CN106119267B

CN106119267B - 一种枣树超氧化物歧化酶基因及其应用

Info

Publication number: CN106119267B
Application number: CN201610678308.0A
Authority: CN
Inventors: 聂园军; 曹秋芬; 李建军; 肖蓉; 邓舒; 董艳辉; 薄晓峰; 李亚莉; 侯丽媛; 侯富恩
Original assignee: Institute Of Agricultural And Environment Resources And Economic Shanxi Academy Of Agricultural Sciences; Biotechnology Research Center of Shanxi Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Agricultural And Environment Resources And Economic Shanxi Academy Of Agricultural Sciences; Biotechnology Research Center of Shanxi Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-08-17
Filing date: 2016-08-17
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2036-08-17
Also published as: CN106119267A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种枣树超氧化物歧化酶基因及其应用，该基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列，核苷酸序列编码的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。本发明首次从枣树中分离出枣树超氧化物歧化酶基因ZjSOD，构建植物表达载体，获得转基因拟南芥植株，该基因作为目的基因导入植物，对于植物品种改良具有重要的现实意义，对于具有优良抗性的植物的抗逆机制的深入研究，有助于明确逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，为进一步充分利用这些优良抗性基因来提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础，同时有助于了解SOD在植物活性氧信号转导中的作用，促进人们对活性氧作为信号分子的了解。

Description

一种枣树超氧化物歧化酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种枣树超氧化物歧化酶基因及其应用。

背景技术

植物在逆境条件下会产生大量活性氧类（如H₂O₂、OH^—、O₂ ^—）引起蛋白变性、DNA突变和膜脂氧化等而危及正常的生理活动。植物为了将活性氧的损伤效应降至最低，已进化形成了一系列的酶学及非酶学机制清除活性氧。超氧化物歧化酶（SODs，EC1.15.1.1.）是一类广泛存在于植物体内的金属酶，能专一地清除生物氧化中的超氧阴离子自由基，将其发生歧化反应生成O₂和H₂O₂。根据酶活性位点的金属辅因子，SOD可以分为三类：Cu/ZnSOD、FeSOD和Mn-SOD，Cu/ZnSOD蛋白主要存在于细胞质或叶绿体中、MnSOD蛋白存在于线粒体、FeSOD蛋白存在于叶绿体中。

人们已利用基因工程的方式将外源SOD基因转入特定的植物体内来研究其作用机制和生理功能。Cannon 等在1987年首次从玉米中克隆得到超氧化物歧化酶基因，随后在番茄、烟草、水稻、拟南芥、桃子、木薯、小麦、苜蓿、甘蔗等植物中克隆获得SOD基因，研究成果为：低温胁迫条件下的超表达SOD 基因的苜蓿生长状况明显优于野生型；SOD转基因玉米植株抗氧化胁迫的能力明显增强；Que 等克隆得到甘蔗Mn-SOD 的全长序列，并发现黑穗病菌处理可显著诱导其表达；烟草Cu/Zn-SOD 在NaCl 胁迫下呈现上调表达；木薯Cu/Zn-SOD 在外源胁迫条件下（如NaCl、ABA、乙烯和蔗糖）的表达量均显著增加；在盐胁迫条件下，超表达小麦Cu/Zn-SOD 的转基因烟草能明显缓解NaCl 对植株的伤害作用；干旱胁迫下草地早熟禾叶片中的胞质和叶绿体Cu/Zn-SOD 表达量下调；而在百脉根叶片中的胞质和叶绿体Cu/ Zn-SOD 的表达水平在NaCl 胁迫下均上调；外源ABA 胁迫抑制东方山羊草Cu/Zn-SOD的表达，而PEG和NaCl胁迫诱导该基因的表达。

植物中SODs的结构、对底物的特异性及在植物组织的分布上都不相同，它们对抵御外界胁迫起了很重要的作用，但我们对其功能及结构特性的认识仍很有限，还需要做大量的工作。因此，克隆和鉴定植物中SODs，研究抗逆机制以及与逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，可为充分利用这些优良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础。

到目前为止，未见有从枣树中分离出枣树超氧化物歧化酶基因用于植物品种改良上的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枣树超氧化物歧化酶基因及其应用。

本发明是采用如下技术方案实现的：一种枣树超氧化物歧化酶基因，该基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列。

