CN111154773A - 小黑杨PsnICE1基因的应用 - Google Patents

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李静
王鑫
郭成博
李海霞
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Abstract

本发明涉及小黑杨PsnICE1基因的应用，属于转基因山杨培育技术领域。本发明小黑杨PsnICE1基因能够提高转基因山杨活性氧清除能力、降低转基因山杨细胞受损伤程度、降低转基因山杨相对电导率、降低转基因山杨丙二醛含量、提高转基因山杨过氧化物酶活性以及提高转基因山杨的抗寒能力。

Description

小黑杨PsnICE1基因的应用
技术领域
本发明涉及转基因山杨培育技术领域，具体涉及小黑杨PsnICE1基因的应用。
背景技术
杨树是世界上分布最广，适应能力最强的树种之一，而我国是世界上杨树栽植面积最大且杨树资源最丰富的国家，无论是在环境绿化、农田防护林的建设、还是工业用木材林的建设，在各个方面以及各个环节都具有着举足轻重的地位。
在我国，西北地区，华北地区，东北地区是杨树主要栽种地区。近年来，我国极端天气发生频繁，生态环境恶化，造成损失较大的是杨树的速生林，而能够高效提升山杨抗逆能力的方法仍比较缺乏。
发明内容
本发明的目的在于提供小黑杨PsnICE1基因的应用。本发明小黑杨PsnICE1基因能够提高转基因山杨活性氧清除能力、降低转基因山杨细胞受损伤程度、降低转基因山杨相对电导率、降低转基因山杨丙二醛含量、提高转基因山杨过氧化物酶活性以及提高转基因山杨的抗寒能力。
本发明提供了小黑杨PsnICE1基因在提高转基因山杨活性氧清除能力中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了小黑杨PsnICE1基因在降低转基因山杨细胞受损伤程度中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了小黑杨PsnICE1基因在降低转基因山杨相对电导率中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了小黑杨PsnICE1基因在降低转基因山杨丙二醛含量中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了小黑杨PsnICE1基因在提高转基因山杨过氧化物酶活性中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了小黑杨PsnICE1基因在提高转基因山杨的抗寒能力中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了小黑杨PsnICE1基因的应用。本发明小黑杨PsnICE1基因能够提高转基因山杨活性氧清除能力、降低转基因山杨细胞受损伤程度、降低转基因山杨相对电导率、降低转基因山杨丙二醛含量、提高转基因山杨过氧化物酶活性以及提高转基因山杨的抗寒能力。试验结果表明，本发明利用农杆菌介导的叶盘法将小黑杨PsnICE1基因转入到山杨中，获得转基因植株，通过25批次侵染，共得到20个抗性愈伤，其中的大部分愈伤长出植株。PCR结果显示，共有10个株系呈阳性。转基因山杨中外源基因PsnICE1的相对表达量为对照的1.9～30.7倍，qRT-PCR检测表明外源基因PsnICE1转入山杨的部分植株并能在RNA转录水平上表达。相对电导率、丙二醛MDA含量、过氧化物酶POD生理指标结果显示，经过4℃低温胁迫处理后，过表达植株(OE)的MDA含量、相对电导率相对最低，POD活性活性相对最高；以上研究表明，PsnICE1能够提高转基因植株活性氧(ROS)清除能力，降低细胞受损伤程度，从而提高山杨的抗寒能力。
附图说明
图1为本发明提供的低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株DAB染色结果；
图2为本发明提供的低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株Evans Blue染色结果；
图3为本发明提供的低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株相对电导率测定结果；
图4为本发明提供的低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株MDA含量测定结果；
