CN115838738B - 一种凤丹PoWRKY71基因及其在植物耐旱方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种凤丹PoWRKY71基因及其在植物耐旱方面的应用。本发明还公开了所述的凤丹PoWRKY71基因编码的蛋白质。本发明还公开了克隆所述的凤丹PoWRKY71基因cDNA全长序列的扩增引物，所述扩增引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明还公开了表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株。本发明通过将构建的PoWRKY71基因沉默载体转化到凤丹中进行表达，干旱处理后，与对照相比，转基因凤丹的耐旱能力显著降低。本发明还通过将构建的PoWRKY71基因过量表达载体转化到烟草中进行表达，干旱处理后，与野生型相比，转基因烟草植株能够清除活性氧积累，降低相对电导率和丙二醛含量，提高抗氧化酶活性，创制了耐旱能力强的烟草新种质。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种凤丹PoWRKY71基因及其在植物耐旱方面的应用。
背景技术
干旱是影响植物正常生长发育和限制作物产量的主要非生物胁迫之一，它对植物的伤害主要体现在对光合系统、渗透平衡以及抗氧化酶系统的破坏（温琦, 等. 植物干旱胁迫响应的研究进展. 江苏农业科学, 2020, 48: 11-15）。凤丹（Paeonia ostii）是芍药科芍药属的多年生木本植物，其籽油中丰富的α-亚麻酸对人体健康大有裨益（Zhao DQ, etal. Characteristics of Paeonia ostii seed oil body and OLE17.5 determiningoil body morphology. Food Chemistry, 2020, 319: 126548）。然而，干旱胁迫极大限制了凤丹在干旱或半干旱地区的种植推广，并会造成其产量和品质的损失。我们之前研究发现，一些外源物质如黄腐酸、阿魏酸以及氧化石墨烯等均可缓解凤丹干旱胁迫，维系植株的正常生长（方紫雯, 等. 阿魏酸对凤丹干旱胁迫的缓解效应. 植物研究, 2020, 40: 353-359; Fang ZW, et al. Effects of fulvic acid on the photosynthetic andphysiological characteristics of Paeonia ostii under drought stress. PlantSignaling & Behavior, 2020, 15: e1774714; Zhao DQ, et al. Graphene oxide asan effective soil water retention agent can confer drought stress toleranceto Paeonia ostii without toxicity. Environmental Science and Technology,2020, 54: 8269-8279）。而在分子水平上，凤丹对干旱胁迫的响应涉及较少。
WRKY基因是植物特有的一类转录因子，不仅对植物的生长发育有调控作用，还参与到糖类合成、器官发育和植物衰老等一系列生理活动以及对各种胁迫的抗性反应（陈林英, 等. WRKY转录因子在大豆响应生物和非生物胁迫中的功能研究进展. 植物遗传资源学报, 2022, 23: 323-332）。WRKY转录因子的命名是基于其蛋白N端高度保守的WRKYGQK结构域和C端的C2H2或C2HC锌指基序（Uelker B, et al. WRKY transcription factors：FromDNA binding towards biological function. Current Opinion in Plant Biology,2004, 7: 491-498），根据WRKYGQK结构域的数量和锌指基序的结构特征又将WRKY转录因子进一步划分为I、II和III亚族（Chen XJ, et al. WRKY transcription factors:evolution, binding, and action. Phytopathology Research, 2019, 1: 13）。在干旱胁迫方面，干旱胁迫诱导了油菜中大多数WRKY转录因子表达水平上调，基因功能研究表明拟南芥AtWRKY57和AtWRKY63（Van Aken O, et al. AtWRKY40 and AtWRKY63 modulatethe expression of stress-responsive nuclear genes encoding mitochondrial andchloroplast proteins. Plant Physiology, 2013, 162: 254-271; Jiang YJ, et al.Heterologous expression of AtWRKY57 confers drought tolerance in Oryza sativa. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 145）、玉米ZmWRKY79（Gulzar F, etal. Maize WRKY transcription factor ZmWRKY79 positively regulates droughttolerance through elevating ABA biosynthesis. International Journal ofMolecular Sciences, 2021, 22: 10080）、苜蓿MeWRKY20（Wei YX, et al. Thechaperone MeHSP90 recruits MeWRKY20 and MeCatalase1 to regulate droughtresistance in cassava. New Phytologist, 2020, 226: 476-491）均能增强植株的耐旱能力。
