CN114250232B - 芍药PlTOE3基因在植物耐高温方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了芍药PlTOE3基因在植物耐高温方面的应用。本发明还公开了过表达芍药PlTOE3基因的载体、表达盒、重组菌或细胞在植物耐高温方面的应用。本发明还公开了获得具有耐高温能力的植物的方法以及鉴定所述的方法获得的具有耐高温能力的植物的方法。本发明通过将构建的PlTOE3基因过量表达载体转化到烟草中进行表达，减少了植物，尤其是烟草的活性氧积累，降低了相对电导率和丙二醛含量，提高了叶绿素荧光参数Fv/Fm和保护酶相关基因的表达水平，创制了耐高温能力强的烟草新种质。

Description

芍药PlTOE3基因在植物耐高温方面的应用
技术领域
本发明属于芍药栽培技术领域，具体涉及芍药PlTOE3基因在植物耐高温方面的应用。
背景技术
转录因子在植物的生长和发育中起着非常重要的作用。AP2/ERF(APETALA2/ethylene responsive factor)家族是植物中的一大类转录因子(Riechmann JL，Heard J，Martin G，Reuber L，Jiang C，Keddie J，Adam L，Pineda O，Ratcliffe OJ，SamahaRR.Arabidopsis transcription factors：genome-wide comparative analysis amongeukaryotes.Science，2000，290：2105-2110)。AP2/ERF转录因子具有1～2个AP2/ERF结构域，每个结构域包含60～70个氨基酸，由3个反向平行的β-折叠和一个α-螺旋组成，具有高度的保守性(闻可心，刘雪梅.AP2功能基因在植物花发育中的重要作用，生物技术通报，2010，2：1-7)。根据DNA结构域的数目，AP2/ERF家族可以分为DREB、ERF、AP2、RAV和Soloist5个亚家族(Nakano T，Suzuki K，Fujimura T，Shinshi H.Genome-wide analysis of theERF gene family in Arabidopsis and rice.Plant Physiology，2006，140：411-432；CaoSL，Wang Y，Li XT，Gao F，Feng JC，Zhou YJ.Characterization of the AP2/ERFtranscription factor family and expression profiling of DREB subfamily undercold and osmotic stresses in Ammopiptanthus nanus.Plants，2020，9：455)。
芍药为芍药科芍药属多年生宿根草本花卉，是我国的传统名花，与牡丹并称为“花王”和“花相”。芍药因性喜冷凉干燥，多分布或栽培在我国华北、东北、西北和西南地区。近年来，随着芍药在园林花境景观中的广泛应用和芍药高档切花市场的兴起，浙江杭州、江苏扬州和上海等“长三角”地区纷纷从山东菏泽、河南洛阳等北方主产区开展“芍药南移”工作。然而，由于我国江南地区夏季高温持续时间长，尤其是超过40℃极端高温的频频出现，使得大多数优良芍药品种“南移”后轻则茎叶灼伤，叶片黄化、边缘焦枯；重则叶片提前枯萎，影响来年开花(张佳平，李丹青，李康，夏宜平.“芍药南移”的重新思考.中国园林，2016，32：91-95)。夏季高温已成为限制芍药切花在南方规模化生产及其在园林景观中广泛应用的主要因素之一。前期，我们测试了30个芍药品种的耐高温能力，筛选出热害指数、相对电导率、光合速率及SPAD值可以作为芍药耐高温能力的评价指标(赵大球，韩晨霞，陶俊.不同芍药品种耐热性鉴定.扬州大学学报(农业与生命科学版)，2015，36：105-109)；进一步通过生理生化和细胞结构变化的相关研究发现，耐高温能力强的芍药品种能够通过提高保护酶活性和热激蛋白的表达水平来有效地清除活性氧、保持细胞结构完整，从而缓解高温伤害(WuYQ，Zhao DQ，Han CX，Tao J.Biochemical and molecular responses of herbaceouspeony to high temperature stress.Canadian Journal ofPlant Science，2016，96：474-484)。芍药的遗传背景比较薄弱，还没有基因组方面的报道，而关于转录因子在芍药耐高温功能方面的验证研究也一直未见报道。
前期，我们分离到1个芍药PlAP2基因，在Genbank数据库的登录号是KC455454，它的cDNA全长序列为1935bp，具有起始密码子ATG、完整开放阅读框1575bp、终止密码子TAG、5′非编码区222bp、3′非编码区137bp和poly(A)12bp，共编码524个氨基酸；通过qRT-PCR检测发现它在心皮和萼片中大量表达(Ge JT，Zhao DQ，Han CX，Wang J，Hao ZJ，TaoJ.Cloning and expression of floral organ development-related genes inherbaceous peony(Paeonia lactiflora Pall.).Molecular Biology Reports，2014，41：6493-6503)。此外，在吴彦庆的毕业论文中同样阐明PlAP2基因是调控芍药花型的关键因子(吴彦庆.