CN107090462B

CN107090462B - 一种NF-Y类核转录因子基因ZmNF-YA13、其编码的蛋白及其应用

Info

Publication number: CN107090462B
Application number: CN201710353407.6A
Authority: CN
Inventors: 苏乔; 尹鑫; 向旭; 安利佳
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2017-05-18
Filing date: 2017-05-18
Publication date: 2020-02-18
Anticipated expiration: 2037-05-18
Also published as: CN107090462A

Abstract

本发明公开了一种NF‑Y类核转录因子基因ZmNF‑YA13、其编码的蛋白及其应用。本发明的基因ZmNF‑YA13来源于郑58玉米，其编码的蛋白ZmNF‑YA13是一种核转录因子，能够调控下游基因表达，从而提高转基因植物的耐旱性、钾吸收功能及降低对ABA敏感性。这种提高转基因植物的耐旱性、钾吸收功能及降低对ABA敏感性的特性，可通过转基因技术应用于农作物上，从而应对日益严重的环境问题。

Description

一种NF-Y类核转录因子基因ZmNF-YA13、其编码的蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，本发明涉及一个NF-Y类核转录因子基因 ZmNF-YA13、其编码的蛋白及该基因在提高植物耐旱性、钾吸收功能及降低ABA 敏感性方面的作用。

背景技术

植物在生长过程中会受到各种生物与非生物胁迫的影响，这些胁迫严重威胁着植物的生长发育。对粮食作物来说，生物与非生物胁迫都有可能使得作物的产量大大降低。干旱由于其分布广泛且重复性高成为农业生产的重要限制因素。因此对植物尤其是对重要的粮食作物来说，研究其抗逆新品种就显得尤为重要。

目前，NF-YA是miR169家族靶基因中报道的比较多的一个基因。NF-Y类转录因子是一类重要的逆境调节因子，由NF-YA、NF-YB和NF-YC亚基组成。在行使功能时，NF-YB亚基和NF-YC亚基先在细胞质中形成异源二聚体，然后迁移到细胞核中和NF-YA亚基结合形成有活性的异源三聚体，与CCAAT结合从而调控下游基因的表达。

玉米是一种重要的粮食作物。本发明利用RT-PCR、RACE及5’端PCR 技术从玉米中分离了ZmNF-YA13全长cDNA，分析了其编码蛋白质序列的结构特征、进化关系及该基因在玉米不同组织及非生物逆境胁迫处理下的表达模式，并使其在烟草中过表达，研究ZmNF-YA13在干旱、ABA及缺钾胁迫下的功能，以期为进一步揭示该基因的生物学功能及调控机制奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于公开一种NF-Y类核转录因子基因ZmNF-YA13、其编码蛋白及该基因在植物耐旱性、钾吸收功能及降低ABA敏感性方面的应用。该基因是从玉米中分离出来的，是一种NF-Y类转录因子。NF-Y类转录因子由 NF-YA、NF-YB和NF-YC亚基组成。在行使功能时，NF-YB亚基和NF-YC亚基先在细胞质中形成异源二聚体，然后迁移到细胞核中和NF-YA亚基结合形成有活性的异源三聚体，与CCAAT结合从而调控下游基因的表达。过表达该基因能够提高转基因烟草对于干旱、低钾胁迫的耐受性及降低其对ABA敏感性，这种提高转基因植物耐干旱和钾吸收功能及降低其对ABA敏感性的特性，可通过转基因技术应用于农作物上，从而应对日益严重的环境问题。

本发明的目的之一在于提供NF-Y类核转录因子基因ZmNF-YA13，该基因是从玉米中分离出来的，具有序列表中SEQ ID NO.1所示的碱基序列。其序列由1147个碱基组成，自5′端第48到第869位残基为该基因的开放阅读框序列。

本发明的另一方面在于提供具有与上文所述的SEQ ID NO:1所示的碱基序列95％以上的同源性，且编码与SEQ ID NO:1所示的碱基序列编码的蛋白质具有相同生物学功能蛋白质的碱基序列。

本发明的目的之二在于提供具有上文所述Y类核转录基因ZmNF-YA13编码的蛋白ZmNF-YA13，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其是由273个氨基酸残基组成的蛋白质。本发明进一步提供所述核转录因子ZmNF-YA13编码的蛋白的衍生蛋白质，即由序列表中SEQ ID NO.2的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而产生的具有相同的生物学功能的衍生蛋白质的氨基酸序列。

