CN114921474B - 一种提高白桦耐盐能力的BpbHLH10基因及其编码的蛋白 - Google Patents

一种提高白桦耐盐能力的BpbHLH10基因及其编码的蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高白桦耐盐能力的BpbHLH10基因及其编码的蛋白，属于基因工程技术领域，所述白桦BpbHLH10基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的BpbHLH10基因可用于培育耐盐转基因白桦植株，研究成果为白桦耐盐性品种改良提供了依据，对揭示林木基因工程育种的优良基因具有重要科学意义。白桦BpbHLH10基因具有明显的耐盐能力，且不影响植物的生长，因此将该基因用于生长转基因植物尤其是转基因林木具有非常重要的应用前景。

Description

一种提高白桦耐盐能力的BpbHLH10基因及其编码的蛋白
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种提高白桦耐盐能力的BpbHLH10基因及其编码的蛋白。
背景技术
植物的生长发育过程中经常会受到各种逆境胁迫的影响，包括生物胁迫(病虫害、草害等)和非生物胁迫(干旱、高低温、高盐、弱光、重金属等)，这些逆境胁迫会给植物生长带来严重的损伤，制约植物生长发育，甚至直接影响植物的品质及产量。为了抵抗逆境胁迫带来的损伤，植物自身会根据所处环境产生一系列应答响应，基因表达调控在这一系列过程中起着至关重要的作用,而转录因子是基因表达中最重要的调控元件。转录因子通过与顺式调控元件结合特异性的激活或抑制靶基因的表达,从而调控植物体内不同的信号通路，最终提高植物在逆境胁迫下的抗逆能力。
白桦(Betulaplatyphylla Suk.)为桦木科桦属植物，为落叶乔木，生长速度快、是东北地区次生林的先锋树种，耐寒能力强，喜酸性土壤，桦木汁营养丰富，药食兼用，在保健、食品、医药、日用行业均有价值，白桦中含有多种次生代谢物，具有很高的药用和经济价值。由于其重要的生态、观赏和实用经济价值，历来被列为国家科技计划研究的重要树种之一。对其遗传改良的范围也在不断扩大，其主要目标是培育速生、优质和高抗的林木新品种。当前，土壤盐渍化已经成为一个全球性的问题，盐渍化土壤因较高的盐分含量，不利于植物的正常生长，其立地植被重建困难、生态恢复缓慢、植被保存率低等问题严重制约着林业的产出和发展。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高白桦耐盐能力的BpbHLH10基因及其编码的蛋白，本发明提供的BpbHLH10基因提高了白桦耐盐胁迫能力。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种提高白桦耐盐能力的BpbHLH10基因，所述BpbHLH10基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的BpbHLH10基因在白桦耐盐胁迫中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的BpbHLH10基因在降低白桦叶片过氧化氢含量中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的BpbHLH10基因在降低白桦叶片超氧阴离子含量中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的BpbHLH10基因在提高白桦超氧化物歧化酶活性中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的BpbHLH10基因在提高白桦过氧化物酶活性中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的BpbHLH10基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种培育耐盐胁迫白桦的方法，包括以下步骤：
1)将上述技术方案所述的BpbHLH10基因连接到pROKII载体中，得到过表达载体；
2)将所述步骤1)得到的过表达载体采用电导法转入到根癌农杆菌中，得到重组菌；
3)将所述步骤2)得到的重组菌采用高效瞬时侵染技术侵染白桦，得到耐盐胁迫白桦植株。
优选的，扩增BpbHLH10基因使用的引物为上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
优选的，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一个抵抗盐胁迫的白桦BpbHLH10基因，可用于培育耐盐转基因白桦植株，研究成果为白桦耐盐性品种改良提供了依据，对揭示林木基因工程育种的优良基因具有重要科学意义白桦BpbHLH10基因具有明显的耐盐能力，且不影响植物的生长，因此将该基因用于生长转基因植物尤其是转基因林木具有非常重要的应用前景。
附图说明
图1为白桦BpbHLH10与其它植物bHLH蛋白多序列比对图，其中PmbHLH：乌梅bHLH；FvbHLH：野草莓bHLH；AtbHLH：拟南芥bHLH；MnbHLH：川桑bHLH；ZjbHLH：枣bHLH；GmbHLH：大豆bHLH；JcbHLH：麻风树bHLH；PebHLH：胡杨bHLH；GabHLH：木棉bHLH；
图2为白桦BpbHLH10与拟南芥bHLH蛋白系统树构建图；
图3为盐胁迫下BpbHLH10基因在白桦根组织中的表达分析；
图4为BpbHLH10转基因白桦在盐胁迫下DAB染色结果；
图5为BpbHLH10转基因白桦在盐胁迫下NBT染色结果；
图6为BpbHLH10转基因白桦在盐胁迫下Evans blue染色结果；
图7为BpbHLH10转基因白桦在盐胁迫下超氧化物歧化酶(SOD)活性测定；
图8为BpbHLH10转基因白桦在盐胁迫下过氧化物酶(POD)活性测定；
图9为BpbHLH10转基因白桦在盐胁迫下H2O2含量的测定；
图10为BpbHLH10转基因白桦在盐胁迫下总蛋白浓度的测定；
图11为BpbHLH10转基因白桦在盐胁迫下相对电导率的测定。
具体实施方式
本发明提供了一种提高白桦耐盐能力的BpbHLH10基因，所述BpbHLH10基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
