CN110078804A - 一种提高植物和微生物耐低氮胁迫能力的蛋白质及其基因 - Google Patents

Abstract

一种提高植物和微生物耐低氮胁迫能力的蛋白质及其基因，属于生物基因工程技术领域。该蛋白质氨基酸序列为：SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或 SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。编码该蛋白质的基因核苷酸序列为：SEQ ID No.1 所示的核苷酸；或SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码 CsNRT2.4的核苷酸序列。本发明新发现了茶树高亲和硝酸根转运蛋白CsNRT2.4，将该蛋白对应的基因在植物或微生物中过表达，可以增强植物和微生物从外界土壤或培养基质中吸收硝酸根，以提高植物或微生物耐低氮胁迫能力。

Description

一种提高植物和微生物耐低氮胁迫能力的蛋白质及其基因

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种提高植物和微生物耐低氮胁迫能力的蛋白质及其基因。

背景技术

硝酸盐（NO₃ ^-）是一种重要的营养物质，也是一种信号分子，且对植物和微生物的新陈代谢和发育都有重要影响。在植物中，从土壤中吸收硝酸盐是一个由复杂网络调控的关键过程，这些网络的核心是根中的硝酸盐转运体。对于硝酸根的吸收和转运，植物进化出了庞大的转运蛋白家族，且在不同的组织部位，会有相应的转运蛋白发挥作用。

研究发现，NRT2转运蛋白被认为是高亲和性硝酸根转运蛋白家族，可在外界硝酸根浓度较低的情况下吸收和转运NO₃ ^-以保证植物的生长发育。茶树是喜铵耐铵的多年生木本叶用植物。然而，最近研究表明混合供应NO₃ ⁻和NH₄ ⁺更有利于茶树生长，说明土壤中的NO₃ ⁻也是茶树生长的重要氮源物质。

目前，有关茶树硝酸根吸收转运的基因及蛋白质未见任何报道。鉴于茶树田间施肥特点是少量多次，因此高亲和硝酸根转运蛋白的在茶树硝酸根的吸收利用中发挥了重要作用，因此该茶树高亲和硝酸根转运蛋白CsNRT2.4基因的发现对于提高植物和微生物硝酸根吸收效率，增加植物和微生物耐低氮胁迫能力具有重要的实践意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种提高植物和微生物耐低氮胁迫能力的蛋白质及其编码基因和应用的技术方案。

所述的一种转运硝酸根的蛋白质，其特征在于该蛋白质的氨基酸序列为：

1）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列 ；或

2）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

所述的编码所述蛋白质的基因,其特征在于该基因的核苷酸序列为：

1）SEQ ID No.1 所示的核苷酸；或

2）SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码 CsNRT2.4的核苷酸序列。

所述的含有所述编码基因的重组载体。

所述的编码基因在从营养介质中转运硝酸根到生物体中的应用。

所述的编码基因在增强植物和微生物从外界土壤或培养基质中吸收硝酸根，以提高植物或微生物耐低氮胁迫能力的应用。

所述的编码基因在增强植物和微生物提高硝酸根吸收效率中的应用。

所述的一种提高植物和微生物耐低氮胁迫能力的方法，其特征在于包括如下步骤：将编码基因导入植物和微生物中，使该基因过量表达，以提高植物和微生物硝酸根吸收效率，增加植物和微生物耐低氮胁迫能力，所述的编码基因的核苷酸序列为：

1）SEQ ID No.1 所示的核苷酸；或

2）SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码 CsNRT2.4的核苷酸序列。

本发明的实验证明，本发明新发现了茶树高亲和硝酸根转运蛋白CsNRT2.4，将该蛋白对应的基因在植物或微生物中过表达，可以增强植物和微生物从外界土壤或培养基质中吸收硝酸根，以提高植物或微生物耐低氮胁迫能力。

附图说明

图1为 茶树CsNRT2.4的基因和氨基酸序列；

图2 为不同茶树组织中CsNRT2.4基因qPCR相对定量结果；

图3 为基质培养3周后CsNRT2.4超表达株系（OE）与野生型（WT）的表型比较，图中星号（*）代表独立样本T测验在P0.05水平下差异显著，WT为野生型Col-0拟南芥，OE为转入茶树CsNRT2.4基因的拟南芥超表达株系；

