CN114196678A

CN114196678A - 一个控制水稻种子活力刺猬互作蛋白OsHIPL1基因及其工程应用

Info

Publication number: CN114196678A
Application number: CN202111507124.5A
Authority: CN
Inventors: 程金平; 张红生; 何影; 陈孙禄; 黄骥; 鲍永美; 王建飞
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2041-12-10
Also published as: CN114196678B

Abstract

本发明属于种子科学与技术学领域，公开了一个水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因在提高水稻种子活力中的应用。所述的水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明中水稻OsHIPL1基因能调控水稻种子活力，基因过量表达试验结果表明，该基因影响水稻种子萌发与幼苗形成。证明本发明OsHIPL1基因调控了水稻种子活力，利用该基因有助于高种子活力水稻品种的遗传改良，有利于水稻直播生产。

Description

一个控制水稻种子活力刺猬互作蛋白OsHIPL1基因及其工程应用

技术领域

本发明属于种子科学与技术领域，涉及水稻种子活力刺猬互作蛋白OsHIPL1基因及其工程应用，具体的，是在提高种子活力中的应用，专用于高活力种子水稻品种选育的遗传改良。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国重要粮食作物之一。传统的水稻种植模式以苗床育秧、人工移栽或机栽到大田为主。随着我国经济发展，工业化、城镇化步伐加快，农村劳动力不断向城镇转移，农业生产面临着劳动力短缺、用工成本高等问题。如何稳定现有水稻生产面积，提高水稻种植效益，对我国粮食安全至关重要。近年来，水稻人工直播种植模式在我国不同水稻产区得到种植者的欢迎，尤其是机直播种植模式，具有操作简单，省工、省力等优势，有很好的应用前景。美国等发达国家的水稻种植主要是机直播，日本等国家主要是机插秧，各有利弊。就我国水稻种植而言，在今后相当长的时间里，直播种植和机插秧模式可能成为水稻种植的主要模式。因此，培育高活力水稻品种，对直播水稻高产、优质生产具有重要的意义。

种子活力是多基因控制的复杂数量性状。近年来，在水稻仅少数种子活力相关基因获得克隆，如种子萌发低温响应基因qLTG3-1、休眠相关基因Sdr4、耐盐萌发相关基因qSE3等。但是，关于正常条件下(蒸馏水，无胁迫)水稻种子活力相关尚未报道克隆。

发明内容

本发明的目的在于公开一个水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因及其编码蛋白，该基因可作为目的基因导入植物，促进水稻种子活力，进而改良水稻种子活力遗传特性。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明的第一个目的是提供水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1，所述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1由权利要求1所述的水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因编码，所述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种植物过表达载体，所述植物过表达载体包含SEQID NO.1所示水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因。

本发明的第四个目的是提供一种提高水稻种子活力的方法，所述方法为构建SEQID NO.1所示水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因的阳性过表达株系，提高水稻种子活力。

作为一个特殊的实施例，申请人构建了SEQ ID NO.1所示水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因的水稻粳稻品种中花11的阳性过表达株系，提高水稻种子活力。

作为其中一种构建方式，所述提高水稻种子活力的方法为将包含SEQ ID NO.1所示水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因的植物过表达载体导入水稻，获得OsHIPL1阳性过量表达株系，提高水稻种子活力。

进一步的，所述方法包括以下步骤：

(1)获得SEQ ID NO.1所示水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因；

(2)构建包含SEQ ID NO.1所示水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因的植物过表达载体；

(3)采用步骤(2)所述植物过表达载体转化水稻愈伤组织，筛选阳性转基因植株，对所获得的阳性过量表达转基因转系进行转录水平验证，验证OsHIPL1基因已经转入基因组DNA中并过量表达，获得OsHIPL1阳性过量表达株系；优选的，利用农杆菌法将步骤(2)所述植物过表达载体转化水稻愈伤组织。

进一步的，步骤(1)具体操作为：以水稻cDNA为模板，采用OsHIPL1基因特异性引物对，利用PCR扩增技术获得如SEQID NO.1所示的OsHIPL1基因；优选的，所述OsHIPL1基因特异性引物对包括SEQID NO.3所示的上游引物和SEQID NO.4所示的下游引物；优选的，所述水稻cDNA为籼稻品种IR26的cDNA，或日本晴的cDNA。