atggaagagctcataatctctccctcttcatcttcctctctagtatctttgccccaagaaaccccaccaacccttcaacaaaggctccaattcgtagtccaaagccaaccggactggtggacttacgccattttctggcaatccgccaacgacgacaatggccagatgttcttggcctggggcgacggccatttcctaggcaccaaagacacatcccctaagctctcccacatcaacagtacccaccaccaccaccccatgtcagtcctacattccgaaagaagaaaattcatgagggatatccaatccatgatcatcaccgaaaaccaccaagacatcgataacatgtccgatgtcacagacgccgaatggttctatgtcatgtccttaacccgctctttcgcccccggcgacggcgtgctcggcaaggcctttagtactaattctctggtgtggctgaccggcggccatgagcttcagtactacagctgcgagagagctaaagaagctcaaatgcacgggattgagactctggtctgtatcccaacttccagtgggattctcgaaatgggttctcaggagataatcagagagaactggggtttagtccaacaagccaagtctttattcgggtcggatctcattggcttggtacccaagcaacccaacccaagttccgggccgatgcaatttcttgaccgaaacatttctttcgcggatatcggcataattgccggcgtacaagaagaggatcataattctcaagaagaggagaacaagaagaagaagaagaaagagtgctttaaaggagcacaatcatcctacgtggactcggagcactctgattccgattgtcctctaatcgccgtgaacatagagaaaagaacacccaagaaaagagggagaaaaccggggctcggccgcgacacgccgttgaaccacgtggaggcggagcggcagcggcgagagaagttgaaccaccggttctacgctctgcgagccgtggtaccgaacgtgtcgagaatggacaaggcatctttgctctccgacgcggtgtcgtacatcaacgagctgaagaccaagatcgatgagctggagtcgcagcttcaaagagattcgaagaaagtgaagttagaactggctgataccatggacaaccaaagcaccaccacctcagtcgaccaaacaaggcctaattcaggcgggttggcgctcgaggtcgagatcaagattgtgggacttgatgccatgattagggttcaatccgagaatgttaattacccgtcagcacggttaatgggtgcgctacgtgacctagagttgcaaatccaccatgcaagcatgtcttgcgtcaacgaactcatgcttcaggatgttgtggtgagggttcctgaaggattgagaactgaagagggtcttaaaactgctcttctcagaagattagagcagtaa。
本发明还提供了上述技术方案所述的BpbHLH10基因在白桦耐盐胁迫中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的BpbHLH10基因在降低白桦叶片过氧化氢含量中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的BpbHLH10基因在降低白桦叶片超氧阴离子含量中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的BpbHLH10基因在提高白桦超氧化物歧化酶活性中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的BpbHLH10基因在提高白桦过氧化物酶活性中的应用。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的BpbHLH10基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
MEELIISPSSSSSLVSLPQETPPTLQQRLQFVVQSQPDWWTYAIFWQSANDDNGQMFLAWGDGHFLGTKDTSPKLSHINSTHHHHPMSVLHSERRKFMRDIQSMIITENHQDIDNMSDVTDAEWFYVMSLTRSFAPGDGVLGKAFSTNSLVWLTGGHELQYYSCERAKEAQMHGIETLVCIPTSSGILEMGSQEIIRENWGLVQQAKSLFGSDLIGLVPKQPNPSSGPMQFLDRNISFADIGIIAGVQEEDHNSQEEENKKKKKKECFKGAQSSYVDSEHSDSDCPLIAVNIEKRTPKKRGRKPGLGRDTPLNHVEAERQRREKLNHRFYALRAVVPNVSRMDKASLLSDAVSYINELKTKIDELESQLQRDSKKVKLELADTMDNQSTTTSVDQTRPNSGGLALEVEIKIVGLDAMIRVQSENVNYPSARLMGALRDLELQIHHASMSCVNELMLQDVVVRVPEGLRTEEGLKTALLRRLEQ。
本发明还提供了一种培育耐盐胁迫白桦的方法，包括以下步骤：
1)将上述技术方案所述的白桦BpbHLH10基因连接到pROKII载体中，得到过表达载体；
2)将所述步骤1)得到的过表达载体采用电导法转入到根癌农杆菌中，得到重组菌；
3)将所述步骤2)得到的重组菌采用高效瞬时侵染技术侵染白桦，得到耐盐胁迫白桦植株。
本发明将上述技术方案所述的BpbHLH10基因连接到pROKII载体中，得到连接载体。
本发明优选以白桦cDNA为模板，使用上下游引物进行扩增，得到白桦BpbHLH10基因。本发明对获取白桦cDNA的方法没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作获取即可。本发明对扩增使用的体系和程序没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作即可。在本发明中，所述上下游引物中引入SmaI酶切位点，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，
具体如下：5’ctctagaggatccccgggatggaagagctcat 3’；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：
5’tcgagctcggtacccgggttactgctctaatc 3’。
在本发明中，所述pROKII载体优选经Sma I酶切后再与白桦BpbHLH10基因，本发明对酶切的条件没有特殊限定，本领域技术人员采用常规即可。本领域技术人员对连接使用的体系和反应条件没有特殊限定，本领域技术人员采用常规即可。
