CN111848762A

CN111848762A - 水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9在提高盐胁迫下种子萌发能力中的应用

Info

Publication number: CN111848762A
Application number: CN201910353741.0A
Authority: CN
Inventors: 程金平; 张红生; 曾鹏
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2039-04-29
Also published as: CN111848762B

Abstract

本发明属于种子科学与技术学领域，公开了水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9在盐胁迫下提高种子萌发能力中的应用。所述的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过MutMap方法从水稻盐敏感突变体gss1中克隆获得基因OsHAK9，功能互补实验证明OsHAK9能够提高盐胁迫下水稻种子的萌发能力。该基因可应用于高活力种子水稻品种选育以及盐胁迫下水稻种子萌发性状的遗传改良，对直播水稻生产具有重要意义。

Description

水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9在提高盐胁迫下种子萌发能力中的应用

技术领域

本发明属于种子科学与技术领域，涉及水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9在盐胁迫下提高水稻种子萌发能力中的应用，专用于高活力种子水稻品种选育以及盐胁迫下水稻种子萌发性状的遗传改良。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国重要粮食作物，全球约有30％的水稻耕地受到盐害的影响。随着经济的发展，水稻直播稻、机插稻越来越普遍，提高盐胁迫条件下水稻种子萌发能力变得日益重要。

种子萌发是一个由多基因控制的复杂数量性状。近十年来利用QTL分析定位了多个水稻种子萌发相关的QTLs，通过图位克隆等方法已成功克隆至少6个种子萌发相关基因，qLTG3-1、 Sdr4、OsVP1、OsGA20ox1、OsFbx352和GD1等。但是在盐胁迫下，种子萌发同时受渗透效应和离子效应双重效应影响。至今，种子耐盐胁迫萌发相关基因的克隆很少，有待进一步发掘和克隆。

MutMap是以二代测序技术为基础，通过对F₂分离群体中隐性表型个体DNA测序，与野生型基因组序列相比对，找出目的基因的定位克隆方法。该方法由Abe等提出，具有快捷、高效、成本低等特点。目前已在水稻抗稻瘟病和水稻苗期耐盐等优异基因发掘方面得到充分验证和利用，如水稻苗期耐盐基因OsRR22的鉴定和克隆。此外，通过对该方法优化，衍生了可用于数量性状Mut-QTL定位。

发明内容

本发明的目的在于提供一个提高盐胁迫下水稻种子萌发能力的水稻钾离子转运蛋白基因 OsHAK9的分离克隆、功能验证和应用。本发明公开一个水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9及其编码蛋白，该基因可作为目的基因导入植物，提高水稻盐胁迫下种子萌发能力，以改良水稻种子活力和耐盐性。

本发明所述的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明的第一个目的为提供SEQ ID NO.1所示的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9在提高盐胁迫下水稻种子萌发能力中的应用。

SEQ ID NO.2所示的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9编码的蛋白在提高盐胁迫下水稻种子萌发能力中的应用。

进一步的，所述的提高盐胁迫下水稻种子萌发能力为提高水稻种子发芽率和/或提高水稻种子发芽速度和/或提高水稻种子活力和/或促进幼苗生长。

进一步的，前述应用为将所述水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9的植物表达载体导入水稻，提高盐胁迫下水稻种子萌发能力。

进一步的，所述水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9的植物表达载体的构建方法为：

(1)以日本晴种子或幼苗cDNA材料为模板，设计如SEQ ID NO.3所示的上游引物OsHAK9-F1和如SEQ ID NO.4所示的下游引物OsHAK9-R1，利用降落PCR扩增技术获得如 SEQID NO.1所示的OsHAK9基因编码序列全长；

(2)以日本晴基因组DNA为模板，设计如SEQ ID NO.5所示的上游引物OsHAK9-F2和如SEQ ID NO.6所示的下游引物OsHAK9-R2，利用常规PCR扩增技术获得如SEQ ID NO.7所示的OsHAK9基因启动子序列；

(3)设计如SEQ ID NO.8所示的上游引物OsHAK9-F3和如SEQ ID NO.9所示的下游引物OsHAK9-R3，利用重叠PCR技术连接步骤(1)和步骤(2)得到的SEQ ID NO.1所示的OsHAK9基因编码区片段和SEQ ID NO.7所示的OsHAK9基因启动子片段，构建得到含有OsHAK9启动子和编码区的融合片段，利用同源重组法将融合片段构建到pCAMBIA1390载体中，转化大肠杆菌，提取阳性质粒，得到OsHAK9基因的植物表达载体。