OsHIPL1-F1：5'-tcctactcccgcaagtccaa-3'(SEQ ID NO.3)

OsHIPL1-R1：5'-ctaaaggcaagcacggctaa-3'(SEQ ID NO.4)

进一步的，步骤(2)具体操作为：采用SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物，利用同源重组方法，将SEQ ID NO.1所示的OsHIPL1基因编码区序列的目的片段融合到pBWA(V)HS载体中；测序验证正确后，转化大肠杆菌DH5α，提取阳性质粒，得到OsHIPL1基因的植物过表达载体。

OsHIPL1-F2：5'-cagtcacctgcaaaacaacatggcgaacagcaagagcct-3'(SEQ ID NO.5)

OsHIPL1-R2：5'-cagtcacctgcaaaatacatcagaagaataatgcacaca-3'(SEQ ID NO.6)

进一步的，步骤(3)所述筛选阳性转基因植株为以转基因植株基因组DNA为模板，所用上游引物如序列表SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.8所示；

OsHIPL1-F3：5'-agcagcggaaactacacctc-3'(SEQ ID NO.7)

OsHIPL1-R3：5'-caagaccggcaacaggattcaatc-3'(SEQ ID NO.8)

所述转录水平验证为采用Real-Time PCR技术，以筛选得到的阳性转基因植株基因组DNA为模板，所用引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，所用内参基因为OsActin，所述内参基因引物序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

OsHIPL1-F4：5'-tgaggcttgatgttgatgg-3'(SEQ ID NO.9)

OsHIPL1-R4：5'-actgaatgggttgtctttagg-3'(SEQ ID NO.10)

OsHIPL1-F5：5'-aggaaggctggaagaggacc-3'(SEQ ID NO.11)

OsHIPL1-R5：5'-cgggaaattgtgagggacat-3'(SEQ ID NO.12)

本发明的第五个目的是提供前述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因，或前述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1，或前述植物过表达载体，或前述提高水稻种子活力的方法在提高水稻种子活力中的应用。

具体的，过表达前述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因，或过表达前述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1，或前述植物过表达载体，或前述提高水稻种子活力的方法在提高水稻种子活力中的应用。

本发明的第六个目的是提供前述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因，或前述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1，或前述植物过表达载体，或前述提高水稻种子活力的方法在筛选、鉴定或培育高活力种子水稻品种中的应用。

具体的，过表达前述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因，或过表达前述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1，或前述植物过表达载体，或前述提高水稻种子活力的方法在筛选、鉴定或培育高活力种子水稻品种中的应用。

进一步的，所述应用包括提高种子萌发率，和/或提高种子萌发指数，和/或提高成苗率。

本发明具有以下有益效果：

本发明本发明从水稻中分离克隆了OsHIPL1基因，且鉴定了该基因在正常条件下(蒸馏水，无胁迫)对种子活力调控方面的功能，对于高活力水稻品种筛选、鉴定和培育具有重要意义。

本发明也为选育高活力种子水稻新品种提供了理论技术支撑，对直播水稻生产具有重要意义。

附图说明

图1：水稻OsHIPL1过量表达植株基因OsHIPL1的表达量；***表示在0.001水平上具有显著性差异。

图2：水稻OsHIPL1过量表达植株在正常条件下萌发第3天表型图。

图3：水稻OsHIPL1过量表达植株与野生型对照在正常条件下第3天的种子萌发率、第4天成苗率和萌发指数比较。其中，图3A为第3天的种子萌发率；图3B为第4天成苗率；图3C为种子萌发指数；**表示在0.01水平上具有显著性差异。

