGCCAAAATACCCT-3'（SEQ ID NO.13）。

本发明所提供的获得耐旱的转基因植物的方法，是将上述凤丹果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA导入植物中，得到耐旱转基因植株。

凤丹果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA的核苷酸序列（SEQ ID NO.1）

TAGGGCACGACGGCAGTTGATCTGACTCAGGATCACTCGTGTTACACTGCAATCGCGTGTCGCCCTTCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGGGCATTTTCCCCCTTGACCATTGCTTTACTACAAAACCATGTCTGCCTTTATAGGAAAGTATGCAGATGAATTAATCAAGAATGCCAAGTACATAGCCACCCCTGGAAAGGGTATTTTGGCAGCAGATGAGAGCACAGGCACCATTGGCAAGCGTCTAGCTAGCATTAACGTCGACAACATCGAGTCCAACCGTCAAGCCCTTCGCGAGCTCCTCTTCACCACCCCGAACGCCCTGCCTTACCTCTCCGGTGTCATTCTTTTCGAGGAAACTCTATACCAAAAAACCACCGACGGAAAGCCATTCGTCGAACTACTCCAGGAAAACAATGTCGTCCCGGGGATCAAAGTCGACAAGGGCACGGTCGATTTGGCGGGCACTAATGGCGAGACCACCACCCAAGGCCTCGACTCGCTCGGAGCTCGTTGTGCACAGTACTACAAGGCCGGAGCGCGATTTGCCAAGTGGCGCTCGGTCCTCAAGATCGGTCCCACTGAACCGTCTGAATTGTCAATCCAGCAGAATGCGCAGGGATTGGCTCGTTACGCCATTATTTGCCAGGAAAATGGGCTTGTACCCATTGTTGAGCCTGAGATTTTGACTGATGGGAACCATGATATTAAGAGATGTGCTGCTGCTACTGAAATGGTACTTGCAGCAGTTTATAAGGCACTCAATGAACAACATGTTCTTCTTGAAGGAACACTCTTGAAGCCCAACATGGTTACACCAGGATCTGACAGCCCCAAGGTGGCACCTGAGGTGATTGCTGAATACACAGTAACAGCATTGCGCCGAACTGTACCACCAGCAGTTCCAGGAATTGTGTTTTTGTCAGGGGGACAAAGCGAGGAAGAGGCAACGTTGAATCTAAACGCCATGAATAAGCTTGAGGTGTTGAAGCCATGGACACTTTCCTTCTCTTTTGGGCGAGCTCTGCAGCAGAGCACACTCAAGTTATGGGGTGGAAAGAAAGAAAATGTTGGAAAAGCTCAAGTGGGATTCTTGGCAAGGTGCAAGGCTAATTCTGATGCCACTCTTGGCAAGTATACCGGTGGCAGTGGGGGTGGGTTGGCTACTGAGAGTTTGTATGTTAAGGGGTACAAGTACTAGGCTTCAGATGTATGGTGAAGATGAATATTGTCCTGTGGATGTCAAACTTGTATTGAATATGTATATCCTTCTTTGATTAAAAAAAAAAAA

由凤丹果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA的核苷酸序列推测得到的氨基酸序列（SEQID NO.2）

MSAFIGKYADELIKNAKYIATPGKGILAADESTGTIGKRLASINVDNIESNRQALRELLFTTPNALPYLSGVILFEETLYQKTTDGKPFVELLQENNVVPGIKVDKGTVDLAGTNGETTTQGLDSLGARCAQYYKAGARFAKWRSVLKIGPTEPSELSIQQNAQGLARYAIICQENGLVPIVEPEILTDGNHDIKRCAAATEMVLAAVYKALNEQHVLLEGTLLKPNMVTPGSDSPKVAPEVIAEYTVTALRRTVPPAVPGIVFLSGGQSEEEATLNLNAMNKLEVLKPWTLSFSFGRALQQSTLKLWGGKKENVGKAQVGFLARCKANSDATLGKYTGGSGGGLATESLYVKGYKY。

附图说明

图1：凤丹果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA的cDNA全长RACE结果检测：其中，M：DL 2000 marker；1：3'-RACE扩增产物；2：5'-RACE扩增产物；