本发明将得到的过表达载体采用电导法转入到根癌农杆菌中，得到重组菌。本发明对电导法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规电导法即可。在本发明中，所述根癌农杆菌优选为根癌农杆菌EHA105。
本发明将得到的重组菌采用高效瞬时侵染技术侵染白桦，得到耐盐胁迫白桦。本发明对所述高效瞬时侵染技术没有特殊限定，本领域技术人员采用常规即可。在本发明中，所述白桦优选为1个月的白桦苗。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1白桦BpbHLH10基因的克隆与序列分析
1.1从东北白桦中克隆获得bHLH基因，命名为BpbHLH10基因，BpbHLH10基因cDNA全长1452bp，基因序列如SEQ ID No.1所示，编码483个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
1.2白桦BpbHLH10基因与其他物种bHLH基因多序列比分析
将筛选出的白桦BpbHLH10基因与其他物种bHLH基因的氨基酸序列进行多序列比对分析。
1.3白桦与拟南芥bHLH基因的聚类分析
从白桦基因组数据库中获得BpbHLH基因氨基酸序列，利用MEGA7.0软件与150个已知与非生物胁迫相关的拟南芥bHLH基因采用NJ法构建系统进化树并进行分析。
1.4白桦BpbHLH10基因理化性质分析
通过在线网站ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)，对白桦BpbHLH10基因序列以及氨基酸序列进行分析。
2盐胁迫下BpbHLH10基因在白桦根中的表达分析
将生长2个月的野生型白桦苗分别进行200mM NaCl处理，胁迫时间分别为0h(control)，0.5h、1h、3h、6h、12h、24h和48h，之后取整株白桦于液氮中冷冻后转移至-80℃冰箱保存。使用试剂盒法(离心柱型通用植物总RNA提取试剂盒Bioteke，RP3302)提取总RNA。RNA提取步骤如下：
1)取白桦根组织于液氮中进行研磨。
2)将研磨好的样品转移至1.5ml RNase-free离心管中，加入1ml裂解液PL颠倒混匀，65℃条件下孵育五分钟使核蛋白体完全分解。
3)室温条件下12000rpm离心5分钟，小心取上清转入一个新的RNase-free过滤住中。
4)10000rpm离心45秒，收集下滤液到一个新的2ml RNase-free离心管中，进行下一步操作。
5)在2ml RNase-free离心管中加入等体积70％乙醇，颠倒混匀。
6)得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中，10000rpm离心45秒，弃掉废液。
7)加入500ul去蛋白液RE，12000rpm离心60秒，弃掉废液。
8)加入700ul漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液。
9)重复步骤8一次。
10)将吸附柱RA放回空收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。
11)取出吸附柱RA，放入一个RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50uL RNase-free water(在65℃水浴锅中预热)，室温放置两分钟，12000rpm离心1分钟。
RNA提取完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测，并测定浓度及纯度。
以1μg总RNA为模板，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)，按照说明进行cDNA合成。将合成的第一链的cDNA稀释10倍，用作定量RT-qPCR模板。
依据BpbHLH10基因全长序列，设计RT-qPCR引物，利用RT-qPCR技术对胁迫处理白桦材料中BpbHLH10基因的表达模式进行分析。选取白桦Ubiquitin基因和α-tubulin基因作为内参基因进行RT-qPCR，每个样品设置3个生物学重复，使用Livak法进行目的基因的相对表达量分析(作图时基因的表达量进行了log2转化，正值表示基因表达上调，负值表示基因表达下调)。反应所需引物见表1，RT-qPCR反应体系如下：
Figure BDA0003694030740000061
Figure BDA0003694030740000071
RT-qPCR反应程序：95℃1min 95℃30s 58℃30s，45个循环；72℃30s，82℃读板1s。
表1实时荧光定量RT-PCR基因及内参引物序列
Figure BDA0003694030740000072
3瞬时转BpbHLH10基因白桦的获得和耐逆性鉴定
3.1根据BpbHLH10基因序列设计引物，在其上、下游分别引入Sma I酶切位点，引物序列分别为：
F：5’CTCTAGAGGATCCCCGGGATGGAAGAGCTCAT 3’
R：5’TCGAGCTCGGTACCCGGGTTACTGCTCTAATC 3’
以白桦cDNA进行PCR扩增获得BpbHLH10基因编码区序列。PCR反应体积为20μL，反应体系为：
Figure BDA0003694030740000073
PCR反应程序：95℃1min 94℃30s 58℃30s，30个循环；72℃1min30s；72℃后延伸7min。
将扩增产物经琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(OMEGA)纯化后，具体操作步骤同试剂盒说明书，产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测回收质量。
3.2过表达载体pROKⅡ-BpbHLH10的构建
含有pROKⅡ空载质粒的大肠杆菌，使用质粒小提试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行pROKⅡ质粒提取，具体操作步骤同试剂盒说明书。产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取质量。
使用Sma I(Promega)核酸内切酶对pROKII载体质粒进行酶切以及纯化回收，酶切反应体系如下：
Figure BDA0003694030740000081
反应条件：25℃4h。
酶切产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用纯化回收试剂盒(OMEGA)对样品进行纯化回收，具体操作步骤同试剂盒说明书。
将基因与用Sma I(Promega)酶切的pROKII载体同源连接。连接体系如下：
Figure BDA0003694030740000082
