CN114231542B - 一种影响山新杨耐盐性的bHLH基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种影响山新杨耐盐性的bHLH基因及其应用，该bHLH基因的序列如序列表1所示，bHLH基因的氨基酸序列如序列表2所示，其应用是bHLH基因的敲除表达对山新杨的耐盐性有影响，则有助于耐盐杨树新种质的培育，研究成果为杨树耐盐性品种改良提供了优良的抗性基因，具有重要科学意义。

Description

一种影响山新杨耐盐性的bHLH基因及其应用
技术领域
本发明属于基因工程的技术领域，具体涉及一种影响山新杨耐盐性的bHLH基因及其应用。
背景技术
转录因子是胁迫反应基因的主要调节因子，是植物改良的优先选择。然而，不同植物的转录因子仍有许多有待发现，在超过80个家族中，仅仅少数几个转录因子深入研究了在生物和非生物胁迫反应中具有的作用。碱性螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH)是真核生物中最广泛的一类转录因子，通过识别靶基因中的特定基序并与之相互作用来调节基因表达；不仅普遍参与植物的生长和代谢，而且在植物对逆境的响应中也发挥着重要作用。然而，大多数关于bHLH转录因子的研究大多集中在一小部分模式植物与作物中。尽管已经使用多种分子生物学方法来探索bHLH转录因子在植物生长和发育的各个阶段以及代谢途径和应激反应中的作用，但关于这些蛋白质的功能和调节作用还有很多需要了解。
山新杨(Populus davidiana×Populus bolleana)，属杨柳科杨属植物，是山杨与新疆杨人工杂交选育出的优良无性系。山新杨生长速度快，适应能力强，抗逆性能好，是北方寒冷地区杨树品种中观赏价值非常高的城乡及庭院绿化树种，具有重要的经济价值。近年来，通过基因工程专业技术对林木进行有目的的遗传改良已经显现出良好势头和发展潜能。因此，探索出有关林木植物个体抗逆性能的基因，研究其生理功能调控特性及形态调控反应机制，对促进林木植物分子生物学技术研究、培育新型林木植物品种提供学术理论和实用价值具有重要意义。
盐胁迫是影响植物生长发育的主要环境胁迫，而目前关于山新杨bHLH转录因子家族基因耐盐功能的相关研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种影响山新杨耐盐性的bHLH基因及其应用，为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种影响山新杨耐盐性的bHLH基因，bHLH基因的序列如序列表1所示，bHLH基因的氨基酸序列如序列表2所示。
一种影响山新杨耐盐性的bHLH基因的应用，其应用是bHLH基因的敲除表达影响山新杨的耐盐性。
bHLH基因的敲除表达影响山新杨的耐盐性的检测步骤如下：
1山新杨bHLH转录因子家族基因的生物信息学分析
1.1山新杨与拟南芥bHLH基因的聚类分析
从山新杨基因组数据库中获得113个bHLH基因氨基酸序列，利用MEGA-X软件与9个已知与非生物胁迫相关的拟南芥bHLH基因采用邻接法构建系统进化树并进行分析。
1.2山新杨bHLH1基因与拟南芥bHLH基因多序列比对分析
将筛选出的山新杨bHLH1基因与拟南芥bHLH基因的氨基酸序列进行多序列比对分析。
1.3山新杨bHLH1基因理化性质分析
通过在线网站ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)，对山新杨bHLH1基因序列以及氨基酸序列进行分析。
2盐胁迫下bHLH1基因在山新杨不同组织中的表达分析
依据山新杨bHLH1基因全长序列，设计RT-qPCR引物，利用RT-qPCR技术对胁迫处理山新杨材料中bHLH1基因的表达模式进行分析。选取山新杨肌动蛋白基因(Actin，Genbank登录号：KR180380)和山新杨延伸因子基因(EF1-α，Genbank登录号：MN196666)作为内参基因进行RT-qPCR，每个样品设置3个生物学重复，使用Livak法进行目的基因的相对表达量分析。反应所需引物见表2-1，RT-qPCR反应体系如下：
Figure GDA0003611816930000031
RT-qPCR反应程序：