本发明的第二个目的是提供一种通过转水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9提高盐胁迫下水稻种子萌发能力的方法，所述方法包括以下步骤：

(3)设计如SEQ ID NO.8所示的上游引物OsHAK9-F3和如SEQ ID NO.9所示的下游引物OsHAK9-R3，利用重叠PCR技术连接步骤(1)和步骤(2)得到的SEQ ID NO.1所示的OsHAK9基因编码区片段和SEQ ID NO.7所示的OsHAK9基因启动子片段，构建得到含有OsHAK9启动子和编码区的融合片段，利用同源重组法将融合片段构建到pCAMBIA1390载体中，提取阳性质粒，得到OsHAK9基因的植物表达载体；

(4)OsHAK9-基因植物表达载体加入感受态农杆菌EHA105，挑选阳性克隆，通过农杆菌介导的水稻转基因技术将SEQ ID NO.1所示的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9转化到水稻愈伤组织中，利用如SEQ ID NO.10所示的上游引物OsHAK9-F4和如SEQ ID NO.11所示的下游引物OsHAK9-R4鉴定阳性株系，培养得到提高盐胁迫下水稻种子萌发能力的转基因植株。

本发明的第三个目的是提SEQ ID NO.1所示的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9基因在筛选、鉴定或培育高活力种子的耐盐水稻品种中的应用。

SEQ ID NO.2所示的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9编码的蛋白在筛选、鉴定或培育高活力种子的耐盐水稻品种中的应用。

所述应用包括以下步骤：

(1)以日本晴幼苗cDNA材料为模板，设计如SEQ ID NO.3所示的上游引物 OsHAK9-F1和如SEQ ID NO.4所示的下游引物OsHAK9-R1，利用降落PCR扩增技术获得如SEQ ID NO.1所示的OsHAK9基因编码序列全长；

(3)设计如SEQ ID NO.8所示的上游引物OsHAK9-F3和如SEQ ID NO.9所示的下游引物OsHAK9-R3，利用重叠PCR技术连接步骤(1)和步骤(2)得到的片段，构建得到含有OsHAK9启动子和编码区的融合片段，利用同源重组法将融合片段构建到pCAMBIA1390载体中，转化大肠杆菌，提取阳性质粒，得到OsHAK9基因的植物表达载体；

(4)OsHAK9-基因植物表达载体加入感受态农杆菌EHA105，挑选阳性克隆，通过农杆菌介导的水稻转基因技术将SEQ ID NO.1所示的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9转化到水稻愈伤组织中，利用如SEQ ID NO.10所示的上游引物OsHAK9-F4和如SEQ ID NO.11所示的下游引物OsHAK9-R4鉴定阳性株系，筛选、鉴定或培育得到高活力种子的耐盐水稻品种。

发明人从日本晴EMS诱变的突变体库中鉴定了一个种子萌发期盐敏感突变体gss1，通过与日本晴(WT)杂交构建了F₂分离群体，对盐胁迫下种子萌发耐盐性进行鉴定，建立了BSA 抗感混池，利用MutMap法成功鉴定到了一个位于水稻7号染色体上的钾离子转运蛋白基因 OsHAK9，功能互补实验证明该基因能够提高水稻在盐胁迫下种子萌发能力，对提高盐胁迫下水稻种子活力具有重要意义。

本发明所述的水稻基因OsHAK9突变体互补转基因植株的获得和基因功能验证，包括如下步骤：

(1)获得水稻基因OsHAK9的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)及氨基酸序列(SEQ IDNO.2)；

(2)以日本晴种子或幼苗cDNA材料为模板，利用降落PCR扩增技术获得OsHAK9基因的编码序列全长，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.4所示；

(3)以日本晴基因组DNA为模板，利用常规PCR扩增技术获得OsHAK9基因启动子序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.5所示，所述下游引物序列如序列表SEQ IDNO.6 所示，所述启动子序列为SEQ IDNO.7所示；

(4)利用重叠PCR技术连接步骤(2)和步骤(3)得到的SEQ ID NO.1所示的OsHAK9基因编码区片段和SEQ ID NO.7所示的OsHAK9启动子片段，构建含有OsHAK9启动子和编码区的融合片段，利用同源重组法将融合片段构建到pCAMBIA1390载体中，转化大肠杆菌，提取阳性质粒，获得重组质粒即OsHAK9基因的植物表达载体，所用引物序列为SEQ IDNO.8 和SEQ IDNO.9所示；