图4为 氮素处理条件下CsNRT2.4超表达株系（OE）与野生型（WT）的表型比较，图中A和B分别为在缺氮（0 mM N）和低氮（0.2 mM N）条件下野生型拟南芥（WT）和CsNRT2.4-OE超表达株系的表型观测，C和D分别为不同氮素处理条件下WT和OE株系的根系长度和鲜重的差异，星号（*）代表独立样本T测验在P0.05水平下差异显著，WT为野生型Col-0拟南芥，OE为转入茶树CsNRT2.4基因的拟南芥超表达株系；

图5 为NMT测定拟南芥根系NO3-吸收速率，图中A为在5 min测试时间内野生型拟南芥（WT）和转茶树CsNRT2.4基因的超表达株系（OE）根系对0.1 mM NO3-的吸收速率的动态变化，B为不同时间点及重复的吸收速率的平均值及方差分析结果，星号（*）代表独立样本T测验在P0.05水平下差异显著，WT为野生型Col-0拟南芥，OE为转入茶树CsNRT2.4基因的拟南芥超表达株系。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例

（1）基因克隆：以龙井43的幼根为材料，用试剂盒法提取总RNA；根据CsNRT2.4的mRNA序列设计引物，用反转录PCR法获得该基因的全长，并测序验证，最终得到的茶树CsNRT2.4的基因序列SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，如图1所示。

上述反转录基因克隆所采用的引物为CsNRT2.4-F: 5′- AGACACCTTCAAAAGTTACA-3′（如SEQ ID No.3所示）； CsNRT2.4-R: 5′- GATACAAATCCGTCACCT-3′（如SEQ ID No.4所示）。

（2）实时荧光定量分析： 荧光定量PCR采用ABI 7500实时PCR系统（AppliedBiosystems），以SYBR Green染料进行标记。内参基因选择茶树GAPDH基因(GE651107)。

采用的引物为CsNRT2.4-Q-F: 5′- CCGACTACTCCGCCAGATTC -3′（如SEQ ID No.5所示）；CsNRT2.4-Q-R: 5′- GGAGGAAGCAGAAGAGTCCG -3′（如SEQ ID No.6所示）； GAPDH-F:5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′（如SEQ ID No.7所示）及 GAPDH-R:5′-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3′（如SEQ ID No.8所示）。

反应体系为25ml，包含0.5mL LATaq, 5mL PCR缓冲液, 2 mL dNTP(2.5 mM),0.5mL引物(10 M), 1mL cDNA(40 ng)和15.5mL ddH₂O。

反应条件为: 94℃，3分钟； 95℃ ，30秒；59℃，30秒；72℃,1分钟；30个循环。72℃,10分钟；4℃保存。每组样品3个重复。

如图2所示，三个茶树品种中根、成熟叶片、一芽二叶等不同组织部位CsNRT2.4基因qPCR相对定量结果，说明茶树CsNRT2.4基因在茶树根中特异表达。

（3）转基因蛋白重组表达纯化：将茶树CsAlaDC全长cDNA的编码框克隆到含有T7启动子的原核表达载体pET28b上。

具体步骤包括：

设计特异引物：正向引物5’-CGCGAGCTC(SacI)ATGGCCAACATTGAAGCAC（如SEQ ID No.9所示）和反向引物5’- GTCGAC(SalI)AAGATGGTTTGGACTCGAATCC（如SEQ ID No.10所示）；通过PCR方法扩增出目的基因CsNRT2.4的编码区序列；表达载体构建：PCR 扩增的Cs NRT2.4基因经胶回收纯化后，割胶回收后，分别对目的片段和pCAMBIA1300-35S-GFP超表达载体质粒进行用SacI 和SalI 双酶切；双酶切回收后的目的片段经T4 DNA连接酶连接到载体上、转化到大肠杆菌Trans5α感受态细胞中、经过菌液PCR及测序验证后，提取得到重组质粒；将正确的重组质粒转化到农杆菌GV3101, 经过PCR鉴定后，接到200 mL的LB（卡那抗性）中摇床28 ℃、200 rpm培养到 OD600在1.0左右；离心菌液（8000 rpm室温离心 6 min），将得到的菌液沉淀用同体积（200 mL）MS溶液（加5 %的蔗糖，KOH调到pH 5.7）重悬。向上述重悬液加入0.02 %Silwet l-77拟南芥转化辅助试剂；将野生型拟南芥花序浸到上述重悬液中，真空0.5 Kpa抽5 min，吸去表面菌液，放到培养室等待收种子（T0代），试验由杭州润朗赛生物技术有限公司协助完成。收到的种子在含有50 μg/mL 的卡那霉素和 25 μg/mL浓度的潮霉素1/5hoagland板上筛选阳性苗。