图5为本发明提供的低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株POD含量测定结果。
具体实施方式
本发明提供了小黑杨PsnICE1基因在提高转基因山杨活性氧清除能力中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ATGCTTTATAGACTCAATAGCAACAATATTTGGCTTGAAGATCATAAAGAAGAGCAAGATTCAACAACAAACCATCATCACCACAACAACATTACCAATACTGCAGCTGGTTGTGGTGGGGTTATGTTGGAGGGAAAAGAAGAAATGGGTTCTCTTTCTACTTTCAAATCTATGTTTGAAGTGGAAGATGAGTGGTACGTGACTAACAACAATAGTACTATTCATCACAACCATCAAGATAGTATCAAAGACCTCACTTTTTCACCAAGTCTTGTCGACCCAGATAATCTTTTGCTTCACCAAGTGGATTCTTCCTCTTCTTGTTCACCTTCTTCTTCAGTTTTCAACAATTTGGATCCTTCTCAGGTACATTACTTTATGCATCCAAAGCCCACTTTGTCTTCACTCCTCAATGTGGTTTCTAACAACCCTTTAGAGCATGGGTTTGATTTGAGTGAAATTGGTCTCCTTGAGAATCAAGGAACAAATTCAACTACAACAGCAAATGTTTCATCTCTGTTAAACAGGGGAAGTGGTGTTTTCGGGAATTTGGGGAATTTCACTGATTTGAGTTCAAACAGTCAGATTAGTATTCCTAATTTATGTTCTGATCCACAATTTTCAAGTTCCCGCATGCTTCAGTTGCCTGAAAATGGTCCTGGGTTTAATGGTTTTAGAGGGCTTGATGAGATTTCGGGGAATCAGTTGTTTTTTAACAGGTCTGATGAGATTTCGGTTAATCGGCCTCTTGAAACTTACCCTTCAATGGGCGCACAGCCTACCTTGTTTCAAAAGAGAGCAGCTTTGAGGAAGAACTTGGGTGAAGTTGAGAGAGACAAAGGGAAGAGAGAAATGACTCAAATTAGTGAAGAGAATGACAAGAAGAGAAAATTTAGTAGTGGAGATGATTTTCTTGAGGATGTTAGCTTTGATGGGTCGGGTTTGAATTATGATTCTGATGAATTTACTGAGAATACTAAGTTGGAGGAGACTGGCAAGAATGGTGGAAACAGTTCAAAGGCGAATAGTGGTGTTACTGGTGGTGGTGTGGATCAAAAGGGGAAGAAAAGGGGGCTTCCAGCTAAGAATTTGATGGCAGAGAGGAGGCGCCGGAAGAAGCTCAATGATAGGCTGTACATGCTGAGGTCTGTTGTTCCAAAGATCAGCAAAATGGATAGGGCATCAATCCTTGGGGATGCAATTGAATACTTGAAAGAACTTCTGCAAAGGATTAATGACCTCCATAATGAATTGGAGTCAACTCCCCCCAGCTCTTCATTGACGCCAACCACTAGTTTTCATCCTTTGACACCGACTCCATCAGCGCTGCCCAGCCGTATCATGGACAAACTTTGCCCCGGCTCATTGCCAAGCCCAAATGGCCAACCTGCAAGGGTCGAGGTTAGAGTGAGAGAAGGGCGAGCTGTAAACATCCACATGTTTTGTGGCCGCAAACCAGGTCTTTTGCTCTCCACTATGAGAGCTTTGGATGACCTTGGGCTAGACATCCAGCAAGCTGTCATTAGCTGTTTCAATGGTTTTGCCATGGATATCTTCCGAGCTGAGCAATGCAAAGAAGGGCAGGACATGCATCCAGATCAAATTAAAGCAGTCCTACTGGATTCAGCTGGCTTCCATGGCGCGATGTAG(>KP165406.1Populus simonii x Populus nigrainducer of CBF expression 1(ICE1)mRNA,complete cds)。