凤丹的遗传背景比较薄弱，还没有基因组方面的报道，而关于凤丹PoWRKY71基因也一直未见报道。在其他植物上，关于WRKY71的研究也仅有少量报道。在拟南芥中，AtWRKY71参与调控植株开花和叶片衰老（Yu YC, et al. WRKY71 accelerates floweringvia the direct activation of FLOWERING LOCUS T and LEAFY in Arabidopsis thaliana. Plant Journal, 2016, 85: 96-106; Yu YC, et al. Arabidopsis WRKY71regulates ethylene-mediated leaf senescence by directly activating EIN2, ORE1 and ACS2 genes. Plant Journal, 2021, 107: 1819-1836）。野草莓FvWRKY71基因可以促进开花（Lei YY, et al. Woodland strawberry WRKY71 acts as a promoter offlowering via a transcriptional regulatory cascade. Horticulture Research,2021, 7: 137）。但有关WRKY71基因在抗旱性方面的功能一直未见报道，因此，对凤丹PoWRKY71基因的深入研究不仅可以拓展凤丹分子生物学研究领域，还可以为今后采用基因工程手段增强植株耐旱能力提供优良基因资源和奠定理论基础。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种凤丹PoWRKY71基因。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述的凤丹PoWRKY71基因编码的蛋白质。
本发明还要解决的技术问题是提供了含有所述凤丹PoWRKY71基因的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株。
本发明还要解决的技术问题是提供了含有所述凤丹PoWRKY71基因的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株在植物耐旱方面的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有耐旱能力的植物的方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供了鉴定所述植物是否具有耐旱能力的方法。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种凤丹PoWRKY71基因，所述凤丹PoWRKY71基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明内容还包括所述的凤丹PoWRKY71基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，本发明的序列表中的SEQ ID NO.1由936个碱基组成。凤丹PoWRKY71基因能够编码PoWRKY71蛋白，此种蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其中，序列表中的SEQID NO.2由311个氨基酸组成。
本发明内容还包括克隆所述的凤丹PoWRKY71基因cDNA全长序列的扩增引物，所述扩增引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明内容还包括表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株，其含有所述的凤丹PoWRKY71基因。
其中，所述重组载体包括但不仅限于基因沉默载体或过表达载体。
其中，所述基因沉默载体包括但不仅限于表达载体TRV2。
本发明通过将构建的含有凤丹PoWRKY71基因的沉默载体转化到凤丹中进行表达，干旱处理后，与对照相比，转基因凤丹的耐旱能力显著降低。进一步的，构建过表达载体中设计的引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。
其中，所述过表达载体包括但不仅限于中间植物表达载体pCAMBIA1301。
本发明先构建凤丹PoWRKY71基因的过表达载体pCAMBIA1301-PoWRKY71，再采用农杆菌介导的叶盘法将pCAMBIA1301-PoWRKY71过表达载体转入烟草中，干旱处理后，与野生型相比，转基因烟草植株能够清除活性氧积累，降低相对电导率和丙二醛含量，提高抗氧化酶活性，表明凤丹PoWRKY71基因具有提升植株耐旱能力的功能。进一步的，构建过表达载体中设计的引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。
本发明内容还包括所述的凤丹PoWRKY71基因、所述的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株、所述的重组载体在植物耐旱方面的应用。
本发明内容还包括所述的重组载体的构建方法，包括以下步骤：扩增所述的凤丹PoWRKY71基因的特异性片段或全长序列，并与基因沉默载体或中间植物表达载体连接即得。
本发明内容还包括获得具有耐旱能力的植物的方法，包括如下步骤：
1）使植物包含所述的凤丹PoWRKY71基因；或
2）使植物表达所述的凤丹PoWRKY71基因编码的蛋白。
进一步地，上述方法还包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。
本发明内容还包括鉴定所述的方法获得的具有耐旱能力的植物的方法，包括如下步骤：
1）鉴定所述植物是否包含所述的凤丹PoWRKY71基因；或
2）鉴定所述植物是否表达所述的凤丹PoWRKY71基因编码的蛋白。
其中，本发明所述的植物包括但不仅限于烟草。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明通过将构建的PoWRKY71基因沉默载体转化到凤丹中进行表达，发现转基因凤丹耐旱能力显著降低。本发明还通过将构建的PoWRKY71基因过量表达载体转化到植物中进行表达，使植物，尤其是转基因烟草植株能够清除活性氧积累，降低相对电导率和丙二醛含量，提高抗氧化酶活性，创制了耐旱能力强的烟草新种质。
附图说明
图1 为凤丹PoWRKY71基因cDNA全长的扩增结果检测；其中，M：DL2000 marker，1：全长扩增产物；