图4：水稻OsHIPL1基因在种子萌发过程中的基因表达分析。

图1～3中，WT为野生型对照；OE-1、OE-2与OE-3为水稻OsHIPL1过量表达植株。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明，实施例中所用方法无特别说明均为常规方法，所用引物、测序由南京思普金生物科技有限公司完成；实验中用到的各种连接酶、DNA ladder、高保真酶、载体等购自宝日医生物技术(北京)有限公司；RNA提取试剂盒购于北京全式金生物技术；反转录试剂盒购于诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒以及基因组提取试剂盒购于美吉生物科技有限公司；pBWA(V)HS过表达载体由武汉伯远生物科技有限公司提供。

实施例1：基因克隆

利用水稻籼稻品种IR26 cDNA为模板，克隆OsHIPL1基因序列，所述上游引物cDNA-F序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述下游引物cDNA-R序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

OsHIPL1-F1：5'-tcctactcccgcaagtccaa-3'(SEQ ID NO.3)

OsHIPL1-R1：5'-ctaaaggcaagcacggctaa-3'(SEQ ID NO.4)

反应体系为：50μL

反应程序为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火58℃30s，延伸72℃90s，循环数35；延伸72℃10min，4℃保存。

获得水稻OsHIPL1基因的核苷酸序列(2391bp，包括部分5'和3'URT区域)其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：OsHIPL1过量表达植株构建与鉴定

(一)OsHIPL1过量表达的重组质粒构建

参照武汉伯远生物科技有限公司pBWA(V)HS过表达载体构建过程，设计水稻基因OsHIPL1过量表达引物，序列如列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，利用同源重组方法，将SEQ ID NO.1所示的OsHIPL1基因编码区序列的目的片段融合到pBWA(V)HS载体中，测序验证正确后，转化大肠杆菌DH5α，提取阳性质粒，得到OsHIPL1基因的植物过量表达载体。

OsHIPL1-F2：5'-cagtcacctgcaaaacaacatggcgaacagcaagagcct-3'(SEQ ID NO.5)

OsHIPL1-R2：5'-cagtcacctgcaaaatacatcagaagaataatgcacaca-3'(SEQ ID NO.6)

反应体系为：

反应程序为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火50℃45s，延伸72℃126s，循环数30，彻底延伸72℃10min，16℃保存。

(二)过量表达转基因株系的获得

将上述步骤中获得的重组质粒，即(一)获得的OsHIPL1基因的植物过表达载体，利用农杆菌法转化野生型粳稻中花11愈伤组织，获得转基因植株。

以转基因植株基因组DNA为模板，筛选阳性转基因植株，所用上游引物如序列表SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.8所示。

OsHIPL1-F3：5'-agcagcggaaactacacctc-3'(SEQ ID NO.7)

OsHIPL1-R3：5'-caagaccggcaacaggattcaatc-3'(SEQ ID NO.8)

反应体系为：

反应程序为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火56℃30s，延伸72℃90s，循环数32，彻底延伸72℃10min，4℃保存。

(三)OsHIPL1过量表达转基因株系表达检测

以步骤(二)筛选得到的阳性转基因植株基因组DNA为模板，利用Real-Time PCR技术对所获得的阳性过量表达转基因转系进行转录水平验证，所用引物序列如序列表中SEQID NO.9和SEQ ID NO.10所示，所用内参基因为OsActin，所述内参基因引物序列如序列表中SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

OsHIPL1-F4：5'-tgaggcttgatgttgatgg-3'(SEQ ID NO.9)

OsHIPL1-R4：5'-actgaatgggttgtctttagg-3'(SEQ ID NO.10)

OsHIPL1-F5：5'-aggaaggctggaagaggacc-3'(SEQ ID NO.11)

OsHIPL1-R5：5'-cgggaaattgtgagggacat-3'(SEQ ID NO.12)

RT-PCR的反应体系为：

反应程序为：第一阶段，预变性95℃5min，第二阶段循环反应，变性95℃10s，退火60℃30s，循环数40，第三阶段融解曲线，95℃15s，退火60℃60s，95℃15s。

验证结果显示：与野生型粳稻中花11相比，转OsHIPL1的植株株系基因表达量显著提高，如图1所示，证实OE-1、OE-2与OE-3植株的OsHIPL1基因已经转入基因组DNA中并过量表达。