Figure GDA0003611816930000032
表2-1 RT-qPCR所用引物序列
Figure GDA0003611816930000041
3敲除表达载体pEG237-bHLH1的构建
3.1 pEG237载体质粒的提取
含有pEG237空载质粒的大肠杆菌为实验室保存，使用质粒小提试剂盒(由南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的)进行pEG237质粒提取，具体操作步骤同试剂盒说明书。产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取质量。
3.2敲除表达靶点的设计
将山新杨bHLH1基因全长序列输入在线处理网站target Design(http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/result/)，经计算输出基因敲除靶点，通过对照基因组序列，得到bHLH1基因外显子组成情况，靶点位置需要完整位于一整个外显子内部，并且避开基因保守结构域。利用在线处理网站RNA Folding Form(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/RNAFolding-Form2.3)对选取的山新杨bHLH1基因敲除靶点进行二级结构分析，避免靶序列与sgRNA序列产生连续配对，设计完成的6个bHLH1基因敲除靶点序列见表3-1。
表3-1敲除表达载体构建所用靶点序列
Figure GDA0003611816930000051
3.3敲除表达靶点的复性
设计完成的靶点送生物公司合成，合成靶点为DNA单链，需要复性为双链才能进行敲除表达载体的构建，复性反应体系如下：
Primer F(100μM) 9.0μL
Primer R(100μM) 9.0μL
Ex Taq Buffer(20mM) 2.0μL
复性反应程序：
95℃5min
85℃5min
75℃5min
65℃5min
55℃5min
45℃5min
35℃5min
25℃∞
复性后的产物稀释100倍备用。
3.4pEG237载体的酶切以及纯化回收
使用BsaⅠ核酸内切酶对pEG237载体质粒进行酶切以及纯化回收，酶切反应体系如下：
Figure GDA0003611816930000061
反应条件：
37℃4h。
酶切产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用纯化回收试剂盒(由生工生物工程股份有限公司生产的)对样品进行纯化回收，具体操作步骤同试剂盒说明书。
3.5山新杨bHLH1基因敲除靶点与pEG237载体的连接
复性后的山新杨bHLH1基因敲除靶点与线性化pEG237载体进行连接，连接反应体系如下：
Figure GDA0003611816930000071
反应条件：
16℃12h，4℃12h。
3.6连接产物转化大肠杆菌
大肠杆菌Top10菌株为实验室保存，连接产物热激转化大肠杆菌Top10感受态，具体步骤如下：
(1)吸取5μL连接液加入感受态细胞，混匀，冰置30min。
(2)42℃水浴1.5min，冰置3min。加入500μL新鲜LB，37℃，220rpm，震荡培养40min。
(3)3500rpm，离心3min。弃掉400μL上清液。重悬菌体，涂布于kan(50mg)抗性筛选培养基。37℃倒置培养12h。
3.7阳性克隆的鉴定
挑取单克隆于液体筛选培养基扩繁，吸取菌液作为模板，使用载体引物进行菌液PCR检测，反应体系如下：
Figure GDA0003611816930000072
Figure GDA0003611816930000081
PCR反应程序为：
Figure GDA0003611816930000082
PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，阳性克隆送测序，将测序正确的菌株扩繁，提取质粒备用。
3.8pEG237-bHLH1重组质粒电击法转化农杆菌
提取构建成功的pEG237-bHLH1重组载体质粒电击转化农杆菌，具体步骤如下：
(1)将2μL重组质粒加入农杆菌感受态细胞中，混匀后转移至干净的电击杯中。