连接产物转化大肠杆菌Top10菌株，具体步骤如下：
(1)吸取5μL连接液加入感受态细胞，混匀，冰浴30min。
(2)42℃水浴60-90s，冰浴2min。加入400μL新鲜LB液体培养基，37℃，220rpm，震荡培养1h。
(3)4000rpm，离心1min。弃掉300μL上清液。重悬菌体，涂布于kan抗性筛选培养基。37℃倒置培养12-24h。
鉴定阳性克隆，挑取单克隆于液体筛选培养基扩繁，吸取菌液作为模板，使用载体引物进行菌液PCR检测，反应体系如下：
Figure BDA0003694030740000083
PCR反应程序：95℃1min 94℃30s 58℃30s，30个循环；72℃2min；72℃后延伸7min。
PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，阳性克隆送测序，将测序正确的菌株扩繁，提取质粒备用。
经PCR验证和测序鉴定正确后，将重组的质粒(pROKII-BpbHLH10)用电导法转入根癌农杆菌EHA105菌株中，具体操作步骤如下：
(1)将1.0μg重组质粒加入农杆菌感受态细胞中，混匀后转移至干净的电击杯中。
(2)使用1550V电压电击后向电击杯中加入400μL LB培养基，混匀。
(3)混匀后的培养基，转移至1.5mL离心管中，28℃220rpm振荡培养1h。
(4)吸取200μL菌液涂布于筛选培养基中，28℃倒置培养2天。
(5)随机挑取菌点扩繁培养，载体引物进行菌液PCR检测。1％琼脂糖凝胶电泳检测，选取阳性克隆，作为工程菌株备用。
3.3为了进一步在生理学上研究转BpbHLH10基因对抗逆的调控，利用高效瞬时侵染技术以pROKⅡ-35S为对照瞬时侵染野生型白桦一个月的组培苗，并放入分别含有150mMNaCl的溶液中进行胁迫处理，取胁迫后植株用于各种生化染色及生理指标检测，具体操作如下：
3.3.1瞬时侵染白桦组培苗
(1)将pROKⅡ-BpbHLH10和pROKⅡ-35S的农杆菌菌种在的LB固体培养基(含25mg/LRif和50mg/L Kan)上划线分离，28℃倒置培养48h；
(2)挑取携带农杆菌单菌落于5ml LB液体培养基中(含有25mg/L Rif和50mg/LKan)，28℃过夜震荡培养；
(3)取过夜培养的菌液1ml，加入到50ml LB液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养，至对数生长后期，OD600约为0.5；
(4)5000rpm，常温离心10min，弃上清液，收集菌体
(5)加入50ml的1/2MS(含150μM的AS)液体培养基，用移液枪反复吹打菌体使之重悬；
(6)28℃，220rpm震荡培养1h。
(7)取各阶段的白桦实生苗及组培苗放到上述配好的菌液中，22-25℃条件下，转速为120rpm慢摇12h。
3.3.2瞬时侵染白桦植株的生化染色及生理指标检测
(1)DAB染色：
分别取未胁迫处理和胁迫处理12h的实验组及对照组白桦叶片，置于离心管中，加入DAB染色液，室温染色过夜。染色结束后，用75％乙醇与5％甘油煮沸脱色。
(2)NBT染色：
分别取未胁迫处理和胁迫处理12h的实验组及对照组白桦叶片，置于离心管中，加入NBT染色液，室温染色过夜。染色结束后，用75％乙醇与5％甘油煮沸脱色。
(3)Evans blue染色：
分别取未胁迫处理和胁迫处理12h的实验组及对照组白桦叶片，置于离心管中，加入Evans blue染色液，抽真空半小时，保持真空状态染色过夜。染色结束后，用75％乙醇与5％甘油煮沸脱色。
(4)超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(南京建成生物工程研究所有限公司SOD含量测定试剂盒)：
准确称取植物组织(0.2～0.5g)，按重量(g)：体积(ml)＝1：4的比例，加入四倍体积的匀浆介质，剪碎，冰水浴条件下进行匀浆，制备成20％的匀浆液，3500rpm，离心10分钟，取上清液待测，具体操作步骤如下表2所示：
表2操作步骤
Figure BDA0003694030740000101
混匀，室温放置十分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，双蒸水调零，读数。
结果计算：
Figure BDA0003694030740000111
(5)过氧化物酶(POD)活性测定(南京建成生物工程研究所有限公司POD活性测定试剂盒)：
1)前处理：
含水量高的嫩叶植物组织匀浆液的制备：取植物组织擦净水分及杂质，准确称取植物组织重量，按照重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例加入9倍体积的匀浆介质(推荐使用生理盐水或磷酸盐缓冲液：0.1mol/LpH7～7.4)，冰水浴条件下制备成10％的组织匀浆液，3500rpm离心10分钟后，取上清液进行测定。
含水量较低的干燥植物组织匀浆液的制备：取植物组织擦净水分及杂质，剪碎后放入研钵，加入液氮，研磨成粉状后转移出来，然后准确称取重量，按照重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例加入9倍体积的匀浆介质(推荐使用生理盐水或磷酸盐缓冲液：0.1mol/LpH＝7～7.4)，漩涡混匀抽提3-5分钟后，3500rpm离心10分钟，取上清液进行测定。
2)具体操作步骤如下表3所示：
表3操作步骤
Figure BDA0003694030740000112
Figure BDA0003694030740000121
混匀，11000rpm离心10分钟，取上清于420nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测定。
结果计算：
定义：在37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化1ug底物的酶量定义为一个酶活力单位。
计算公式：
Figure BDA0003694030740000122
(6)H2O2含量的测定(南京建成生物工程研究所有限公司H2O2含量测定试剂盒)
准确称取组织重量，按照重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例，加入9倍体积的0.9％的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，1000rpm离心10分钟，取上清10％匀浆待测。具体操作步骤如下表4所示：
表4操作步骤
Figure BDA0003694030740000123
Figure BDA0003694030740000131
混匀，波长405nm，光径1cm下用双蒸水调零，测定各管吸光度值并记录。
结果计算：
Figure BDA0003694030740000132