图2 为凤丹PoWRKY71蛋白与拟南芥AtWRKY蛋白的系统进化树分析；
图3 为凤丹PoWRKY71蛋白与拟南芥AtWRKY蛋白的同源性比对；
图4 为野生型凤丹和转PoWRKY71基因凤丹的PCR鉴定；
图5 为野生型凤丹和转PoWRKY71基因凤丹的qRT-PCR鉴定：其中，不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；
图6 为15天自然干旱处理后凤丹植株的表型；其中，野生型凤丹和空载体保持正常生长状态，转凤丹PoWRKY71基因的凤丹叶片萎蔫、下垂；
图7 为15天自然干旱处理后凤丹植株（H2O2）积累量的DAB染色法观测；
图8 为15天自然干旱处理后凤丹植株（O2 ·-）积累量测定；
图9 为15天自然干旱处理后凤丹植株相对电导率测定；不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；
图10 为15天自然干旱处理后凤丹植株丙二醛含量测定；不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；
图11 为15天自然干旱处理后凤丹植株光合特性测定；不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；
图12 为15天自然干旱处理后凤丹植株叶绿素荧光参数测定；不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；
图13 为15天自然干旱处理后凤丹植株叶片含水量测定；不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；
图14 为15天自然干旱处理后凤丹植株抗氧化酶活性测定；不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；其中，a为超氧化物歧化酶活性（SOD）；b为过氧化物酶活性（POD），c为过氧化氢酶活性（CAT），d为抗坏血酸过氧化物酶活性（APX）；
图15 为野生型烟草和转PoWRKY71基因烟草的PCR鉴定；
图16 为野生型烟草和转PoWRKY71基因烟草的qRT-PCR鉴定：其中，不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；
图17 为10天自然干旱处理后烟草植株的表型；其中，野生型烟草叶片萎蔫、下垂，转入凤丹PoWRKY71基因的烟草保持正常生长状态；
图18为10天自然干旱处理后烟草植株（H2O2）积累量的DAB染色法观测；
图19为10天自然干旱处理后烟草植株（O2 ·-）积累量测定；
图20为10天自然干旱处理后烟草植株叶片含水量测定；不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；
图21为10天自然干旱处理后烟草植株相对电导率测定；不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；
图22为10天自然干旱处理后烟草植株丙二醛含量测定；不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；
图23为10天自然干旱处理后烟草植株光合特性测定；不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；
图24为10天自然干旱处理后烟草植株叶绿素荧光参数测定；不同小写字母表示差异显著（p<0.05）；
图25为10天自然干旱处理后烟草植株抗氧化酶活性测定；不同小写字母表示差异显著（p<0.05），其中，a为超氧化物歧化酶活性（SOD）；b为过氧化物酶活性（POD），c为过氧化氢酶活性（CAT），d为抗坏血酸过氧化物酶活性（APX）。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规步骤进行，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 凤丹PoWRKY71基因cDNA全长序列的克隆
选取凤丹叶片（栽植于扬州大学芍药国家种质资源库）为材料，采用MiniBESTPlant RNA Extraction Kit（TaKaRa）试剂盒提取总RNA。采用PrimeScript™ II 1stStrand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）反转录生产cDNA的第一条链，第一轮反转录体系为：1 μL RNA、1 μL Oligo dT Primer (50 μM)、1 μL dNTP Mixture（10mM each）、7 μL RNaseFree ddH2O；反应条件为：65℃反应5 min，于冰上迅速冷却。第二轮反转录体系为：10 μL第一轮反应液、4 μL 5×PrimeScript II Buffer、0.5 μL RNase Inhibitor (40U/μL)、1 μLPrimeScript II RTase (200U/μL)、4.5 μL RNase Free ddH2O；反应条件为：42℃反应60min，95℃反应5 min，于冰上冷却。PCR扩增体系为：12.5 μL 2×Phanta Flash Master Mix（Vazyme）、1 μL Forward Primer（5'-TCTCCCTCACCCTCACTA-3'（SEQ ID NO.3））、1 μLReverse Primer（5'-CTCACGGCTCTTGTTTCA-3'（SEQ ID NO.4））、2 μL第二轮PCR扩增产物、8.5 μL ddH2O。反应程序：98℃预变性30 s；98℃变性10 s，60℃退火5 s，72℃延伸5 s，共35个循环；72℃延伸1 min。将产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。
实施例2 凤丹PoWRKY71基因推测得到的氨基酸序列与拟南芥AtWRKY蛋白的系统进化树分析和同源性比对