该基因的核苷酸序列开放阅读框编码的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。

该枣树超氧化物歧化酶基因是以壶瓶枣结果枝cDNA为模板，由下述引物对为引物扩增得到的：

上游引物P1的序列为：5'—acgaattcagatggcaatgggaagtg—3'，

下游引物P2的序列为：5'—atcccgggtagcagactctctctcata—3'。

上述枣树超氧化物歧化酶基因在提高植物抗逆性中的应用。

本发明从山西省农业科学院生物技术研究中心园艺作物生物技术研究室构建壶瓶枣（Ziziphus jujuba Mill hupingzao）结果枝（即枣吊）cDNA文库中筛选到枣树超氧化物歧化酶基因的全序列，将其命名为ZjSOD（ Z iziphus j ujuba superoxide dismutases）。生物信息学分析表明ZjSOD基因cDNA序列全长为699 bp，编码232个氨基酸，其中包含有22个酸性氨基酸，24个碱性氨基酸，计算得知蛋白质的相对分子量为25.5971 KD，理论等电点为8.59。

根据枣树超氧化物歧化酶基因cDNA编码的序列，设计带有EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位点的特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其上游引物为P1的序列为：5'—acgaattcagatggcaatgggaagtg—3'，包含EcoRⅠ限制性酶切位点（即有下划线部分）；下游引物为P2的序列为：5'—atcccgggtagcagactctctctcata—3'，包含该SmaⅠ限制性酶切位点（即下划线部分）。经限制性内切酶EcoRⅠ和SmaⅠ修饰后连接于携带有黄色荧光蛋白基因YFP的植物表达载体PEZR(K)-LNY上，然后再经含卡纳霉素的LB平板筛选转化子、PCR鉴定、酶切鉴定、测序证明植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjSOD构建成功。通过冻融法将携带目的基因的植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjSOD转入农杆菌LBA4404的感受态细胞中，经含卡纳霉素的LB平板筛选转化子、PCR鉴定、酶切鉴定、测序证明工程菌PEZR(K)-LNY-ZjSOD构建成功。农杆菌介导ZjSOD基因通过浸花法转化拟南芥，经含卡那霉素Km的MS培养基筛选获得含有目的基因ZjSOD的转基因拟南芥植株T₀代，经PCR鉴定目的基因证实ZjSOD成功转入拟南芥。

为了进一步研究枣树超氧化物歧化酶基因在非生物胁迫（高盐、渗透）条件下的表达分析，用不同浓度的NaCl处理野生型枣幼苗，提取RNA，逆转录为cDNA后，对ZjSOD基因进行表达分析，结果显示：与未用NaCl处理的对照相比，ZjSOD基因受盐胁迫的诱导，同时分别用不同浓度的PEG6000处理野生型枣幼苗，提取RNA，逆转录为cDNA后，对ZjSOD基因进行表达分析，结果显示：与未用PEG处理的对照相比，ZjSOD基因受PEG6000（模拟干旱条件）的诱导，以上两个实验表明ZjSOD基因在转录水平受盐和干旱诱导。

为了进一步研究枣树超氧化物歧化酶基因在植物生长发育中的功能，本发明构建了ZjSOD基因的过量表达载体，转化拟南芥，对获得的转基因阳性株系进行表型分析与功能研究，主要研究内容包括 ZjSOD基因在种子萌发时期参与盐、PEG和ABA胁迫应答试验，结果表明ZjSOD增强了转基因种子对盐、PEG的敏感性，同时增强了对H₂O₂的耐受性；在幼苗发育时期参与盐、PEG和ABA胁迫应答试验，结果表明在拟南芥中过量表达ZjSOD增强了植株对盐胁迫和PEG的敏感性，同时增强了对H₂O₂的耐受性；此外通过ZjSOD转基因拟南芥在盐、PEG和H₂O₂胁迫条件下生理指标的测定分析，表明ZjSOD基因可能在幼苗发育早期参与盐、渗透胁迫及H₂O₂的应答；为了研究ZjSOD基因参与干旱、高盐胁迫应答及ROS信号通路的机制，选取参与盐信号通路应答的SOS2基因、参与干旱胁迫RD29A和ERD15及参与ROS信号通路相关基因CAT1、APX1和GPX3进行转录水平上的表达分析，结果表明，ZjSOD基因在ROS信号途径中起正调控作用，而在干旱和高盐胁迫中起负调控作用，同时也暗示ZjSOD基因可能直接参与ROS信号途径，从而间接参与干旱和高盐胁迫应答。