托桂型芍药花型形成的相关基因筛选及其调控机制研究，扬州大学博士学位论文，2019)。近期，我们将该基因的氨基酸序列与拟南芥的AP2/ERF转录因子家族构建了进化树，发现它与AtTOE3亲缘关系最近(图1)，因此我们将其重新命名为P1TOE3。而有关TOE3的研究报道较少，卓维等对烟草NtTOE3基因进行了克隆、载体构建及表达分析，发现它能快速响应低钾、高盐、干旱等逆境处理(卓维，陈倩，罗银，杨尚谕，鲁黎明，李立芹.烟草乙烯转录因子ERF基因NtTOE3的克隆、载体构建及表达分析.植物研究，2018，38：733-740)；Yin等通过转基因研究，发现盐穗木HcTOE3能够正向调节拟南芥的耐寒性(Yin F，Zeng Y，Ji J，Wang P，Zhang Y，Li W.The halophyte Halostachys caspica AP2/ERF transcriptionfactor HcTOE3 poskively regulates freezing tolerance in Arabidopsis.FrontiersinPlant Science，2021，12：638788)。
而芍药PlTOE3基因在改变植物耐高温能力方面的应用尚未有报道。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了芍药PlTOE3基因在植物耐高温方面的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了过表达芍药PlTOE3基因的载体、表达盒、重组菌或细胞在植物耐高温方面的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种耐高温芍药PlTOE3基因过表达载体及其构建方法。
本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有耐高温能力的植物的方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供了鉴定所述的方法获得的具有耐高温能力的植物的方法。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：芍药PlTOE3基因在植物耐高温方面的应用。
本发明所述芍药PlTOE3基因的登录号是KC455454。
本发明内容还包括过表达芍药PlTOE3基因的载体、表达盒、重组菌或细胞在植物耐高温方面的应用。
其中，所述植物包括但不仅限于烟草。
本发明内容还包括一种耐高温芍药PlTOE3基因过表达载体，所述耐高温芍药PlTOE3基因过量表达载体包括芍药PlTOE3基因。
本发明内容还包括所述的耐高温芍药PlTOE3基因过表达载体的构建方法，包括以下步骤：扩增芍药PlTOE3基因，并与双元表达载体pCAMBIA1301质粒连接即得。
本发明内容还包括获得具有耐高温能力的植物的方法，包括如下步骤：
1)使植物包含芍药PlTOE3基因；或
2)使植物表达芍药PlTOE3基因编码的蛋白。
其中，所述的方法包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。
本发明内容还包括鉴定所述的方法获得的具有耐高温能力的植物的方法，包括以下步骤：
1)测定所述植物是否包含芍药PlTOE3基因；或，
2)测定所述植物是否表达芍药PlTOE3基因编码的蛋白。
其中，所述植物包括但不仅限于烟草。
本发明通过构建芍药PlTOE3基因的过量表达载体，采用农杆菌介导的叶盘法将pCAMBIA1301-PlTOE3过量表达载体转入烟草中，待植株培养2个月后置于42℃条件下72h，转PlTOE3基因的烟草植株正常生长，而野生型烟草叶片干枯、萎蔫，表明过量表达芍药PlTOE3基因具有改变植物耐高温能力的功能。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明通过将构建的PlTOE3基因过量表达载体转化到烟草中进行表达，减少了植物，尤其是烟草的活性氧积累，降低了相对电导率和丙二醛含量，提高了叶绿素荧光参数Fv/Fm和保护酶相关基因的表达水平，创制了耐高温能力强的烟草新种质。
附图说明
图1芍药PlTOE3氨基酸序列与拟南芥的AP2/ERF转录因子家族构建的进化树。
图2野生型和转PlTOE3基因烟草植株的PCR鉴定。
图3野生型和转PlTOE3基因烟草植株的qRT-PCR鉴定：其中，不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。
图4野生型和转PlTOE3基因烟草植株在高温胁迫下的表型比较。
图5野生型和转PlTOE3基因烟草植株在高温胁迫下的H2O2积累量比较。
图6野生型和转PlTOE3基因烟草植株在高温胁迫下的O2积累量比较。
图7野生型和转PlTOE3基因烟草植株在高温胁迫下的相对电导率比较：其中，不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。
图8野生型和转PlTOE3基因烟草植株在高温胁迫下的丙二醛比较：其中，不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。
图9野生型和转PlTOE3基因烟草植株在高温胁迫下的叶绿素荧光参数Fv/Fm比较：其中，不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。