本发明的目的之三在于提供一种重组表达载体，该重组表达载体上含有上文所述的碱基序列；且在优选的技术方案中，是以pTF101作为表达载体，该植物表达载体含有除草剂的抗性基因，可以利用除草剂对转基因植株进行筛选。

本发明的目的之四在于提供一种含有上文所述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞优选为根癌农杆菌EHA101菌株。

本发明的目的之五在于提供上文所述的NF-Y类核转录因子基因 ZmNF-YA13在培育耐干旱和提高钾吸收功能及降低对ABA敏感性转基因植物中的应用。该基因的转基因植物在干旱及钾吸收功能明显提高，且对ABA敏感性降低。优选的技术方案中，该基因在提高烟草在干旱、钾吸收性能及降低其对ABA敏感性中有较好的应用效果。

本发明的有益效果：

本发明的基因ZmNF-YA13具有核转录因子的功能，该基因能提高转基因烟草在干旱胁迫下的叶片相对含水量、提高超氧化物歧化酶的活性、干重、鲜重并促进根系的生长，进而提高植物对于干旱胁迫的耐受性，同时也预示着它在农作物耐旱方面的应用价值。在ABA胁迫下转ZmNF-YA13基因烟草较野生型烟草的根系更发达，幼苗生长状态更好，同时也预示着该基因在农作物降低ABA 敏感性方面的应用价值。在K⁺耗竭实验中，转ZmNF-YA13基因烟草较野生型烟草的耗竭液中的K⁺浓度下降得更多，这预示着该基因在农作物耐低钾方面的应用价值。

附图说明

图1为ZmNF-YA13基因克隆PCR电泳图，其中：A为保守区部分片段克隆， M为DL2000marker，泳道1为克隆所得保守区片段，长度约为662bp；B为3′端部分片段克隆，M为DL2000marker，泳道1为克隆所得3′部分片段，长度约为751Kb；C为5′端部分片段克隆，M为DL2000marker，泳道1为克隆所得5′部分片段，长度约为750bp；D为ORF全长PCR电泳图，M为DL5000 marker，泳道1为ORF加3’UTR，全长为1130bp，泳道2为ORF，全长852bp。

图2为本发明的ZmNF-YA13基因编码的蛋白质保守区域分析图， ZmNF-YA13具有3个保守区域，DNA结合区、NF-YB/C结合区及连接区，表明它属于NF-YA家族成员。

图3为本发明的ZmNF-YA13基因编码的蛋白的进化分析图，结果显示 NF-YA与NF-YB之间具有显著的差异；ZmNF-YA13与同属于单子叶植物的小麦的NF-YA10亲缘关系最近。

图4为不同胁迫条件下采用实时定量PCR的方法分析ZmNF-YA13基因在玉米地上部分和地下部分的表达结果图，结果表明该基因不同胁迫条件下在玉米地上及地下部分中均呈现不同程度的上调或下调表达。

图5为采用实时定量PCR的方法分析ZmNF-YA13基因在玉米不同的组织器官中的表达结果图，结果表明该基因在玉米不同组织器官中都有表达，且在雄穗、花丝和种子中表达量较高。

图6为重组植物表达载体PTF101-ZmNF-YA13的结构图谱，表明该基因可在35S启动子的调控下组成型表达，重组载体具有除草剂抗性。

图7为除草剂筛选后所获得的阳性转基因烟草。

图8为干旱胁迫条件下转基因以及野生型烟草的生长情况及各项生理指标的检测结果。

图9为ABA胁迫条件下转基因及野生型烟草的生长情况。

图10为转基因与野生型烟草的K⁺耗竭实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。下面实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规条件或分子克隆中所述条件，或按照产品说明书上所提供的条件。下面是实例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

试验中使用的试剂盒以及试剂：无缝连接试剂盒：Trangene公司，pEASY-UniSeamless Cloning and Aseembly Kit；质粒提取试剂盒：Sangon Biotech公司， SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒。