图2：凤丹与其他4种植物FBA基因推测得到的氨基酸序列同源性比对分析：其中，黑色部分为所有物种同源性为100%的序列；

图3：基于RT-PCR检测的转凤丹果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA烟草株系筛选；其中，M：DL 2000 marker；1-3：转基因烟草植株；4：野生型烟草；

图4：基于qRT-PCR检测的转凤丹果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA烟草株系筛选；

图5：自然干旱胁迫后烟草植株的表型：其中，野生型烟草叶片萎蔫、下垂；转入凤丹果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA的烟草保持正常生长状态；

图6：自然干旱胁迫后土壤含水量与叶片含水量测定；

图7：自然干旱胁迫后叶片相对电导率（REC）测定；

图8：自然干旱胁迫后叶片超氧阴离子（O₂ ^·-）积累水平观测；

图9：自然干旱胁迫后叶片过氧化氢（H₂O₂）积累水平观测。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

下面结合具体实施方式和说明书附图对本发明作进一步详细的描述。若无特别说明，本发明所述的实验方法，均为常规方法；所述的生物材料，均可从商业途径获得。

实施例1凤丹果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA的cDNA全长序列克隆

PoFBA基因3'端cDNA序列的获得：选用干旱胁迫下凤丹叶片作为材料，采用MiniBESTPlant RNA Extraction Kit (TaKaRa)试剂盒提取总RNA。采用3' full RACE Core SetVer. 2.0 (TaKaRa)反转录生产cDNA的第一条链，反转录体系为：1 μL RNA、1 μL 3'-RACEAdaptor、1 μLdNTP Mixture (10mM each)、2 μL 5× M-MLV Buffer、0.25μLRNaseInhibitor、0.25 μL Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H^-)、4.5 μLRNaseFree ddH₂O；反转录程序：42℃反应60min，70℃延伸15min。在此基础之上，3'-RACE分别进行两轮PCR扩增。第一轮PCR扩增体系为：2 μLcDNA、8 μL 1×cDNA Dilution BufferⅡ、2 μL3'-RACE Outer Primer、2 μL Gene specific Outer Primer (10 μM)（5'-AAACCACCGACGGAAAGC-3'（SEQ ID NO.3））、5 μL 10× LA PCR Buffer Ⅱ (Mg⁺ Plus)、0.5μL LA DNA pdymerase、30.5 μLRNaseFree ddH₂O。反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸120 s，循环20次；72℃延伸10 min。第二轮PCR扩增体系为：1 μL第一轮PCR扩增产物、8 μLdNTP Mixture (2.5mM each)、2 μL3'-RACE InnerPrimer（5'-AGGCACTCAATGAACAAC-3'（SEQ ID NO.4））、2 μL Gene Specific InnerPrimer、5 μL 10× LA PCR Buffer Ⅱ (Mg⁺ Plus)、0.5 μL LA DNA pdymerase、31.5 μLRNaseFree ddH₂O。反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸120 s，循环30次；72℃延伸10 min。将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

PoFBA基因5'端cDNA序列的获得：采用SMARTer^TM RACE cDNAAmplification KitUser Manual (Clontech)反转录生产cDNA的第一条链，反转录反应分为三步，首先进行体系一：1 μL RNA、1 μL5'-RACE CDS Ptimer A、9μL Deionized H₂O。反应程序为：72℃反应3min后，42℃反应2 min。然后进行体系二：11μL体系一的反应液、4 μL 5× Frist-standBuffer、0.5μLDithiothreitol (100 mM)、1 μLdNTP Mixture (20mM each)、0.5μLRNaseInhibitor、2 μL SMAR Tscribe Reverse Transcriptase、1 μLSMARTER IIAOligonudeatide。反应程序为：42℃反应90 min后，70℃反应10 min。最后进行体系三：20μL体系二的反应液、50 μLTricine-EDTA Buffer。反应程序为：25℃条件下静置15 min，稀释cDNA。在此基础之上，5'-RACE进行PCR扩增，反应体系为：2.5 μL5'cDNA、25μL2×SeqAmpBuffer、1 μLSeqAmp DNA Polymerase、5 μL 10× UPM、1 μL 5'Gene Specific Primer（5'-CCCATCAGTCAAAATCTCAGGCTCAACAA-3'（SEQ ID NO.5））、15.5 μLRNaseFree ddH₂O。反应条件为：94℃反应30 s、72℃反应3 min，循环5次；94℃反应30 s、70℃反应30 s、72℃反应3 min，循环5次；94℃反应30 s、68℃退火30 s、72℃延伸3 min，循环25次。将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