图10野生型和转PlTOE3基因烟草植株在高温胁迫下的保护酶相关基因的表达水平：其中，Cu/ZnSOD为超氧化物歧化酶基因；POD为过氧化物酶基因；CAT为过氧化氢酶基因；不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。
本发明说明书附图中的图2-10中的编号1和2代表的实验过程中的两个平行样。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规步骤进行，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1芍药PlTOE3基因过量表达载体在烟草中的表达
芍药PlTOE3基因过量表达载体构建：设计含有酶切位点BamHI和Kpn I用于扩增PlTOE3序列的引物(上游引物PlTOE3-F：5′-caggtcgactctagaggatccATGTGGGATCTGAACGATTCACC-3′，下游引物PlTOE3-R：5′-ttcgagctcagatctggtaccCCCTTCTCTCTCCTCCCCCA-3′)。PCR扩增体系：12.5μL2×Phanta Flash Master Mix(Vazyme)、1μL Forward Primer、1μLReverse Primer、2μL DNA模板(采用NuClean Plant Genomic DNA Kit(CWBIO)试剂盒提取芍药叶片DNA作为模板)、8.5μL ddH2O。反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，52℃退火5s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃延伸1min。反应结束后将PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析，并采用TSP601-DNA凝胶回收试剂盒(Tsingke)回收含酶切位点的PlTOE3大片段。取双元表达载体pCAMBIA1301质粒用BamH I和Kpn I(NEB)进行双酶切，反应体系为：2.0μL10×CutSmart Buffer、7μL pCAMBIA1301质粒、0.4μL BamHI(20000U/mL)、0.4μL KpnI(20000U/mL)、10.2μL ddH2O；37℃反应0.5h。双酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分析，采用TSP601-DNA凝胶回收试剂盒(Tsingke)回收纯化质粒pCAMBIA1301大片段。用
Figure BDA0003400976980000051
plus One step PCR Cloning Kit(Novoprotein)试剂盒采用同源重组的方法连接两个回收的产物，反应体系为：4.0μL5×反应缓冲液、1.0μL
Figure BDA0003400976980000052
plus重组酶、9μLpCAMBIA1301大片段、6μL PlTOE3大片段、7.0μL ddH2O；在50℃金属浴连接15min后置于冰上冷却，取5μL连接产物转化TreliefTM5α感受态细胞(Tsingke)，而后在LB平板上(含有Kan50mg/L)37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pCAMBIA1301-PlTOE3，再进行双酶切与测序验证，直至pCAMBIA1301-PlTOE3过量表达载体构建成功。
芍药PlTOE3基因过量表达载体转化烟草：取5uL pCAMBIA1301-PlTOE3过量表达载体质粒转化GV3101(pSoup-p19)感受态细胞(TOLOBIO)，而后在YEB平板上(含有Rif 50mg/L和Kan 50mg/L)28℃培养2d，挑取阳性单克隆于YEB液体培养基中(含有Rif 50mg/L和Kan50mg/L)，28℃，200rpm培养过夜。取所摇菌液2mL加入50mL含有相同抗生素的液体YEB(含有Rif 50mg/L和Kan 50mg/L)中，在相同条件下培养至OD600＝0.3-0.4。将摇好的菌倒入50mL离心管中，室温离心5000rpm、10min，弃上清备用。先在灭菌后的小三角瓶中加入适量乙酰丁香酮(20mg/mL)，向离心管中加入5mL MS0(MS0液体基本培养基，无琼脂和蔗糖)将溶解菌体，用枪打匀，倒入加有适量乙酰丁香酮的小三角瓶中，然后加MS0至50mL。向另一个灭菌小三角瓶中加入50mL MS0(MS0液体基本培养基，无琼脂和蔗糖)备用。取烟草的无菌苗叶片，切成小块(约1cm×1cm)，放入50mL加有MS0小三角瓶中，共切100-150片叶片放入瓶中，将叶片倒入覆有纱布的烧杯，取经过滤后的叶片加入50mL MS0+100μL乙酰丁香酮(100μmol/mL)的小三瓶中，侵染8min，侵染时不断轻轻摇动；侵染完成后，滤去菌液，取出叶片，用无菌滤纸吸干叶片表面多余的菌液，接种于共培养培养基[MS+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.66％琼脂]中，暗培养3d；共培养结束后，转入抗性芽筛选分化培养基[MS+3.0mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.66％琼脂+100mg/L Cb+25mg/L Hyg]中进行选择培养，两周继代一次，直到分化出芽；当分生不定芽达2em以上时，切下不定芽，转入生根筛选培养基[1/2MS+0.3mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.66％琼脂+50mg/L Cb+8mg/L Hyg]进行生根筛选。经过4-6个月的培养，可获得转PlTOE3基因烟草。