将凤丹PoWRKY71基因的氨基酸序列SEQ ID NO.2与拟南芥AtWRKY基因的氨基酸序列分别保存为TXT文件，再载入MEGA 7.0软件中，利用邻接法（neighbor joining method）构建系统进化树，Bootstrap设置为1000，进化树可视化结果显示凤丹PoWRKY71蛋白与拟南芥AtWRKY71蛋白聚为一支，属于Ⅱc亚族，初步命名为凤丹PoWRKY71（图2）。将凤丹PoWRKY71基因的氨基酸序列SEQ ID NO.2与拟南芥AtWRKY基因的氨基酸序列分别保存为TXT文件，再载入DNAMAN5.2.2软件中进行同源性比对，如图3所示，凤丹PoWRKY71蛋白和拟南芥AtWRKY8、AtWRKY28和AtWRKY71蛋白均具有保守的WRKY结构域和锌指基序。
实施例3 凤丹PoWRKY71基因沉默载体在凤丹中的表达
1、凤丹PoWRKY71基因沉默载体构建：设计含有酶切位点Xba I和BamH I用于扩增PoWRKY71特异性序列的引物（Forward Primer：5'-AAGGTTACCGAATTCTCTAGAACCTCCCACATGCACCTGC-3'（SEQ ID NO.5），Reverse Primer：5'-CGTGAGCTCGGTACCGGATCCTCTGATGAACCGAGAGAACTTTACTAC-3'（SEQ ID NO.6））。PCR扩增体系：12.5 μL 2×Phanta Flash MasterMix（Vazyme）、1 μL Forward Primer、1 μL Reverse Primer、2 μL实施例1中含PoWRKY71基因的cDNA模板、8.5 μL ddH2O。反应程序：98℃预变性30 s；98℃变性10 s，60℃退火5 s，72℃延伸5 s，共35个循环；72℃延伸1 min。反应结束后将PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析，并采用TSP601-DNA凝胶回收试剂盒（Tsingke）回收含酶切位点的PoWRKY71特异性片段。取双元表达载体TRV2质粒（实验室保存）用Xba I和BamH I（NEB）进行双酶切，反应体系为：2.0 μL 10×CutSmart Buffer、7 μL TRV2质粒、0.4 μL Xba I、0.4 μL BamH I、10.2 μLddH2O；37℃反应0.5 h。双酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分析，采用TSP601-DNA凝胶回收试剂盒（Tsingke）回收纯化质粒TRV2大片段。用NovoRec® plus One step PCR Cloning Kit（Novoprotein）试剂盒采用同源重组的方法连接两个回收的产物，反应体系为：4.0 μL 5×反应缓冲液、1.0 μL NovoRec® plus 重组酶、11 μL TRV2大片段、4 μL PoWRKY71特异性片段；在50℃金属浴连接15 min后置于冰上冷却，取5 μL连接产物转化100 μL TreliefTM5α感受态细胞（Tsingke），而后在LB平板上（含有Kan 50 mg/L）37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒TRV2-PoWRKY71，再进行双酶切与测序验证，直至TRV2-PoWRKY71沉默载体构建成功。
2、凤丹PoWRKY71基因沉默载体转化凤丹：分别取5 μL TRV2-PoWRKY71沉默载体质粒、TRV2空载体质粒和TRV1载体质粒（实验室保存）转化GV3101（pSoup-p19）感受态细胞（TOLOBIO），而后在YEB平板上（含有Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L）28℃培养2 d，挑取阳性单克隆于YEB液体培养基中（含有Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L），28℃，200 rpm培养过夜。取所摇菌液2 mL加入50 mL含有相同抗生素的液体YEB中，在相同条件下培养至OD600=1.5。将摇好的菌液倒入50 mL离心管中，室温离心5000 rpm、10 min，弃上清备用。先在灭菌后的三角瓶中配置重悬液（含10 mM MES, 10 mM无水氯化镁和0.2 mM乙酰丁香酮），向离心管中加入重悬液溶解菌体，用枪打匀，调整OD600=1.5，室温条件下将菌液置于黑暗中1-3 h，使其复壮。将TRV2-PoWRKY71沉默载体菌液和TRV2空载体菌液分别与TRV1载体菌液等体积混合备用。选取1年生凤丹，使用灭菌去离子水清洗根部，利用修枝剪形成伤口，而后浸没在上述菌液中，抽真空30 min侵染凤丹植株，侵染完成后，取出凤丹，使用灭菌去离子水清洗2遍，自然晾干2 h，种植于常规栽培基质中（园土：蛭石：珍珠岩 = 1：1：1），4℃黑暗处理24 h后，转入培养箱中进行光照培养（25℃光照14 h，黑暗10 h），即可获得空载体凤丹和转PoWRKY71基因凤丹。
实施例4 转凤丹PoWRKY71基因的凤丹植株鉴定
1、PCR鉴定：采用NuClean Plant Genomic DNA Kit（CWBIO）试剂盒提取实施例3中培养的转PoWRKY71基因凤丹、空载体凤丹和野生型凤丹（栽植于扬州大学芍药国家种质资源库）叶片DNA。在此基础之上，以凤丹Ubiquitin（JN699053）基因为内参（Forward Primer：5'-GACCTATACCAAGCCGAAG-3'（SEQ ID NO.7）、Reverse Primer：5'-CGTTCCAGCACCACAATC-3'（SEQ ID NO.8）），同时设计TRV1和TRV2载体特异性引物（TRV1 Forward Primer：5'-ACTAACCTGGGCGAAGGACAC-3'（SEQ ID NO.9）、TRV1 Reverse Primer：5'-CGGACTCAGATGCCGAATACA-3'（SEQ ID NO.10）、TRV2 Forward Primer：5'-TTGTTACTCAAGGAAGCACGAT-3'（SEQ ID NO.11）、TRV2 Reverse Primer：5'-TCCCCTATGGTAAGACAATGAG-3'（SEQ ID NO.12））进行PCR扩增。反应体系：12.5 μL 2×RapidTaq Master Mix（Vazyme）、1 μL Forward Primer、1 μL Reverse Primer、2 μL DNA模板、8.5 μL ddH2O。反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性15 s，52℃退火15 s，72℃延伸5 s，共35个循环；72℃延伸5 min。反应结束后将PCR反应液进行凝胶电泳检测。从图4可以看出，野生型凤丹、空载体和转凤丹PoWRKY71基因凤丹叶片中均检测到单一而明亮的Ubiquitin条带，而就扩增PoWRKY71条带而言，仅在转凤丹PoWRKY71基因的凤丹叶片中检测到位置正确的单一、明亮、清晰条带，在野生型凤丹和空载体中均未检测到。