实施例1 ZmNF-YA13基因cDNA的克隆与分析

(1)玉米总RNA提取

称取50mg郑58新鲜玉米叶片，于液氮中研磨成粉末。待液氮挥发完全后，迅速将其转入含有1mL预冷Trizol试剂的离心管中，充分混匀，室温静置10 min；加入0.2mL氯仿，混合均匀，室温静置5min；于4℃低温离心机中，12000 r/min离心15min，将上清液转移至新的离心管中；加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温静置10min；于低温离心机中4℃，12000r/min离心15min；弃上清，加入1.0mL预冷的75％乙醇(DEPC水配制)，充分洗涤沉淀，4℃，7500rpm离心5min；弃上清，于超净工作台中吹干至透明状，加入适量RNase-free 水溶解沉淀。1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。结果呈现了28S、18S、 5S三种典型的RNA带型，各条带清晰，无明显的拖尾现象，表明提取的RNA 无明显降解，可进一步用于RT-PCR实验。

(2)单链cDNA的获得

以提取的玉米叶片总RNA为模板(500ng)，根据北京全式金公司

Reverse Transcriptase反转录说明书进行RT-PCR，得到的单链cDNA 可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或者PCR扩增等。

(3)玉米ZmNF-YA13基因部分编码区的获得

1)保守区引物设计：根据NCBI上已有的B73玉米ZmNF-YA13基因序列，在其高度保守区设计一对引物，序列分别为表1中的ZmNF-YA13-F和 ZmNF-YA13-R。

2)PCR扩增：以反转录获得的单链cDNA为模板，ZmNF-YA13-F和 ZmNF-YA13-R为正反向引物，PCR扩增ZmNF-YA13基因部分编码区。将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离(结果如图1A)，至溴酚蓝指示带位于凝胶2/3处，在紫外灯下切下662bp区域的凝胶放入1.5mL离心管中，用TaKaRa公司(大连) 的MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.3.0回收试剂盒进行回收。

3)回收DNA片段连接、转化与测序：采用宝生物pMD18-T vector试剂盒，将回收后的PCR产物直接与T载体相连，连接产物用于大肠杆菌转化。PCR检测呈阳性的克隆，送测序，测序后即可确定ZmNF-YA13基因的部分片段信息。将阳性克隆的测序结果通过NCBI在线数据库做核酸同源性比对，结果表明克隆所得片段与B73玉米中ZmNF-YA13同源性分别为99％。初步推断克隆所得片段是玉米ZmNF-YA13基因编码区的部分序列。

(4)RACE法克隆玉米ZmNF-YA13基因3′cDNA

1)3′RACE特异引物的设计：根据已获得的玉米ZmNF-YA13基因部分 cDNA片段以及TaKaRa(大连)公司的3’-full RACE Kit提供的引物3’RACE Outer Primer/3’RACE InnerPrime，设计一对嵌套PCR引物：3′正向特异性外侧引物3-GSP1，巢式特异性内侧引物3-GSP2，引物序列见表1。

2)单链cDNA的获得：按照Takara 3′RACE试剂盒操作，反转录所得单链cDNA作为巢式PCR模版。

3)巢式PCR反应：Outer PCR反应用外侧引物3-GSP1和3′RACE Outer Primer进行扩增。Inner PCR反应以巢式第一轮PCR产物为模板，用内侧引物 3-GSP2和3′RACE InnerPrimer引物进行巢式扩增。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离(结果如图1B)、切胶回收、连接克隆载体、转化大肠杆菌感受态。选取长度为750bp左右的阳性克隆送测序。测序结果通过NCBI数据库做Blast 比对，结果显示：该序列与B73玉米ZmNF-YA13基因同源性为100％，初步推断该片段是ZmNF-YA13基因3′端部分序列。

(5)5’端PCR法克隆ZmNF-YA13基因5′cDNA

本实施例中ZmNF-YA13基因5′cDNA序列采用5’端PCR方法获得。步骤如下：由于在实验的过程中发现郑58玉米与B73玉米中NF-YA13基因的同源性达到99％，因此在B73玉米的NF-YA135’UTR设计引物通过PCR的方法获得了约750bp的ZmNF-YA13基因5′端片段(图1C)，回收纯化目的片段，连接到 pMD-18T克隆载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取单菌落摇菌进行菌液PCR检测并挑取阳性克隆送测序。通过Blast比对，结果表明该序列与B7玉米NF-YA13 5′端序列的同源性分别为98％，由此可以推断该序列是玉米NF-YA13基因5′端部分序列。