(7)蛋白浓度的测定(南京建成生物工程研究所有限公司蛋白浓度测定试剂盒)：
1)前处理：
称取为0.1g的白桦植物组织，液氮条件下研磨成粉，按照重量(g)：体积(mL)＝1：9的比例加入生理盐水，10000rpm离心10分钟后，取上清液。然后用生理盐水按1：9的比例稀释成1％的组织匀浆，作为待测液。
具体操作步骤如下表5所示：
表5操作步骤
空白管 标准管 测定管
双蒸水(mL) 0.05
蛋白标准品(mL) 0.05
样品(mL) 0.05
考马斯亮蓝染色液(mL) 3 3 3
充分混匀，静置10分钟，于波长595nm处，光径1cm，蒸馏水调零，测定各管吸光度值。
结果计算：
Figure BDA0003694030740000141
(8)相对电导率的测定：
取瞬时侵染后3-5片、大小一致的新鲜叶片，依次用双蒸水和超纯水冲洗3次，滤纸吸干表面水分，放于50mL的离心管中。加入超纯水30mL，真空泵抽15min，用电导仪测其电导值，记为S1；然后将离心管于90℃恒温水浴锅中水浴20min，然后冷却至室温，测其电导值，记为：S2。
结果计算：
相对电导率＝S1/S2*100％
结果：
1白桦BpbHLH10基因的克隆与序列分析
1.1白桦BpbHLH10基因的克隆
提取野生型白桦的总RNA，设计引物进行PCR扩增，胶回收获得目的片段，将其连入T载体后进行测序，然后获得完整的编码区(CDS)的BpbHLH10基因序列如SEQ ID No.1所示：
获得的BpbHLH10基因编码区长1452bp，编码483个氨基酸。BLASTx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastx&BLAST_PROGRAMS＝blastx&PAGE_TYPE＝BlastSearch&SHOW_DEFAULTS＝on&LINK_LOC＝blasthome)相似性分析，BpbHLH10蛋白包含有保守的bHLH保守域(图1),为bHLH家族基因。白桦BpbHLH10氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
2、利用生物信息学软件和在线网络资源对克隆获得的BpbHLH10基因进行序列分析：
对获得的BpbHLH10基因用ProtParam(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)软件计算推导的蛋白质分子量及理论等电点。利用Blast程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列同源性搜索，选择与其相似程度高的其他不同植物的bHLH蛋白的氨基酸序列，用多序列联配程序Clustalx(1.83)进行多序列比对。
结果表明该基因编码蛋白分子量为119.58kDa，理论等电点为4.96。
进一步通过Biodiet软件对该基因编码蛋白序列与其他相似程度高的植物的bHLH蛋白的序列同源性比较发现，白桦BpbHLH10蛋白属于bHLH转录因子(图2)。系统树构建显示，白桦BpbHLH10蛋白与目前已知其他物种的bHLH蛋白的序列差异较为相近，其中BpbHLH10转录因子与拟南芥的bHLH转录因子遗传距离最近(图1，2)。
2逆境胁迫后白桦BpbHLH10基因表达模式分析
对盐胁迫下白桦BpbHLH10基因在根组织部位中的表达模式进行分析，结果如图3所示。结果显示，在NaCl胁迫条件下，在处理0.5-48h内，以未胁迫处理的材料为对照，BpbHLH10基因的表达量分别为2.41、4.42、4.225、4.205、5.595、4.32、4.68。在不同胁迫处理下，BpbHLH10基因的表达量有不同的变化，随着胁迫时间的延长，BpbHLH10基因的表达量随着处理时间的增加逐渐升高，到12h达到高峰。在24h表达量与12h时相比有所下降，48h时又有相应上升。结果表明BpbHLH10基因的表达能够响应盐处理，该基因可能与抗逆胁迫相关。
3转BpbHLH10基因白桦的获得和耐逆性鉴定
根据BpbHLH10基因序列设计扩增引物，将扩增产物经琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(OMEGA)纯化后，与用Sma I(Promega)酶切的pROKII载体连接。连接产物转化大肠杆菌Top10菌株，经PCR验证和测序鉴定正确后，将重组的质粒用电导法转入根癌农杆菌EHA105菌株中，得到阳性重组菌。
为了进一步在生理学上研究转BpbHLH10基因对抗逆的调控，利用高效瞬时侵染技术以pROkⅡ-35S为对照瞬时侵染野生型白桦一个月的组培苗，并放入分别含有150mM NaCl的溶液中进行胁迫处理，取侵染后植株用于各种生化染色及生理指标检测。
3.1DAB染色
细胞中H2O2释放出的氧离子能够氧化DAB，形成棕色沉淀，根据染色的深浅，能判断细胞中H2O2释放量的多少，细胞受损伤越严重，H2O2释放的越多。分别取未胁迫处理和胁迫处理12h的实验组和对照组白桦叶片进行DAB染色，染色结果如图4。
在非胁迫生长条件下(control)，实验组植株以及对照组植株叶片颜色较浅，且相互之间无明显差异，说明H2O2含量大致相同；在NaCl非生物胁迫条件下，实验组以及对照组植株叶片上的颜色发生明显的变化。转BpbHLH10基因的植株叶片上的颜色比对照组白桦叶片上的颜色浅，表明实验组植株叶片内的H2O2的含量较对照组白桦植株叶片内的H2O2含量少，说明转BpbHLH10基因株系受胁迫之后的损伤程度低。实验结果证明BpbHLH10基因在白桦植株体内起抗逆作用。
3.2NBT染色
NBT染色结果可以用来检测植物中超氧阴离子(O2-)的含量，根据染色的深浅，能判断细胞中超氧阴离子(O2-)的多少，细胞受损伤越严重，超氧阴离子(含量O2-)越多。分别取未胁迫处理和胁迫处理12h的实验组和对照组白桦叶片进行NBT染色，染色结果如图5。
在非胁迫生长条件下(control)，实验组植株以及对照组植株叶片颜色较浅，且相互之间无明显差异，说明超氧阴离子(O2-)含量大致相同；在NaCl非生物胁迫条件下，实验组以及对照组植株叶片上的颜色发生明显的变化。转BpbHLH10基因的植株叶片上的颜色比对照组白桦叶片上的颜色浅，表明实验组植株叶片内的超氧阴离子(O2-)的含量较对照组白桦植株叶片内的超氧阴离子(O2-)含量少，说明转BpbHLH10基因株系受胁迫之后的损伤程度低。实验结果说明BpbHLH10基因能够正向调控植物的抗逆功能。
3.3 Evans blue染色
Evans blue染色液可以进入死细胞，并将其染成蓝色，根据染色的深浅，能判断细胞中死细胞的多少，细胞受损伤越严重，死细胞越多。分别取未胁迫处理和胁迫处理12h的实验组和对照组白桦叶片进行Evans blue染色，染色结果如图6。