(2)使用1700V电压电击后向电击杯中加入600μL LB培养基，混匀。
(3)混匀后的培养基，转移至1.5mL离心管中，28℃220rpm培养1h。
(4)吸取200μL菌液涂布于筛选培养基中，28℃倒置培养2天。
(5)随机挑取菌点扩大培养，载体引物进行菌液PCR检测。1％琼脂糖凝胶电泳检测，选取阳性克隆，作为工程菌株备用。
4鉴定瞬时转化山新杨中各个靶点对于bHLH1基因的打靶效率
4.1 pEG237-bHLH1载体瞬时转化山新杨植株
(1)培养pEG237-bHLH1载体质粒以及pEG237空载质粒的农杆菌至OD600＝0.8，稀释50倍，使用加有SPD、5-Azac、AS、DTT的培养基培养至OD600＝0.7，3000rpm离心收集菌体，转化液调整OD600＝0.7。
(2)将山新杨植株浸泡在侵染液中，25℃90rpm培养1h，再加入1/3体积转化液，培养1.5h。
(3)将侵染后的植株转移到加有CaCl2、AS、蔗糖、DTT的复水液中1min，无菌滤纸吸干菌液。
(4)共培养培养基中培养48h后整株提取DNA检测不同敲除靶点的打靶效率。
4.2瞬时转化山新杨中基因敲除靶点打靶效率检测
依据靶点在bHLH1基因中的位置，选取包含有靶点的200bp左右的片段，设计实时荧光定量检测引物，见表4-1。提取敲除表达载体瞬时转化山新杨整株植株DNA作为模板，RT-qPCR检验各个靶点的打靶效率，选择打靶效率高的靶点进行稳定转化。
表4-1敲除表达载体打靶效率所用检测引物序列
Figure GDA0003611816930000091
Figure GDA0003611816930000101
实时荧光定量反应体系、条件同2。
5山新杨的稳定遗传转化与抗性筛选
(1)将含有pEG237-bHLH1载体质粒的农杆菌菌株活化至OD600＝0.4-0.6，3000rpm离心10min，使用1/2MS液体培养基(含终浓度为150μM的AS)重悬菌体，调整OD600＝0.2-0.4。
(2)将山新杨外植体浸泡在侵染液中，轻轻摇动10min。
(3)将浸泡后的外植体用灭菌的滤纸吸干，平铺于共培养培养基上，暗培养3d。
(4)暗培养结束后，将外植体转移到kan(50mg)筛选培养基上。
(5)产生抗性不定芽后，将不定芽移至生根培养基中进行壮苗，得到敲除表达植株。
6敲除表达山新杨的分子检测
通过稳定转化，获得山新杨bHLH1基因的敲除表达植株，根据山新杨bHLH1基因敲除表达载体靶点位置设计分子检测引物，引物序列见表6-1。
表6-1敲除表达植株所用检测引物序列
Figure GDA0003611816930000102
使用植物DNA提取试剂盒(由生工生物工程股份有限公司生产的)提取敲除表达山新杨整株植株的DNA，野生型植株作为对照，以提取的山新杨DNA作为模板，使用检测引物对打靶片段进行PCR扩增，扩增体系、条件同3.7。
扩增产物经纯化回收后与pMD18-T载体进行连接转化，阳性克隆送测序，检测bHLH1基因的敲除状况。连接体系如下：
Figure GDA0003611816930000111
连接条件：
16℃12h。
连接产物热激转化大肠杆菌具体步骤同3.6。
随机挑取单菌落使用PMD18-T通用载体引物进行菌液PCR检测。阳性克隆送测序。测序结果与对照进行序列比对，确定其打靶状况。
7敲除表达山新杨植株的生理生化指标检测
对生长量达到检测要求的山新杨bHLH1基因的敲除表达株系H1、H2盆栽苗与野生型盆栽苗使用200mM NaCl胁迫处理12h，未胁迫处理敲除表达植株与野生型植株作为对照，处理后的整株植株测量其电解质渗透率、丙二醛含量、POD酶活性、SOD酶活性、叶绿素含量以及耐盐相关基因的相对表达量。
7.1电解质渗透率的测定
电解质渗透率的测量步骤如下：
(1)取大小相等的叶片放入干净的50mL离心管内，加超纯水30mL，真空泵抽2min后维持真空状态13min，电导仪测电导值，记录为S1。
(2)将测取S1后的离心管放入90℃水浴锅加热20min，冷却至室温，测其电导值，记录为S2。
(3)电解质渗透率＝S1/S2。
7.2丙二醛含量测定
丙二醛的测量步骤如下：
(1)取约0.05-0.1g植物材料用液氮速冻后研磨，放入2mL离心管内。