2、qRT-PCR鉴定：采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa)试剂盒提取总RNA，并采用HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)（Vazyme）试剂盒将总RNA反转录成cDNA，反应体系为：1.0 μL RNA（1000ng/μL）、4.0 μL 4×gDNA wiper Mix、11.0 μL RNase Free dH2O；反应条件为：42℃反应2 min。反应完成后，再在第一步的反应液中加入4.0 μL 5×HiScript III qRT SuperMix；反应条件为：37℃反应15 min，85℃反应5 s。将反转录获得的cDNA用NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus（Novoprotein）试剂盒进行qRT-PCR检测。在此基础之上，以凤丹Ubiquitin（JN699053）基因为内参（ForwardPrimer：5'-GACCTATACCAAGCCGAAG-3'（SEQ ID NO.7）、Reverse Primer：5'-CGTTCCAGCACCACAATC-3'（SEQ ID NO.8）），同时设计PoWRKY71基因的特异性引物（ForwardPrimer：5'-TTCATCTGAGGCTGGTGT-3'（SEQ ID NO.13）、Reverse Primer：5'-GGTTCCCTTTGTCTTTTCT-3'（SEQ ID NO.14））进行qRT-PCR检测。反应体系：2μL cDNA、12.5 μL 2×NovoStart®SYBR qPCR SuperMix Plus、1 μL Forward Primer、1 μL ReversePrimer、8.5 μL ddH2O。反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环；72℃延伸10 min。反应结束后采用2-△△Ct方法进行基因相对表达水平的分析。qRT-PCR鉴定结果表明，PoWRKY71在转基因凤丹中具有显著较低的表达水平（图5）。
实施例5 转凤丹PoWRKY71基因的凤丹植株耐旱能力鉴定
待实施例3中培养的凤丹和野生型凤丹植株生长30天后，一次性浇足水后再对凤丹植株进行干旱处理，15天后观察植株表型变化，发现野生型凤丹和空载体生长情况良好，而转PoWRKY71基因的凤丹叶片萎蔫、下垂，表明沉默凤丹PoWRKY71基因显著降低了凤丹的耐旱能力（图6）。
实施例6 干旱胁迫下凤丹植株的H2O2积累量测定
采用二氨基联苯胺（DAB）染色法观察实施例3中培养的凤丹和野生型凤丹H2O2的积累量。使用50 mM的Tris-acetate缓冲液来配制浓度为0.1 mg/mL、pH为5.0的DAB染色液。用染色液在黑暗中充分浸泡叶片24 h后，取出叶片放入95%（v/v）酒精中进行沸水浴，在15min后进行拍照。从图7可以看出，野生型凤丹和空载体叶片颜色较浅，而转凤丹PoWRKY71基因的凤丹叶片颜色明显较深，表明转PoWRKY71基因的凤丹积累了较多的H2O2。
实施例7 干旱胁迫下凤丹植株的O2 ·-积累量测定
采用荧光探针法观察实施例3中培养的凤丹和野生型凤丹O2 ·-积累量，具体操作参照活体细胞氧化应激ROS原位染色试剂盒（上海哈灵生物科技有限公司）说明书并稍作修改，具体步骤如下：①滴100 μL清理液于载玻片上，捏紧2片不锈钢双面剃须刀片快速切割滤纸上的新鲜叶片，避开主叶脉；②用细头毛笔沾取切好的样品放于载玻片清理液中，并调整好位置；③叶片样品全部放好后将载玻片上清理液尽量吸取干净，然后加入10 μL荧光染色剂二氢溴化乙啶（DHE），37℃孵育20 min；④在荧光显微镜（Axio Imager D2，ZEISS，德国）下观察并且拍照。从图8可以看出，野生型凤丹和空载体叶片中的荧光较弱，而转凤丹PoWRKY71基因的凤丹叶片颜色明显较深，表明转PoWRKY71基因的凤丹积累了较多的O2 ·-。
实施例8 干旱胁迫下凤丹植株的相对电导率测定
分别称取实施例3中培养的凤丹和野生型凤丹各0.1 g，用直径1 cm打孔器获得的叶片圆片，放入含有适量去离子水的注射器中，堵住注射器前端抽真空直至叶片沉入水下。然后一起倒入玻璃试管中，加去离子水至总体积达为20 mL。室温静置4 h，摇匀后用电导率仪（DDS-307A，上海雷磁仪器有限公司）测定溶液电导率C1。接下来将试管封口，沸水浴30min，等温度冷却至室温后测定此时溶液电导率为C2。每个处理按下列公式计算叶片相对电导率：相对电导率（%）=C1/C2×100%。从图9可以看出，与野生型凤丹和空载体相比，转凤丹PoWRKY71基因的凤丹叶片相对电导率显著较高，提升了55.81%，表明转PoWRKY71基因的凤丹具有较高的相对电导率。
实施例9 干旱胁迫下凤丹植株的丙二醛含量测定
采用丙二醛试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）进行测定。具体步骤如下：（1）样品制备：分别称取实施例3中培养的凤丹和野生型凤丹约0.1 g的叶片，加入1 mL提取液，进行冰浴匀浆，8000 g、4℃离心10 min，取上清，置于冰上待测。（2）吸取0.6 mL试剂一于1.5mL离心管中，再加入0.2 mL经过步骤（1）处理后的样本，混匀。（3）95℃水浴中保温30 min，取出后置于冰浴中冷却，10000 g、25℃离心10 min。（4）吸取上清液于1 mL玻璃比色皿中，测定532 nm和600 nm处的吸光度，记为A532和A600，△A=A532-A600。（5）丙二醛含量（nmol/g FW）=25.8×△A÷0.1。从图10可以看出，与野生型凤丹和空载体相比，转凤丹PoWRKY71基因的凤丹丙二醛含量显著较高，提升了26.74%，表明转PoWRKY71基因的凤丹含有较多的丙二醛。
实施例10 干旱胁迫下凤丹植株的光合特性测定
