CN116463373A - BpNAC9蛋白在调控白桦耐盐碱性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及BpNAC9蛋白在调控白桦耐盐碱性中的应用。所述BpNAC9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述BpNAC9蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将所述BpNAC9蛋白的编码基因构建至表达载体上，然后用得到的重组表达载体转化农杆菌，并用转化的农杆菌侵染白桦组培苗，可以得到耐盐碱性提高的白桦。本发明为培育高抗的林木品种提供了宝贵的基因资源。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及BpNAC9蛋白在调控白桦耐盐碱性中的应用。
背景技术
植物在生长发育的各个阶段均面临着各种压力，主要包括由竞争和感染引起的生物胁迫以及包含极端温度和盐碱旱等不利条件的非生物胁迫。这些不良因素可能会影响植物的生长，甚至导致植物的死亡。为了应对这些不良环境的影响，植物通过调控激素信号和相关基因的表达来抵抗各种外界压力。转录因子(Transcription factors,TFs)是一种能够与DNA特异结合，并通过促进或抑制转录来调节基因表达的蛋白质，在控制植物的基因表达中发挥着重要作用。转录因子作为关键的分子开关，通过调节基因的开启和关闭，使植物能够承受恶劣的条件，并调控植物的发育过程以应对各种胁迫压力。
NAC转录因子(NAM，ATAF 1/2和CUC 2)是最大的植物特异性转录因子家族之一。植物NAC转录因子在N端区域包含一个高度保守的DNA结合结构域(约150个氨基酸)，称为NAC结构域；在C端区域含有一个可变的转录调节结构域，称为NAC转录调控区。NAC转录因子参与了植物的各种生长发育过程，包括叶片衰老、次生壁形成、侧根发育、芽顶端分生组织发育、花发育、植物激素信号传导和细胞分裂，并且响应多种生物及非生物胁迫。迄今为止，已在不同种植物中鉴定出大量的NAC转录因子，其中拟南芥含有113个NAC、烟草有154个、水稻含有170个、小麦含有263个、高粱含有131个、番茄含有101个、毛果杨含有169个NAC家族成员。
白桦(Betula platyphylla)属桦木科桦木属，其主要分布于我国的华北、东北、西北等14个省市地区，是一个北温带广布树种。其为喜光的速生树种，耐湿、耐寒、耐瘠薄土壤，种子小而产量高，白桦的形态优美，具有较高的观赏价值，也是很好的城市绿化用材。树皮可提取栲胶和用为人造纤维原料，也可入药，有清热利湿，祛痰止咳，解毒消肿的功效。白桦是拓荒的先锋树种，可在采伐后的荒山或火烧迹地上快速生长，庇护生长较慢的植物。具有全球范围内的广阔的发展前景。目前，白桦已经被列为国家科技攻关研究对象之一。环境条件恶化会对林木的生长造成影响，因此培育高抗的林木品种是林业生产中亟待解决的关键问题，其对生态环境的修复、森林功能的提升以及生态安全建设都起着重要的支撑作用。
发明内容
本发明的目的之一是提供BpNAC9蛋白在调控白桦耐盐碱性中的应用，所述BpNAC9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，通过使白桦过表达BpNAC9蛋白实现白桦耐盐碱性的提高。
本发明的目的之二是提供所述BpNAC9蛋白的编码基因或含有所述编码基因的生物材料在调控白桦耐盐碱性中的应用，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，通过使白桦包含所述编码基因或含有所述编码基因的生物材料实现白桦耐盐碱性的提高。
进一步的，所述生物材料包括基因表达盒、表达载体或宿主细胞。
本发明的目的之三是提供一种调控白桦耐盐碱性的方法，包括如下(a)和/或(b)：
(a)使白桦包含BpNAC9蛋白的编码基因或含有所述编码基因的生物材料；
(b)使白桦过表达BpNAC9蛋白；
所述BpNAC9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，通过将BpNAC9蛋白的编码基因转入白桦使白桦包含BpNAC9蛋白的编码基因和/或使白桦过表达BpNAC9蛋白。
更进一步的，通过将BpNAC9蛋白的编码基因转入白桦使白桦包含BpNAC9蛋白的编码基因和/或使白桦过表达BpNAC9蛋白。