实施例2凤丹与其他4种植物PoFBA基因推测得到的氨基酸序列同源性比对分析

将凤丹与其他4种植物PoFBA基因推测得到的氨基酸序列分别用FASTA格式表示，保存为TXT文件，再载入DNAMAN5.2.2软件中进行同源性比对，可以观察到它们最同源的氨基酸序列，结果见图2。

实施例3凤丹果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA真核表达载体在烟草中的表达

凤丹PoFBA真核表达载体构建：将已获得的PoFBA基因全长序列送武汉思特进科技发展有限公司进行全基因合成，再进行PCR扩增，体系为：1 μLdNTP Mixture (25 mM each)、PoFBA-Forward Primer （5'-GAGAACACGGGGGACTGGTACCCGGGGATCCATGTCTGCCTTTATAGGAA-3'（SEQ ID NO.6））和PoFBA-Reverse Primer （5'-ACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGTCGACGTACTTGTACCCCTTAAC-3'（SEQ ID NO.7））各2 μL、5 μL 10×pfu Buffer、0.4 μLPfu高温聚合酶（5 U/μL）、40 μLRNaseFree ddH₂O。扩增程序为：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，循环35次；72℃延伸6 min。将目的片段切下，进行胶回收，检测无误后与载体进行连接。随后，对目的基因及表达载体pCAMBIA1301进行双酶切反应。分别对载体pCAMBIA1301和扩增片段PoFBA分别用BamH I和Sal I进行酶切。载体酶切体系为：10 μL质粒（300 μg/mL）、1 μLBamH I（10 U/μL）、1 μLSal I（10 U/μL）、5 μL 10× Buffer、33 μLRNaseFree ddH₂O。扩增片段酶切体系为：43 μL PCR产物、1 μLBamH I（10 U/μL）、1 μLSalI（10 U/μL）、5 μL 10× Buffer。以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应3 h。对酶切的产物进行胶回收，洗脱后备用。再将目的片段与表达载体进行连接、转化，连接体系为：6 μL酶切目的片段（50 ng）、8 μL酶切载体（100 ng）、2 μL 10×T4 DNA ligase Buffer、1 μL T4DNA ligase、3 μLRNaseFree ddH₂O，然后16℃水浴2h即可。重组产物取10 μL加入200 μL预冷的DH5α感受态中，42℃热击90 s，冰上静置2 min，加入790μL无抗生素的LB液体培养基，37℃下100 rpm培养1 h，铺板后放入恒温培养箱，37℃倒置培养18 h。挑取培养基上的单菌株放入3 mL LB液体培养基（50 mg/L Kan）中，37℃下200 rpm过夜培养后进行菌液PCR验证。PCR验证体系：2.5 μL 10× PCR Buffer Ⅱ（Mg²⁺）、2 μLdNTP Mixture (2.5 mM each)、2 μL质粒DNA、1.25 μL Forward Primer（5'-GACTGGTACCCGGGGATCCATGTCTGCCTTTATAGGAA-3'（SEQ ID NO.8））、1.25 μL Reverse Primer（5'-CCCTTGCTCACCATGTCGACGTACTTGTACCCCTTAAC-3'（SEQ ID NO.9））、0.25 μLLA Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、15.75 μL ddH₂O。反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环32次；72℃延伸10 min。对PCR反应液进行电泳检测以验证扩增片断大小。最后提取质粒进行双酶切验证，体系为：1 μLBamHI、1 μLSalI、10 μL上一步提取的质粒DNA、2 μL 10×K Buffer、6 μLddH₂O，37℃反应1.5 h，直至凤丹PoFBA真核表达载体构建成功。