(2)加1.5mL 10％三氯乙酸(TCA)，4℃放置30min，11,000rpm离心10min。
(3)吸取1mL提取液，加入1mL 0.6％TBA，混匀，沸水浴15min，迅速冷却，12,000rpm离心20min。
(4)取上清液分别测定600nm、532nm和450nm处OD值，对照管1mL水+1mL 0.6％TBA。
(5)MDA(mmol/g)＝[6.452(OD532-OD600)-0.559OD450]/W
7.3过氧化物酶活性测定
过氧化物酶活性的测量步骤如下：
(1)取0.05-0.1g植物材料，液氮速冻后研磨。
(2)加1.5mL 0.01M磷酸缓冲液，反应30min，11,000rpm离心20min，取上清。
(3)酶液0.5mL+0.8％H2O20.5 mL+0.1M磷酸缓冲液0.5mL+0.1M愈创木酚0.5mL。
(4)30℃水浴反应10min。
(5)470nm处测样品吸光值(OD)，使用双蒸水代替H2O2作对照。
(6)POD活力＝(N×△A)/W
N：稀释倍数△A：吸光度W：材料重量
7.4超氧化物歧化酶酶活性测定
超氧化物歧化酶酶活性使用SOD活性测定试剂盒(由南京建成生物工程研究所生产的)测定，具体操作步骤同试剂盒说明书。
7.5叶绿素含量测定
(1)称0.1g左右的叶片剪成细丝或者液氮研磨，放在2mL的离心管(做3个重复)。
(2)加入2mL 50％的丙酮液，放在黑暗处浸提至材料变白。
(3)测定波长663nm、645nm、652nm和470nm下光密度，以50％的丙酮液为空白。
(4)Ca＝13.95D665-6.88D649,Cb＝24.96D649-7.32D665
叶绿素的浓度C＝(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245
叶绿素含量(mg/g)＝C(mg/L)×V/A×1000
Ca：叶绿素a的浓度；Cb为叶绿素b的浓度；C：叶绿素总浓度；V为提取液总体积(mL)；A为叶片鲜重。
7.6耐盐相关基因的相对表达量测定
依据山新杨耐盐相关基因的基因序列，设计RT-qPCR引物，利用RT-qPCR技术对山新杨bHLH1基因敲除表达植株中耐盐相关基因的相对表达量进行测定。选取山新杨肌动蛋白基因(Actin，Genbank登录号：KR180380)和山新杨延伸因子基因(EF1-α，Genbank登录号：MN196666)作为内参基因进行RT-qPCR。反应所需引物见表7-1，RT-qPCR反应体系同4。
表7-1 RT-qPCR所用引物序列
Figure GDA0003611816930000141
8敲除表达山新杨植株的组织化学染色
对山新杨bHLH1基因敲除表达与野生型盆栽苗使用200mM NaCl胁迫处理12h，未胁迫处理敲除表达植株与野生型植株作为对照，处理后的植株叶片进行组织化学染色。
8.1NBT染色
将叶片置于2mL离心管中，加入1.5mLNBT染色液，室温染色过夜。弃去染色液，加入96％的乙醇沸水浴10min脱色。
8.2DAB染色
将叶片置于2mL离心管中，加入1.5mL DAB染色液，室温染色过夜。弃去染色液，加入96％的乙醇沸水浴10min脱色。
8.3Evans blue染色
将叶片置于2mL离心管中，加入1.5mL Evans blue染色液。将管置于真空干燥器中，抽真空15min，并保持真空6h。弃去染色液，用10mM磷酸缓冲液(pH7.8)清洗叶片3-5次去其浮色，加入96％的乙醇沸水浴10min脱色。
本发明的有益效果：
盐胁迫是备受关注的非生物胁迫，而有关林木盐胁迫条件下的转录因子响应研究触及林木抗逆生理育种研究前沿及热点，山新杨bHLH1基因耐盐功能有关研究有助于耐盐杨树新种质的培育，本发明通过检测稳定转化植株的生理指标，发现bHLH1基因的敲除表达影响植株的盐胁迫抵抗能力，为杨树耐盐性品种改良提供了优良的抗性基因，具有重要科学意义。
附图说明
图1-1是山新杨与拟南芥bHLH转录因子的系统进化树；
图1-2是山新杨与拟南芥bHLH基因序列比对分析；
图2-1是盐胁迫下bHLH基因在山新杨不同组织中的表达分析；
图3-1是山新杨bHLH1基因敲除表达载体构建菌液PCR电泳检测；
图4-1是RT-qPCR检测靶点基因敲除效率；
