CN110468140A

CN110468140A - 一种调控番茄抗坏血酸合成的nfya基因及其应用

Info

Publication number: CN110468140A
Application number: CN201910774829.XA
Authority: CN
Inventors: 张余洋; 叶志彪; 郑伟; 张俊红; 陈卫芳; 张廷艳; 王涛涛; 欧阳波
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2019-11-19

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因及其应用。本发明利用AsA合成途径中其中一个重要基因GME1的启动子作为诱饵钓库做酵母单杂得到几个相关的转录因子，然后做点对点验证证明NF‑YA与GME1的启动子互作。本发明首次发现NFYA基因的表达能够调控番茄中抗坏血酸的合成，为后续调控番茄或相关作物中的抗坏血酸的合成提供理论指导。

Description

一种调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因及其应用。

背景技术

抗坏血酸(AsA)是植物中很重要的抗氧化分子，也是很多酶类的辅因子，而且也参与控制生物体细胞的分裂和生长。AsA是通过分解不正常的氧化代谢和逆境伤害等氧化胁迫产生的活性氧来保护植物的。活性氧是有毒物质的分子信号，活性氧必须快速地被控制以防止蛋白质被氧化，从而防止破坏细胞膜结构和功能的完整性。氧化胁迫对人体的疾病产生发挥很大的作用，但是这种氧化胁迫的影响可以通过从食物中摄取AsA(Giovannucci1999)来降低。因为人类和其他的灵长类的AsA生物合成途径的最后一步被阻塞。果实中高水平的AsA可以为人类提供高的营养价值(张薇2005；Hancock and Viola 2005；Naqvi etal 2009)，AsA在人体中可以预防坏血病、动脉粥样硬化、癌症、贫血和牙龈出血等症状(杜长城等2007)。除了对人体营养价值的作用，同时在植物生命的很多方面都发挥着很重要的作用。因此，提高作物中抗氧化剂的含量成为我们今后研究的一个重要方面。

抗坏血酸合成与代谢途径中的酶大部分已经被克隆报道，但是调控这些基因的转录因子却至今没有任何报道。

CCAAT-box是真核生物启动子上非常常见的一类顺式作用元件，NUCLEAR FACTORY(NF-Y)是一类由NF-YA，NF-YB，和NF-YC三个亚基组成的转录因子，CBFs是(NF-Y)中的NF-YA，而NF-YA有约56个氨基酸的结构域组成的两个螺旋(A1和A2)，A1和A2分别行使不同的功能：A1确保与其他的亚基结合，A2与特殊的DNA序列CCAAT结合。由NF-YA，NF-YB，NF-YC这三个家族的蛋白组成的异源三聚体可以结合DNA上的CCAAT位点。NF-Y转录因子(又名血红素结合蛋白〔HAPs〕和CCAAT box结合蛋白〔CBFs〕)是很多植物生长发育过程中的应急调控因子和逆境应答信号。NF-Y是有类组蛋白亚基特殊序列的转录因子。NF-YB和NF-YC这两个亚基包含有类似H₂B和H₂A的核心组蛋白(Baxevanis et al 1995；Zemzoumi et al 1999)，这两个亚基必须形成稳定的异源二聚体才能与NF-YA结合。而NF-YA通过某种机制特异的结合转录因子复合体(Dolfini et al 2012；Mantovani et al 1994)。在动物中，NF-YA在DNA上的结合会影响组蛋白特殊的翻译后修饰和改变染色质状态(Donati et al 2008；Gattaand Mantovani 2011)。NF-Y已经被作为转录因子的一个催化剂，但是也有报道指出其在抑制方面也有作用(German et al 2008；Leyva-González et al 2012)。与动物中单个的NF-Y基因发挥作用相比，在植物中，NF-Y是以多基因的家族形式编码(Edwards et al 1998).在拟南芥中有10个NF-YA、13个NF-YB、13个NF-YC亚基，更特别的是在二穗短柄草中(Brachypodium distachyon)中有36个NF-Y亚基(Cao et al 2011)。这些亚基在不同的发育过程中(Siefers et al 2009)和不同的环境响应机制(Des Marais et al 2012；Pant et al2009；Siefers et al 2009)有不同的表达模式，表明在不同的器官和不同的刺激下，只有一部分亚基组合组装形成NF-Y聚合物发挥作用。超量表达一个亚基可能足够影响NF-Y的功能，但其他的NF-Y也存在与同一个组织中，超量表达某一个NF-Y时，有很多表型能观察到，也不排除与某个亚基在正常条件下没有互作的亚基，在这种情况下会相互作用。由NF-YA，NF-YB，NF-YC这三个家族的蛋白组成的异源三聚体可以结合DNA上的CCAAT位点。在植物中，NF-Y家族庞大，可以形成更多的复合体形成的蛋白质结构更复杂，这样的转录因子系统可以使植物适应更多地环境变化。近年来，很多报道出现表明单个亚基在植物很多途径中发挥着很重要的作用，尤其是对于胚胎发育、花的开花时间调控以及抗旱信号等方面有很重要的调控作用，但是还没有对抗坏血酸调控相关报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因及其应用。