实施例3：OsHIPL1过表达植株表型分析

(一)种子萌发试验：

利用实施例2获得的OsHIPL1基因的阳性过量表达转基因株系OE-1、OE-2与OE-3植株种子，以及野生型对照中花11(WT)水稻品种，进行如下种子萌发试验：

每次重复挑选健康饱满的种子50粒/组，用2％的次氯酸钠溶液表面消毒10min，蒸馏水冲洗3次，将种子表面擦干，均匀平铺于培养皿(直径9cm)中，倒入10mL蒸馏水，放置25℃条件下光照/黑暗各12h培养7d后，最后统计萌发与成苗情况。试验重复3次。

(二)结果分析：

与野生型对照中花11(WT)种子相比，过量表达转基因株系OE-1、OE-2与OE-3的种子萌发率、萌发指数与成苗率显著提高，水稻OsHIPL1过表达转基因株系OE-1、OE-2与OE-3以及野生型对照中花11(WT)的种子活力表型对比如所述表1、附图2和图3所示。可见，OsHIPL1基因对水稻种子萌发与幼苗生长具有重要促进作用。

表1水稻OsHIPL1过表达转基因株系OE-1、OE-2与OE-3以及野生型对照中花11(WT)的种子萌发率、萌发指数与成苗率表型值

**表示在0.01水平上具有显著性差异。

实施例4种子萌发过程中基因表达分析

(一)准备组织样本：

利用野生型籼稻品种IR26，挑选健康饱满的种子50粒，2％的次氯酸钠溶液表面消毒10min，蒸馏水冲洗3次，将种子表面擦干，置于垫有两层滤纸的培养皿(直径9cm)中，加入10mL蒸馏水，放置25℃黑暗培养箱中分别吸胀0、6、12、24、30、36、48、54、60和72h后，分别取样。种子经液氮冷冻处理后迅速磨成粉末，样品贮存于-80℃。试验重复3次。

(二)RT-PCR测定：

用TransZol Plant reagent kit(北京全式金生物技术)试剂盒，提取各个样本中的RNA；用

II Reverse Transcriptase system(诺唯赞生物科技有限公司)试剂盒反转录形成cDNA，以其为模板；用荧光定量PCR进行分析，荧光定量PCR检测OsHIPL1的引物序列，所述上游引物OsHIPL1-F序列如序列表SEQ ID NO.9所示，所述下游引物OsHIPL1-R序列如序列表SEQ ID NO.10所示。采用水稻内参基因OsActin引物，所述上游引物OsActin-F的序列如序列表SEQ ID NO.11所示，所述下游引物OsActin-R的序列如序列表SEQ IDNO.12所示。

OsHIPL1-F4：5'-tgaggcttgatgttgatgg-3'(SEQ ID NO.9)

OsHIPL1-R4：5'-actgaatgggttgtctttagg-3'(SEQ ID NO.10)

OsHIPL1-F5：5'-aggaaggctggaagaggacc-3'(SEQ ID NO.11)

OsHIPL1-R5：5'-cgggaaattgtgagggacat-3'(SEQ ID NO.12)

其中，RT-PCR反应体系为10μl：5μl 2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，0.25μl Forward Primer(10μM)，0.25μl reverse Primer(10μM)，1μl Template cDNA，3.5μlddH₂O。反应程序为：预变性，95℃5min；循环反应，95℃10sec，60℃30sec，循环数40；溶解曲线，95℃15s，60℃60s，95℃15s。

(三)结果分析：

RT-PCR结果显示，在种子萌发过程中OsHIPL1基因的表达量呈现先上升后下降的变化趋势，且在种子吸胀12h时，OsHIPL1基因存在高诱导表达，如所述附图4所示。可见，OsHIPL1基因在种子萌发过程中得到诱导表达，基因表达对种子发芽成苗具有重要作用。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一个控制水稻种子活力刺猬互作蛋白OsHIPL1基因及其工程应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2391