图5-1是山新杨bHLH1基因敲除表达植株的获得，其中a为稳定转化后外植体叶片；b为外植体叶片伤口发生膨大；c为外植体叶片伤口产生不定芽；d为生有不定芽的外植体叶片进行抽茎培养；e为不定芽进行生根壮苗；f为获得敲除表达植株盆栽苗；
图6-1是山新杨bHLH1基因敲除表达阳性株系测序；
图7-1是山新杨bHLH1敲除表达阳性植株盐胁迫处理前；
图7-2是山新杨bHLH1敲除表达阳性植株盐胁迫处理后；
图7-3是山新杨bHLH1敲除表达阳性株系电解质渗透率检测；
图7-4是山新杨bHLH1敲除表达阳性株系丙二醛含量检测；
图7-5是山新杨bHLH1敲除表达阳性株系过氧化物酶活性检测；
图7-6是山新杨bHLH1敲除表达阳性株系超氧化物歧化酶活性检测；
图7-7是山新杨bHLH1敲除表达阳性株系耐盐相关基因的相对表达量检测；
图7-8是山新杨bHLH1敲除表达阳性株系叶绿素含量检测；
图8-1是山新杨bHLH1敲除表达阳性株系NBT染色结果；
图8-2是山新杨bHLH1敲除表达阳性株系DAB染色结果；
图8-3是山新杨bHLH1敲除表达阳性株系Evans Blue染色结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不受下述实施例限定。
实施例
1山新杨bHLH转录因子家族基因的生物信息学分析
1.1山新杨与拟南芥bHLH基因的聚类分析
从山新杨基因组数据库中获得113个bHLH基因氨基酸序列，与9个已知与非生物胁迫相关的拟南芥bHLH基因采用邻接法构建系统进化树，结果如图1-1所示，从图中可以看到红色符号标记的山新杨bHLH1基因与拟南芥耐盐相关基因(AT4G02590)处于同一进化分支，表明该基因可能参与山新杨的盐胁迫响应。
1.2山新杨bHLH1基因与拟南芥bHLH基因多序列比分析
将筛选出的山新杨bHLH1基因与拟南芥bHLH基因(AT4G02590)的氨基酸序列进行多序列比对分析，发现其氨基酸序列之间存在相同的bHLH保守结构域(图1-2)。
1.3山新杨bHLH1基因理化性质分析
通过在线网站ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)，对山新杨bHLH1基因序列以及氨基酸序列进行分析。山新杨bHLH1基因的编码区包括999个碱基序列，编码332个氨基酸，分子量为35767.59，理论pI：6.45。
2盐胁迫下bHLH基因在山新杨不同组织中的表达分析
对盐胁迫下山新杨bHLH1基因在根、茎、叶组织部位中的表达模式进行分析，结果如图2-1表明，山新杨bHLH1基因在盐胁迫处理下出现明显的上调表达。研究结果表明山新杨bHLH1基因对盐胁迫响应明显。
3敲除表达载体pEG237-bHLH1的构建
使用pEG237载体引物进行菌液PCR检测，电泳结果如图3-1所示，表明载体构建成功。
4山新杨bHLH1基因6个敲除靶点打靶效率的检测
将构建好的6个不同靶点的重组载体通过农杆菌介导的瞬时转化体系对山新杨进行瞬时侵染，共培养3天后，提取瞬时转化植株的DNA作为模板进行RT-qPCR，结果如图4-1所示，表明靶点5对基因bHLH1的打靶效率最高，靶点1次之。选取靶点1、5稳定转化山新杨，对bHLH1基因进行敲除。
5山新杨的稳定遗传转化与抗性筛选
稳定转化后通过抗性筛选逐步获得78个bHLH1基因敲除表达植株，如图5-1所示。
6敲除表达山新杨的分子检测
提取bHLH1基因敲除表达转基因株系的DNA，使用分子检测引物扩增靶点作用位置片段，扩增片段连接pMD18-T载体，阳性克隆送测序，测序检测得到11个(Target18个株系、Target53个株系)纯合bHLH1基因敲除表达株系。测序结果如图6-1所示，两个靶点均对bHLH1基因进行了敲除打靶，造成了单碱基的缺失。
7敲除表达山新杨植株的生理生化指标检测
对生长量达到检测要求的山新杨bHLH1基因的敲除表达株系H1、H2盆栽苗与野生型盆栽苗使用200mM NaCl胁迫处理12h，未胁迫处理敲除表达植株与野生型植株作为对照。胁迫处理之前敲除表达植株与野生型植株长势、状态一致，如图7-1所示；胁迫处理之后，相对于野生型植株，敲除表达植株出现明显的萎蔫，如图7-2所示。表明敲除表达植株的耐盐性出现明显的下降。
7.1电解质渗透率的测定