本发明是这样实现的，一种调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因，基因序列见SEQID NO.1。

进一步，NFYA基因能够与GME1启动子结合。

如上所述的调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因在调控番茄抗坏血酸含量方面的应用。

进一步，NFYA基因在番茄各组织中的表达量与其对应的抗坏血酸含量负相关。

进一步，所述应用表现为NFYA基因影响抗坏血酸合成途径相关基因的表达。

进一步，所述应用表现为NFYA基因影响抗坏血酸代谢途径相关基因的表达。

进一步，所述应用表现为NFYA基因影响抗坏血酸转运相关基因的表达。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明利用AsA合成途径中其中一个重要基因GME1的启动子作为诱饵钓库做酵母单杂得到几个相关的转录因子，然后做点对点验证证明NF-YA与GME1的启动子互作。

本发明首次发现NFYA基因的表达能够调控番茄中抗坏血酸的合成，为后续调控番茄或相关作物中的抗坏血酸的合成提供理论指导。

附图说明

图1是SlNF-YA转基因株系的表型观察；

图2是番茄不同组织中总抗坏血酸含量检测结果；

图3是番茄不同组织中SlNF-YA表达分析结果；

图4是SlNF-YA转基因株系叶片中AsA合成相关基因的表达分析；

图5是SlNF-YA转基因株系叶片中AsA代谢相关基因的表达分析；

图6是SlNF-YA转基因株系叶片中AsA转运相关基因的表达分析；

图7是超量转基因株系中SlNF-YA的表达分析；

图8是干涉转基因株系中SlNF-YA的表达分析；

图9是SlNF-YA超量转基因株系叶片AsA含量测定；

图10是SlNF-YA干涉转基因株系叶片AsA含量测定；

图11是GME1启动子的分析；

图12是不同的GME1启动子片段与SlNF-YA结合瞬时表达检测；

图13是NF-YA在酵母中的转录激活活性。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因及其应用，具体如下各实施例所示。本发明涉及的番茄(Solanum lycopersicum)材料：常规品系AC，用于基因的克隆以及遗传转化。SlNF-YA序列由茄科基因组数据库(https://solgenomics.net/)获取，该基因登录号为:Solyc01g006930。SlNF-YA基因序列见SEQ ID NO.1。

实施例1 SlNF-YA基因的表达

1.SlNF-YA超量表达载体的构建

超量表达载体的构建使用Primer 5设计基因全长引物后，在正、反向引物前加上B位点。SlNF-YA超量表达载体构建引物为Fw：AAAAAGCAGGCTATGAATACTACTATATTTTCC，见SEQID NO.2；Rv AGAAAGCTGGGTTCATACTTTGAGGTTGCAACAG，见SEQ ID NO.3。设计好的引物以番茄AC的cDNA为模板在PCR仪里扩增获得目的基因。PCR体系及程序分别见表1和表2。

表1.PCR扩增反应体系

表2.PCR的反应程序

将目的片段通过BP反应连在pDONR221中间载体上，其中BP反应体系：载体质粒1μL，目的片段3μL，BP酶0.5μL，25℃反应4h。构建载体过程使用Gateway试剂盒，具体方法参照Invitrogen公司的使用说明书。