与现有技术相比，本发明首次从枣树中分离出枣树超氧化物歧化酶基因ZjSOD，该基因作为目的基因导入植物，对于植物品种改良具有重要的现实意义，对于具有优良抗性的植物的抗逆机制的深入研究，有助于明确逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，为进一步充分利用这些优良抗性基因来提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础，同时有助于了解SOD在植物活性氧信号转导中的作用，促进人们对活性氧作为信号分子的了解。

附图说明

图1 ZjSOD蛋白质结构预测图；

图2 ZjSOD与其他物种的SOD蛋白的亲缘关系图谱；图中：红桐树(Avicenniamarina) AAN15216.1, 大麻(Datisca glomerata) AEK82129.1, 油桐(Pistacia vera)ABR29644.1, 桃树(Prunus persica) AFH08811.1、AFH08815.1、Q9SM64.1、XP_007218297.1, 芭蕉树(Musa acuminate) AFX61786.1, 柄扁桃(Prunus pedunculata)AHW49466.1, 橡胶树(Hevea brasiliensis) CAB53458.1、CAC13961.1, 亚洲棉(Gossypium arboretum) KHG05444.1, 梅(Prunus mume) XP_008242423.1、 XP_008233869.1, 桑树(Morus notabilis) XP_010103633.1, 醉蝶花(Tarenayahassleriana) XP_010558055.1 ；

图3为与ZiSOD同源性较高的蛋白的序列比对分析结果；

图4为不同浓度的NaCl处理野生型枣幼苗；

图5为ZjSOD基因在不同浓度NaCl胁迫条件下的表达分析；

图6为不同浓度的PEG6000处理野生型枣幼苗；

图7为ZjSOD基因在不同浓度PEG6000胁迫条件下的表达分析；

图8为ZjSOD转基因拟南芥种子种植在MS培养基上的种子萌发率统计分析；

图9 为ZjSOD转基因拟南芥种子种植在MS+150mM NaCl培养基上的种子萌发率统计分析；

图10为ZjSOD转基因拟南芥种子种植在MS+0.5 Pa PEG6000培养基上的种子萌发率统计分析；

图11为ZjSOD转基因拟南芥种子种植在MS+5 mM H₂O₂培养基上的种子萌发率统计分析；

图12 为方法一中ZjSOD过量表达转基因拟南芥分别种植在MS、MS+150 mM NaCl、MS+0.5 Pa PEG6000、MS+5 mM H₂O₂培养基上进行培养观察幼苗的生长状况；

图13 为方法一中ZjSOD过量表达转基因拟南芥在NaCl胁迫条件下幼苗的生长状况分析；

图14 为方法一中ZjSOD过量表达转基因拟南芥在PEG6000胁迫条件下幼苗的生长状况分析；

图15 为方法一中ZjSOD过量表达转基因拟南芥在H₂O₂胁迫条件下幼苗的生长状况分析；

图16为方法二中ZjSOD过量表达转基因拟南芥分别种植在MS、MS+150 mM NaCl、MS+0.5 Pa PEG6000、MS+5 mM H₂O₂培养基上进行培养观察幼苗的生长状况；