相对电导率是说明细胞膜受损的一个生理指标，胞膜受损导致电解质外渗增加，细胞膜结构是否完整影响植物的抗逆能力。
电解质渗透率的测定结果如图7-3可知，未经胁迫山新杨植株，电解质渗透率的值基本趋于一致，而经过胁迫处理的山新杨植株，相对于对照，基因bHLH1的敲除表达株系电解质的外渗显著提高，其中株系H2尤为显著。以上试验结果表明山新杨bHLH1基因的敲除使得植株的电解质渗透率明显上升，降低山新杨的耐盐能力。
7.2丙二醛含量测定
丙二醛是膜脂过氧化的最终分解产物，通过其含量变化可以反映植物在逆境胁迫下的受伤害的程度。
丙二醛含量的测量结果如图7-4所示，在未经盐处理之前，野生型植株与敲除表达株系的丙二醛含量接近一致，盐处理后，敲除表达株系的丙二醛含量相对于对照有明显的升高，其中株系H2尤为显著。以上试验结果表明山新杨bHLH1基因的敲除使得植株的丙二醛含量明显上升，山新杨的耐盐能力降低。
7.3过氧化物酶活性测定
在过氧化物酶(POD)催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，过氧化物酶是植物体内降低氧自由基伤害的重要保护酶，和植物的抵御逆境胁迫能力紧密相关。
POD酶活性的测量如图7-5所示，在未经盐处理之前，野生型植株与敲除表达株系的POD酶活性接近一致，盐处理后，敲除表达株系的POD酶活性相对于对照显著降低，其中株系H2尤为显著。以上试验结果表明山新杨bHLH1基因的敲除使得植株的POD酶活性明显降低，降低山新杨的耐盐能力。
7.4超氧化物歧化酶活性测定
SOD可以催化超氧阴离子自由基的歧化反应，抵抗活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的损伤，从而提高植物的抗逆能力。
SOD酶活性的测量如图7-6所示，在未经盐处理之前，野生型植株与敲除表达株系的SOD酶活性接近一致，盐处理后，敲除表达株系的SOD酶活性相对于对照有所降低，其中株系H2尤为显著。以上试验结果表明山新杨bHLH1基因的敲除使得植株的SOD酶活性降低，降低山新杨的耐盐能力。
7.5耐盐相关基因的相对表达量测定
提取盐胁迫条件下bHLH1基因敲除表达植株和野生型山新杨植株的RNA，反转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR实验。
耐盐相关基因的相对表达量测定结果如图7-7所示，从图中可以看到在盐胁迫下，SOD、POD、P5CS基因的表达量在敲除表达植株中的表达量变化明显，在敲除表达植株中的表达量基本均低于野生型山新杨。表明山新杨bHLH1基因的敲除使得植株抵御逆境的能力降低。
7.6叶绿素含量的测定
根据叶绿素提取液对光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测其吸光度，可用公式计算提取液中各色素的含量。叶绿素含量是影响光合作用的一个重要因素，胁迫后植物受损伤叶绿素含量下降，因此叶绿素含量可作为植物抗性强弱的指标之一。
叶绿素含量的测定如图7-8所示，在未经盐处理之前，野生型植株与敲除表达株系的叶绿素含量接近一致，盐处理后，叶绿素含量均有所升高，敲除表达株系叶绿素含量变化量相对于对照较低，其中株系H2尤为显著。以上试验结果表明山新杨bHLH1基因的敲除使得植株的抗逆能力降低。
8敲除表达山新杨植株的组织化学染色
由组织化学染色结果图8-1、8-2、8-3知，在非胁迫生长条件下，敲除表达植株以及野生型植株叶片基本无颜色，且相互之间无明显差异；在盐胁迫条件下，敲除表达植株以及野生型植株叶片基本无颜色发生明显的变化。bHLH1基因的敲除表达植株叶片上的颜色比野生型山新杨叶片上的颜色深，说明敲除表达株系受胁迫之后的损伤程度高。实验结果证明bHLH1基因在山新杨植株体内起抗逆作用。
8.1 NBT染色
硝基四氮唑蓝(Nitroblue Tetrazolium,NBT)还原法，通过超氧离子O2-氧化NBT生成蓝色甲腙，根据蓝色的深浅，可以反映O2-的多少。
8.2 DAB染色
二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)染色，是由于细胞中的过氧化酶，能将过氧化氢中的氧释放出来，氧化二氨基联苯胺(DAB)，形成棕色沉淀而定位于过氧化酶活性的部位。通过颜色的深浅，可以反映H2O2的多少。