连接产物按照标准热激方法热激后转入大肠杆菌，50mg/L Km抗性平板上筛选阳性单克隆，挑选单克隆在50mg/L Km抗性的液体LB中培养，在37℃200r/min摇床上培养10-15h。用M13的正向引物(引物序列为：TGTAAAACGACGGCCAGT，见SEQ ID NO.4)和基因的反向引物检测阳性，挑选阳性的单克隆测序验证。挑选序列正确的单克隆继续在50mg/L Km抗性的液体LB培养基震荡过夜后抽提质粒。质粒提取方法参照一般的试剂盒操作。

通过LR反应将目的片段连接在PMV3上，LR反应体系：PMV3载体1μL，目的基因质粒3μL，LR酶0.5μL，25℃下连接4h。连接产物通过热激法转入大肠杆菌，在50mg/L Spec抗性平板上筛选阳性单克隆，挑选单克隆在50mg/L Spec抗性的液体LB中培养，在37℃200r/min摇床上培养过夜。用35S的正向引物(引物序列为：TTCGCAAGACCCTTCCTCTA，见SEQ ID NO.5)和基因的反向引物检测阳性，挑选阳性单克隆使用50mg/L Spec抗性的液体LB培养基摇菌后抽提质粒。抽提质粒后用限制性内切酶XbaI和XhoI酶切检测。

酶切体系为：20μL体系，包括XbaI酶1μL，XhoI 1μL，10×buffer 2μL，质粒5μL，ddH₂O11μL，反应条件为37℃3小时。

结果正确的质粒可以利用电转仪1800V的电压下转入农杆菌感受态C58细胞中，在含Rif 100mg/L，Spec 50mg/L的LB固体平板筛选2-3天，挑选阳性克隆，28℃振荡培养12-18h，用35S和基因反向特异引物的反向检测阳性正确的单克隆菌液加50％甘油保存在﹣70℃的冰箱里，用于番茄的遗传转化。

2.SlNF-YA干涉表达载体的构建

利用软件和网站对目的基因进行分析，避开基因的保守结构域，选择300bp的片段进行RNAi抑制表达。使用Primer5设计干涉引物后，在正、反向引物前加上attB位点。SlNF-YA干涉载体引物序列为：Fw：TTCTGATGAAGGTCCGATATTC，见SEQ ID NO.6；RvCTATCAGACTGCAGCACTTCAG，见SEQ ID NO.7。attB位点序列为：attB-FwGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT，见SEQ ID NO.8；attB-RvGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT，见SEQ ID NO.9。以番茄常规系AC的cDNA为模板扩增干涉片段。PCR体系如表1。PCR程序如表3。

表3.PCR的反应程序

将扩增的目的片段通过BP反应连在干涉表达载体pHellsgate2上(BP反应体系：载体质粒1μL，目的片段：3μL，BP酶0.5μL，25℃反应4h)。

连接产物热击后转入大肠杆菌，50mg/L Spec抗性平板上筛选阳性单克隆，挑选单克隆在50mg/L Spec抗性的液体LB中培养，在37℃200r/min摇床上培养12-15h。用35S正引物和基因的反向引物检测阳性，挑选阳性的单克隆测序验证。挑选序列正确的继续在单克隆使用50mg/L Spec抗性的液体LB培养基摇菌后抽提质粒。抽提质粒后用限制性内切酶XbaI和XhoI酶切检测，酶切体系为：20μl体系，包括XbaI酶1μl，XhoI 1μl，10×buffer 2μl，质粒5μl，ddH₂O 11μl，反应条件为37℃3小时。结果正确的质粒可以利用电转仪在1800V的电压下转入农杆菌感受态C58细胞中，用含Rif 100mg/L，Spec 50mg/L的LB固体平板筛选2-3天，然后挑选阳性克隆，28℃振荡培养15-18h，用35S和反向特异引物(引物序列为：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTATCAGACTGCAGCACTTCAG，见SEQ ID NO.10)检测阳性，之后保存菌液。

3.本发明构建的SlNF-YA的超量以及干涉的表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将载体转入番茄的常规品系Ailsa Craig中，方法参照：欧阳波博士学位论文，华中农业大学，2003，对获得的转基因株系用35S和特异引物阳性检测后证明表达载体已导入番茄基因组中。对转基因株系的表型观察结果见图1，其中，A：超量转基因株系的花；B：干涉转基因株系的花；C：对照AC的花枝；D：超量转基因株系的花枝；E：干涉转基因株系的花枝。