(5)将上述步骤(4)中重组质粒转化农杆菌EHA105，挑选阳性克隆，再将带有转化质粒的农杆菌转化水稻突变体gss1愈伤组织。

(6)对上述水稻互补转基因材料进行阳性筛选，所述上游引物序列如序列表SEQID NO.10 所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.11所示。并鉴定200mM盐胁迫下水稻种子萌发能力，具体为鉴定萌发速度与幼苗生长。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

本发明从水稻EMS诱变的突变体库中分离鉴定种子萌发期盐敏感突变体gss1，利用 MutMap定位方法克隆获得OsHAK9基因，通过构建互补转基因株系首次证明了该基因参与水稻盐胁迫下种子萌发能力的调控。

本发明为选育耐盐高活力种子水稻新品种奠定了基础，也为改良水稻种子活力提供了重要的基因资源，对直播稻生产具有重要意义。

附图说明

图1：日本晴突变体gss1在盐浓度胁迫下种子萌发表型图，图中，M表示EMS诱变的粳稻日本晴种子萌发盐敏感突变体gss1，WT表示野生型日本晴；图1A为不同盐浓度(0～250mM) 下种子萌发率；图1B为200mM盐浓度胁迫下10天内种子萌发发芽率；图1C为200mM盐浓度胁迫下种子萌发5天、7天和9天的表型；

图2：水稻种子萌发耐盐GSS1基因MutMap定位图；

图3：水稻基因OsHAK9互补转基因材料在200mM盐胁迫下种子萌发表型和基因表达，其中，图3A为种子萌发第10天的种子萌发率；图3B为种子萌发第10天的种子成苗率；图3C为种子萌发指数；图3D为OsHAK9基因相对表达量。

具体实施方式

实施例1：基因定位

(一)材料与方法

1.材料：EMS诱变的粳稻日本晴种子萌发盐敏感突变体gss1(附图1所示)，以及与野生型日本晴(WT)杂交构建F₂分离群体，用于基于抗感池(BSA)的MutMap法种子萌发期耐盐位点的检测与定位。由图1A、图1B、图1C可以看出gss1突变体种子在盐胁迫下种子萌发率、萌发速度或幼苗生长显著低于对照粳稻日本晴种子。

2.抗感池单株筛选：在F₂分离群体中，随机选择150单株的后代种子进行200mM盐胁迫下种子萌发鉴定，根据鉴定结果选择极端抗盐和盐敏感的各20个单株。

3.用CTAB法提取极端个体与亲本DNA，构建BSA混池，于北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行全基因组重测序，抗感混池与日本晴(Nip)的测序深度分别20x和10x。

(二)结果与分析

以日本晴序列为参考序列，结果显示：测序质量合格，GC分布正常，平均覆盖深度在12.12X～22.54X之间，1X覆盖度在98.88％以上。在95％的置信水平下，比较△{(S-WT)-(R-WT)} 的SNP-index，共获得3个候选突变位点，分别位于5号和7号染色体上，其中钾离子转运蛋白基因OsHAK9的△SNP-index最大(附图2)。

实施例2：基因克隆

利用粳稻品种日本晴幼苗叶片cDNA为模板，利用降落PCR扩增技术克隆OsHAK9基因序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述下游引物序列如序列表SEQ IDNO.4所示。获得水稻OsHAK9基因的核苷酸序列及氨基酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQID NO.1所示，其氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。

OsHAK9-F1：5'-GCTGATTCTCTCGATTGATTAC-3'(SEQ ID NO.3)

OsHAK9-R1：5'-AGCAGAGAGATTTGATTTTGAA-3'(SEQ ID NO.4)

PCR反应体系为：

反应程序为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃90s，8个循环，变性95℃30s，退火56℃30s，延伸72℃90s，30个循环，彻底延伸72℃，10min，4℃保存。

实施例3：互补转基因植株

(一)启动子序列扩增：以日本晴基因组DNA为模板，利用PCR扩增技术扩增OsHAK9起始编码子上游约2.4kb序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.5所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.6所示，获得如SEQ ID NO.7所示的OsHAK9基因启动子序列。

OsHAK9-F2：5'-GCAACAGCAAAGGTCACTCT-3'(SEQ ID NO.5)

OsHAK9-R2：5'-ACCAGTGGATCGGATAGTCC-3'(SEQ ID NO.6)

PCR反应体系为：

反应程序为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火56℃30s，延伸72℃90s，30个循环，彻底延伸72℃10min，32个循环，4℃保存。