凤丹PoFBA真核表达载体转化烟草：将100mL的YEB固体培养基（Kan 50 mg/L、Rif50 mg/L）分装至6个培养皿，用接种针蘸取农杆菌菌液，在培养基上分区划线，暗培养36-48h；挑选单菌落，放入YEB液体培养基（Kan 50 mg/L、Rif 50 mg/L）中，28℃下200 rpm过夜培养后取2 mL菌液加入50 mLYEB液体培养基（Kan 50 mg/L、Rif 50 mg/L）中，28℃下200 rpm培养到OD₆₀₀=0.3-0.4；摇好的菌液倒入50 mL的离心管中，25℃下5,000 rpm离心10 min，倒掉上清液；小三角瓶灭菌后依次加入400 μL AS（20 mg/mL）和5 mL MS₀液体培养基（不用调pH，不要加入蔗糖、琼脂），用枪打匀菌体，倒入上述小三角瓶中，然后加MS₀液体培养基至50mL；纱布灭菌，然后用橡皮筋绑紧覆盖在烧杯口；将50 mL MS₀倒入另一个灭过菌的小三角瓶中备用；把烟草无菌苗叶片切成1 cm × 1 cm小块，切100-150片，放入含有50 mL MS₀的小三角瓶中，然后把叶片倒入烧杯中，再把过滤后的叶片放到含有菌液的小三瓶中，不断摇动，侵染8 min；过滤菌液，取出叶片，用无菌滤纸吸干表面的菌液，接种在共培养的培养基[MS₀+NAA（0.1 mg/L）+6-BA（3.0 mg/L）+6.66%琼脂+蔗糖（30 g/L）]中，暗培养3 d左右；共培养结束以后，转入到抗性芽筛选分化培养基[MS₀+NAA（0.1 mg/L）+6-BA（3.0 mg/L）+蔗糖（30 g/L）+6.66%琼脂+Hyg（25 mg/L）+Cb（100 mg/L）]中，大概两周继代一次，直至分化出芽；当分生不定芽长到2 cm以上时，用刀切下不定芽，转接到生根筛选培养基[1/2 MS+6.66%琼脂+蔗糖（30 g/L）+Cb（50 mg/L）+IBA（3.0 mg/L）+Hyg（8mg/L）]进行生根筛选。经过3个月的培养，可获得转PoFBA基因烟草。

转凤丹PoFBA基因烟草株系的筛选：

RT-PCR检测：采集烟草叶片为材料，参照MiniBEST Plant Genomic DNA ExtractionKit (TaKaRa)试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模板，通过PCR进行序列分析扩增，PoFBA扩增的上游引物PoFBA-F：5'-GACTGGTACCCGGGGATCCATGTCTGCCTTTATAGGAA-3'（SEQ ID NO.8），下游引物PoFBA-R：5'-CCCTTGCTCACCATGTCGACGTACTTGTACCCCTTAAC-3'（SEQ ID NO.9）；25μL反应体系：10×PCR Buffer（Mg²⁺ Plus）2.5μL，上游引物、下游引物各1.25μL（10mM），dNTPmixture（2.5mM each）2.0μL，LA Taq^®高保真酶0.25μL，DNA模板2.0μL，ddH₂O 15.75μL；反应程序：94℃预变性5 min，然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60 sec，反应35个循环，72℃延伸10min；使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。从图3中可以看出，转PoFBA烟草植株能够扩增出1条清晰明亮的条带，而野生型烟草的带条暗弱。