采用Li-6400型便携式光合仪（Li-Cor，Lincoln，美国）于上午8：30测定实施例3中培养的凤丹和野生型凤丹的光合参数。光合仪设置标准叶室2 cm × 3 cm，光合光子量子通量密度（PPFD）为1000 μmol m-2 s-1。测定的光合特性指标包括Pn（净光合速率）、Tr（蒸腾速率）、Gs（气孔导度）、Ci（细胞间隙 CO2浓度）。从图11可以看出，与野生型凤丹和空载体相比，转凤丹PoWRKY71基因的凤丹具有显著较低的Pn。
实施例11 干旱胁迫下凤丹植株的叶绿素荧光参数测定
分别取实施例3中培养的凤丹和野生型凤丹的叶片，用叶夹夹住，用叶绿素荧光仪（PAM-2500，德国Walz公司）对在黑暗中静置2 h后标记过的叶片进行叶绿素荧光参数测定。系统记录了Fm、Fo、执行饱和脉冲前的实时荧光产量（Fv’）、PSⅡ处于关闭时的最大荧光产量（Fm’）和Y(Ⅱ)，此外，可变荧光（Fv=Fm-Fo）、光化学效率（Fv/Fm）采用仪器自带数据处理软件PAM Win计算得到。从图12可以看出，与野生型凤丹和空载体相比，转凤丹PoWRKY71基因的凤丹具有显著较低的Fv/Fm。
实施例12 干旱胁迫下凤丹植株的叶片含水量测定
相对含水量使用烘箱（9423A，上海精宏实验设备有限公司）和天平（BSA224S，德国Sartorius公司）进行测定。分别称取实施例3中培养的凤丹和野生型凤丹约0.1 g的叶片，重量记录为样品鲜重（FW），随后将样品放入信封中，105℃烘箱内杀青5 min，再将温度调至65 ℃烘干至恒重，记录此时样品重量，记为样品干重（DW）。相对含水量计算如下：相对含水量（%）＝（FW - DW）/FW × 100%。从图13可以看出，与野生型凤丹和空载体相比，转凤丹PoWRKY71基因的凤丹叶片具有显著较低的叶片含水量。
实施例13 干旱胁迫下凤丹植株的抗氧化酶活性测定
SOD活性测定参照SOD试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）说明书进行，具体步骤如下：①分别称取实施例3中培养的凤丹和野生型凤丹各0.1 g粉末状叶片样品，加入1 mL试剂盒提供的提取液，冰浴研磨至匀浆，4 ℃下8,000 rpm离心10 min，取上清液置于冰上待测；②将试剂一、二和四在25 ℃水浴5min；③将分光光度计预热30 min，用蒸馏水调零，将波长设置为560 nm；④在测定管中依次加入240 μL试剂一、6 μL试剂二、90 μL上清液、180 μL试剂三和510 μL试剂四，在对照管中依次加入240 μL试剂一、6 μL试剂二、90 μL蒸馏水、180 μL试剂三和510 μL试剂四；⑤充分混匀，室温静置30 min，然后加入1 mL比色皿中，通过分光光度计测定吸光值A；⑥计算公式：抑制百分率（P）＝（A对照管-A测定管）/A对照管×100%，SOD活性（U/g FW）=114×P/（1-P）。
POD活性测定参照POD试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）说明书进行，具体步骤如下：①分别称取实施例3中培养的凤丹和野生型凤丹0.1 g粉末状叶片样品，加入1 mL试剂盒提供的提取液，冰浴研磨至匀浆，4 ℃下8,000 rpm离心10 min，取上清液置于冰上待测；②将28.5 μL试剂二和19 μL试剂三加入49.4 mL试剂一中，混匀，25 ℃水浴10min以上；③将分光光度计预热30 min，用蒸馏水调零，将波长设置为470 nm；④依次在1 mL石英比色皿中加入50 μL上清液和950 μL工作液，混匀；⑤使用分光光度计测定1 min时吸光值A1和2min后的吸光值A2；⑥计算公式：ΔA = A2-A1，POD活性（U/g FW）=2000×ΔA÷0.1。
CAT活性测定参照CAT活性测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）说明书进行，具体步骤如下：①分别称取实施例3中培养的凤丹和野生型凤丹0.1 g粉末状叶片样品，加入1 mL试剂盒提供的提取液，冰浴研磨至匀浆，4 ℃下8,000rpm离心10 min，取上清液置于冰上待测；②将紫外分光光度计预热30 min，用蒸馏水调零，依次在1 mL石英比色皿中加入35 μL上清液、1 mL试剂一（25 ℃预热10 min），迅速混匀；③使用分光光度计在波长240 nm处测定初始吸光值和1 min后的吸光值分别记为A1和A2；④计算公式：ΔA = A1-A2，CAT活性（nmol/min/g FW）=678×ΔA÷0.1。
APX活性测定参照APX活性测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）说明书进行，具体步骤如下：①分别称取实施例3中培养的凤丹和野生型凤丹0.1 g粉末状叶片样品，加入1 mL试剂盒提供的提取液，冰浴研磨至匀浆，4 ℃下12,000rpm离心20 min，取上清液置于冰上待测；②将紫外分光光度计预热30 min，用蒸馏水调零，依次在1mL石英比色皿中加入100 μL上清液、700 μL试剂一（25 ℃预热30 min）、100 μL试剂二和100 μL试剂三，迅速混匀；③使用分光光度计在波长290 nm处测定10 s和130 s的吸光值分别记为A1和A2；④计算公式：ΔA = A1-A2，APX活性（nmol/min/g FW）=1786×ΔA÷0.1。
从图14可以看出，与野生型凤丹和空载体相比，转凤丹PoWRKY71基因的凤丹具有显著较低的抗氧化酶活性。其中，a为超氧化物歧化酶活性（SOD）；b为过氧化物酶活性（POD），c为过氧化氢酶活性（CAT），d为抗坏血酸过氧化物酶活性（APX）。
实施例14 凤丹PoWRKY71基因过量表达载体在烟草中的表达