(二)构建重组质粒：基于重叠PCR方法原理，设计重组引物，序列如列表中SEQ IDNO.8 和SEQ ID NO.9所示，利用同源重组方法，将包含有SEQ ID NO.7所示的OsHAK9基因启动子序列和SEQ ID NO.1所示的OsHAK9基因编码区序列的目的片段融合，并将融合片段构建到pCAMBIA1390载体中，转化大肠杆菌DH5α，提取阳性质粒，得到OsHAK9基因的植物表达载体。

OsHAK9-F3：5'-ATGGATCCTGAGTTCGGGAG-3'(SEQ ID NO.8)

OsHAK9-R3：5'-CTTTCGAGGCGCCATGCCTC-3'(SEQ ID NO.9)

PCR反应体系为：

重叠PCR反应程序为：以案例2中克隆所得目的基因和上述的启动子为双模板，配置除了高保真酶和引物之外的PCR体系，进行5个循环的扩增，然后再加入高保真酶和引物。PCR 程序如下，预变性95℃5min，变性95℃30s，退火56℃30s，延伸72℃90s(无高保真酶和引物)，扩增5个循环，再加入酶和引物，变性95℃30s，退火56℃30s，延伸72℃90s，32 个循环，彻底延伸72℃10min，4℃保存。

(三)互补转基因株系的获得：将上述步骤中获得的重组质粒转化gss1愈伤组织。

以转基因植株基因组DNA为模板，筛选阳性转基因植株所用上游引物如序列表SEQID NO.10所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.11所示。

OsHAK9-F4：5'-GTTTCTTTTGTCGATGCTCA-3'(SEQ ID NO.10)

OsHAK9-R4：5'-CACTCCCAGGCTTGGTAATA-3'(SEQ ID NO.11)

反应体系为：

反应程序为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火56℃30s，延伸72℃90s，32 个循环，彻底延伸72℃10min，4℃保存。

(四)互补转基因株系表达检测：以步骤(三)筛选得到的阳性转基因植株基因组DNA 为模板，利用Real-Time PCR技术对所获得的纯合阳性互补转基因转系进行转录水平验证，所用引物序列如序列表中SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示，所用内参基因为OsActin，所述内参基因引物序列如序列表中SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。

OsHAK9-F5：5'-GGTCTCGAATCAAGGAGTGGCTTG-3'(SEQ ID NO.12)

OsHAK9-R5：5'-GCCCTGAAACCGCTGAGAATACAG-3'(SEQ ID NO.13)

OsHAK9-F6：5'-AGGAAGGCTGGAAGAGGACC-3'(SEQ ID NO.14)

OsHAK9-R6：5'-CGGGAAATTGTGAGGGACAT-3'(SEQ ID NO.15)

RT-PCR的反应体系为：

反应程序为：第一阶段，预变性95℃5min，第二阶段循环反应，变性95℃10s，退火60℃ 30s，40个循环，第三阶段融解曲线，95℃15s，退火60℃60s，95℃15s。

验证结果显示：与EMS诱变的粳稻日本晴种子萌发盐敏感突变体gss1相比，转OsHAK9 的植株株系基因表达量显著提高，证实OsHAK9基因已经转入基因组DNA中并表达。

实施例4：互补转基因植株表型分析

(一)种子萌发试验：利用构建的OsHAK9互补转基因植株种子，以及盐敏感gss1突变体水稻品种，进行如下种子萌发试验：每次重复挑选健康饱满的种子50粒，用2％的次氯酸钠溶液表面消毒10min，蒸馏水冲洗3次，将种子表面擦干，置于含有40mL石英砂的培养皿(直径9cm)中，倒入20mL的200mM NaCl，放置25℃条件下光照/黑暗各12h培养10d后，最后统计成苗率。试验重复3次。

(二)结果分析：如所述附图3所示，与盐敏感突变体gss1种子相比，OsHAK9互补转基因种子发芽率和发芽速度显著提高(图3A、图3C)，幼苗生长显著变强(图3B)。可见，OsHAK9基因对提高盐胁迫下种子发芽速度与幼苗生长具有重要促进作用。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9在提高盐胁迫下种子萌发能力中的应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2367