T2、T3代纯合体筛选：将阳性T1代单株种下后，收获的部分种子（T2）经25-30 μg/mL浓度的潮霉素筛选后，筛选全部存活的为AA（T3）为纯合的株系，获得CsNRT2.4转基因拟南芥的纯系植物。

（4）CsNRT2.4转基因拟南芥耐低氮胁迫能力验证

以野生型（Col-0，WT）及CsNRT2.4基因超表达株系（OE）为材料，采用草炭基质及不同氮素处理的培养基（1/2 MS without nitrogen + 0、0.2 mM N）培养的方法，观测超表达株系的生长差异。同时设置不同的氮素浓度0、0.2 mM N（以KNO₃ 和(NH₄)₂SO₄为氮源，其中NO₃ ^-：NH₄ ⁺=1:1） 对拟南芥生长的影响。对株系的根系长度、叶片大小、生物量进行统计，考察超表达株系的生长表型差异。待幼苗生长3周至6-7枚叶片后进行表型差异统计。

如图3和图4所示，OE株系生长明显优于WT，对其叶片特征的测定结果显示，OE株系的叶宽、叶长以及叶柄长度均明显高于野生型（WT）。说明CsNRT2.4可促进拟南芥的硝酸根吸收及氮素利用率，提高植株的耐低氮胁迫能力。

采用NMT非损伤测定的方法测定转CsNRT2.4基因（OE）和野生型拟南芥（WT）根系NO₃ ^-离子吸收的差异。在不含氮素的1/2MS的培养基进行氮素饥饿7天之后，选取距根尖3-4mm的成熟区，测定不同株系拟南芥根系对0.1 mM NO₃ ^-的吸收速率，结果如图5所示，发现CsNRT2.4超表达株系的NO₃ ^-吸收速率明显高于野生型。说明，茶树CsNRT2.4基因有助于提升拟南芥根系在低氮条件下对外界NO₃ ^-的吸收速率。

序列表

<110> 中国农业科学院茶叶研究所

<120> 一种提高植物和微生物耐低氮胁迫能力的蛋白质及其基因

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1515

<212> DNA

<213> 茶树(tea)