(6)玉米ZmNF-YA13基因编码区的获得

将已克隆得到的保守区序列、3′端以及5′端进行拼接，通过ORF finder预测出ZmNF-YA13的全长开放阅读框(ORF)。利用带有植物表达载体pTFT01同源臂的正反向引物，通过PCR的方式分别扩增出ZmNF-YA13基因的ORF及带 3’UTR的ORF(图1D)。将PCR产物送测序公司测序，测序结果与拼接的序列一致。将该基因命名为ZmNF-YA13。

(7)生物信息学分析

利用通过Clustal将ZmNF-YA13与拟南芥、玉米、人及小鼠等NF-YA氨基酸序列进行比对，结果表明，玉米NF-YA13蛋白含有其他物种中NF-YA家族所包含的保守区域：NF-YB/C结合区、DNA结合区及中间连接区(图2)。系统发育分析表明ZmNF-YA13是典型的核转录因子NF-Y类家族成员(图3)，与已报导的其他植物核转录因子NF-Y具有很高的同源性，其中与拟南芥 (Arabidopsis thaliana)NF-YA3同源性最高，达到72％，与水稻(Oryza sativa)、大豆(Solanum lycopersicum)及小麦(Triticum aestivum)等的NF-YA同源性介于 39％-61％之间(表2)。

表1.ZmNF-YA13基因克隆所用引物

注：表1中横线标注的碱基序列为载体同源臂。

表2.ZmNF-YA13与其他高等植物NF-YA家族氨基酸同源性分析

实施例2玉米中ZmNF-YA13基因表达模式分析

本实验所用玉米材料品种为郑58。

用于研究胁迫处理的玉米处理方式：将玉米种子放置于65℃的水中，充分搅拌，待水至室温时，将种子置于潮湿避光处萌发，待种子萌发5天后，将玉米幼苗种植于装有等量石英砂的花盆中于恒温光照培养箱中培养条件为温度 24℃/20℃(昼/夜)，光周期16h/8h(昼/夜)，空气湿度60％。待玉米幼苗长至三叶一心期后选取长势一致的植株分别进行干旱、NaCl、Na₂CO₃、冷、ABA以及缺钾胁迫处理。本实验采用25％PEG6000处理24h的方法模拟自然干旱(图4A，图4

B)；用含有200mM NaCl的hoagland营养液浇灌用于盐胁迫诱导(图4C，图4D)；将玉米幼苗置于4℃的冰箱中用于低温胁迫处理(图4E，图4F)；用含有100μM ABA的hoagland营养液浇灌用于ABA胁迫处理(图4G，图4H)；用含有 50mmolNa₂CO₃的hoagland营养液浇灌用于碱胁迫诱导(图4K，图4L)；用不含钾的hoagland营养液浇灌用于诱导缺钾胁迫(图4I，图4J)。各处理均设三个平行，在处理后的第0h、1h、3h、6h、12h、24h取样，分别收集地上和地下部分并混合均匀，经液氮速冻后于-80℃冰箱中保存，用于后续RNA的提取。

用于研究不同组织器官的玉米材料种植于大连理工大学转基因试验基地的温室内。各个组织器官均设三个平行，在玉米散粉后第二天取其根、茎、叶、雄穗、花丝，待种子灌浆后取其种子，经液氮速冻后于-80℃冰箱中保存，用于后期RNA的提取。

提取的RNA反转录成cDNA，用于后续qPCR(实时定量PCR检测)实验，表3为qPCR过程中所用到的引物序列。其中以zma-miR172及ZmU6基因作为 qPCR内参(miR172-RT为zma-miR172特异性反转录引物，其他表内引物为 ZmNF-YA13、zma-miR172及ZmU6的上、下游引物)。

表3.ZmNF-YA13基因的qRT-PCR扩增引物

结果表明，相对于对照组，地上及地下部分中ZmNF-YA13均呈现不同程度的上调或下调表达(图4)。ZmNF-YA13在不同的组织器官中都有表达，且在雄穗、花丝和种子中表达量较高(图5)。