在非胁迫生长条件下(control)，实验组植株以及对照组植株叶片颜色较浅，且相互之间无明显差异，说明死细胞数量大致相同；在NaCl非生物胁迫条件下，实验组以及对照组植株叶片上的颜色发生明显的变化。转BpbHLH10基因的植株叶片上的颜色比对照组白桦叶片上的颜色浅，表明实验组植株叶片内的死细胞的数量较对照组白桦植株叶片内的死细胞数量少，说明转BpbHLH10基因株系受胁迫之后的损伤程度低。实验结果证明BpbHLH10基因能提高白桦植株的抗逆能力。
3.4超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(南京建成生物工程研究所有限公司SOD含量测定试剂盒)
SOD可以催化超氧阴离子自由基的歧化反应，抵抗活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的损伤，从而提高植物的抗逆能力，测定结果如图7。
在NaCl的非生物胁迫条件下，BpbHLH10基因的过表达瞬时侵染植株的SOD活性为955.1U/g，对照组的SOD活性为709.5U/g，实验组SOD活性为高于对照组，说明瞬时侵染后过表达植株的抗逆境胁迫能力比对照植株强。实验结果表明BpbHLH10基因能够正向调控SOD活性。
3.5过氧化物酶(POD)活性测定(南京建成生物工程研究所有限公司POD活性测定试剂盒)
在过氧化物酶(POD)催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，过氧化物酶是植物体内降低氧自由基伤害的重要保护酶，和植物的抵御逆境胁迫能力紧密相关，实验结果如图8。
在非胁迫条件下(control)，实验组和对照组白桦株系的POD活性大致相同；在NaCl的非生物胁迫条件下，实验组及对照组白桦株系的POD活性发生了变化。过表达BpbHLH10基因的瞬时侵染株系的POD活性为65.5U/g，对照POD活性为38.9U/g，实验组高于对照组，说明实验组植株的抵御逆境胁迫能力比对照强。结果说明BpbHLH10基因的表达量与POD的酶活正相关，说明其能够通过调控植物体内的抗氧化酶活性来提高植物的抗逆能力。
3.6 H2O2含量的测定(南京建成生物工程研究所有限公司H2O2含量测定试剂盒)
H2O2作为活性氧，在生物体内普遍存在，更是活性氧之间转化的重要枢纽。在众多氧化代谢产物中，H2O2会使细胞衰老和解体这一过程加速，其原理是其能够对细胞膜产生损害，并直接或者间接使生物大分子氧化，在逆境胁迫下，植物抵抗逆境的能力越强，体内积累的H2O2含量就越低，实验结果如图9所示。
如图9示，在NaCl的非生物胁迫条件下，实验组及对照组白桦株系的H2O2浓度发生了变化。过表达BpbHLH10基因的瞬时侵染株系的H2O2浓度为23.7mmol/L，对照的浓度为30.8mmol/L，实验组的H2O2浓度低于对照，说明实验组植株的抵御逆境胁迫能力比对照强。结果说明过表达BpbHLH10基因能够提高植物抗逆能力。
3.7总蛋白浓度的测定(南京建成生物工程研究所有限公司蛋白浓度测定试剂盒)
植物体内的可溶性蛋白质大多是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标，植物体内蛋白的含量多少可以反映出植物抗逆境胁迫的能力，在逆境胁迫下，植物抵抗逆境的能力越强，其总蛋白含量就越高，实验结果如图10所示。
如图10所示，在NaCl的非生物胁迫条件下，实验组及对照组白桦株系的蛋白浓度发生了变化。过表达BpbHLH10基因的瞬时侵染株系的蛋白浓度为15.7gprot/L，对照的蛋白浓度为7.6gprot/L，实验组的蛋白浓度高于对照，说明实验组植株的抵御逆境胁迫能力比对照强。结果说明过表达BpbHLH10基因与植物的抗逆能力正相关。
3.8相对电导率的测定
植物叶肉相对电导率是反应植物细胞膜透性的一项基本指标，当植物受到逆境影响时，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗。植物的相对电导率越高反映了其抗逆能力的越高，实验结果如图11所示。
在非胁迫条件下(control)，实验组和对照组白桦株系的相对电导率大致相同；在NaCl的非生物胁迫条件下，实验组及对照组白桦株系的相对电导率发生了变化。过表达BpbHLH10基因的瞬时侵染株系的相对电导率为10％，对照的相对电导率为14％，实验组的相对电导率低于对照，说明实验组植株的抵御逆境胁迫能力比对照强，过表达BpbHLH10基因能够提高植物的抗逆能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure BDA0003694030740000191
Figure BDA0003694030740000201
Figure BDA0003694030740000211
Figure BDA0003694030740000221
Figure BDA0003694030740000231
Figure BDA0003694030740000241
序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> 一种提高白桦耐盐能力的BpbHLH10基因及其编码的蛋白
<141> 2022-06-06
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggaagagc tcataatctc tccctcttca tcttcctctc tagtatcttt gccccaagaa 60
accccaccaa cccttcaaca aaggctccaa ttcgtagtcc aaagccaacc ggactggtgg 120
acttacgcca ttttctggca atccgccaac gacgacaatg gccagatgtt cttggcctgg 180
ggcgacggcc atttcctagg caccaaagac acatccccta agctctccca catcaacagt 240
acccaccacc accaccccat gtcagtccta cattccgaaa gaagaaaatt catgagggat 300
atccaatcca tgatcatcac cgaaaaccac caagacatcg ataacatgtc cgatgtcaca 360
gacgccgaat ggttctatgt catgtcctta acccgctctt tcgcccccgg cgacggcgtg 420
ctcggcaagg cctttagtac taattctctg gtgtggctga ccggcggcca tgagcttcag 480
tactacagct gcgagagagc taaagaagct caaatgcacg ggattgagac tctggtctgt 540
atcccaactt ccagtgggat tctcgaaatg ggttctcagg agataatcag agagaactgg 600