4.SlNF-YA转基因植株的表达量分析

为了分析SlNF-YA的组织表达谱，转基因植株中目标基因的表达情况以及与AsA代谢途径相关基因的表达量变化，采用real-time RT-PCR方法进行检测。real-time RT-PCR所用引物经Primer 5软件设计，序列为Fw:ATTCAGGCTGCTTCCTCTGT，见SEQ ID NO.11；Rv:AACCCACATAACTCCGGTGA，见SEQ ID NO.12。提取RNA方法参照Invitrogen公司TRIzol试剂盒使用说明书。用无RNA酶的DNase I，37℃处理1h，以便去除RNA中存在的DNA，加入EDTA终止DNase I的作用。经MLV酶(Toyobo)反转录后合成第一链cDNA。Real-time RT-PCR的分析利用罗氏荧光定量PCR仪LightCycler 480Real-time PCR测定其相对表达量。反应程序为预变性在95℃下5min，95℃变性5s，58℃复性15s，72℃延伸20s，循环次数40。反应产物由LightCycler 480Real-time PCR检测系统进行定量分析。

SlNF-YA的组织表达谱分析结果如图2和图3所示，SlNF-YA在番茄的根、茎、叶、花以及果实的各个生长发育时期都成组成型表达，而根中的表达量最高，叶片中的表达量最低。随着果实的发育，各个时期的表达量由高降低。而对各组织中AsA的测定发现，各组织中AsA含量差异较大，在根中含量最低，而在叶片中含量最高。随着果实的发育，AsA含量却呈现逐渐增加的趋势，而红熟时期达到最高。因此，SlNF-YA在各组织的表达量与其对应的AsA含量之间存在一定的负相关性。番茄抗坏血酸含量测定方法由公开发表文献(Hu et al.,2016Plant Journal)获取。

对转基因株系叶片中与AsA合成、代谢、转运相关的基因的表达量分析结果如图4-6所示，超量和干涉转基因株系与AsA合成、代谢、转运相关的基因表达量有的有所升高，有的有所下降，这也可能是造成其总AsA含量没有变化的原因。

利用q-PCR检测了部分转基因植株中目标基因SlNF-YA的表达情况，结果如图7和图8所示，表明超量表达株系中目标基因表达量显著提高，SlNF-YA干涉转基因株系中目标基因表达被显著抑制。q-PCR检测方法由公开发表文献(Ye et al.,2017,Plant Cell)获取。

应用酶标仪法对T0代转基因株系叶片中AsA的含量进行了测定，结果如图9和图10所示，结果表明，无论是超量还是抑制SlNF-YA的表达，转基因株系叶片中总的AsA与对照相比变化不是很明显，但是超量转基因株系中还原型的AsA与对照相比显著性的下降，而干涉转基因株系中的还原型AsA含量与对照相比显著升高。酶标仪测定抗坏血酸含量方法由公开发表文献(Hu et al.,2016Plant Journal)获取。

实施例2 SlNF-YA与GME1结合瞬时表达分析

瞬时表达实验(Hellens et al 2005b)用于验证转录因子NF-YA与启动子GME1是否结合以及结合位点。SlNF-YA上有与CCAAT结合的结构域，GME1启动子分析结果见图11，其中，“方框”代表CCAAT-box；“P”代表启动子。分析启动子GME1发现其有四个CCAAT位点。通过PCR扩增克隆的方法将启动子的不同CCAAT位点区域扩增出来，连接至pEASY-Blunt中，通过测序验证阳性克隆。将正确的阳性克隆质粒通过限制性内切酶KpnI/NotI酶切法连接到pGreenII 0800-LUC上。

PCR体系及反应程序见表1、表2。pEASY-Blunt载体连接体系为：扩增目的片段3μl,pEASY-Blunt 1μl，反应程序为：25℃15min。双酶切体系为：20μl体系，包括KpnI酶1μl，NotI1μl，10×buffer 2μl，质粒5μl，ddH₂O 11μl，反应条件为37℃3小时。pGreenII 0800-LUC连接体系为：酶切片段5.5μl,pGreenII 0800-LUC 2.5μl,T4连接酶1μl,T4连接buffer 1μl，连接条件22℃2h。