qRT-PCR检测：采集烟草叶片为材料，参照RNAiso Plus（Total RNA 提取）试剂盒（TaKaRa）说明书方法提取总RNA，按照PrimerScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa）取1.0 μg总RNA 反转录成cDNA。将反转录所得的cDNA按照TransStart®Tip Green qPCRSuperMix试剂盒（Trans）进行qRT-PCR检测，以烟草Actin为内参基因，设计引物为：上游引物NtActin-F：5'-TCCTCATGCAATTCTTCG-3'（SEQ ID NO.10）；下游引物NtActin-R：5'-ACCTGCCCATCTGGTAAC-3'（SEQ ID NO.11）；设计PoFBA基因引物为：上游引物PoFBA-F：5'-CGTGTCGCCCTTCTAATA-3'（SEQ ID NO.12）；下游引物PoFBA-R：5'-CTGCTGCCAAAATACCCT-3'（SEQ ID NO.13）；25μL反应体系：2×TransStart® Tip GreenqPCR 12.5 μL，cDNA模板2.0 μL，上游引物、下游引物各1.0 μL（10mM），ddH₂O 8.5 μL；反应程序：94℃预变性30sec，然后94℃变性5sec，52.2℃退火30sec，72℃延伸30sec，反应45个循环，溶解曲线65℃-95℃，每5 sec升温0.5℃；采用公式2^-△△CT法计算基因的相对表达量。从图4可以看出，PoFBA在野生型烟草植株中的表达水平与转PoFBA烟草植株存在显著差异。

实施例4转凤丹果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA烟草植株的耐干旱能力鉴定

干旱胁迫下烟草植株的表型：将烟草植株置于22℃、10 h光照条件下进行自然干旱胁迫，32天后可以观察到野生型烟草叶片出现萎蔫、下垂等干旱伤害症状，而转凤丹PoFBA基因烟草并未出现上述的干旱伤害症状，仍然保持正常的生长状态，表明转PoFBA基因烟草具有较强的耐干旱能力，结果见图5。

干旱胁迫下烟草植株的相关胁迫生理指标测定：（1）土壤含水量：取适量盆土称重并记为鲜重（FW），而后将其在烘箱（9423A，上海精宏实验设备有限公司）中105℃处理5min，再在65℃处理2 h以上，将烘干恒重的样品称量并记为干重（DW），并按下列公式计算叶片相对含水量：土壤含水量（%）=（FW-DW）/FW×100%。（2）叶片含水量：取适量新鲜叶片称重并记为鲜重（FW），而后将其在烘箱（9423A，上海精宏实验设备有限公司）中105℃处理5min，再在65℃处理2 h以上，将烘干恒重的样品称量并记为干重（DW），并按下列公式计算叶片相对含水量：叶片相对含水量（%）=（FW-DW）/FW×100%。（3）相对电导率（REC）：称取0.1 g用直径1 cm打孔器获得的叶片圆片，放入含有适量去离子水的注射器中，堵住注射器前端抽真空直至叶片沉入水下。然后一起倒入玻璃试管中，加去离子水至总体积达为20 mL。室温静置4 h，摇匀后用电导率仪（DDS-307A，上海雷磁仪器有限公司）测定溶液电导率C1。接下来将试管封口，沸水浴30 min，等温度冷却至室温后测定此时溶液电导率为C2。每个处理按下列公式计算叶片REC：REC（%）=C1/C2×100%。（4）超氧阴离子（O₂ ^·-）积累水平：采用荧光探针法观察O₂ ^·-积累量，具体操作参照活体细胞氧化应激ROS原位染色试剂盒（上海哈灵公司）说明书并稍作修改，具体步骤如下：①滴100 μL清理液于载玻片上，捏紧2片不锈钢双面剃须刀片快速切割滤纸上的新鲜叶片，避开主叶脉；②用细头毛笔沾取切好的样品放于载玻片清理液中，并调整好位置；③叶片样品全部放好后将载玻片上清理液尽量吸取干净，然后加入10 μL荧光染色剂二氢溴化乙啶（DHE），37℃孵育20 min；④在荧光显微镜（AxioImager D2，ZEISS，德国）下观察并且拍照。（5）过氧化氢（H₂O₂）积累水平：采用二氨基联苯胺（DAB）染色法观察H₂O₂的积累量。使用50 mM的Tris-acetate缓冲液来配制浓度为0.1 mg/mL、pH为5.0的DAB染色液。用染色液在黑暗中充分浸泡叶片24 h后，取出叶片放入95%（v/v）酒精中进行沸水浴，在15 min后进行拍照。从图6-9可以看出，与野生型烟草相比，转PoFBA基因烟草植株具有显著较高的叶片含水量、较低的相对电导率、O₂ ^·-和H₂O₂积累水平，而两者之间的土壤含水量差异不显著，表明转PoFBA基因烟草植株在干旱胁迫下受到的伤害少，具有较强的耐旱能力。