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggatcctg agttcgggag aggcatggcg cctcgaaaga gagagccatg gcggacgacg 60

ctgctgctgg cgtaccagag cctcggggtg gtgtacggcg acctgagcat ctcgcccctg 120

tacgtgtaca agagcacctt cgcggaggac atcacccact cggagtccaa cgaggagatc 180

ttcggcgtcc tctccttcgt cttctggacc ctcaccctca tccccctcat caagtacgtc 240

tccatcgtcc tccgcgccga cgacaacggc gaaggaggga cgtttgcgct ctactctctg 300

atctgcaggc acgccaatgt gagcctcctc ccaaacaggc aggtcgccga cgaggagctc 360

tccacgtaca agctggagta cccgcctgaa gtggctaaca ggtctcgaat caaggagtgg 420

cttgagaagc acaagactct gcagactgct ctgctgatca tggtgatgat tggaacctgt 480

atggtcatcg gggatggcgt cctcacgccc gcgatatctg tattctcagc ggtttcaggg 540

cttgaactct ccttgtccag ggatcagcat gaatatgccg tcattccgat aacatgtgtc 600

atattagtgt tcctgtttgc actccagcat tacggtaccc atcgtgtcgg atttctcttt 660

gcaccaatag tcctagcctg gttgatttgc atgagcatgc ttggcttgta caatatcatc 720

cactggaacc ctcaagttta tcgcgctctt aatccctatt acatgctcaa attcttgagg 780

aagactaaga agtctgggtg gatgtccctg gggggaattt tgctctgcat gacaggatct 840

gaagcaatgt ttgctgatct tggccatttc tcctacagtg caatccagct tgctttcact 900

acattagtat accctgcact gattttggga tacatgggcc aagctgcgta tttatcgaaa 960

catcacactc tgaactcaac ctaccaaatt ggttactata tatcggttcc agagagtgta 1020

aggtggcctg tgcttgtgct ggcaattttg gcatcggtcg tcggaagcca agcaatcatc 1080

agtggaacat tctccatcat caaccagagc cagtcactca gttgcttccc aagagtgaaa 1140

gtggtgcaca catctgagaa tatccatggc cagatttaca tccctgagat caactggctg 1200

ctcatggtcc tctgcattgc tgtgactgtc ggttttcgcg ataccaagca tatgggaaat 1260

gcatccggat tggcagtgat cacggtgatg ctggtgacga catgcctgac atccttggtg 1320

atcatgctgt gttggcaccg gagtccggcg ctggcactcg tcttcttcct cttcttcggc 1380

tccatcgagg tgctctactt ctcggcgtcg ctgatcaagt tccgggaggg ggcgtggctg 1440

ccgatcatgc tggcgctcat cctcatggcc gtcatgttca tctggcacca caccaccatc 1500

aagaagtacg agttcgacct gcacaacaag gtgaccctgg agtggctgct cgccctgggc 1560

gacaagctgg gcatggtgcg cgtcccgggc atcggcctcg tctacaccga cctcacctcc 1620

ggcgtgccgg ccaacttctc ccgcttcgtc accaacctcc cggcgttcca ccgcgtgctg 1680

gtgttcgtct gcgtcaagtc cgtcccggta ccgcacgtgc ttcccgccga gcgctacctc 1740

gtcggccgcg tcggcccggc ggggcaccgg tcgtaccggt gcatcgtgcg gtacggctac 1800

cgcgacgtgc accaggacgt ggactcgttc gaggcggagc tcgtcgagag cctcgccacc 1860

ttcatcaagc tggacgcgct gtaccaccgc tgcagcgacg ccggcagcgg gagcgagcag 1920

ctcgacgacg gccgctacga gcgcgagaac gcgctcacgg tgatcgggac gaaccctctc 1980

cggcgatgcc tcagctacga ggcctcccac gacggcgtgt cctcggtgga cgccgcgcgc 2040

agcccgaacg ggatagtgga ggtcccggcg gcggcggcgg cggcgccggt gacgaagaag 2100

gtgaggttcg tggtggaggc ggcgagcccg gaggtggaga agggcgtggt ggaggagctg 2160

caggagctgt gcgaggcgag ggaggccggc acggcgttca tcctggggca ctcgcacgtg 2220

cagaccaagc cgggctcgtc gctgctgaag aagctcgccg tcggcgtcgg gtacaacttc 2280

ctccggcgaa actgccgcgg cccggacgtg gtgctgcgcg tgccgccggc gtcgctgctc 2340

gaggtcggca tggtctacgt cctatga 2367

<210> 2

<211> 788

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Asp Pro Glu Phe Gly Arg Gly Met Ala Pro Arg Lys Arg Glu Pro