ggtttagtcc aacaagccaa gtctttattc gggtcggatc tcattggctt ggtacccaag 660
caacccaacc caagttccgg gccgatgcaa tttcttgacc gaaacatttc tttcgcggat 720
atcggcataa ttgccggcgt acaagaagag gatcataatt ctcaagaaga ggagaacaag 780
aagaagaaga agaaagagtg ctttaaagga gcacaatcat cctacgtgga ctcggagcac 840
tctgattccg attgtcctct aatcgccgtg aacatagaga aaagaacacc caagaaaaga 900
gggagaaaac cggggctcgg ccgcgacacg ccgttgaacc acgtggaggc ggagcggcag 960
cggcgagaga agttgaacca ccggttctac gctctgcgag ccgtggtacc gaacgtgtcg 1020
agaatggaca aggcatcttt gctctccgac gcggtgtcgt acatcaacga gctgaagacc 1080
aagatcgatg agctggagtc gcagcttcaa agagattcga agaaagtgaa gttagaactg 1140
gctgatacca tggacaacca aagcaccacc acctcagtcg accaaacaag gcctaattca 1200
ggcgggttgg cgctcgaggt cgagatcaag attgtgggac ttgatgccat gattagggtt 1260
caatccgaga atgttaatta cccgtcagca cggttaatgg gtgcgctacg tgacctagag 1320
ttgcaaatcc accatgcaag catgtcttgc gtcaacgaac tcatgcttca ggatgttgtg 1380
gtgagggttc ctgaaggatt gagaactgaa gagggtctta aaactgctct tctcagaaga 1440
ttagagcagt aa 1452
<210> 2
<211> 483
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Glu Glu Leu Ile Ile Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Leu Val Ser
1               5                   10                  15
Leu Pro Gln Glu Thr Pro Pro Thr Leu Gln Gln Arg Leu Gln Phe Val
            20                  25                  30
Val Gln Ser Gln Pro Asp Trp Trp Thr Tyr Ala Ile Phe Trp Gln Ser
        35                  40                  45
Ala Asn Asp Asp Asn Gly Gln Met Phe Leu Ala Trp Gly Asp Gly His
    50                  55                  60
Phe Leu Gly Thr Lys Asp Thr Ser Pro Lys Leu Ser His Ile Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr His His His His Pro Met Ser Val Leu His Ser Glu Arg Arg Lys
                85                  90                  95
Phe Met Arg Asp Ile Gln Ser Met Ile Ile Thr Glu Asn His Gln Asp
            100                 105                 110
Ile Asp Asn Met Ser Asp Val Thr Asp Ala Glu Trp Phe Tyr Val Met
        115                 120                 125
Ser Leu Thr Arg Ser Phe Ala Pro Gly Asp Gly Val Leu Gly Lys Ala
    130                 135                 140
Phe Ser Thr Asn Ser Leu Val Trp Leu Thr Gly Gly His Glu Leu Gln
145                 150                 155                 160
Tyr Tyr Ser Cys Glu Arg Ala Lys Glu Ala Gln Met His Gly Ile Glu
                165                 170                 175
Thr Leu Val Cys Ile Pro Thr Ser Ser Gly Ile Leu Glu Met Gly Ser
            180                 185                 190
Gln Glu Ile Ile Arg Glu Asn Trp Gly Leu Val Gln Gln Ala Lys Ser
        195                 200                 205
Leu Phe Gly Ser Asp Leu Ile Gly Leu Val Pro Lys Gln Pro Asn Pro
    210                 215                 220
Ser Ser Gly Pro Met Gln Phe Leu Asp Arg Asn Ile Ser Phe Ala Asp
225                 230                 235                 240
Ile Gly Ile Ile Ala Gly Val Gln Glu Glu Asp His Asn Ser Gln Glu