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

tcctactccc gcaagtccaa gtgctgagct cctcccccaa taaatccgcc cagccccgcc 60

gcgccatgcc cgcgagaccc ctccacggcg acggccatgg cgaacagcaa gagcctgctc 120

ctctgctggt gctcgctcct cctcctcctc ctcgccgccg cagcgccgcc cgccctcgcc 180

ctcccgctct gcaccgactc cagggcgccg gtgccgctga acgggacgac gctgggcttc 240

tgcggcggcg gggggagcgg gagcagcagc tgctgcggcg ccgcggatga tgccgcgctg 300

aggaagcggt tcgaggcgat gaacgtctcc gacgccgcgt gcgccggggt cgtcaagtcc 360

gtcctctgcg cgaaatgtaa tccatattcg gctgagttgt tcaactcaag ctcaaagatt 420

cggatggttc ccgtcctgtg caatggatca gcttcagcta gttctactca atcgaaggat 480

tctacacaag actactgcaa actagtttgg gaaacatgca agaatgtgac aatactgaat 540

tctccttttc aatctccttt gcaaggtggt gcaacattac ctagttcatc atcaaaactt 600

actgatgttt ggcagtcaga aaatgacttt tgtacatcat ttggtggctc atctgacaac 660

cagtcagtat gcttaaatgg aaatgaagtt tcatttagca cttcagaacc atcacccagt 720

cctaaagggg tgtgtattga gagaattgga aacgggacat acttgaacat ggctcctcat 780

ccggatggat ccaacagagt tttcttgtct agccaagcag gtaaaatatg gttggcaact 840

gtcccagaac aaggctctgg aggcattctg caatttgatg aagccagccc atttattgat 900

ctaactgatg aagtccactt tgattctgag tttggactca tgggtatagc atttcaccca 960

aagtttgcta ccaatgggcg cttctttgtt tcttataatt gtgacagaac tcagtcatct 1020

aactgtgctg gtaggtgttc atgtaattct gatgttaact gtgatccttc aaagcttgga 1080

tctgataatg gtgcccagcc atgccagtac caagttgttg ttgcagagta ctctgcgaaa 1140

gtctcatcat caaatgtttc ggaggcaaca tctgctaatc catccgaggt tagaaggata 1200

tttacaatgg gactgccata tacagcccac catgggggac agatactttt tggacctaca 1260

gatggatatc tgtaccttat gatgggtgat ggtggaaaca aaggcgaccc ttttaatttt 1320

tctcaaaata agagatcact tttggggaaa attatgaggc ttgatgttga tggcgttcaa 1380

agccagagtc aaatcattaa ccagagcttg tggggtaatt attctgttcc taaagacaac 1440

ccattcagtg acgaccgaga cttacaacca gagatttggg ccttgggctt gaggaaccca 1500

tggagatgta attttgattc tgagaggcct tcctatttct actgtgcaga tgttgggcag 1560

gatttatatg aagaggtaga tttgatctcg aagggtggaa actatggatg gcgtgcatat 1620

gagggcccat acatttatca tccagaatgg actcctggag ggaatacatc gcttaattct 1680

ataaatgcca tcttccctgt tatgggctac agccattctg ctatcaacaa gaacactggg 1740

tctgcatcaa ttacaggtgg atttgtttat cgagggtctt ctgatccctg cctatatgga 1800

aggtacatat atgctgatct ttacgcgtca gcaatgtgga ccggcacaga gaccccagag 1860

agcagcggaa actacacctc aactctgatt ccgttcagct gctccaagaa ctctccaata 1920

ccctgcgaat ctgcatcagg cagcaaccaa ccatcgttgg gctacatttt ctccttcggc 1980

gaggacaaca acaaggatgt cttccttcta acatacaaag gcgtctaccg agttgtccgg 2040

cctagcctct gcggctacac ctgtgccgcg gagaaaccag agaccaacaa caatggaacg 2100

tctccctcag gctcttcatc atttgcttca ggaaggagga tagggaagtt ggcagtagta 2160

atggcgtttg ttttgtgtgc attattcttc tgagatgtcc atccctgtta gcttgttata 2220

tatcatgtat ggtttctttc gcacctgctg tacagcattg acgagcccta cacgtctgtg 2280

tgactgtttg tgattattag tagtatttgg ttgtgcttag ttctcaagtg gtgggcttgt 2340

gcaatgtagc attgtgatga ctgaaaatta attagccgtg cttgccttta g 2391

<210> 2

<211> 698

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Ala Asn Ser Lys Ser Leu Leu Leu Cys Trp Cys Ser Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ala Pro Pro Ala Leu Ala Leu Pro Leu Cys