更进一步的，将所述BpNAC9蛋白的编码基因构建至表达载体上，然后用得到的重组表达载体转化农杆菌，并用转化的农杆菌侵染白桦组培苗，得到耐盐碱性提高的白桦。
更进一步的，所述表达载体包括pROKⅡ。
更进一步的，所述农杆菌包括根癌农杆菌EHA105。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
现有技术一般采用一个功能基因改良林木的遗传品质，而转录因子是调控胁迫响应基因表达的分子开关，相比功能基因，转录因子可以调控逆境中多个相关基因的表达，可以使遗传品质得到更好的提升，被认为是利用基因工程改良植物抗逆性的优良候选。因此，在本发明中，利用NAC转录因子来增强白桦的耐盐碱能力，是一种更有效的改良植物耐盐碱能力的方法。
附图说明
图1为BpNAC9转基因白桦在盐胁迫下DAB染色结果。
图2为BpNAC9转基因白桦在盐胁迫下NBT染色结果。
图3为BpNAC9转基因白桦在盐胁迫下Evans blue染色结果。
图4为BpNAC9转基因白桦在盐胁迫下超氧化物歧化酶(SOD)活性测定。
图5为BpNAC9转基因白桦在盐胁迫下过氧化物酶(POD)活性测定。
图6为BpNAC9转基因白桦在盐胁迫下总蛋白浓度的测定。
图7为BpNAC9转基因白桦在盐胁迫下H2O2含量的测定。
图8为BpNAC9转基因白桦在盐胁迫下相对电导率的测定。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
1白桦BpNAC基因的克隆与序列分析
1.1从白桦(Betula platyphylla)中克隆获得NAC基因，命名为BpNAC9基因，BpNAC基因cDNA全长744bp，基因序列如SEQ ID NO.2所示，编码247个氨基酸，氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2瞬时转BpNAC9基因白桦的获得和耐逆性鉴定
2.1根据BpNAC9基因序列设计引物，在其上、下游分别引入Sma I酶切位点，引物序列分别为：
F(SEQ ID NO.3)：5′-GACTCTAGAGGATCCCCGGGATGGAGGAATT CGCACC-3′；
R(SEQ ID NO.4)：5′-ATTCGAGCTCGGTACCCGGGTTAAAGCCAATT CAGTTGT-3′；
以白桦cDNA进行PCR扩增获得BpNAC9基因编码区序列。
PCR反应体积为20μL，反应体系为：
PCR反应程序：
将扩增产物经琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(OMEGA)纯化后，具体操作步骤同试剂盒说明书,产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测回收质量。
2.2过表达载体pROKⅡ-BpNAC9的构建
含有pROKⅡ空载质粒的大肠杆菌为实验室保存，使用质粒小提试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行pROKⅡ质粒提取，具体操作步骤同试剂盒说明书。产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取质量。
使用Sma I(Promega)核酸内切酶对pROKII载体质粒进行酶切以及纯化回收，酶切反应体系如下：
反应条件：25℃4h
酶切产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用纯化回收试剂盒(OMEGA)对样品进行纯化回收，具体操作步骤同试剂盒说明书。
将基因与用Sma I(Promega)酶切的pROKII载体同源连接。连接体系如下：
连接产物转化大肠杆菌Top10菌株，具体步骤如下：
(1)吸取5μL连接液加入感受态细胞，混匀，冰浴30min。
(2)42℃水浴60-90s，冰浴2min。加入400μL新鲜LB液体培养基，37℃，220rpm，震荡培养1h。
(3)4000rpm，离心1min。弃掉300μL上清液。重悬菌体，涂布于kan抗性筛选培养基。37℃倒置培养12-24h。
鉴定阳性克隆，挑取单克隆于液体筛选培养基扩繁，吸取菌液作为模板，使用载体引物进行菌液PCR检测，反应体系如下：
PCR反应程序：
95℃1min
72℃后延伸7min
PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，阳性克隆送测序，将测序正确的菌株震荡培养，提取质粒备用。