本发明还提供了小黑杨PsnICE1基因在降低转基因山杨细胞受损伤程度中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了小黑杨PsnICE1基因在降低转基因山杨相对电导率中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了小黑杨PsnICE1基因在降低转基因山杨丙二醛含量中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了小黑杨PsnICE1基因在提高转基因山杨过氧化物酶活性中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了小黑杨PsnICE1基因在提高转基因山杨的抗寒能力中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
下面结合具体实施例对本发明所述的小黑杨PsnICE1基因的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1、植物过表达载体pROK2-PsnICE1的构建
(1)含有pROK2载体同源序列的PsnICE1基因片段的克隆
以pMD18-T-PsnICE1质粒为模板，infusion-ICE1-F和infusion-ICE1-R为引物(infusion-ICE1-F：TCGAGCTCGGTACCCGGGATGCTTTATAGACTCAATAGC(SEQ ID NO.2)；infusion-ICE1-R：CTCTAGAGGATCCCCGGGCTACATCGCGCCATGGAAGCC(SEQ ID NO.3)，注：_为pROK2质粒线性化末端的同源互补序列)，利用PCR的方法，引入pROK2质粒线性化末端的同源互补序列。PCR反应体系：10×Ex Taq PCR buffer 2.0μL，dNTP Mix(10mM)0.4μL，infusion-ICE1-F(10μM)、infusion-ICE1-R(10μM)各1.0μL，Ex Taq(5U/μL)0.2μL，pMD18-T-PsnICE1质粒0.1～0.2μg，补dd H2O至20μL。反应条件：94℃30s；94℃10s、58℃30s、72℃90s共35个循环；72℃10min。采用美国OMEGA生物技术公司PCR纯化试剂盒对PCR扩增的PsnICE1目的片段进行纯化。
(2)pROK2载体质粒酶切及纯化
SmaI单酶切pROK2载体质粒。PCR纯化试剂盒对酶切后的质粒直接进行纯化回收。
(3)目的片段与pROK2载体连接
连接目的基因(PsnICE1)片段与pROK2载体，用In-Fusion Advantage PCRCloning Kit试剂盒进行连接pROK2线性载体与PsnICE1基因片段，构建pROK2-PsnICE1载体。连接体系：pROK2线性载体0.2～0.4μg，PsnICE1基因片段2.0μL，In-Fusion EnzymeMix1.0μL，补dd H2O至10μL，连接条件：37℃温育15min，50℃温育15min。
(4)连接产物转化大肠杆菌
将连接产物加入50μL大肠杆菌感受态Top10中，进行大肠杆菌转化。利用热激法进行大肠杆菌转化，具体操作步骤如下：50μL大肠杆菌Top10感受态细胞中加入5μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；42℃水浴锅中热激1.5min，冰上静置2min；加入400μL液体LB培养基，37℃180r/min震荡培养箱中活化1h；将200μL菌液涂匀于LB固体培养基上(含有50mg/LKan)，封好平板并倒置于37℃恒温培养箱中，培养14～18h，进行抗性筛选。挑取抗性平板中的单个克隆，加入10mL LB液体培养基(含有50mg/LKan)，37℃180r/min振荡培养箱中培养8h，以菌液为模板进行PCR检测。PCR反应体系及反应条件如上。反应结束后，取5μL PCR产物进行电泳检测，能扩增出特异片段的菌液视为阳性克隆，挑选2～3个阳性克隆委托苏州金唯智生物科技有限公司，使用pROK2载体通用引物进行双向测序。测序结果准确后，将载体命名为：pROK2-PsnICE1，保存菌种于无菌甘油中(等体积，终浓度为15％)，液氮预冻后保存于-80℃超低温冰箱。
2、pROK2-PsnICE1转化根瘤农杆菌EHA105
(1)根癌农杆菌感受态的制备(冷CaCl2法)