20 25 30

Thr Asp Ser Arg Ala Pro Val Pro Leu Asn Gly Thr Thr Leu Gly Phe

35 40 45

Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Cys Cys Gly Ala Ala Asp

50 55 60

Asp Ala Ala Leu Arg Lys Arg Phe Glu Ala Met Asn Val Ser Asp Ala

65 70 75 80

Ala Cys Ala Gly Val Val Lys Ser Val Leu Cys Ala Lys Cys Asn Pro

85 90 95

Tyr Ser Ala Glu Leu Phe Asn Ser Ser Ser Lys Ile Arg Met Val Pro

100 105 110

Val Leu Cys Asn Gly Ser Ala Ser Ala Ser Ser Thr Gln Ser Lys Asp

115 120 125

Ser Thr Gln Asp Tyr Cys Lys Leu Val Trp Glu Thr Cys Lys Asn Val

130 135 140

Thr Ile Leu Asn Ser Pro Phe Gln Ser Pro Leu Gln Gly Gly Ala Thr

145 150 155 160

Leu Pro Ser Ser Ser Ser Lys Leu Thr Asp Val Trp Gln Ser Glu Asn

165 170 175

Asp Phe Cys Thr Ser Phe Gly Gly Ser Ser Asp Asn Gln Ser Val Cys

180 185 190

Leu Asn Gly Asn Glu Val Ser Phe Ser Thr Ser Glu Pro Ser Pro Ser

195 200 205

Pro Lys Gly Val Cys Ile Glu Arg Ile Gly Asn Gly Thr Tyr Leu Asn

210 215 220

Met Ala Pro His Pro Asp Gly Ser Asn Arg Val Phe Leu Ser Ser Gln

225 230 235 240

Ala Gly Lys Ile Trp Leu Ala Thr Val Pro Glu Gln Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ile Leu Gln Phe Asp Glu Ala Ser Pro Phe Ile Asp Leu Thr Asp Glu

260 265 270

Val His Phe Asp Ser Glu Phe Gly Leu Met Gly Ile Ala Phe His Pro

275 280 285

Lys Phe Ala Thr Asn Gly Arg Phe Phe Val Ser Tyr Asn Cys Asp Arg

290 295 300

Thr Gln Ser Ser Asn Cys Ala Gly Arg Cys Ser Cys Asn Ser Asp Val

305 310 315 320

Asn Cys Asp Pro Ser Lys Leu Gly Ser Asp Asn Gly Ala Gln Pro Cys

325 330 335

Gln Tyr Gln Val Val Val Ala Glu Tyr Ser Ala Lys Val Ser Ser Ser

340 345 350

Asn Val Ser Glu Ala Thr Ser Ala Asn Pro Ser Glu Val Arg Arg Ile

355 360 365

Phe Thr Met Gly Leu Pro Tyr Thr Ala His His Gly Gly Gln Ile Leu

370 375 380

Phe Gly Pro Thr Asp Gly Tyr Leu Tyr Leu Met Met Gly Asp Gly Gly

385 390 395 400

Asn Lys Gly Asp Pro Phe Asn Phe Ser Gln Asn Lys Arg Ser Leu Leu

405 410 415

Gly Lys Ile Met Arg Leu Asp Val Asp Gly Val Gln Ser Gln Ser Gln

420 425 430

Ile Ile Asn Gln Ser Leu Trp Gly Asn Tyr Ser Val Pro Lys Asp Asn

435 440 445

Pro Phe Ser Asp Asp Arg Asp Leu Gln Pro Glu Ile Trp Ala Leu Gly

450 455 460

Leu Arg Asn Pro Trp Arg Cys Asn Phe Asp Ser Glu Arg Pro Ser Tyr

465 470 475 480

Phe Tyr Cys Ala Asp Val Gly Gln Asp Leu Tyr Glu Glu Val Asp Leu

485 490 495

Ile Ser Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Arg Ala Tyr Glu Gly Pro Tyr