经PCR验证和测序鉴定正确后，将重组的质粒(pRokII-BpNAC9)用电击法转入根癌农杆菌EHA105菌株中，具体操作步骤如下：
(1)将1.0μg重组质粒加入农杆菌感受态细胞中，混匀后转移至干净的电击杯中。
(2)使用1750V电压电击后向电击杯中加入400μL LB培养基，混匀。
(3)混匀后的培养基，转移至1.5mL离心管中，28℃220rpm振荡培养1h。
(4)吸取200μL菌液涂布于筛选培养基中，28℃倒置培养2天。
(5)随机挑取菌点扩繁培养，载体引物进行菌液PCR检测。1％琼脂糖凝胶电泳检测，选取阳性克隆，作为工程菌株备用。
2.3为了进一步在生理学上研究转BpNAC9基因对抗逆的调控，利用高效瞬时侵染技术以pROkⅡ-35S为对照瞬时侵染野生型白桦一个月的组培苗，并放入分别含有200mMNaHCO3的溶液中进行胁迫处理，取胁迫后植株用于各种化学染色及生理指标检测，具体操作如下：
2.3.1瞬时侵染白桦组培苗
将pROKⅡ-BpNAC9和pROkⅡ-35S的农杆菌菌种在的LB固体培养基(含25mg/L Rif和50mg/L Kan)上划线分离，28℃倒置培养48h；
挑取携带农杆菌单菌落于5ml LB液体培养基中(含有25mg/L Rif和50mg/L Kan)，28℃过夜震荡培养；
(3)取过夜培养的菌液1ml，加入到50ml LB液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养，至对数生长后期，OD600约为0.5；
(4)5000rpm，常温离心10min，弃上清液，收集菌体
(5)加入50ml的1/2MS(含150μM的AS)液体培养基，用移液枪反复吹打菌体使之重悬；
(6)28℃，220rpm震荡培养1h。
(7)将白桦组培苗放到上述配好的菌液中，22-25℃条件下，转速为120rpm慢摇12h。
2.3.2瞬时侵染后白桦植株的生化染色及生理指标检测
(1)DAB染色：
分别取未胁迫处理和胁迫处理6h的实验组及对照组白桦叶片，置于离心管中，加入DAB染色液，室温染色过夜。染色结束后，用75％乙醇与5％甘油煮沸脱色。
细胞中H2O2释放出的氧离子能够氧化DAB，形成棕色沉淀，根据染色的深浅，能判断细胞中H2O2释放量的多少，细胞受损伤越严重，H2O2释放的越多。分别取未胁迫处理和胁迫处理6h的实验组和对照组白桦叶片进行DAB染色，染色结果如图1。
在非胁迫生长条件下(control)，实验组植株以及对照组植株叶片颜色较浅，且相互之间无明显差异，说明H2O2含量大致相同；在NaHCO3非生物胁迫条件下，实验组以及对照组植株叶片上的颜色发生明显的变化。转NAC9基因的植株叶片上的颜色比对照组白桦叶片上的颜色浅，表明实验组植株叶片内的H2O2的含量较对照组白桦植株叶片内的H2O2含量少，说明转NAC9基因株系受胁迫之后的损伤程度低。实验结果证明NAC9基因在白桦植株体内起抗逆作用。
(2)NBT染色：
分别取未胁迫处理和胁迫处理6h的实验组及对照组白桦叶片，置于离心管中，加入NBT染色液，室温染色过夜。染色结束后，用75％乙醇与5％甘油煮沸脱色。
NBT染色结果可以用来检测植物中超氧阴离子(O2-)的含量，根据染色的深浅，能判断细胞中超氧阴离子(O2-)的多少，细胞受损伤越严重，超氧阴离子(含量O2-)越多。分别取未胁迫处理和胁迫处理6h的实验组和对照组白桦叶片进行NBT染色，染色结果如图2。
在非胁迫生长条件下(control)，实验组植株以及对照组植株叶片颜色较浅，且相互之间无明显差异，说明超氧阴离子(O2-)含量大致相同；在NaHCO3非生物胁迫条件下，实验组以及对照组植株叶片上的颜色发生明显的变化。转BpNAC9基因的植株叶片上的颜色比对照组白桦叶片上的颜色浅，表明实验组植株叶片内的超氧阴离子(O2-)的含量较对照组白桦植株叶片内的超氧阴离子(O2-)含量少，说明转BpNAC9基因株系受胁迫之后的损伤程度低。实验结果说明BpNAC9基因能够正向调控植物的抗逆功能。
(3)Evans blue染色：
分别取未胁迫处理和胁迫处理6h的实验组及对照组白桦叶片，置于离心管中，加入Evans blue染色液，抽真空半小时，保持真空状态染色过夜。染色结束后，用75％乙醇与5％甘油煮沸脱色。
Evans blue染色液可以进入死细胞，并将其染成蓝色，根据染色的深浅，能判断细胞中死细胞的多少，细胞受损伤越严重，死细胞越多。分别取未胁迫处理和胁迫处理6h的实验组和对照组白桦叶片进行Evans blue染色，染色结果如图3。