挑取根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105单菌落于10mL的LB液体培养基中(含有25mg/L Rif、50mg/L Kan)，28℃、220r/min过夜培养。取200μL菌液加入到20mLLB液体培养基中(含有25mg/L Rif、50mg/L Kan)，在28℃、220r/min震荡培养箱继续培养至OD600为0.4左右。将菌液置于预冷的10mL离心管中，冰浴30min；3500r/min、4℃低温离心机中离心5min，收集菌体。吸弃上清，吸取5mL预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，冰浴30min；4℃低温离心机中3500r/min离心10min。吸弃上清，吸取1mL预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮菌体，分装100uL于预冷的离心管中，液氮速冻后迅速移至-80℃超低温冰箱保存。
(2)根癌农杆菌转化(液氮冻融法)
取0.5μgpROK2-PsnICE1质粒加到100μL EHA105感受态细胞中，混匀后放置冰上30min。液氮中冷冻5min后37℃水浴中热激5min。热激后加入800μL LB液体培养基(不含抗生素)，轻柔混匀，28℃、220r/min复苏3～5h。用灭菌的玻璃棒涂200μL菌液于LB固体培养基上(含有25mg/L Rif和50mg/L Kan)，28℃倒置培养2～3d。
(3)根癌农杆菌阳性克隆PCR检测
操作步骤同大肠杆菌阳性克隆鉴定一样，随机挑选筛选平板上的抗性单个菌斑，经LB液体培养基(含有25mg/L Rif和50mg/L Kan)培养，以98℃变性10min的菌液为模板，对目的基因进行PCR检测。反应体系和条件同上。保存PCR阳性克隆菌种，命名为EHA105-pROK2-PsnICE1，用于后续的拟南芥转化。
3、农杆菌介导的山杨遗传转化
(1)农杆菌工程菌液制备
接种农杆菌EHA105-pROK2-PsnICE1于10mL LB液体培养基中(含有25mg/LRif和50mg/LKan)，28℃180r/min振荡培养36h左右，取1mL于50mLLB液体培养基中(含有25mg/LRif和50mg/LKan)，继续振荡培养至OD600至0.5左右，将菌液转入10mL离心管中，4000r/min，离心5min，弃上清，无菌水重悬菌体，并稀释至OD600为0.1，用于侵染。
(2)侵染
取山杨无菌苗叶片，沿与主叶脉垂直的方向切除叶尖，将带有创面的叶片浸泡于菌液中，2min后取出叶片，放于无菌滤纸上，吸去多余菌液。
(3)共培养
将已侵染后的叶片平铺于不含抗生素的分化培养基上，暗培养2天。
(4)脱菌及选择培养
将共培养叶片更换至含30mg/L Kan、200mg/L Cab、200mg/LCef的分化培养基上，于组织培养室中培养，及时更换培养基以免菌液过多抑制叶片分化，经30天左右的培养后，可见抗性芽。
(5)抗性芽的选择培养
将抗性芽更换至培养瓶中，于含30mg/LKan、200mg/LCab、200mg/L Cef的分化培养基上继续选择培养，当抗性小苗长到2cm左右时，转至生根培养基中(含30mg/LKan、200mg/LCab、200mg/L Cef)继续培养。
(6)转转PsnICE1基因山杨过表达植株移栽
扩繁转PsnICE1基因山杨过表达植株，挑选高6cm左右的转基因和非转基因山杨幼苗，小心洗去根部的培养基，移栽至灭菌土中，浇透水后覆膜保湿5d左右，保持灭菌土表层为湿润状态，约10d左右可成活。
4、转PsnICE1基因山杨的分子水平鉴定
(1)山杨总RNA的提取和反转录
利用百泰克公司无氯仿植物总RNA提取试剂盒(RP3401)中的操作步骤提取山杨RNA，用全式金公司的反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。反转录反应体系：2×TS ReactionMix10μL，Oligo dT primer(0.5μg/μL)1μL，
Figure BDA0002387196510000071
RT/RI Enzyme Mix1μL，gDNARemover1μL，Total RNA0.5μg，RNase Free dH2O补至20μL。反应条件：42℃反应45min；80℃反应5sec。程序结束后，将cDNA保存于-20℃冰箱，稀释10倍用于后续qRT-PCR反应。
(2)qRT-PCR分析
对转PsnICE1基因山杨过表达植株进行荧光qRT-PCR分析，以转PsnICE1基因山杨过表达植株的cDNA为模板，野生型山杨的cDNA为对照，以Actin基因表达量的平均值作为内参(所有样品设置三次生物学重复)，进行荧光qRT-PCR，定量引物序列为PsnICE1-RT-F:AAGTGGAAGATGAGTGGTA(SEQ ID NO.4)，PsnICE1-RT-R