图17为方法二中ZjSOD过量表达转基因拟南芥在正常生长条件下幼苗的生长状况分析；

图18 为方法二中ZjSOD过量表达转基因拟南芥在NaCl胁迫条件下幼苗的生长状况分析；

图19 为方法二中ZjSOD过量表达转基因拟南芥在PEG6000胁迫条件下幼苗的生长状况分析；

图20 为方法二中ZjSOD过量表达转基因拟南芥在H₂O₂胁迫条件下幼苗的生长状况分析；

图21 为ZjSOD转基因拟南芥在盐、PEG6000和H₂O₂胁迫条件下SOD活性的测定分析；

图22为ZjSOD转基因拟南芥在盐、PEG6000和H₂O₂胁迫条件下CAT活性的测定分析；

图23为ZjSOD转基因拟南芥在盐、PEG6000和H2O2胁迫条件下POD活性的测定分析；

图24为ZjSOD转基因拟南芥在盐、PEG6000和H₂O₂胁迫条件下丙二醛（MDA）的测定分析；

图25为ZjSOD转基因拟南芥在盐、PEG6000和H₂O₂胁迫条件下离子泄露变化的测定分析；

图26为ZjSOD转基因拟南芥在盐、PEG6000和H₂O₂胁迫条件下脯氨酸含量变化的测定分析；

图27为RT-PCR分析参与盐胁迫应答相关基因SOS2的表达；

图28为 RT-PCR分析参与干旱胁迫应答相关基因RD29A的表达；

图29为RT-PCR分析参与干旱胁迫应答相关基因ERD15的表达；

图30 为RT-PCR分析参与ROS信号通路相关基因CAT1的表达；

图31 为RT-PCR分析参与ROS信号通路相关基因APX1的表达；

图32为RT-PCR分析参与ROS信号通路相关基因GPX3的表达。

具体实施方式

实施例1：枣树超氧化物歧化酶基因ZjSOD的生物学信息分析

本发明从山西省农业科学院生物技术研究中心园艺作物生物技术研究室构建壶瓶枣（Ziziphus jujuba Mill hupingzao）结果枝（即枣吊）cDNA文库中筛选到枣树超氧化物歧化酶基因的全序列，将其命名为ZjSOD（ Z iziphus j ujuba superoxide dismutases），通过在NCBI网站分析显示：ZjSOD1蛋白质结构具有保守的SOD结构域（图1），属于Fe-SOD型。通过从不同物种中寻找与ZjSOD蛋白同源性较高，序列相似度较高的蛋白序列，进行系统进化关系分析，结果显示ZjSOD与橡胶树CAB53458.1和CAC13961.1亲缘关系较近，位于进化树的同一分枝上，与桃树Q9SM64.1处于同一亚枝（图2）。挑选与ZjSOD蛋白同源性较高序列比对分析（图3），结果表明ZjSOD与橡胶树CAB53458.1和CAC13961.1的氨基酸相似度分别为82.09% 和80.74%，同源性较高，与桃树Q9SM64.1氨基酸相似度为76.43%（表1）。

生物信息学分析表明：ZjSOD基因cDNA序列全长为699 bp，编码232个氨基酸，其中包含有22个酸性氨基酸，24个碱性氨基酸，计算得知蛋白质的相对分子量为25.5971 KD，理论等电点为8.59。

上述生物信息学分析方法均为本领域技术人员熟知的常规技术手段。

实施例2：枣树超氧化物歧化酶基因ZjSOD表达载体的构建、扩增及农杆菌介导ZjSOD基因转化拟南芥

根据枣树超氧化物歧化酶基因cDNA编码的序列，设计带有EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位点的特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其上游引物为P1的序列为：5'—acgaattcagatggcaatgggaagtg—3'，包含EcoRⅠ限制性酶切位点（即有下划线部分）。下游引物为P2的序列为：5'—atcccgggtagcagactctctctcata—3'，包含该SmaⅠ限制性酶切位点（即下划线部分）。经限制性内切酶EcoRⅠ和SmaⅠ修饰后连接于携带有黄色荧光蛋白基因YFP的植物表达载体PEZR(K)-LNY上，然后再经含卡纳霉素的LB平板筛选转化子、PCR鉴定、酶切鉴定、测序证明植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjSOD构建成功。通过冻融法将携带目的基因的植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjSOD转入农杆菌LBA4404的感受态细胞中，经含卡纳霉素的LB平板筛选转化子、PCR鉴定、酶切鉴定、测序证明工程菌PEZR(K)-LNY-ZjSOD构建成功。农杆菌介导ZjSOD基因通过浸花法转化拟南芥，经含卡那霉素Km的MS培养基筛选获得含有目的基因ZjSOD的转基因拟南芥植株T₀代，经PCR鉴定目的基因证实ZjSOD成功转入拟南芥。

实施例3：ZjSOD基因在非生物胁迫（高盐、渗透）条件下的表达分析

1、ZjSOD基因在转录水平受高盐诱导

分别用50 mM、100 mM、200 mM和300 mM的NaCl处理野生型枣幼苗（图4），随后提取RNA，逆转录为cDNA后，对ZjSOD基因进行表达分析，结果显示：与未用NaCl处理的对照相比，ZjSOD基因受盐胁迫的诱导，主要表现为在不同浓度NaCl处理相同时间下或者同一浓度NaCl处理不同时间下ZjSOD基因的表达量均显著升高，其中，在100 mM NaCl浓度下处理48h的表达量最高（图5）。