实施例3转ZmNF-YA13基因烟草的获得

(1)ZmNF-YA13基因植物表达载体构建

1)植物表达载体pTF101的获得：采用生工生物工程有限公司质粒小量提取试剂盒提取pTF101植物表达载体的质粒，具体方法见说明书。利用SmaI及 SpeI两种限制性内切酶对pTF101-35s植物表达载体进行双酶切反应，使其线性化，采用琼脂糖凝胶电泳对酶切后的产物检测，切下目标区域处的凝胶并用胶回收试剂盒进行回收纯化。

2)ZmNF-YA13编码区的获得：以反转录所得单链cDNA为模板，分别以 ZmNF-YA13-S及ZmNF-YA13-35S-A为正反向引物，扩增ZmNF-YA13基因编码区。利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，切下目标区域处的凝胶并用胶回收试剂盒进行回收纯化。

3)连接：利用无缝克隆试剂盒将回收纯化后的植物表达pTF101与 ZmNF-YA13基因编码区进行连接。

4)采用热激法将连接液转化大肠杆菌DH5α，PCR检测筛选出阳性克隆。

图6为重组植物表达载体PTF101-ZmNF-Y13的结构图谱，表明该基因可在 35S启动子的调控下组成型表达，重组载体具有除草剂抗性。

5)阳性重组质粒转化农杆菌：提取PTF101-ZmNF-YA13质粒，转化农杆菌EHA101感受态细胞。

①根癌农杆菌EHA101感受态细胞的制备方法如下：挑取EHA101单菌落于含有100mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，180 rpm振荡培养过夜。取过夜培养的菌体按1:100的比例接种到50mL YEB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养3-4h至细菌生长对数期OD₆₀₀＝0.5-0.6左右。取5mL菌液于4℃，4000rpm离心10min，沉淀用5mL预冷的TE(pH7.5)洗涤一次，加1mL新鲜的YEB培养基，重新悬浮，分装，-70℃保存。

②采用冻融法将质粒PTF101-ZmNF-YA13导入农杆菌，方法如下：取一管 (0.2mL)根癌农杆菌(Agribecterium tumefaciens)EHA101菌株感受态细胞置冰上融化，加入1μg质粒PTF101-ZmNF-YA13，混匀，然后依次在冰上、液氮中及37℃水浴中放置5min，用YEB液体培养基稀释至1mL，于28℃，180rpm 振荡培养2-4h；取适量菌液涂布于含有100mg/L利福平、50mg/L卡那霉素和 100mg/L壮观霉素的YEB平板培养基上，28℃培养36h左右长出抗性菌落，运用菌液PCR确定阳性克隆。

(2)叶盘转化法转化烟草

1)转化用烟草叶盘的制备：取生长二十天左右的无菌烟草叶片去除主脉，

用无菌剪刀将其剪成1cm²的小块作为侵染用外植体。

2)转化用农杆菌菌液的制备：将从-80℃冰箱中取出来的含有重组表达载体的农杆菌在固体的YEB培养基(YEB+100mg/L Rif+50mg/L Kan+100mg/L Spec)中进行划线培养。挑取生长状态良好的单菌落接种于5ml含有上述抗生素的YEB液体培养基中，28℃，180rpm过夜摇菌20h左右。将过夜活化的农杆菌按照1:50的比例加入到不含抗生素的液体YEB中，28℃振荡培养4～6h至 OD600约为0.5～0.6。

3)转化：将剪好的烟草叶片放入上述农杆菌菌液中5-10min，期间缓慢摇晃2-3次。侵染结束后将叶片置于无菌的滤纸上以吸干残余的菌液，远轴面向上置于分化培养基(MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L)上28℃暗培养2d。