综上所述，本发明获得了1个凤丹果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因PoFBA的cDNA全长序列，并通过将构建的PoFBA基因真核表达载体转化到烟草中进行表达，制备了耐旱转基因烟草。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，但并非是对本发明的实施方式的限定。本领域普通技术人员应该理解的是，在不脱离本发明创造构思的前提下，以本发明为基础做出的任何修改、等同替换和改进等，都属于本发明的要求保护范围之列。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种凤丹PoFBA基因、表达载体及其制备方法和应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagggcacga cggcagttga tctgactcag gatcactcgt gttacactgc aatcgcgtgt 60

cgcccttcta atacgactca ctatagggca agcagtggta tcaacgcaga gtacatgggg 120

gcattttccc ccttgaccat tgctttacta caaaaccatg tctgccttta taggaaagta 180

tgcagatgaa ttaatcaaga atgccaagta catagccacc cctggaaagg gtattttggc 240

agcagatgag agcacaggca ccattggcaa gcgtctagct agcattaacg tcgacaacat 300

cgagtccaac cgtcaagccc ttcgcgagct cctcttcacc accccgaacg ccctgcctta 360

cctctccggt gtcattcttt tcgaggaaac tctataccaa aaaaccaccg acggaaagcc 420

attcgtcgaa ctactccagg aaaacaatgt cgtcccgggg atcaaagtcg acaagggcac 480

ggtcgatttg gcgggcacta atggcgagac caccacccaa ggcctcgact cgctcggagc 540

tcgttgtgca cagtactaca aggccggagc gcgatttgcc aagtggcgct cggtcctcaa 600

gatcggtccc actgaaccgt ctgaattgtc aatccagcag aatgcgcagg gattggctcg 660

ttacgccatt atttgccagg aaaatgggct tgtacccatt gttgagcctg agattttgac 720

tgatgggaac catgatatta agagatgtgc tgctgctact gaaatggtac ttgcagcagt 780

ttataaggca ctcaatgaac aacatgttct tcttgaagga acactcttga agcccaacat 840

ggttacacca ggatctgaca gccccaaggt ggcacctgag gtgattgctg aatacacagt 900

aacagcattg cgccgaactg taccaccagc agttccagga attgtgtttt tgtcaggggg 960

acaaagcgag gaagaggcaa cgttgaatct aaacgccatg aataagcttg aggtgttgaa 1020

gccatggaca ctttccttct cttttgggcg agctctgcag cagagcacac tcaagttatg 1080

gggtggaaag aaagaaaatg ttggaaaagc tcaagtggga ttcttggcaa ggtgcaaggc 1140

taattctgat gccactcttg gcaagtatac cggtggcagt gggggtgggt tggctactga 1200

gagtttgtat gttaaggggt acaagtacta ggcttcagat gtatggtgaa gatgaatatt 1260

gtcctgtgga tgtcaaactt gtattgaata tgtatatcct tctttgatta aaaaaaaaaa 1320

a 1321

<210> 2

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Ala Phe Ile Gly Lys Tyr Ala Asp Glu Leu Ile Lys Asn Ala

1 5 10 15

Lys Tyr Ile Ala Thr Pro Gly Lys Gly Ile Leu Ala Ala Asp Glu Ser

20 25 30

Thr Gly Thr Ile Gly Lys Arg Leu Ala Ser Ile Asn Val Asp Asn Ile

35 40 45

Glu Ser Asn Arg Gln Ala Leu Arg Glu Leu Leu Phe Thr Thr Pro Asn

50 55 60

Ala Leu Pro Tyr Leu Ser Gly Val Ile Leu Phe Glu Glu Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Gln Lys Thr Thr Asp Gly Lys Pro Phe Val Glu Leu Leu Gln Glu Asn