在非胁迫生长条件下(control)，实验组植株以及对照组植株叶片颜色较浅，且相互之间无明显差异，说明死细胞数量大致相同；在NaHCO3非生物胁迫条件下，实验组以及对照组植株叶片上的颜色发生明显的变化。转BpNAC9基因的植株叶片上的颜色比对照组白桦叶片上的颜色浅，表明实验组植株叶片内的死细胞的数量较对照组白桦植株叶片内的死细胞数量少，说明转BpNAC9基因株系受胁迫之后的损伤程度低。实验结果证明BpNAC9基因能提高白桦植株的抗逆能力。
(4)超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(试剂盒法)：
准确称取植物组织(0.2～0.5g)，按重量(g)：体积(ml)＝1：4的比例，加入四倍体积的匀浆介质，剪碎，冰水浴条件下进行匀浆，制备成20％的匀浆液，3500rpm，离心10分钟，取上清液待测，具体操作步骤如下表1所示：
表1SOD活性测定操作步骤
混匀，室温放置十分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，双蒸水调零，读数。
结果计算：
*即为反应体系中的稀释倍数
SOD可以催化超氧阴离子自由基的歧化反应，抵抗活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的损伤，从而提高植物的抗逆能力，测定结果如图4。
在NaHCO3的非生物胁迫条件下，BpNAC9基因的过表达瞬时侵染植株的SOD活性高于对照，说明瞬时侵染后过表达植株的抗逆境胁迫能力比对照植株强。实验结果表明BpNAC9基因能够正向调控SOD活性。
(5)过氧化物酶(POD)活性测定(试剂盒法)：
1)前处理：
含水量高的嫩叶植物组织匀浆液的制备：取植物组织擦净水分及杂质，准确称取植物组织重量，按照重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例加入9倍体积的匀浆介质(推荐使用生理盐水或磷酸盐缓冲液：0.1mol/L pH7～7.4)，冰水浴条件下制备成10％的组织匀浆液，3500rpm离心10分钟后，取上清液进行测定。
含水量较低的干燥植物组织匀浆液的制备：取植物组织擦净水分及杂质，剪碎后放入研钵，加入液氮，研磨成粉状后转移出来，然后准确称取重量，按照重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例加入9倍体积的匀浆介质(推荐使用生理盐水或磷酸盐缓冲液：0.1mol/L pH＝7～7.4)，漩涡混匀抽提3-5分钟后，3500rpm离心10分钟，取上清液进行测定。
2)具体操作步骤如下表2所示：
表2POD活性测定步骤
混匀，11000rpm离心10分钟，取上清于420nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测定。
结果计算：
定义：在37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化1ug底物的酶量定义为一个酶活力单位。
计算公式：
在过氧化物酶(POD)催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，过氧化物酶是植物体内降低氧自由基伤害的重要保护酶，和植物的抵御逆境胁迫能力紧密相关，实验结果如图5。
在非胁迫条件下(control)，实验组和对照组白桦株系的POD活性大致相同；在NaHCO3的非生物胁迫条件下，实验组及对照组白桦株系的POD活性发生了变化。过表达BpNAC9基因的瞬时侵染株系的POD活性高于对照，说明实验组植株的抵御逆境胁迫能力比对照强。结果说明BpNAC9基因的表达量与POD的酶活正相关，说明其能够通过调控植物体内的抗氧化酶活性来提高植物的抗逆能力。
(6)蛋白浓度的测定(试剂盒法)：
1)前处理：
称取为0.1g的白桦植物组织，液氮条件下研磨成粉，按照重量(g)：体积(mL)＝1：9的比例加入生理盐水，10000rpm离心10分钟后，取上清液。然后用生理盐水按1：9的比例稀释成1％的组织匀浆，作为待测液。
具体操作步骤如下表3所示：
表3蛋白浓度测定步骤
充分混匀，静置10分钟，于波长595nm处，光径1cm，蒸馏水调零，测定各管吸光度值。
结果计算：
植物体内的可溶性蛋白质大多是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标，植物体内蛋白的含量多少可以反映出植物抗逆境胁迫的能力，在逆境胁迫下，植物抵抗逆境的能力越强，其总蛋白含量就越高，实验结果如图6所示。