4)抗性芽的筛选及转基因植株的生根培养：共培养两天后，叶盘周围会长

出清晰可见的农杆菌菌落，将其转移到含有双丙氨膦和头孢霉素的筛选培

养基上进行筛选，两周左右即可形成愈伤组织。将烟草愈伤组织转移到新

的筛选培养基上继续培养至长出幼芽，用灭菌手术刀切下1-2cm的幼芽，

置于生根培养基上进行生根培养(图7)。

实施例4干旱胁迫条件下转基因烟草的生理检测

将PCR检测为阳性的T₀代转ZmNF-YA13基因烟草L3和L4两个株系利用无性繁殖的方式进行扩繁，以获得足够的苗用于生理实验。将生长状态一致的 T₀代转基因烟草与野生型植株(WT)种植于花盆中，并置于恒温光照培养箱中进行缓苗培养，培养条件为25℃/23℃(昼/夜)，光周期16h/8h(昼/夜)，空气湿度60-70％，培养两周后进行干旱胁迫处理。挑选生长状态一致的烟草进行后续的干旱胁迫实验(图8A)。本实验采用苛扣浇水的方法模拟自然条件下的干旱，干旱处理前给所有植株浇以充足的水分，之后不再浇水。在干旱处理的7d后取样测定叶片相对含水量(RWC)、SOD酶活性、干重、鲜重以及根长等各项生理指标。为保证实验结果的准确性，各指标的测定均设有三个重复。

实验结果：干旱胁迫7d后，野生型植株出现了明显萎蔫现象，而转 ZmNF-YA13基因烟草L3和L4株系能够正常生长(图8B)。为进一步了解烟草叶片中水分的损失状况，本研究测定了干旱处理前后野生型及转基因烟草的 RWC。干旱处理之前野生型烟草及转ZmNF-YA13基因烟草L3和L4株系的叶片相对含水量并无显著差异，其相对含水量分别为80％、78％和81％，在干旱处理7d后，野生型、转ZmNF-YA13基因的烟草L3和L4株系的叶片相对含水量都有所下降，分别为65％、74％和73％，转基因植株的叶片相对含水量显著高于野生型植株(图8C)；在干旱处理前，野生型、转ZmNF-YA13基因的烟草 L3和L4株系叶片中SOD的活性分别为194U/g、188U/g和150U/g。野生型与转ZmNF-YA13基因烟草L3株系叶片中的SOD活性无明显差别，L4株系烟草叶片中SOD活性却显著低于野生型植株。干旱处理一周后，野生型、转 ZmNF-YA13基因的烟草L3、L4株系叶片中SOD活性较干旱处理前都有所提高分别为213U/g、288U/g和274U/g，且转ZmNF-YA13基因的烟草L3和L4株系叶片中SOD活性显著高于野生型植株(图8D)。植物根部生长可能与植物对干旱的耐受性相关。干旱处理一周后，野生型、转ZmNF-YA13基因烟草L3和 L4株系的根长分别为11.67±0.10cm、15.33±0.17cm和15.00±0.14cm，转基因植株的根长显著大于野生型植株的根长。植物干鲜重可以直观的反映出植物的生长状况。干旱处理一周后，转基因株系的干鲜重显著高于野生型植株(图8E)。

因此，上述实验结果表明在干旱胁迫下过表达ZmNF-YA13基因的烟草具有优于野生型植株的表型及生理特性，最终受到较少的伤害。

实施例5 ABA胁迫条件下转基因烟草的生根实验

将PCR检测为阳性的T₀代转ZmNF-YA13基因烟草L3和L4两个株系运用无性繁殖的方式进行扩繁，以获得足够的苗用于生理实验。将生长状态一致的 L3、L4及野生型烟草分别在含有3μM ABA的MS培养基中培养3周，进行生根实验。

实验结果：从转基因烟草的生根试验中可以看出，在ABA处理3周后，转基因烟草L3和L4的根系较野生型烟草株系更发达，且转基因烟草比野生型烟草的生长状态更好(图9)。

因此，该实验结果表明过表达ZmNF-YA13基因可能降低转基因烟草对ABA 的敏感性。

实施例6转基因烟草的K⁺耗竭实验

将PCR检测为阳性的T₀代转ZmNF-YA13基因烟草L3和L4两个转基因株系利用无性繁殖方式进行扩繁，以获得足够的苗用于生理实验。烟草在MS 培养基中培养3W后，分别选取大小和长势都一致的转基因阳性植株和野生型植株各3棵进行钾饥饿处理48h，饥饿液为缺钾的1/2HoagLand营养液以 NaH₂PO₄代替KH₂PO₄，以Ca(NO₃)₂代替KNO₃，饥饿处理后进行耗竭实验(图10A)。耗竭液为0.2mM CaSO₄+0.1mM KCl，每4h取一次样，耗竭时间为32h；饥饿和耗竭期间保持24h通气。将取出的耗竭液稀释10倍后用原子吸收方法测定耗竭液中钾离子浓度。