85 90 95

Asn Val Val Pro Gly Ile Lys Val Asp Lys Gly Thr Val Asp Leu Ala

100 105 110

Gly Thr Asn Gly Glu Thr Thr Thr Gln Gly Leu Asp Ser Leu Gly Ala

115 120 125

Arg Cys Ala Gln Tyr Tyr Lys Ala Gly Ala Arg Phe Ala Lys Trp Arg

130 135 140

Ser Val Leu Lys Ile Gly Pro Thr Glu Pro Ser Glu Leu Ser Ile Gln

145 150 155 160

Gln Asn Ala Gln Gly Leu Ala Arg Tyr Ala Ile Ile Cys Gln Glu Asn

165 170 175

Gly Leu Val Pro Ile Val Glu Pro Glu Ile Leu Thr Asp Gly Asn His

180 185 190

Asp Ile Lys Arg Cys Ala Ala Ala Thr Glu Met Val Leu Ala Ala Val

195 200 205

Tyr Lys Ala Leu Asn Glu Gln His Val Leu Leu Glu Gly Thr Leu Leu

210 215 220

Lys Pro Asn Met Val Thr Pro Gly Ser Asp Ser Pro Lys Val Ala Pro

225 230 235 240

Glu Val Ile Ala Glu Tyr Thr Val Thr Ala Leu Arg Arg Thr Val Pro

245 250 255

Pro Ala Val Pro Gly Ile Val Phe Leu Ser Gly Gly Gln Ser Glu Glu

260 265 270

Glu Ala Thr Leu Asn Leu Asn Ala Met Asn Lys Leu Glu Val Leu Lys

275 280 285

Pro Trp Thr Leu Ser Phe Ser Phe Gly Arg Ala Leu Gln Gln Ser Thr

290 295 300

Leu Lys Leu Trp Gly Gly Lys Lys Glu Asn Val Gly Lys Ala Gln Val

305 310 315 320

Gly Phe Leu Ala Arg Cys Lys Ala Asn Ser Asp Ala Thr Leu Gly Lys

325 330 335

Tyr Thr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Leu Ala Thr Glu Ser Leu Tyr Val

340 345 350

Lys Gly Tyr Lys Tyr

355

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaccaccga cggaaagc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggcactcaa tgaacaac 18

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccatcagtc aaaatctcag gctcaacaa 29

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagaacacgg gggactggta cccggggatc catgtctgcc tttataggaa 50

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acagctcctc gcccttgctc accatgtcga cgtacttgta ccccttaac 49

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gactggtacc cggggatcca tgtctgcctt tataggaa 38

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cccttgctca ccatgtcgac gtacttgtac cccttaac 38

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcctcatgca attcttcg 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acctgcccat ctggtaac 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgtgtcgccc ttctaata 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctgctgccaa aataccct 18

Claims

1.一种凤丹PoFBA基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的凤丹PoFBA基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种带有权利要求1所述凤丹PoFBA基因的真核表达载体，其特征在于，由序列如SEQID NO.1所示的凤丹PoFBA基因与中间植物表达载体pCAMBIA1301构成。

4.权利要求1所述的凤丹PoFBA基因在制备耐旱转基因植物中的应用。

5.权利要求3所述的真核表达载体在制备耐旱转基因植物中的应用。

6.克隆权利要求1所述的凤丹PoFBA基因cDNA全长序列的RACE扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。

7.一种耐旱转基因植物的制备方法，其特征在于，包括：

8.根据权利要求7所述的耐旱转基因植物的制备方法，其特征在于，构建真核表达载体中设计的引物为SEQIDNO.6和SEQIDNO.7。

9.根据权利要求7所述的耐旱转基因植物的制备方法，其特征在于，进行RT-PCR的上游引物为SEQ ID NO.8，下游引物为SEQ ID NO.9。

10.根据权利要求7所述的耐旱转基因植物的制备方法，其特征在于，进行qRT-PCR检测，以烟草Actin为内参基因，设计引物为：上游引物NtActin-F序列如SEQ ID NO.10所示；下游引物NtActin-R序列如SEQ ID NO.11所示；设计PoFBA基因引物为：上游引物PoFBA-F序列如SEQ ID NO.12所示；下游引物PoFBA-R序列如SEQ ID NO.13所示。