、ZjSOD基因在转录水平受干旱诱导

分别用0.5 Pa、0.8 Pa和1.2 Pa的PEG6000处理野生型枣幼苗（图6），随后提取RNA，逆转录为cDNA后，对ZjSOD基因进行表达分析，结果显示：与未用PEG处理的对照相比，ZjSOD基因受PEG6000（模拟干旱条件）的诱导，主要表现为在不同浓度PEG6000处理相同时间下或者同一浓度PEG6000处理不同时间下ZjSOD基因的表达量均显著升高，其中，在0.5Pa PEG6000浓度下处理24 h的表达量最高（图7）。

综上结果表明ZjSOD基因在转录水平受盐和干旱诱导。

实施例4：ZjSOD在拟南芥中的功能研究

1、 ZjSOD基因在种子萌发时期参与高盐、PEG和ABA胁迫应答

为了研究ZjSOD基因在植物生长发育中的功能，本发明构建了ZjSOD基因的过量表达载体，转化拟南芥，对获得的转基因阳性株系进行表型分析与功能研究。

RT-PCR研究表明ZjSOD基因在转录水平上受干旱、高盐胁迫诱导。为了研究ZjSOD基因是否参与非生物胁迫应答，将野生型及ZjSOD过量表达转基因拟南芥株系L7、L9、L12和L14的种子分别种植在MS、MS+150mM NaCl、MS+0.5 Pa PEG6000、MS+5 mM H₂O₂培养基上进行培养观察。经过三次重复实验进行萌发率的统计分析，结果显示：图8所示，在MS培养基中，ZjSOD过量表达转基因拟南芥种子与野生型种子在4天之内均完全萌发，且彼此的萌发率无明显差异。图9所示，在150 mM NaCl处理条件下，ZjSOD转基因拟南芥种子较野生型萌发迟缓，萌发率显著低于野生型，生长3天后，大约60%的野生型种子萌发，而仅有35%左右的ZjSOD过量表达转基因种子萌发。生长6天后，野生型种子的萌发率达到约90%，而ZjSOD过量表达转基因种子的萌发率仅达到约60%，表现为对高盐敏感。图10所示，当在0.8 Pa PEG600处理条件下，ZjSOD过量表达转基因种子的萌发率明显低于野生型，生长4天后，约75%的野生型种子萌发，而仅有50%的ZjSOD过量表达转基因种子萌发。但是，图11所示，在5 mM H₂O₂生长条件下，ZjSOD过量表达转基因种子萌发率显著高于野生型，生长4天后，所有ZjSOD过量表达转基因种子完全萌发，而仅有90%的野生型种子萌发。

综上结果表明ZjSOD增强了转基因种子对盐、PEG的敏感性，同时增强了对H₂O₂的耐受性。

、 ZjSOD基因在幼苗发育时期参与高盐、PEG和H₂O₂胁迫应答

为了研究ZjSOD基因在幼苗发育时期的功能，采用两种方法。方法一是将野生型及ZjSOD过量表达株系L9、L12和L14的种子分别种植在MS、MS+150 mM NaCl、MS+0.5 PaPEG6000、MS+5 mM H₂O₂培养基上进行培养观察幼苗的生长状况（如图12所示）。方法二是首先在MS培养基上萌发48 h后转移至MS+150 mM NaCl、MS+0.5 Pa PEG6000、MS+5 mM H₂O₂培养基上进行垂直培养（如图16所示），这两种方式获得了类似的结果。主要表现为：在正常生长条件下(MS培养基上)，ZjSOD过量表达转基因株系与野生型幼苗的生长状况无明显差异（图17）。但是在盐和PEG6000处理条件下，ZjSOD过量表达株系（L7、L9、L12和L14）的生长明显受到抑制，其绿苗率明显低于野生型，表现为对盐和PEG6000较野生型更加敏感（如图13、14、18、19所示）。而在H₂O₂处理条件下，ZjSOD过量表达株系（L7、L9、L12和L14）的绿苗率明显高于野生型，表现为对盐和PEG6000较野生型耐受性增强（如图15、20所示）。