1 5 10 15

Trp Arg Thr Thr Leu Leu Leu Ala Tyr Gln Ser Leu Gly Val Val Tyr

20 25 30

Gly Asp Leu Ser Ile Ser Pro Leu Tyr Val Tyr Lys Ser Thr Phe Ala

35 40 45

Glu Asp Ile Thr His Ser Glu Ser Asn Glu Glu Ile Phe Gly Val Leu

50 55 60

Ser Phe Val Phe Trp Thr Leu Thr Leu Ile Pro Leu Ile Lys Tyr Val

65 70 75 80

Ser Ile Val Leu Arg Ala Asp Asp Asn Gly Glu Gly Gly Thr Phe Ala

85 90 95

Leu Tyr Ser Leu Ile Cys Arg His Ala Asn Val Ser Leu Leu Pro Asn

100 105 110

Arg Gln Val Ala Asp Glu Glu Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Tyr Pro

115 120 125

Pro Glu Val Ala Asn Arg Ser Arg Ile Lys Glu Trp Leu Glu Lys His

130 135 140

Lys Thr Leu Gln Thr Ala Leu Leu Ile Met Val Met Ile Gly Thr Cys

145 150 155 160

Met Val Ile Gly Asp Gly Val Leu Thr Pro Ala Ile Ser Val Phe Ser

165 170 175

Ala Val Ser Gly Leu Glu Leu Ser Leu Ser Arg Asp Gln His Glu Tyr

180 185 190

Ala Val Ile Pro Ile Thr Cys Val Ile Leu Val Phe Leu Phe Ala Leu

195 200 205

Gln His Tyr Gly Thr His Arg Val Gly Phe Leu Phe Ala Pro Ile Val

210 215 220

Leu Ala Trp Leu Ile Cys Met Ser Met Leu Gly Leu Tyr Asn Ile Ile

225 230 235 240

His Trp Asn Pro Gln Val Tyr Arg Ala Leu Asn Pro Tyr Tyr Met Leu

245 250 255

Lys Phe Leu Arg Lys Thr Lys Lys Ser Gly Trp Met Ser Leu Gly Gly

260 265 270

Ile Leu Leu Cys Met Thr Gly Ser Glu Ala Met Phe Ala Asp Leu Gly

275 280 285

His Phe Ser Tyr Ser Ala Ile Gln Leu Ala Phe Thr Thr Leu Val Tyr

290 295 300

Pro Ala Leu Ile Leu Gly Tyr Met Gly Gln Ala Ala Tyr Leu Ser Lys

305 310 315 320

His His Thr Leu Asn Ser Thr Tyr Gln Ile Gly Tyr Tyr Ile Ser Val

325 330 335

Pro Glu Ser Val Arg Trp Pro Val Leu Val Leu Ala Ile Leu Ala Ser

340 345 350

Val Val Gly Ser Gln Ala Ile Ile Ser Gly Thr Phe Ser Ile Ile Asn

355 360 365

Gln Ser Gln Ser Leu Ser Cys Phe Pro Arg Val Lys Val Val His Thr

370 375 380

Ser Glu Asn Ile His Gly Gln Ile Tyr Ile Pro Glu Ile Asn Trp Leu

385 390 395 400

Leu Met Val Leu Cys Ile Ala Val Thr Val Gly Phe Arg Asp Thr Lys

405 410 415

His Met Gly Asn Ala Ser Gly Leu Ala Val Ile Thr Val Met Leu Val

420 425 430

Thr Thr Cys Leu Thr Ser Leu Val Ile Met Leu Cys Trp His Arg Ser

435 440 445

Pro Ala Leu Ala Leu Val Phe Phe Leu Phe Phe Gly Ser Ile Glu Val

450 455 460

Leu Tyr Phe Ser Ala Ser Leu Ile Lys Phe Arg Glu Gly Ala Trp Leu

465 470 475 480

Pro Ile Met Leu Ala Leu Ile Leu Met Ala Val Met Phe Ile Trp His

485 490 495

His Thr Thr Ile Lys Lys Tyr Glu Phe Asp Leu His Asn Lys Val Thr

500 505 510

Leu Glu Trp Leu Leu Ala Leu Gly Asp Lys Leu Gly Met Val Arg Val

515 520 525

Pro Gly Ile Gly Leu Val Tyr Thr Asp Leu Thr Ser Gly Val Pro Ala

530 535 540

Asn Phe Ser Arg Phe Val Thr Asn Leu Pro Ala Phe His Arg Val Leu

545 550 555 560

Val Phe Val Cys Val Lys Ser Val Pro Val Pro His Val Leu Pro Ala

565 570 575

Glu Arg Tyr Leu Val Gly Arg Val Gly Pro Ala Gly His Arg Ser Tyr

580 585 590

Arg Cys Ile Val Arg Tyr Gly Tyr Arg Asp Val His Gln Asp Val Asp

595 600 605

Ser Phe Glu Ala Glu Leu Val Glu Ser Leu Ala Thr Phe Ile Lys Leu

610 615 620

Asp Ala Leu Tyr His Arg Cys Ser Asp Ala Gly Ser Gly Ser Glu Gln

625 630 635 640

Leu Asp Asp Gly Arg Tyr Glu Arg Glu Asn Ala Leu Thr Val Ile Gly

645 650 655

Thr Asn Pro Leu Arg Arg Cys Leu Ser Tyr Glu Ala Ser His Asp Gly

660 665 670

Val Ser Ser Val Asp Ala Ala Arg Ser Pro Asn Gly Ile Val Glu Val

675 680 685

Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Val Thr Lys Lys Val Arg Phe Val

690 695 700

Val Glu Ala Ala Ser Pro Glu Val Glu Lys Gly Val Val Glu Glu Leu

705 710 715 720

Gln Glu Leu Cys Glu Ala Arg Glu Ala Gly Thr Ala Phe Ile Leu Gly

725 730 735

His Ser His Val Gln Thr Lys Pro Gly Ser Ser Leu Leu Lys Lys Leu

740 745 750

Ala Val Gly Val Gly Tyr Asn Phe Leu Arg Arg Asn Cys Arg Gly Pro

755 760 765

Asp Val Val Leu Arg Val Pro Pro Ala Ser Leu Leu Glu Val Gly Met

770 775 780

Val Tyr Val Leu

785

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctgattctc tcgattgatt ac 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcagagaga tttgattttg aa 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcaacagcaa aggtcactct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accagtggat cggatagtcc 20