实施例2转芍药PlTOE3基因的烟草植株鉴定
PCR鉴定：采用NuClean Plant Genomic DNA Kit(CWBIO)试剂盒提取烟草叶片DNA。在此基础之上，以烟草NtActin(AB158612)基因为内参(Forward Primer：5′-TCCTCATGCAATTCTTCG-3′、Reverse Primer：5′-ACCTGCCCATCTGGTAAC-3′)，同时设计PlTOE3基因的特异性引物(Forward Primer：5′-GATGACGACAGGGGTAAA-3′、Reverse Primer：5′-GATCCGCTTCTTGGTTCT-3′)进行PCR扩增。反应体系：12.5μL2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)、1μL Forward Primer、1μL Reverse Primer、2μL DNA模板、8.5μL ddH2O。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸5s，共35个循环；72℃延伸5min。反应结束后将PCR反应液进行凝胶电泳检测。从图2可以看出，野生型烟草和转芍药PlTOE3基因烟草中均检测到单一而明亮的NtActin条带，而就扩增PlTOE3条带而言，仅在转芍药PlTOE3基因烟草中检测到单一、明亮、清晰的条带，在野生型烟草中未检测到。
qRT-PCR鉴定：采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa)试剂盒提取总RNA，并采用HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme)试剂盒将总RNA反转录成cDNA，反应体系为：1.0μL RNA、4.0μL 4×gDNA wiper Mix、11.0μL RNase FreedH2O；反应条件为：42℃反应2min。反应完成后，再在第一步的反应液中加入4.0μL 5×HiScript III qRT SuperMix；反应条件为：37℃反应15min，85℃反应5s。将反转录获得的cDNA用
Figure BDA0003400976980000061
SYBR qPCR SuperMix Plus(Novoprotein)试剂盒进行qRT-PCR检测。在此基础之上，以烟草NtActin(AB158612)基因为内参(Forward Primer：5′-TCCTCATGCAATTCTTCG-3′、Reverse Primer：5′-ACCTGCCCATCTGGTAAC-3′)，同时设计PlTOE3基因的特异性引物(Forward Primer：5′-GATGACGACAGGGGTAAA-3′、Reverse Primer：5′-GATCCGCTTCTTGGTTCT-3′)进行qRT-PCR检测。反应体系：2μL cDNA、12.5μL 2×
Figure BDA0003400976980000071
SYBR qPCR SuperMix Plus、1μL Forward Primer、1μL Reverse Primer、8.5μL ddH2O。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸10min。反应结束后采用2-ΔΔCt方法进行基因相对表达水平的分析。qRT-PCR鉴定结果表明，PlTOE3在转基因烟草中具有显著较高的表达水平(图3)。
实施例3转芍药PlTOE3基因的烟草植株耐高温能力鉴定
将移栽2个月后的烟草植株置于42℃、24h光照条件下进行高温胁迫，72h后可以观察到野生型烟草叶片出现干枯、萎蔫等高温伤害症状，而转芍药PlTOE3基因烟草并未出现上述的高温伤害症状，仍然保持正常的生长状态，表明转PlTOE3基因烟草具有较强的耐高温能力，结果见图4。
实施例4高温胁迫下烟草植株的H2O2积累量测定
采用二氨基联苯胺(DAB)染色法观察H2O2的积累量。使用50mM的Tris-acetate缓冲液来配制浓度为0.1mg/mL、pH为5.0的DAB染色液。用染色液在黑暗中充分浸泡叶片24h后，取出叶片放入95％(v/v)酒精中进行沸水浴，在15min后进行拍照。从图5可以看出，野生型烟草叶片颜色较深，而转芍药PlTOE3基因烟草叶片颜色明显较浅，表明转PlTOE3基因烟草积累了较少的H2O2。
实施例5高温胁迫下烟草植株的O2 -积累量测定
采用荧光探针法观察O2 -积累量，具体操作参照活体细胞氧化应激ROS原位染色试剂盒(上海哈灵公司)说明书并稍作修改，具体步骤如下：①滴100μL清理液于载玻片上，捏紧2片不锈钢双面剃须刀片快速切割滤纸上的新鲜叶片，避开主叶脉；②用细头毛笔沾取切好的样品放于载玻片清理液中，并调整好位置；③叶片样品全部放好后将载玻片上清理液尽量吸取干净，然后加入10μL荧光染色剂二氢溴化乙啶(DHE)，37℃孵育20min；④在荧光显微镜(Axio Imager D2，ZEISS，德国)下观察并且拍照。从图6可以看出，野生型烟草叶片中的荧光较强，而转芍药PlTOE3基因烟草叶片颜色明显较弱，表明转PlTOE3基因烟草积累了较少的O2 -。