:CACTCAAATCAAACCCATGC(SEQ ID NO.5)，Actin-F:CACAACTGCTGAACGGGAAAT(SEQID NO.6)，Actin-R:CAGGGCAACGGAAACACTCT(SEQ ID NO.7)。qRT-PCR反应体系：2×SYBRGreen Realtime PCR Master mix12.5μl，PsnICE1-RT-F(10μM)0.5μl，PsnICE1-RT-R(10μM)0.5μl，cDNA2.0μl，超纯水补足总体积至25μl。qRT-PCR反应程序：94℃预变性30s；94℃12s，58℃30s，72℃40s，80℃读板1s，45个循环。用2-ΔΔCt方法进行基因的相对表达量分析。
5、转PsnICE1基因山杨过表达植株在低温胁迫下的抗逆分析
(1)低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株的组织化学染色分析
将转PsnICE1基因山杨过表达植株与野生型山杨组培苗放入常温(温度为22±2℃)及4℃光照培养箱中进行低温处理，光照强度为400μmol·m-2·s-1，光周期为16h光照/8h黑暗，相对湿度为65～75％的人工气候室中培养24h，取叶片用于各种生化染色。
二氨基联苯胺染色(DAB)
实验步骤：取对照和低温胁迫处理24h的各转PsnICE1基因山杨过表达植株和野生型山杨叶片，置于30mL离心管中，加入DAB染色液(要尽量减小额外伤害)；真空渗入10min后室温染色过夜(暗处放置，叶片尽量分散开)，光下放置1h至出现红棕色斑点。染色结束后，用75％乙醇+5％甘油煮沸脱色。
伊文斯兰染色(Evans blue)
实验步骤：取对照和低温胁迫处理24h的各转PsnICE1基因山杨过表达植株和野生型山杨叶片，置于30mL离心管中，加入Evans blue染色液，室温染色过夜。染色结束后，用75％乙醇+5％甘油煮沸脱色。
(2)低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株的生理生化指标分析
将转PsnICE1基因山杨过表达植株与野生型山杨组培苗移栽入营养土中继续生长8～10周。再分别放入常温(温度为22±2℃)及4℃光照培养箱中进行低温处理，光照强度为400μmol·m-2·s-1，光周期为16h光照/8h黑暗，相对湿度为65～75％的人工气候室中培养24h，取不同植株的叶片用于各种生理生化指标的测定分析。实验进行三次独立重复，SPSS16.0软件对试验数据进行方差分析和独立样本T检验。
相对电导率测定
取低温胁迫处理24h的各转PsnICE1基因山杨过表达植株和野生型山杨植株的叶片，使用DDS2IIA型电导率仪测定溶液电导率，实验步骤如下：
将50mL的小烧杯刷洗干净，用双蒸水和dd H2O分别冲洗3次，再用ddH2O浸泡平衡24h；将植物叶片用自来水洗去表面的灰尘，再用双蒸水和ddH2O分别冲洗3次，用洁净滤纸吸净表面的水分，用打孔器在叶片上打取5个直径为7mm的圆片，置于平衡过的小烧杯中，加入50mL dd H2O；真空渗透15min，保持真空渗透状态15min，期间确保叶片组织在液面以下。用电导率仪测定溶液电导值，记录为S1。然后将小烧杯放入90℃水浴20min，冷却至室温后测定溶液电导值，记录为S2。
计算：相对电导率＝S1/S2×100％
丙二醛(MDA)含量测定
丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
实验步骤：研样，称重0.05g-0.1g；1.5ml 10％三氯乙酸抽提，4℃30min，11000rpm离心20min，取上清；测值管：1ml酶液+1ml 0.6％TBA；调零管：1ml水+1ml 0.6％硫代巴比妥酸(TBA)沸水浴15min，冷却，测OD532和OD450；
计算公式C(μM)＝6.45OD532-0.56OD450
每克样品中丙二醛的含量y＝(C×v)/w，单位为μmol/g
过氧化物酶(POD)活性测定
取低温胁迫处理24h的各转PsnICE1基因山杨过表达植株和野生型山杨植株，测定各植株内的POD活性，测定步骤如下：
待测样品酶液的制备：
取0.05～0.1g植株，称重，用液氮研磨成粉末状。然后向研磨液中加入1.5ML0.01M磷酸缓冲液(pH 7.2)，4℃放置30min，10,000rpm离心20min，弃沉淀，上清即为待测样品酶液，每个样品3个生物学重复。
POD活性测定：
向0.5mL酶液中加入0.5mL 0.8％H2O2，0.5mL 0.1M磷酸缓冲液(pH 7.2)和0.5mL愈创木酚溶液，充分混匀，30℃反应10min，用722S分光光度计测各样品470nm处的OD值，以ddH2O替代酶液的反应体系作为对照值，并以dd H2O替代H2O2溶液液的反应体系作为对照调零。