<210> 7

<211> 2429

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 7

cggatagtcc ttgtcctttg aatgaaactg atgctaccct ttttctcaaa ttttacacct 60

tgttttctac taaacaatat gattttataa aaaataaatt ctatataaag attactttaa 120

aataattcta tatattaatc atttttttaa aattttttta agctaataat taattaatta 180

atcatgtatt aatgagtcgt acgttttcat ggtatagagg tgtttctaat tggccagtcc 240

aaactcagtc ttatagtatc ctatcatgta aaagtgttaa tataccatta tatttatatt 300

aagtttcata aaactacaaa tacttttgtt aaattatcac ataactacaa ttttaagata 360

atatatcata aaactacaga tttaatacta actttattat agaactacag atttaaggtt 420

gagtgttgta aaactataaa tttactaaca aaattatcat aaaaatacaa atttagcatc 480

aatttagaca aaactcggat gtttataatt caaatataat attagtgcta aggatttaaa 540

ccccgaaata tgtaattatg tgataatttt attgttaaat atgtagtttt gtgatactta 600

gtcttaaata tgtagttttc tgataaaatc tgtagttttg tgataatttg atcaaatatt 660

tataatttta tgaaaattac tcttgtgtat attcacagta tattacaaat gttaatgttt 720

atatatccgt acaaaattca aagagttgaa agataccatg atacgtgtca ttggcatgtg 780

ggtctagaac tcagatgtca ttcggttatt ttcatatagt atgatggtat tttgtaacct 840

acgtatatct gcaatggttt ttttaatata taaaaaaaat ttagcataca atctcctcta 900

aaaaaaatat taccaagcct gggagtgccg gatacgattc gcttcgcttt tattcatatc 960

catgtggcgt ggaacggatc atcgatggca catcgcggga tgctcgagga gatggccatg 1020

tgttcttggt acttgcttga ttctttccat cttttcttta tttgattgta gaaagaaaga 1080

aacagctcaa acttgtgtgg ccggcacggc tgtattaatg ttctccgttg catcagagtc 1140

atattttgtc gattcttcaa gtcctcttct ggtcgtcgtc ctaaaagatt agtagtagct 1200

cgtttggcat ttgagatgca gacatgggtt gggtgcagaa ctaggggaat gcttttctgt 1260

cttctgctgc ttctttgatt tcttcagaag tttcttgcac accaatgtgt atagtagaga 1320

agccaaaaat gggaatacga tctcttgggt tttgtgctgt tactagctcc ttgttcttgc 1380

cctttcagca agcaaatatg agatctttgc agctataatt aatcaagaac tgttctctgt 1440

aaaaataaat aggagtccac ttttggacca gtcactgcat tagaatgtaa acaattcttt 1500

cgctttcaca agtttacata aggttcggca tgagtaagat cacatttttc tcgagacata 1560

agaagtggta ggagtccatc tttcaaaaag aattggtgat ccgttatcat ctattctttt 1620

cgatttggac ctatcctctc ctccctgcca aactctgaac tgaccaaaaa ggtttggatc 1680

tttttgcatt ggtttgaggc aagaagaaga agaggttgga gtgcgaattc caccattaac 1740

gcaatagtga tgatctaggg gaggcttccc tggtctgcat tacattctga aagcaaaagc 1800

tcattgagtc ggcacttcct gtgctgtgat gcgagaatgt gagttcacat gcttttgtcc 1860

ttggacccac atggcctgcc ttggctgttc cattcggtca tatgcccaaa aagctctcgt 1920

taaatcccct acctgctgca ctttgccatc catcgatttg attttatatg atgcaacttg 1980

gtgttatccc aactttgtaa gtttagtgtg attatctctt tgaagcttag gtagaggagt 2040

gagcactagt agttgattaa taggatttgt attgtaagtg tgatactgct ccaccacacg 2100