如图所示，在NaHCO3的非生物胁迫条件下，实验组及对照组白桦株系的蛋白浓度发生了变化。过表达BpNAC9基因的瞬时侵染株系的蛋白浓度高于对照，说明实验组植株的抵御逆境胁迫能力比对照强。结果说明过表达BpNAC9基因与植物的抗逆能力正相关。
(7)H2O2含量的测定(试剂盒法)
准确称取组织重量，按照重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例，加入9倍体积的0.9％的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，1000rpm离心10分钟，取上清10％匀浆待测。具体操作步骤如下表4所示：
表4H2O2含量测定步骤
结果计算：
H2O2作为活性氧，在生物体内普遍存在，更是活性氧之间转化的重要枢纽。在众多氧化代谢产物中，H2O2会使细胞衰老和解体这一过程加速，其原理是其能够对细胞膜产生损害，并直接或者间接使生物大分子氧化，在逆境胁迫下，植物抵抗逆境的能力越强，体内积累的H2O2含量就越低，实验结果如图7所示。
如图所示，在NaHCO3的非生物胁迫条件下，实验组及对照组白桦株系的H2O2浓度发生了变化。过表达BpNAC9基因的瞬时侵染株系的H2O2浓度低于于对照，说明实验组植株的抵御逆境胁迫能力比对照强。结果说明过表达BpNAC9基因能够提高植物抗逆能力。
(8)相对电导率的测定：
取瞬时侵染后3-5片、大小一致的新鲜叶片，依次用双蒸水和超纯水冲洗3次，滤纸吸干表面水分，放于50mL的离心管中。加入超纯水30mL，真空泵抽15min，用电导仪测其电导值，记为S1；然后将离心管于90℃恒温水浴锅中水浴20min，然后冷却至室温，测其电导值，记为：S2。
结果计算：相对电导率＝S1/S2*100％
植物叶肉相对电导率是反应植物细胞膜透性的一项基本指标，当植物受到逆境影响时，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗。植物的相对电导率越低反映了其抗逆能力的越高，实验结果如图8所示。
在非胁迫条件下(control)，实验组和对照组白桦株系的相对电导率大致相同；在NaHCO3的非生物胁迫条件下，实验组及对照组白桦株系的相对电导率发生了变化。过表达BpNAC9基因的瞬时侵染株系的相对电导率低于于对照，说明实验组植株的抵御逆境胁迫能力比对照强，过表达BpNAC9基因能够提高植物的抗逆能力。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.BpNAC9蛋白在调控白桦耐盐碱性中的应用，其特征在于，所述BpNAC9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过使白桦过表达BpNAC9蛋白实现白桦耐盐碱性的提高。
3.权利要求1中所述BpNAC9蛋白的编码基因或含有所述编码基因的生物材料在调控白桦耐盐碱性中的应用，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过使白桦包含所述编码基因或含有所述编码基因的生物材料实现白桦耐盐碱性的提高。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生物材料包括基因表达盒、表达载体或宿主细胞。
6.一种调控白桦耐盐碱性的方法，其特征在于，包括如下(a)和/或(b)：
(a)使白桦包含BpNAC9蛋白的编码基因或含有所述编码基因的生物材料；
(b)使白桦过表达BpNAC9蛋白；
所述BpNAC9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过将BpNAC9蛋白的编码基因转入白桦使白桦包含BpNAC9蛋白的编码基因和/或使白桦过表达BpNAC9蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述BpNAC9蛋白的编码基因构建至表达载体上，然后用得到的重组表达载体转化农杆菌，并用转化的农杆菌侵染白桦组培苗，得到耐盐碱性提高的白桦。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述表达载体包括pROKⅡ。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述农杆菌包括根癌农杆菌EHA105。
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