POD活性计算：
Figure BDA0002387196510000101
式中：POD活性(U/g FW)；
A1：对照管吸光度；
A2：测定管吸光度；
N：反应体系稀释倍数；
T：反应时间(min)；
W：待测样品鲜重(g)。
6、转基因株系的确定
通过25批次侵染，共得到20个抗性愈伤，其中的大部分愈伤长出植株。将抗性愈伤经过在选择培养基上分化得到抗性芽，再进行生根培养基筛选时，如果在附加抗性的生根培养基上能生根生长的植株，可以初步认定为阳性转化植株，以10株抗性山杨植株中长势较好的7个山杨无性系植株为研究对象，提取RNA，以得到的高质量RNA为模板，通过逆转录得到cDNA，以cDNA为模板，进行qRT-PCR检测。结果显示，转PsnICE1基因山杨中外源基因PsnICE1的相对表达量为对照的1.9～30.7倍(具体数值见表1)，qRT-PCR检测表明外源基因PsnICE1转入山杨的部分植株能在RNA转录水平上表达。
表1转PsnICE1基因山杨过表达植株中外源基因PsnICE1的相对表达量
Figure BDA0002387196510000111
7、低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株的组织化学染色分析
(1)DAB染色
对野生型、转PsnICE1基因山杨过表达植株进行4℃低温处理，进行组织化学染色。利用DAB染色研究转PsnICE1基因山杨过表达植株细胞内过氧化氢的含量，细胞中H2O2释放出的氧离子能够氧化DAB，DAB能够被细胞中过氧化氢释放出的氧离子氧化形成棕色沉淀，从而能够定位过氧化酶活性的具体部位。通过染色的深浅，能反映出细胞中H2O2释放量的多少。形成棕色沉淀，分别取未胁迫处理和胁迫处理24h的各转基因和野生型山杨叶片进行DAB染色，染色结果如图1所示。
图1为低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株DAB染色结果。从图1中可以看出，在正常生长条件下(0h)，OE1、OE3、OEG、OEI和WT三个转基因株系植株叶片基本没有染上任何颜色，且无明显的差异，说明H2O2含量基本相同；在低温胁迫处理24h条件下经过染色，OE1、OE3、OEG、OEI和WT三个转PsnICE1基因山杨叶片上的颜色有明显的变化。PsnICE1基因的过表达株系植株叶片上的颜色明显浅于野生型WT叶片上的颜色，说明过表达植株叶片内的H2O2的含量较野生型WT叶片内的H2O2含量少。实验结果说明PsnICE1基因在山杨植株体内起着一定的抗逆作用。
(2)Evans blue染色
Evans blue能够进入失活或胞膜结构不完整的细胞内，并将其染成蓝色。利用Evans blue染色研究转基因山杨细胞的损伤情况，能够通过染色的深浅研究转基因山杨细胞的损伤情况。分别取未胁迫处理和低温胁迫处理24h的各转基因和野生型山杨叶片进行Evans Blue染色，染色结果如图2所示。
图2为低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株Evans Blue染色结果。从图2中可以看到，在正常生长条件下(CK)，OE1、OE3、OEG、OEI以及WT叶片上蓝色较淡，且无明显的变化，说明细胞损伤的情况大致相同；在低温胁迫条件下，OE1、OE3、OEG、OEI以及WT叶片上的颜色明显不同。PsnICE1基因的过表达株系OE植株叶片上的颜色浅于野生型WT叶片上的颜色，说明OE植株叶片的损伤程度较WT程度低。实验结果说明PsnICE1基因在山杨植株体内起着一定的抗逆功能。
8、低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株的生理生化指标分析
(1)相对电导率测定
相对电导率是衡量细胞膜损伤情况的一个重要生理指标，逆境胁迫下细胞膜受损导致电解质外渗增加，破坏细胞膜结构的完整性直接影响植物的抗逆能力。取低温胁迫处理24h的各转PsnICE1基因山杨和野生型山杨叶片(每个株系取3个重复)进行相对电导率测定，结果如图3所示。
图3为低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株相对电导率测定，结果表明：在正常生长条件下(ck)，OE1、OE3、OEG、OEI以及WT的相对电导率没有基本一致；在低温胁迫条件下，OE1、OE3、OEG、OEI以及WT的相对电导率均有显著的变化。PsnICE1基因的过表达株系的相对电导率明显低于WT，说明PsnICE1基因的过表达株系的抗逆境胁迫能力明显优于WT。试验结果说明PsnICE1基因在山杨植株体内起着非常重要的抗逆作用。