当幼苗在MS培养基中垂直生长时，ZjSOD过量表达转基因株系根的生长状况均类似于野生型。但是，在添加有150 mM NaCl或0.5 Pa PEG6000培养基中垂直生长数天的幼苗存在显著差异。表现为：与野生型相比，ZjSOD过量表达株系幼苗的主根生长受抑制程度更加明显，主根根长显著短于野生型。而在添加有5 mM H₂O₂培养条件下，ZjSOD过量表达株系幼苗的主根生长长势优于野生型，根长显著长于野生型。

综上结果表明在拟南芥中过量表达ZjSOD增强了植株对盐胁迫和PEG6000的敏感性，同时增强了对H₂O₂的耐受性。

、ZjSOD转基因拟南芥的生理指标的测定

SOD活性、CAT活性、POD活性、丙二醛（MDA）、离子的泄露变化及脯氨酸含量的变化一定程度上反应植物的抗逆性。于是对生长10天的幼苗分别用150 mM NaCl、0.5 PaPEG6000 或5 mM H₂O₂进行处理6 h 后，测定SOD活性、CAT活性、POD活性、MDA、离子的泄露变化及脯氨酸含量。每个实验至少重复三次，每次3个独立重复。

结果如图21-26所示，在正常生长条件下，ZjSOD过量表达转基因株系与野生型相比，CAT活性、POD活性、MDA、离子的泄露变化及脯氨酸含量均无显著变化，而SOD活性在ZjSOD过量表达转基因株系中显著高于野生型。在NaCl、PEG和H₂O₂胁迫条件下导入的ZjSOD基因提高了拟南芥体内的SOD活性水平，尤其在H₂O₂胁迫条件下，其SOD 活性呈显著性增加。ZjSOD过量表达转基因株系中CAT(过氧化氢酶)活性和POD活性在高盐和PEG6000胁迫条件下明显降低，H₂O₂胁迫条件下其CAT和POD活性显著升高。在NaCl、PEG和H₂O₂胁迫条件下，与野生相比，ZjSOD过量表达转基因株系中的MDA含量和脯氨酸含量均显著升高。在NaCl、PEG胁迫条件下，ZjSOD过量表达转基因株系中的电解质泄露显著升高，而在H₂O₂胁迫条件下其电解质泄露显著降低。

综上结果暗示：ZjSOD基因可能在幼苗发育早期参与盐、渗透胁迫及H₂O₂的应答。

、ZjSOD基因可能参与调控干旱、高盐胁迫应答及ROS信号通路相关基因的表达

为了研究ZjSOD基因参与干旱、高盐胁迫应答及ROS信号通路的机制，选取参与盐信号通路应答的SOS2基因、参与干旱胁迫RD29A和ERD15及参与ROS信号通路相关基因CAT1、APX1和GPX3进行转录水平上的表达分析。结果如图27-32所示，在正常生长条件下，SOS2、 RD29A、ERD15及CAT1、APX1和GPX3基因在ZjSOD转基因拟南芥株系中的表达量与野生型相比均无显著差异。但是在NaCl和PEG6000条件下，盐胁迫应答相关基因SOS2在ZjSOD转基因拟南芥株系中的表达量显著下调，而RD29A和ERD15在NaCl和PEG6000胁迫下的转基因株系中的表达量显著上调，在H₂O₂胁迫条件下，RD29A和ERD15在ZjSOD转基因株系中的表达量显著下调。在NaCl、PEG6000和H₂O₂胁迫下，参与ROS氧化胁迫信号通路的CAT1、APX1和GPX3基因在ZjSOD过量表达转基因拟南芥株系中的表达量均显著上调。

综上结果表明：ZjSOD基因在ROS信号途径中起正调控作用，而在干旱和高盐胁迫中起负调控作用。同时也暗示ZjSOD基因可能直接参与ROS信号途径，从而间接参与干旱和高盐胁迫应答。

序列表

〈110〉山西省农业科学院农业资源与经济研究所山西省农业科学院生物技术研究中心

〈120〉一种枣树超氧化物歧化酶基因及其应用

〈160〉2

〈210〉1

〈211〉699

〈212〉DNA

〈213〉枣树(Ziziphus jujuba Mill )

〈220〉

〈221〉CDS

〈222〉(1)…(699)