500 505 510

Ile Tyr His Pro Glu Trp Thr Pro Gly Gly Asn Thr Ser Leu Asn Ser

515 520 525

Ile Asn Ala Ile Phe Pro Val Met Gly Tyr Ser His Ser Ala Ile Asn

530 535 540

Lys Asn Thr Gly Ser Ala Ser Ile Thr Gly Gly Phe Val Tyr Arg Gly

545 550 555 560

Ser Ser Asp Pro Cys Leu Tyr Gly Arg Tyr Ile Tyr Ala Asp Leu Tyr

565 570 575

Ala Ser Ala Met Trp Thr Gly Thr Glu Thr Pro Glu Ser Ser Gly Asn

580 585 590

Tyr Thr Ser Thr Leu Ile Pro Phe Ser Cys Ser Lys Asn Ser Pro Ile

595 600 605

Pro Cys Glu Ser Ala Ser Gly Ser Asn Gln Pro Ser Leu Gly Tyr Ile

610 615 620

Phe Ser Phe Gly Glu Asp Asn Asn Lys Asp Val Phe Leu Leu Thr Tyr

625 630 635 640

Lys Gly Val Tyr Arg Val Val Arg Pro Ser Leu Cys Gly Tyr Thr Cys

645 650 655

Ala Ala Glu Lys Pro Glu Thr Asn Asn Asn Gly Thr Ser Pro Ser Gly

660 665 670

Ser Ser Ser Phe Ala Ser Gly Arg Arg Ile Gly Lys Leu Ala Val Val

675 680 685

Met Ala Phe Val Leu Cys Ala Leu Phe Phe

690 695

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctactccc gcaagtccaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctaaaggcaa gcacggctaa 20

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagtcacctg caaaacaaca tggcgaacag caagagcct 39

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagtcacctg caaaatacat cagaagaata atgcacaca 39

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agcagcggaa actacacctc 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caagaccggc aacaggattc aatc 24

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgaggcttga tgttgatgg 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

actgaatggg ttgtctttag g 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aggaaggctg gaagaggacc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgggaaattg tgagggacat 20

Claims

1.水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1，其特征在于，所述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1由权利要求1所述的水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因编码，所述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种植物过表达载体，其特征在于，所述植物过表达载体包含SEQ ID NO.1所示水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因。

4.一种提高水稻种子活力的方法，其特征在于，所述方法为构建SEQ ID NO.1所示水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因的阳性过表达株系，提高水稻种子活力。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)获得SEQ ID NO.1所示水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因；

(2)构建包含SEQ ID NO.1所示水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因的植物过表达载体；优选的，步骤(2)具体操作为：采用SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物，利用同源重组方法，将SEQ ID NO.1所示的OsHIPL1基因编码区序列的目的片段融合到pBWA(V)HS载体中；测序验证正确后，转化大肠杆菌DH5α，提取阳性质粒，得到OsHIPL1基因的植物过表达载体；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体操作为：以水稻cDNA为模板，采用OsHIPL1基因特异性引物对，利用PCR扩增技术获得如SEQ ID NO.1所示的OsHIPL1基因；优选的，所述OsHIPL1基因特异性引物对包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ IDNO.4所示的下游引物；优选的，所述水稻cDNA为籼稻品种IR26的cDNA，或日本晴的cDNA。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述筛选阳性转基因植株为以转基因植株基因组DNA为模板，所用上游引物如序列表SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.8所示；

8.权利要求1所述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因，或权利要求2所述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1，或权利要求3所述植物过表达载体，或权利要求4所述提高水稻种子活力的方法在提高水稻种子活力中的应用。

9.权利要求1所述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1基因，或权利要求2所述水稻刺猬互作蛋白OsHIPL1，或权利要求3所述植物过表达载体，或权利要求4所述提高水稻种子活力的方法在筛选、鉴定或培育高活力种子水稻品种中的应用。

10.根据权利要求8和9所述的应用，其特征在于，所述应用包括提高种子萌发率，和/或提高种子萌发指数，和/或提高成苗率。