(2)MDA含量测定结果
MDA含量是植物细胞受损的表现，对其测定有利于了解胁迫对山杨造成的伤害程度。MDA含量胁迫前转基因株系和非转基因株系都含有相近的MDA含量，低温胁迫后各株系MDA含量增加，但转基因株系MDA含量要显著低于非转基因株系，平均仅为WT的53.95％(图4，低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株MDA含量测定)。表明过表达PsnICE1基因能有效清除低温胁迫下产生的MDA，以减轻细胞受损。
(3)POD活性
POD活性在非胁迫下转基因株系和非转基因株系中相近，在低温胁迫下四个株系的POD活性均明显升高，但转PsnICE1基因山杨过表达植株要显著高于非转基因株系，WT仅为转PsnICE1基因山杨过表达植株的45.96％、45.47％(图5，低温胁迫下转PsnICE1基因山杨过表达植株POD含量测定)，表明PsnICE1基因能在低温胁迫下调节转PsnICE1基因山杨保持较高的POD活性。
为进一步分析转PsnICE1基因山杨在低温胁迫下的抗寒能力，对转PsnICE1基因山杨和野生型山杨植株进行组织化学染色和相关生理指标检测。DAB、Evans blue组织化学染色结果显示，转PsnICE1基因山杨过表达植株(OE)细胞内的O2-和H2O2含量明显低于野生型山杨植株，说明转PsnICE1基因山杨过表达植株受低温胁迫后细胞膜结构较为完整，受损伤程度低。相对电导率、丙二醛MDA含量、过氧化物酶POD生理指标结果显示，转PsnICE1基因山杨过表达植株(OE)的MDA含量、相对电导率相对最低，POD活性活性相对最高；以上研究表明，向山杨中转入PsnICE1基因能够提高山杨活性氧(ROS)清除能力，降低细胞受损伤程度，从而提高山杨植株的抗寒能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 黑龙江省林业科学研究所
<120> 小黑杨PsnICE1基因的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1650
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctttata gactcaatag caacaatatt tggcttgaag atcataaaga agagcaagat 60
tcaacaacaa accatcatca ccacaacaac attaccaata ctgcagctgg ttgtggtggg 120
gttatgttgg agggaaaaga agaaatgggt tctctttcta ctttcaaatc tatgtttgaa 180
gtggaagatg agtggtacgt gactaacaac aatagtacta ttcatcacaa ccatcaagat 240
agtatcaaag acctcacttt ttcaccaagt cttgtcgacc cagataatct tttgcttcac 300
caagtggatt cttcctcttc ttgttcacct tcttcttcag ttttcaacaa tttggatcct 360
tctcaggtac attactttat gcatccaaag cccactttgt cttcactcct caatgtggtt 420
tctaacaacc ctttagagca tgggtttgat ttgagtgaaa ttggtctcct tgagaatcaa 480
ggaacaaatt caactacaac agcaaatgtt tcatctctgt taaacagggg aagtggtgtt 540
ttcgggaatt tggggaattt cactgatttg agttcaaaca gtcagattag tattcctaat 600
ttatgttctg atccacaatt ttcaagttcc cgcatgcttc agttgcctga aaatggtcct 660
gggtttaatg gttttagagg gcttgatgag atttcgggga atcagttgtt ttttaacagg 720
tctgatgaga tttcggttaa tcggcctctt gaaacttacc cttcaatggg cgcacagcct 780
accttgtttc aaaagagagc agctttgagg aagaacttgg gtgaagttga gagagacaaa 840