实施例6高温胁迫下烟草植株的相对电导率测定
称取0.1g用直径1cm打孔器获得的叶片圆片，放入含有适量去离子水的注射器中，堵住注射器前端抽真空直至叶片沉入水下。然后一起倒入玻璃试管中，加去离子水至总体积达为20mL。室温静置4h，摇匀后用电导率仪(DDS-307A，上海雷磁仪器有限公司)测定溶液电导率C1。接下来将试管封口，沸水浴30min，等温度冷却至室温后测定此时溶液电导率为C2。每个处理按下列公式计算叶片相对电导率：相对电导率(％)＝C1/C2×100％。从图7可以看出，与野生型烟草相比，转芍药PlTOE3基因烟草叶片相对电导率显著较低，降低了27.35％，表明转PlTOE3基因烟草具有较少的相对电导率。
实施例7高温胁迫下烟草植株的丙二醛含量测定
采用丙二醛试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)进行测定。具体步骤如下：(1)样品制备：称取0.1g的烟草叶片，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，8000g、4℃离心10min，取上清，置于冰上待测。(2)吸取0.6mL试剂一于1.5mL离心管中，再加入0.2mL经过步骤(1)处理后的样本，混匀。(3)95℃水浴中保温30min，取出后置于冰浴中冷却，10000g、25℃离心10min。(4)吸取上清液于1mL玻璃比色皿中，测定532nm和600nm处的吸光度，记为A532和A600，△A＝A532-A600。(5)丙二醛含量(nmol/g FW)＝25.8×△A÷0.1。从图8可以看出，与野生型烟草相比，转芍药PlTOE3基因烟草的丙二醛含量显著较低，降低了21.25％，表明转PlTOE3基因烟草具有较少的丙二醛。
实施例8高温胁迫下烟草植株的叶绿素荧光参数测定
将叶片用叶夹夹住，用叶绿素荧光仪(PAM-2500，德国Walz公司)对在黑暗中静置2h后标记过的叶片进行叶绿素荧光参数测定。系统记录了Fm、Fo、执行饱和脉冲前的实时荧光产量(Fv’)、PS II处于关闭时的最大荧光产量(Fm’)和Y(II)，此外可变荧光(Fv＝Fm-Fo)、光化学效率(Fv/Fm)采用仪器自带数据处理软件PAM Win计算得到。从图9可以看出，与野生型烟草相比，转芍药PlTOE3基因烟草具有显著较高的Fv/Fm。
实施例9高温胁迫下烟草植株叶片中保护酶相关基因的表达水平检测
以烟草叶片为材料，采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa)试剂盒来提取总RNA，并采用HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme)试剂盒将总RNA反转录成cDNA，反应体系为：1.0μL RNA、4.0μL 4×gDNA wiper Mix、11.0μLRNase Free dH2O；反应条件为：42℃反应2min。反应完成后，再在第一步的反应液中加入4.0μL 5×HiScript III qRT SuperMix；反应条件为：37℃反应15min，85℃反应5s。将反转录所获得的cDNA采用
Figure BDA0003400976980000091
SYBR qPCR SuperMix Plus(Novoprotein)进行qRT-PCR检测，以烟草Actin(AB158612)为内参基因(Actin-F：5′-TCCTCATGCAATTCTTCG-3′、Actin-R：5′-ACCTGCCCATCTGGTAAC-3′)，检测保护酶相关基因Cu/ZnSOD(XM_016631233)、POD(AB044154)和CAT(AF443179)的表达水平，反应体系为：2μL cDNA、12.5μL 2×
Figure BDA0003400976980000092
SYBR qPCR SuperMix Plus、1μL Forward Primer、1μL Reverse Primer、8.5μL ddH2O。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；7℃延伸10min。它们的特异型引物分别为：Cu/ZnSOD-F：5′-CACTTCACTCTTCTTTCCACG-3′、Cu/ZnSOD-R：5′-TGACAACGCCCTCAACAT-3′；POD-F：5′-TCGTATTTCTCCAACCTCA-3′、POD-R：5′-CCGAATGTCAATCCAAGT-3′；CAT-F：5′-CCTCGTGGTTTTGCTGTC-3′、CAT-R：5′-GGATTTAGGATTTGGCTTCA-3′。采用公式2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。从图10可以看出，与野生型烟草相比，Cu/ZnSOD、POD、CAT在转PlTOE3基因烟草叶片中的表达水平显著较高。
综上所述，本发明提供了一种芍药PlTOE3基因在改变植物耐高温能力方面的应用，通过将构建的PlTOE3基因过量表达载体转化到烟草中进行表达，减少了活性氧积累，降低了相对电导率和丙二醛含量，提高了叶绿素荧光参数Fv/Fm和保护酶相关基因的表达水平，创制了耐高温能力强的烟草新种质。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 芍药PlTOE3基因在植物耐高温方面的应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caggtcgact ctagaggatc catgtgggat ctgaacgatt cacc 44