〈400〉1

atggcaatgg gaagtgtgag caggaaaacc ctagtgggac ttggaagaaa tgtaggattt 60

ggagggatag ggtatgtgcg tggagtgaag accttcacgc ttccagacct tccttacgac 120

tatggtgctt tggaacctgc tatcagcgga gagattatgc aactccatca ccagaagcac 180

caccagacct acataactaa cttcaacaag gctctcgaac agctcgaccc agccatcgct 240

aaaggcgatg ccactgccgt cgtcaaattg cagagcgcca tcaaattcaa tggcggaggt 300

catataaacc actcaatttt ctggaagaat ttgacccctg ttcgagaagg aggtggtgag 360

cctccaaagg gttcattggg ctgggctatt gacactcagt ttggctcttt agaagctctg 420

attcagaaaa tgaacaccga tggtgctgct cttcaaggtt ctggatgggt gtggcttgct 480

cttgataaag aacagaagaa gctttctgtt gaaaccacag caaatcagga tccacttgtg 540

actaaggggt caggtttagt tcctctgctg gggatagatg tttgggagca tgcatactac 600

ttacagtaca aaaatgtgag accagactat ctgaagaaca tatggaaggt tatcaactgg 660

aaatatgcaa gtaatgagta tgagagagag tctgcttga 699

〈210〉2

〈211〉232

〈212〉PRT

〈213〉枣树(Ziziphus jujuba Mill)

〈400〉2

Met Ala Met Gly Ser Val Ser Arg Lys Thr Leu Val Gly Leu Gly

1 5 10 15

Arg Asn Val Gly Phe Gly Gly Ile Gly Tyr Val Arg Gly Val Lys

20 25 30

Thr Phe Thr Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Leu Glu

35 40 45

Pro Ala Ile Ser Gly Glu Ile MET Gln Leu His His Gln Lys His

50 55 60

His Gln Thr Tyr Ile Thr Asn Phe Asn Lys Ala Leu Glu Gln Leu

65 70 75

Asp Pro Ala Ile Ala Lys Gly Asp Ala Thr Ala Val Val Lys Leu

80 85 90

Gln Ser Ala Ile Lys Phe Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser

95 100 105

Ile Phe Trp Lys Asn Leu Thr Pro Val Arg Glu Gly Gly Gly Glu

110 115 120

Pro Pro Lys Gly Ser Leu Gly Trp Ala Ile Asp Thr Gln Phe Gly

125 130 135

Ser Leu Glu Ala Leu Ile Gln Lys MET Asn Thr Asp Gly Ala Ala

140 145 150

Leu Gln Gly Ser Gly Trp Val Trp Leu Ala Leu Asp Lys Glu Gln

155 160 165

Lys Lys Leu Ser Val Glu Thr Thr Ala Asn Gln Asp Pro Leu Val

170 175 180

Thr Lys Gly Ser Gly Leu Val Pro Leu Leu Gly Ile Asp Val Trp

185 190 195

Glu His Ala Tyr Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Arg Pro Asp Tyr

200 205 210

Leu Lys Asn Ile Trp Lys Val Ile Asn Trp Lys Tyr Ala Ser Asn

215 220 225

Glu Tyr Glu Arg Glu Ser Ala ***

230

Claims

1.一种枣树超氧化物歧化酶基因在提高拟南芥抗逆性中的应用，所述应用为增强了转基因种子对盐、PEG的敏感性，同时增强了对H₂O₂的耐受性；增强了植株对盐胁迫和PEG的敏感性，同时增强了对H₂O₂的耐受性；在幼苗发育早期参与盐、渗透胁迫及H₂O₂的应答；该枣树超氧化物歧化酶基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的一种枣树超氧化物歧化酶基因在提高拟南芥抗逆性中的应用，其特征是该枣树超氧化物歧化酶基因的核苷酸序列开放阅读框编码的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。

3.根据权利要求1或2所述的一种枣树超氧化物歧化酶基因在提高拟南芥抗逆性中的应用，其特征是该枣树超氧化物歧化酶基因是以壶瓶枣结果枝cDNA为模板，由下述引物对为引物扩增得到的：

上游引物P1的序列为：5'—acgaattcagatggcaatgggaagtg—3'，

下游引物P2的序列为：5'—atcccgggtagcagactctctctcata—3'。