gggaagagag aaatgactca aattagtgaa gagaatgaca agaagagaaa atttagtagt 900
ggagatgatt ttcttgagga tgttagcttt gatgggtcgg gtttgaatta tgattctgat 960
gaatttactg agaatactaa gttggaggag actggcaaga atggtggaaa cagttcaaag 1020
gcgaatagtg gtgttactgg tggtggtgtg gatcaaaagg ggaagaaaag ggggcttcca 1080
gctaagaatt tgatggcaga gaggaggcgc cggaagaagc tcaatgatag gctgtacatg 1140
ctgaggtctg ttgttccaaa gatcagcaaa atggataggg catcaatcct tggggatgca 1200
attgaatact tgaaagaact tctgcaaagg attaatgacc tccataatga attggagtca 1260
actcccccca gctcttcatt gacgccaacc actagttttc atcctttgac accgactcca 1320
tcagcgctgc ccagccgtat catggacaaa ctttgccccg gctcattgcc aagcccaaat 1380
ggccaacctg caagggtcga ggttagagtg agagaagggc gagctgtaaa catccacatg 1440
ttttgtggcc gcaaaccagg tcttttgctc tccactatga gagctttgga tgaccttggg 1500
ctagacatcc agcaagctgt cattagctgt ttcaatggtt ttgccatgga tatcttccga 1560
gctgagcaat gcaaagaagg gcaggacatg catccagatc aaattaaagc agtcctactg 1620
gattcagctg gcttccatgg cgcgatgtag 1650
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgagctcgg tacccgggat gctttataga ctcaatagc 39
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctctagagga tccccgggct acatcgcgcc atggaagcc 39
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagtggaaga tgagtggta 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cactcaaatc aaacccatgc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacaactgct gaacgggaaa t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagggcaacg gaaacactct 20

Claims (6)

1.小黑杨PsnICE1基因在提高转基因山杨活性氧清除能力中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.小黑杨PsnICE1基因在降低转基因山杨细胞受损伤程度中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.小黑杨PsnICE1基因在降低转基因山杨相对电导率中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.小黑杨PsnICE1基因在降低转基因山杨丙二醛含量中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.小黑杨PsnICE1基因在提高转基因山杨过氧化物酶活性中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.小黑杨PsnICE1基因在提高转基因山杨的抗寒能力中的应用，所述小黑杨PsnICE1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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