根据茄科基因组数据(https://solgenomics.net/)基因序列Solyc01g006930，克隆出SlNF-YA基因片段，扩增引物为：Fw-ATGAATACTACTATATTTTCC，见SEQ ID NO.13；Rv-TCATACTTTGAGGTTGCAACAG，见SEQ ID NO.14。将转录因子NF-YA克隆至pGreenII-62-SK上。将含有不同启动子片段的载体pGreenII 0800-LUC和含有SlNF-YA的pGreenII-62-SK载体分别导入农杆菌。基因克隆与连接等分子操作方法由公开文献《分子克隆实验指南(第四版)》(科学出版社,2017,J.萨姆布鲁克、M.R.格林著，贺福初译)获取。

农杆菌转化具体方法如下：

试剂：0.5MES(pH＝5.6)、10mM MgCl₂、100mM乙酰丁香酮(As)。取单克隆1mL LB(Km+Rif)，28℃培养24h。然后接种50μL农杆菌菌液于5mL LB(5mL LB+100μL 0.5Mm MES+2μL100Mm As)，28℃，250r/min，条件下培养12-18h，菌液OD₆₀₀约为1.0。4000r/min条件下离心10min倒掉上清，加10mM MgCl2重悬至OD₆₀₀约为1.0。每毫升菌液加2μL 100mM As静置3h以上。最后以(0800-Luc+转录因子)：(62-sk+启动子)＝1:9的比例注射烟草。

注射烟草瞬时表达的结果如图12，结果验证了SlNF-YA与GME1启动子可以结合并发挥作用。

实施例3 NF-YA在酵母中的转录激活分析

通过PCR的方法扩增获得SlNF-YA的编码序列。SlNF-YA片段扩增获取方法同实施例2中所述。SlNF-YA连接到pEASY-Blunt中间载体测序后，通过限制性内切酶NcoI/SalI酶切后连接到具有GAL4 DNA结合结构域的载体pGBKT7上，得到pGBKT7-SlNF-YA融合载体，抽取质粒后连同阴性对照pGBKT7，阳性对照pGBKT7-53+pGADT7-RecT一起转化到酵母菌株AH109中，在SD/-Trp的培养基上培养3-5天。阳性对照载体由酵母双杂交系统试剂盒(Clontech公司)_获取，实验方案参照Clontech说明书。挑选较圆的酵母菌落PCR检测后，挑取阳性克隆在20uL无菌水中悬浮，分别在酵母缺陷型培养基SD/-Trp，SD/-Ade/-Trp，SD/-His/-Trp和SD/-Ade/-His/-Trp上划线，于30℃培养2-3d，并且观察菌落生长状态。PCR体系和程序见表1和表2。PCR检测引物为T7:TAATACGACTCACTATAGGGCGA；Rv:TCATACTTTGAGGTTGCAACAG。

其中，pEASY-Blunt连接方案、双酶切体系和条件、连接实验方案同实施例2所述。具体操作指南参考公开文献《分子克隆实验指南(第四版)》(科学出版社,2017,J.萨姆布鲁克、M.R.格林著，贺福初译)。

对SlNF-YA的自激活活性的验证结果如图13所示，其中，1”代表pGBKT7-53+pGADT7-T；“2”代表PGBKT7+slNF-YA；“3”代表PGBKT7结果表明SlNF-YA在酵母中没有自激活活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1576

<212> DNA

<213> SlNF-YA(SlNF-YA)