1、凤丹PoWRKY71基因过量表达载体构建：设计含有酶切位点BamH I和Kpn I用于扩增PoWRKY71序列的引物（Forward Primer：5'-CAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGTCTGATGAACCGAGAGAACTTT-3'（SEQ ID NO.15）、Reverse Primer：5'-TTCGAGCTCAGATCTGGTACCCGGCTCTTGTTTCATAACCAAAG-3'（SEQ ID NO.16））。PCR扩增体系：12.5 μL 2×Phanta Flash MasterMix（Vazyme）、1 μL Forward Primer、1 μL Reverse Primer、2 μL实施例1中含PoWRKY71基因的cDNA模板、8.5 μL ddH2O。反应程序：98℃预变性30 s；98℃变性10 s，60℃退火5 s，72℃延伸10 s，共35个循环；72℃延伸1 min。反应结束后将PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析，并采用TSP601-DNA凝胶回收试剂盒（Tsingke）回收含酶切位点的PoWRKY71大片段。取双元表达载体pCAMBIA1301质粒（实验室保存）用BamH I和Kpn I（NEB）进行双酶切，反应体系为：2.0 μL 10×CutSmart Buffer、7 μL pCAMBIA2300质粒、0.4 μL BamH I、0.4 μL KpnI、10.2 μL ddH2O；37℃反应0.5 h。双酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分析，采用TSP601-DNA凝胶回收试剂盒（Tsingke）回收纯化质粒pCAMBIA1301大片段。用NovoRec® plus Onestep PCR Cloning Kit（Novoprotein）试剂盒采用同源重组的方法连接两个回收的产物，反应体系为：4.0 μL 5×反应缓冲液、1.0 μL NovoRec® plus 重组酶、9 μL pCAMBIA1301大片段、6 μL PoWRKY71大片段；在50℃金属浴连接15 min后置于冰上冷却，取5 μL连接产物转化100 μL TreliefTM5α感受态细胞（Tsingke），而后在LB平板上（含有Kan 50 mg/L）37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pCAMBIA1301-PoWRKY71，再进行双酶切与测序验证，直至pCAMBIA1301-PoWRKY71过量表达载体构建成功。
2、凤丹PoWRKY71基因过量表达载体转化烟草：取5 uL pCAMBIA1301-PoWRKY71过量表达载体质粒转化GV3101（pSoup-p19）感受态细胞（TOLOBIO），而后在YEB平板上（含有Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L）28℃培养2 d，挑取阳性单克隆于YEB液体培养基中（含有Rif50 mg/L和Kan 50 mg/L），28℃，200 rpm培养过夜。取所摇菌液2 mL加入50 mL含有相同抗生素的液体YEB中，在相同条件下培养至OD600=0.3-0.4。将摇好的菌液倒入50 mL离心管中，室温离心5000 rpm、10 min，弃上清备用。先在灭菌后的小三角瓶中加入适量乙酰丁香酮（20 mg/mL），向离心管中加入5mL MS0（MS液体基本培养基，无琼脂和蔗糖（Hopebio））将溶解菌体，用枪打匀，倒入加有适量乙酰丁香酮的小三角瓶中，然后加MS0至50 mL。向另一个灭菌小三角瓶中加入50 mL MS0（MS0液体基本培养基，无琼脂和蔗糖）备用。取烟草的无菌苗叶片，切成小块（约1 cm×1 cm），放入50 mL加有MS0小三角瓶中，共切100-150片叶片放入瓶中，将叶片倒入覆有纱布的烧杯，取经过滤后的叶片加入50 mL MS0 +100 μL乙酰丁香酮（100 μmol/mL）的小三瓶中，侵染8 min，侵染时不断轻轻摇动；侵染完成后，滤去菌液，取出叶片，用无菌滤纸吸干叶片表面多余的菌液，接种于共培养培养基[MS+3.0 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA + 30 g/L蔗糖+ 6.66% 琼脂]中，暗培养3 d；共培养结束后，转入抗性芽筛选分化培养基[MS+3.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+ 6.66%琼脂+ 100 mg/L Cb + 25 mg/L G418]中进行选择培养，两周继代一次，直到分化出芽；当分生不定芽达2cm以上时，切下不定芽，转入生根筛选培养基[1/2 MS + 0.3 mg/L IBA + 30 g/L蔗糖+6.66% 琼脂+50 mg/LCb + 8 mg/L G418]进行生根筛选。经过4-6个月的培养，可获得转PoWRKY71基因烟草。
实施例15 转凤丹PoWRKY71基因的烟草植株鉴定
1、PCR鉴定：采用NuClean Plant Genomic DNA Kit（CWBIO）试剂盒提取烟草叶片DNA。在此基础之上，以烟草NtActin（AB158612）基因为内参（Forward Primer：5'-TCCTCATGCAATTCTTCG-3'（SEQ ID NO.17）、Reverse Primer：5'-ACCTGCCCATCTGGTAAC-3'（SEQ ID NO.18）），同时设计PoWRKY71基因的特异性引物（Forward Primer：5'-TTCATCTGAGGCTGGTGT-3'（SEQ ID NO.13）、Reverse Primer：5'-GGTTCCCTTTGTCTTTTCT-3'（SEQ ID NO.14））进行PCR扩增。反应体系：12.5 μL 2×Rapid Taq Master Mix（Vazyme）、1μL Forward Primer、1 μL Reverse Primer、2 μL DNA模板、8.5 μL ddH2O。反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性15 s，52℃退火15 s，72℃延伸5 s，共35个循环；72℃延伸5 min。反应结束后将PCR反应液进行凝胶电泳检测。从图15可以看出，野生型烟草（实验室保存）和转凤丹PoWRKY71基因的烟草中均检测到单一而明亮的NtActin条带，而就扩增PoWRKY71条带而言，仅在转凤丹PoWRKY71基因的烟草中检测到单一、明亮、清晰的条带，在野生型烟草中未检测到。