8.3 Evans blue染色
正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥伊文思蓝(Evans Blue)，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，细胞膜的通透性增加，可被伊文思蓝染成蓝色。
Figure GDA0003611816930000231
Figure GDA0003611816930000241
Figure GDA0003611816930000251
Figure GDA0003611816930000261
序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> 一种影响山新杨耐盐性的bHLH基因及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> 山新杨
<400> 1
atggcaggaa atcctccacc tgaagggttg ggagatgatt tcctcgagca gatcttggca 60
gtgcagccac ctggttacag tggtggtggg gaggttatgg ggtccactag cctgcccatg 120
atggggctgc agttagggtc ttgtgctggt aatgttggat tactgaggag taatgctaat 180
aataacatgg gaatgatgcc tttagggctg aacttagagc atcatgggtt tttaaggcaa 240
caacaagatg atagtggtag ttccttagat accaacaaca gcaataatat caataacact 300
tctccttcta taaaatctgc tcgaatcttg gggagagatt cggtgcacat gacaagcttg 360
tttccaacat ttggacatct gcagattcat tcatcgatcc ggcctacacc acctcctcct 420
ggaccacctc aaattcacca gattaatagc catccaaatc caggagcagt ttcagctgta 480
ccacaaccgc ctggcatccg gccacgggtg cgagcaagac gggggcaagc cacggatcca 540
cacagtattg ctgagaggct gcgaagagta agaatcacgg agagggtgaa ggcgttgcaa 600
gaattggttc ccacttgcaa caagacagac agggcagcca tgcttgatga aattgtggac 660
tatgtgaagt ttctaagact ccaaatcaag gttctgagca tgagcagact aggtgcagca 720
ggcgctgtgg ctcagcttgt agccgatgta ccattgtcat tagttcaggg agagggcaat 780
gaaggaggag ccaatcagca atcttgggaa aattggtcaa atgatgacac tgaacaagaa 840
gtagctaagt taatggaaga agacgttgga gctgccatgc aattgcttca gtccaaggca 900
ctctgcatca tgcccatatc gcttgcttca gcaatcttcc gagcacgccc acctaacgca 960
tcagcgctca tcaacaccga atcgaacacc ccttcataa 999
<210> 2
<211> 332
<212> PRT
<213> 山新杨
<400> 2
Met Ala Gly Asn Pro Pro Pro Glu Gly Leu Gly Asp Asp Phe Leu Glu
1 5 10 15
Gln Ile Leu Ala Val Gln Pro Pro Gly Tyr Ser Gly Gly Gly Glu Val
20 25 30