实验结果：随着时间变化，耗竭液中的的K⁺浓度逐渐下降。相对于野生型烟草(WT)，转基因烟草L3株系的耗竭液中K⁺浓度下降得更快，即K⁺被更高效地吸收(图10B)。

因此，实验结果表明过表达ZmNF-YA13基因可能提高转基因烟草的K⁺吸收能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 一种NF-Y类核转录因子基因ZmNF-YA13、其编码的蛋白及其应用

<120> 大连理工大学

<130> 2011

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1147

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agagcaggtt cgtttggcgg acgcaccgag ggagacgtgt gggagccatg cttcttccct 60

cttcgtcttc cgcttccgct tccgcttccg cttccaaagg taactccttt gggaaaaccg 120

ttaacgatca tctgaggtca actttgagtt ttgataacaa gcaacctcca tttgcaagtc 180

aaaactttga ctacggtcaa acaatagctt gcatttcata cccgtacaat cgttctagat 240

caggagatgt ttgggcagcc tatgagtcac gcaccagcac tgccactgtg ttccgttccc 300

aaattgctgg tgggggttca tccacaagaa ttcccttgcc tttggaatta gcagagaatg 360

aacccatata tgtgaatccc aaacaatatc acgggatact tcgcagaaga cagttacgtg 420

ccaagttaga ggttcagaac aagctagtca gagcccgaaa gccttacctt catgagtcta 480

ggcatcttca tgcaatgaag agggcacgag gttccggtgg acgattcctc aacactaagc 540

agctccagca gtctcacacc gccctcacca ggtccaccac cacaagtggc acaagctcct 600

caggctcaac tcatctgcgg cttggtggtg gcgcagccgc agctggagat cgatctgtgc 660

tggcacccaa aacaatggtc tcacaagaca gtagcaagaa ggccgtttct tcagccctcg 720

ccttcactgc gactccaatg ctgcgcagag atgacggctt cttgcagcac ccaagccatc 780

ttttcagttt ttctggtcat tttgggcagg caagcgcgca agctggcgtt cataatggaa 840

gtcagcatag ggttccagtt atgagatgac cggtttgcga accatagctg gtgatccagg 900

cgtctagggt caacttcgct gtggtgtctt agtctctcag gcaattcatc cttggcttaa 960

tttctggctt tttattagaa ggtaccaaaa tgtgttccat accgttgtgg ccacagagcc 1020

cataaaccag ggggtttgat ggttggcact cctacccaaa ctattgttgc agtggtgttt 1080

gttagaataa accttgacta ttattctgta caatttgcct ttatcttgta ctgccaaaaa 1140

aaaaaaa 1147

<210> 2

<211> 273

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

MLLPSSSSAS ASASASKGNS FGKTVNDHLR STLSFDNKQP PFASQNFDYG QTIACISYPY 60

NRSRSGDVWA AYESRTSTAT VFRSQIAGGG SSTRIPLPLE LAENEPIYVN PKQYHGILRR 120

RQLRAKLEVQ NKLVRARKPY LHESRHLHAM KRARGSGGRF LNTKQLQQSH TALTRSTTTS 180

GTSSSGSTHL RLGGGAAAAG DRSVLAPKTM VSQDSSKKAV SSALAFTATP MLRRDDGFLQ 240

HPSHLFSFSG HFGQASAQAG VHNGSQHRVP VMR 273

Claims

1.一种来源于玉米的NF-Y类核转录因子基因ZmNF-YA13，其特征在于，所述NF-Y类核转录因子基因ZmNF-YA13的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的来源于玉米的NF-Y类核转录因子基因ZmNF-YA13编码的蛋白质ZmNF-YA13，所述蛋白质ZmNF-YA13的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种含有权利要求1所述的来源于玉米的NF-Y类核转录因子基因ZmNF-YA13的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，其表达载体为pTF101。

5.一种含有权利要求3所述的重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为根癌农杆菌EHA101菌株。

6.如权利要求1所述的来源于玉米的NF-Y类核转录因子基因ZmNF-YA13在培育耐干旱、降低ABA敏感性和/或提高钾吸收功能转基因植物中的应用。