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcgagctca gatctggtac ccccttctct ctcctccccc a 41
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctcatgca attcttcg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acctgcccat ctggtaac 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatgacgaca ggggtaaa 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatccgcttc ttggttct 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcctcatgca attcttcg 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acctgcccat ctggtaac 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatgacgaca ggggtaaa 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatccgcttc ttggttct 18
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cacttcactc ttctttccac g 21
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgacaacgcc ctcaacat 18
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcgtatttct ccaacctca 19
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgaatgtca atccaagt 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cctcgtggtt ttgctgtc 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggatttagga tttggcttca 20

Claims (9)

1.芍药PlTOE3基因在植物耐高温方面的应用，所述芍药PlTOE3基因的登录号是KC455454。
2.过表达芍药PlTOE3基因的载体、表达盒、重组菌或细胞在植物耐高温方面的应用，所述芍药PlTOE3基因的登录号是KC455454。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草。
4.一种耐高温芍药PlTOE3基因过表达载体，其特征在于，所述耐高温芍药PlTOE3基因过表达载体包括芍药PlTOE3基因，所述芍药PlTOE3基因的登录号是KC455454。
5.权利要求4所述的耐高温芍药PlTOE3基因过表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：扩增芍药PlTOE3基因，并与双元表达载体pCAMBIA1301质粒连接即得，所述芍药PlTOE3基因的登录号是KC455454。
6.获得具有耐高温能力的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）使植物包含芍药PlTOE3基因；或
2）使植物表达芍药PlTOE3基因编码的蛋白，所述芍药PlTOE3基因的登录号是KC455454。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。
8.鉴定权利要求6或7所述的方法获得的具有耐高温能力的植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1) 测定所述植物是否包含芍药PlTOE3基因；或，
2) 测定所述植物是否表达芍药PlTOE3基因编码的蛋白，所述芍药PlTOE3基因的登录号是KC455454。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述植物为烟草。
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Cloning and expression of floral organ development-related genes in herbaceous peony (Paeonia lactiflora Pall.);Jintao Ge 等;《Mol Biol Rep》;20140628;第41卷;第6493-6503页 *

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