Met Gly Ser Thr Ser Leu Pro Met Met Gly Leu Gln Leu Gly Ser Cys
35 40 45
Ala Gly Asn Val Gly Leu Leu Arg Ser Asn Ala Asn Asn Asn Met Gly
50 55 60
Met Met Pro Leu Gly Leu Asn Leu Glu His His Gly Phe Leu Arg Gln
65 70 75 80
Gln Gln Asp Asp Ser Gly Ser Ser Leu Asp Thr Asn Asn Ser Asn Asn
85 90 95
Ile Asn Asn Thr Ser Pro Ser Ile Lys Ser Ala Arg Ile Leu Gly Arg
100 105 110
Asp Ser Val His Met Thr Ser Leu Phe Pro Thr Phe Gly His Leu Gln
115 120 125
Ile His Ser Ser Ile Arg Pro Thr Pro Pro Pro Pro Gly Pro Pro Gln
130 135 140
Ile His Gln Ile Asn Ser His Pro Asn Pro Gly Ala Val Ser Ala Val
145 150 155 160
Pro Gln Pro Pro Gly Ile Arg Pro Arg Val Arg Ala Arg Arg Gly Gln
165 170 175
Ala Thr Asp Pro His Ser Ile Ala Glu Arg Leu Arg Arg Val Arg Ile
180 185 190
Thr Glu Arg Val Lys Ala Leu Gln Glu Leu Val Pro Thr Cys Asn Lys
195 200 205
Thr Asp Arg Ala Ala Met Leu Asp Glu Ile Val Asp Tyr Val Lys Phe
210 215 220
Leu Arg Leu Gln Ile Lys Val Leu Ser Met Ser Arg Leu Gly Ala Ala
225 230 235 240
Gly Ala Val Ala Gln Leu Val Ala Asp Val Pro Leu Ser Leu Val Gln
245 250 255
Gly Glu Gly Asn Glu Gly Gly Ala Asn Gln Gln Ser Trp Glu Asn Trp
260 265 270
Ser Asn Asp Asp Thr Glu Gln Glu Val Ala Lys Leu Met Glu Glu Asp
275 280 285
Val Gly Ala Ala Met Gln Leu Leu Gln Ser Lys Ala Leu Cys Ile Met
290 295 300
Pro Ile Ser Leu Ala Ser Ala Ile Phe Arg Ala Arg Pro Pro Asn Ala
305 310 315 320
Ser Ala Leu Ile Asn Thr Glu Ser Asn Thr Pro Ser
325 330

Claims (2)

1.一种影响山新杨耐盐性的bHLH基因的应用，其特征在于：所述应用是bHLH基因的敲除表达降低山新杨的耐盐性；
所述bHLH基因的序列如序列表1所示，所述bHLH基因的氨基酸序列如序列表2所示。
2.根据权利要求1所述的一种影响山新杨耐盐性的bHLH基因的应用，其特征在于：包括所述bHLH基因的敲除表达降低山新杨的耐盐性的检测步骤，所述检测步骤如下：
S1.山新杨bHLH转录因子家族基因的生物信息学分析；
S2.盐胁迫下bHLH1基因在山新杨不同组织中的表达分析；
S3.敲除表达载体的构建；
S4.瞬时转化山新杨中鉴定各个靶点对于bHLH1基因的打靶效率；
S5.山新杨的稳定遗传转化与抗性筛选；
S6.敲除表达山新杨的分子检测；
S7.敲除表达山新杨植株的耐盐生理生化指标检测；
S8.敲除表达山新杨植株的组织化学染色。
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