                245                 250                 255
Glu Glu Asn Lys Lys Lys Lys Lys Lys Glu Cys Phe Lys Gly Ala Gln
            260                 265                 270
Ser Ser Tyr Val Asp Ser Glu His Ser Asp Ser Asp Cys Pro Leu Ile
        275                 280                 285
Ala Val Asn Ile Glu Lys Arg Thr Pro Lys Lys Arg Gly Arg Lys Pro
    290                 295                 300
Gly Leu Gly Arg Asp Thr Pro Leu Asn His Val Glu Ala Glu Arg Gln
305                 310                 315                 320
Arg Arg Glu Lys Leu Asn His Arg Phe Tyr Ala Leu Arg Ala Val Val
                325                 330                 335
Pro Asn Val Ser Arg Met Asp Lys Ala Ser Leu Leu Ser Asp Ala Val
            340                 345                 350
Ser Tyr Ile Asn Glu Leu Lys Thr Lys Ile Asp Glu Leu Glu Ser Gln
        355                 360                 365
Leu Gln Arg Asp Ser Lys Lys Val Lys Leu Glu Leu Ala Asp Thr Met
    370                 375                 380
Asp Asn Gln Ser Thr Thr Thr Ser Val Asp Gln Thr Arg Pro Asn Ser
385                 390                 395                 400
Gly Gly Leu Ala Leu Glu Val Glu Ile Lys Ile Val Gly Leu Asp Ala
                405                 410                 415
Met Ile Arg Val Gln Ser Glu Asn Val Asn Tyr Pro Ser Ala Arg Leu
            420                 425                 430
Met Gly Ala Leu Arg Asp Leu Glu Leu Gln Ile His His Ala Ser Met
        435                 440                 445
Ser Cys Val Asn Glu Leu Met Leu Gln Asp Val Val Val Arg Val Pro
    450                 455                 460
Glu Gly Leu Arg Thr Glu Glu Gly Leu Lys Thr Ala Leu Leu Arg Arg
465                 470                 475                 480
Leu Glu Gln
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ctctagagga tccccgggat ggaagagctc at 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tcgagctcgg tacccgggtt actgctctaa tc 32
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ggaggacaag gtggaggg 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gattgagggg agggatgc 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tggctcgaat gcactgttgg 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tcaaccgcct tgtctctcag g 21

Claims (8)

1.BpbHLH10基因在白桦耐盐胁迫中的应用；
所述BpbHLH10基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BpbHLH10基因在降低白桦叶片过氧化氢含量中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BpbHLH10基因在降低白桦叶片超氧阴离子含量中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BpbHLH10基因在提高白桦超氧化物歧化酶活性中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BpbHLH10基因在提高白桦过氧化物酶活性中的应用。
6.一种培育耐盐胁迫白桦的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将权利要求1中所述的BpbHLH10基因连接到pROKII载体中，得到过表达载体；
2)将所述步骤1)得到的过表达载体采用电导法转入到根癌农杆菌中，得到重组菌；
3)将所述步骤2)得到的重组菌采用高效瞬时侵染技术侵染白桦，得到耐盐胁迫白桦植株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，扩增BpbHLH10基因使用的引物为上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。
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