tgtctatatc gcttccttcc attccatcac ctcgcattca ttccaattag tgatcttgag 2160

gggctccatc tgcaactttt caccttggat atatttgcat ccttgctttt cccagctctc 2220

ctcgcccttt ccccttctta gagctgattc tctcgattga ttacctagta ctactgcaat 2280

tcacattgtc agctcttgct tgttcccagg tgcgtcctct atctgtgttc aatcttgttc 2340

ttggcctgca gaatctatac aagttatgac agtgtgttgt atctaattca tcttttcttg 2400

gagcaggagg atcagtttct tgctgagca 2429

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggatcctg agttcgggag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctttcgaggc gccatgcctc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtttcttttg tcgatgctca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cactcccagg cttggtaata 20

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggtctcgaat caaggagtgg cttg 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gccctgaaac cgctgagaat acag 24

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aggaaggctg gaagaggacc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgggaaattg tgagggacat 20

Claims

1.SEQ ID NO.1所示的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9在提高盐胁迫下水稻种子萌发能力中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的提高盐胁迫下水稻种子萌发能力为提高水稻种子发芽率和/或提高水稻种子发芽速度和/或提高水稻种子活力和/或促进幼苗生长。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，将所述水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9的植物表达载体导入水稻，提高盐胁迫下水稻种子萌发能力。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9的植物表达载体的构建方法为：

(1)以日本晴种子或幼苗cDNA材料为模板，设计如SEQ ID NO.3所示的上游引物OsHAK9-F1和如SEQ ID NO.4所示的下游引物OsHAK9-R1，利用降落PCR扩增技术获得如SEQID NO.1所示的OsHAK9基因编码序列全长；

(3)设计如SEQ ID NO.8所示的上游引物OsHAK9-F3和如SEQ ID NO.9所示的下游引物OsHAK9-R3，利用重叠PCR技术连接步骤(1)和步骤(2)得到的片段，构建得到含有OsHAK9启动子和编码区的融合片段，利用同源重组法将融合片段构建到pCAMBIA1390载体中，得到OsHAK9基因的植物表达载体。

5.一种通过转水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9提高盐胁迫下水稻种子萌发能力的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(3)设计如SEQ ID NO.8所示的上游引物OsHAK9-F3和如SEQ ID NO.9所示的下游引物OsHAK9-R3，利用重叠PCR技术连接步骤(1)和步骤(2)得到的片段，构建得到含有OsHAK9启动子和编码区的融合片段，利用同源重组法将融合片段构建到pCAMBIA1390载体中，得到OsHAK9基因的植物表达载体；

6.SEQ ID NO.1所示的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9在筛选、鉴定或培育高活力种子的耐盐胁迫水稻品种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：

(1)以日本晴幼苗cDNA材料为模板，设计如SEQ ID NO.3所示的上游引物OsHAK9-F1和如SEQ ID NO.4所示的下游引物OsHAK9-R1，利用降落PCR扩增技术获得如SEQ ID NO.1所示的OsHAK9基因编码序列全长；

(4)OsHAK9基因植物表达载体加入感受态农杆菌EHA105，挑选阳性克隆，通过农杆菌介导的水稻转基因技术将SEQ ID NO.1所示的水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK9转化到水稻愈伤组织中，利用如SEQ ID NO.10所示的上游引物OsHAK9-F4和如SEQ ID NO.11所示的下游引物OsHAK9-R4鉴定阳性株系，筛选、鉴定或培育得到高活力种子的耐盐水稻品种。