<400> 1

gaaggctata tttcattggt cattgccatg taattccaat tttttttcca cttgtaaatc 60

attctgttgc cttctctctc tctctttctt ctctccctct gctagaaatt gtactgacat 120

ggctgctact aaatggggtt tctctaattg actgtacaat cacacaaagc ttaaagtttt 180

catcttggta caactattac ttcactagga acataattcc tttagatttt caagagaaaa 240

ggtgtgagtt gctcttgtat aaccatgaat actactatat tttccaaagg aaatgaacgg 300

gttgtccaga atcaatctgt tggaacattg tgctctgctc cttggtggag taatggtttt 360

atgtctcaat ctgtggctta tgctgagcct tttggacaat tgaaatctgc atctgtggag 420

cagcagccta aggggaatgc aacagagttc actatttcct ctggtgattg caaatcttcg 480

gcaaatgggc aaaaacttcc gaacattcag gctgcttcct ctgttcgtgc agctaatatg 540

gactatcgag gtcactttga gctaggtttt ggtcagtccc tgatttatgc aaaacatcct 600

tatggagagc aatgcattgg gttattttcg gcttatgctc ctcaactttc gggccgcatt 660

atgctaccat tgaatttggc ttctgatgaa ggtccgatat tcgtaaatgc caagcagtat 720

catgggatac taaggcgtcg aaagaccagg gctaaggaaa tggagaaaaa agctcttaaa 780

ccacgcaagc cgtacttgca cctctctcgc catctccatg ctttgcgccg acctaggggc 840

tgtggtggtc gtttcttgaa cacaaggaat atgaatggaa ctatgaaggc tggaaaaacc 900

aacaatatgt tcaagacagg cgatgttcaa aacttttacc ccaccggatc ccagaattct 960

gaagtgctgc agtctgatag cagcaatttg agctcaccaa aagaaacatc tggcagtagg 1020

ttcttcgatt catcaggggt cgctaacatg tactctagtg acaatcttga tccttttctg 1080

ttccaaaacc tgaggcctcc ggtccaggca ataccggaca tgatgaatac tggacacggt 1140

attttcgtgt ctggtaagtg ggtttgcaca gcagatagct gttgcaacct caaagtatga 1200

tagccttggc ttgagaaaga ggtcaggtgt cacgagttga gcctcacctc atccgtgcta 1260

caacctaatg catacacatt tggttgctgc aattgccgga ccatccttgg ctatcatggg 1320

cagttcatcc ttggcttagc attaacgcgg tgcctatatc gttctattgc tatcaagcaa 1380

cgtggatggt aagaggcact aaagccttaa tgctacttta ttttcagcac tttgttggat 1440

aaataagctt gttttcgatg agatgatgac gatgacgacc ctgtcgatcg ggggtctctg 1500

atgttgcagt gtgtttggat tactgttttg tgatgttggt ttgtgaaaac tacaatgatg 1560

tatgattgaa cttgat 1576

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(SlNF-YA-F)

<400> 2

aaaaagcagg ctatgaatac tactatattt tcc 33

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(SlNF-YA-R)

<400> 3

agaaagctgg gttcatactt tgaggttgca acag 34

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(M13-F)

<400> 4

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(35S-F)

<400> 5

ttcgcaagac ccttcctcta 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(SlNF-YA-Fw)

<400> 6

ttctgatgaa ggtccgatat tc 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(SlNF-YA-Rv)

<400> 7

ctatcagact gcagcacttc ag 22

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(attB-Fw)

<400> 8

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(attB-Rv)

<400> 9

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(F)

<400> 10

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tatcagactg cagcacttca g 51

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(RT-PCR-SlNF-YA-F)

<400> 11

attcaggctg cttcctctgt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(RT-PCR-SlNF-YA-R)

<400> 12

aacccacata actccggtga 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(PCR-SlNF-YA-F)

<400> 13

atgaatacta ctatattttc c 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(PCR-SlNF-YA-R)

<400> 14

tcatactttg aggttgcaac ag 22

Claims

1.一种调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因，基因序列见SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因，其特征在于：NFYA基因能够与GME1启动子结合。

3.如权利要求1或2所述的调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因在调控番茄抗坏血酸含量方面的应用。

4.根据权利要求3所述的调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因在调控番茄抗坏血酸含量方面的应用，其特征在于：NFYA基因在番茄各组织中的表达量与其对应的抗坏血酸含量负相关。

5.根据权利要求3所述的调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因在调控番茄抗坏血酸含量方面的应用，其特征在于：所述应用表现为NFYA基因影响抗坏血酸合成途径相关基因的表达。

6.根据权利要求3所述的调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因在调控番茄抗坏血酸含量方面的应用，其特征在于：所述应用表现为NFYA基因影响抗坏血酸代谢途径相关基因的表达。

7.根据权利要求3所述的调控番茄抗坏血酸合成的NFYA基因在调控番茄抗坏血酸含量方面的应用，其特征在于：所述应用表现为NFYA基因影响抗坏血酸转运相关基因的表达。