2、qRT-PCR鉴定：采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa)试剂盒提取总RNA，并采用HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)（Vazyme）试剂盒将总RNA反转录成cDNA，反应体系为：1.0 μL RNA（1000ng/μL）、4.0 μL 4×gDNA wiper Mix、11.0 μL RNase Free dH2O；反应条件为：42℃反应2 min。反应完成后，再在第一步的反应液中加入4.0 μL 5×HiScript III qRT SuperMix；反应条件为：37℃反应15 min，85℃反应5 s。将反转录获得的cDNA用NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus（Novoprotein）试剂盒进行qRT-PCR检测。在此基础之上，以烟草NtActin（AB158612）基因为内参（ForwardPrimer：5'-TCCTCATGCAATTCTTCG-3'（SEQ ID NO.17）、Reverse Primer：5'-ACCTGCCCATCTGGTAAC-3'（SEQ ID NO.18）），同时设计PoWRKY71基因的特异性引物（ForwardPrimer：5'-TTCATCTGAGGCTGGTGT-3'（SEQ ID NO.13）、Reverse Primer：5'-GGTTCCCTTTGTCTTTTCT-3'（SEQ ID NO.14））进行qRT-PCR检测。反应体系：2μL cDNA、12.5 μL 2×NovoStart®SYBR qPCR SuperMix Plus、1 μL Forward Primer、1 μL ReversePrimer、8.5 μL ddH2O。反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环；72℃延伸10 min。反应结束后采用2-△△Ct方法进行基因相对表达水平的分析。qRT-PCR鉴定结果表明，PoWRKY71在转基因烟草中具有显著较高的表达水平（图16）。
实施例16 转凤丹PoWRKY71基因的烟草植株耐旱能力鉴定
一次性浇足水后对烟草植株进行干旱处理，10天后观察植株表型变化，发现野生型烟草叶片出现萎蔫、下垂等干旱伤害症状，而转PoWRKY71基因的烟草仍然保持正常的生长状态，表明转PoWRKY71基因的烟草具有较强的耐旱能力（图17）。参照实施例6、7、8、9、10、11、12和13进一步评估转凤丹PoWRKY71基因的烟草植株耐旱能力，发现与野生型烟草相比，转PoWRKY71基因烟草积累了较少的H2O和O2•-（图18，19），叶片含水量提升了28.11%（图20），相对电导率降低了45.88%（图21），丙二醛含量降低了36.85%（图22），具有显著较高的Pn和Fv/Fm（图23、图24）。同时，转凤丹PoWRKY71基因烟草具有显著较高的抗氧化酶活性（图25），其中a为超氧化物歧化酶活性（SOD）；b为过氧化物酶活性（POD），c为过氧化氢酶活性（CAT），d为抗坏血酸过氧化物酶活性（APX）。
综上所述，本发明提供了一种凤丹PoWRKY71基因在改变植物耐旱能力方面的应用。本发明通过将构建的PoWRKY71基因沉默载体转化到凤丹中进行表达，干旱处理后，与对照相比，转基因凤丹的耐旱能力显著降低。本发明还通过将构建的PoWRKY71基因过量表达载体转化到烟草中进行表达，干旱处理后，与野生型相比，转基因烟草植株能够清除活性氧积累，降低相对电导率和丙二醛含量，提高抗氧化酶活性，创制了耐旱能力强的烟草新种质。
Claims (13)
1.一种凤丹PoWRKY71基因，其特征在于，所述凤丹PoWRKY71基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.权利要求1所述的凤丹PoWRKY71基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.克隆权利要求1所述的凤丹PoWRKY71基因cDNA全长序列的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
4.一种表达盒其含有权利要求1所述的凤丹PoWRKY71基因。
5.一种重组载体，其含有权利要求1所述的凤丹PoWRKY71基因。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为过表达载体。
7.一种重组细胞，其含有权利要求1所述的凤丹PoWRKY71基因。
8.一种重组菌株，其含有权利要求1所述的凤丹PoWRKY71基因。
9.权利要求1所述的凤丹PoWRKY71基因、权利要求4所述的表达盒、权利要求5~6所述的重组载体、权利要求7所述的重组细胞或权利要求8所述的重组菌株在植物耐旱方面的应用。
10.权利要求5所述的重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：扩增权利要求1所述的凤丹PoWRKY71基因的全长序列，并与中间植物表达载体连接即得。
11.获得具有耐旱能力的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）使植物过表达权利要求1所述的凤丹PoWRKY71基因；或
2）使植物过表达权利要求2所述的凤丹PoWRKY71基因编码的蛋白。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，其包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。
13.鉴定权利要求11或12所述的方法获得的具有耐旱能力的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）鉴定所述植物是否过表达权利要求1所述的凤丹PoWRKY71基因；或
2）鉴定所述植物是否过表达权利要求2所述的凤丹PoWRKY71基因编码的蛋白。
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| CN114958864A (zh) * | 2022-04-15 | 2022-08-30 | 扬州大学 | 芍药PlWRKY47基因及其在植物耐高温方面的应用 |
-
2022
- 2022-11-22 CN CN202211463800.8A patent/CN115838738B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Also Published As
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