<400> 1

atggccaaca ttgaagcaca actctccaca tcaaaatttt cattaccagt agattccgaa 60

aacaaatcca aatcactcaa aatcttctcc ttcgccaacc cacacatgag aaccttccac 120

ctctcctggt tttcattctt cacttgtttc gtctccacct tcgccgccgc tcctctcgtc 180

ccaatcatcc gcgacaacct caacctcacc aaatccgaca taggaaacgc cggggtagcc 240

tcggtttccg gaagcatctt ttccaggctc gtcatgggcc cagtatgtga tctactgggc 300

ccacggtacg gttgtgcttt tttaatcatg ttgtcggccc cgacagtgtt ctcgatgtcg 360

ttcgtgtcgt cggcatcggg atacattact gtccgattca tgattgggtt ttgtttggca 420

acgttcgtgt cgtgtcagta ttggatgagt aggatgttta atggggagat tattgggctt 480

gtgaatggga cggccgctgg gtgggggaat atgggtggag gagctactca gcttataatg 540

ccgttgctgt atgagttgat tttacggtgc gggtcgagtc cgtttaccgc gtggcggatt 600

gcttttttta tacccggttg gtttcatgtc attatgggga ttttggtttt gactcttggt 660

caggatttgc ctgaagggaa ccttggggct ttgcagaaga agggtgatgt tgccagagat 720

aaattctcta aggtgttatg gtatgctatc acaaactaca ggacatggat ctttgtcctc 780

ctctacggct attccatggg tgtcgagtta tccacagaca atgtcatcgc agagtacttt 840

tacgacaggt tcaatctcaa gctccacact gccggcacca tcgcagccac cttcggcatg 900

gccaacctca tcgcccgccc cttcggcggc ttcgcttccg actactccgc cagattcttc 960

ggcatgagag gccgcctgtg gaccctctgg atcctccaaa cactcggcgg actcttctgc 1020

ttcctcctcg gccacgccaa ctccctcccc atcgccatct ccatgatgat cctcttctcc 1080

gccggcgctc aggccgcctg cggagccacc ttcggcatca tccccttcat ttctcgccga 1140

tctctcggag tcatttctgg catggtcgga gccggtggga attttgggtc tggtttgaca 1200

cagttgatat ttttcacaag ctccaagtac tcaactcaaa tgggtttatc ttatatgggt 1260

gttatgatta tgtgttgtac tttgccggtg atgtttgtga attttccgca gtggggtggg 1320

atgtttgttg gggccgcgaa agagggtgtg aaagggagtg aagagtacta ttatgggtcg 1380

gagtggagcg agcaggagaa ggagaagggg atgcatcagg gaagtttgaa gtttgcggag 1440

aacagccggt cggagagggg gaggagggtt gcttctgtgg catcgccgct ggattcgagt 1500

ccaaaccatc tttaa 1515

<210> 2

<211> 504

<212> PRT

<213> 茶树(tea)

<400> 2

Met Ala Asn Ile Glu Ala Gln Leu Ser Thr Ser Lys Phe Ser Leu Pro

1 5 10 15

Val Asp Ser Glu Asn Lys Ser Lys Ser Leu Lys Ile Phe Ser Phe Ala

20 25 30

Asn Pro His Met Arg Thr Phe His Leu Ser Trp Phe Ser Phe Phe Thr

35 40 45

Cys Phe Val Ser Thr Phe Ala Ala Ala Pro Leu Val Pro Ile Ile Arg

50 55 60

Asp Asn Leu Asn Leu Thr Lys Ser Asp Ile Gly Asn Ala Gly Val Ala

65 70 75 80

Ser Val Ser Gly Ser Ile Phe Ser Arg Leu Val Met Gly Pro Val Cys

85 90 95

Asp Leu Leu Gly Pro Arg Tyr Gly Cys Ala Phe Leu Ile Met Leu Ser

100 105 110

Ala Pro Thr Val Phe Ser Met Ser Phe Val Ser Ser Ala Ser Gly Tyr

115 120 125

Ile Thr Val Arg Phe Met Ile Gly Phe Cys Leu Ala Thr Phe Val Ser

130 135 140

Cys Gln Tyr Trp Met Ser Arg Met Phe Asn Gly Glu Ile Ile Gly Leu

145 150 155 160

Val Asn Gly Thr Ala Ala Gly Trp Gly Asn Met Gly Gly Gly Ala Thr

165 170 175

Gln Leu Ile Met Pro Leu Leu Tyr Glu Leu Ile Leu Arg Cys Gly Ser

180 185 190

Ser Pro Phe Thr Ala Trp Arg Ile Ala Phe Phe Ile Pro Gly Trp Phe

195 200 205

His Val Ile Met Gly Ile Leu Val Leu Thr Leu Gly Gln Asp Leu Pro

210 215 220

Glu Gly Asn Leu Gly Ala Leu Gln Lys Lys Gly Asp Val Ala Arg Asp

225 230 235 240

Lys Phe Ser Lys Val Leu Trp Tyr Ala Ile Thr Asn Tyr Arg Thr Trp

245 250 255

Ile Phe Val Leu Leu Tyr Gly Tyr Ser Met Gly Val Glu Leu Ser Thr

260 265 270

Asp Asn Val Ile Ala Glu Tyr Phe Tyr Asp Arg Phe Asn Leu Lys Leu

275 280 285

His Thr Ala Gly Thr Ile Ala Ala Thr Phe Gly Met Ala Asn Leu Ile

290 295 300

Ala Arg Pro Phe Gly Gly Phe Ala Ser Asp Tyr Ser Ala Arg Phe Phe

305 310 315 320

Gly Met Arg Gly Arg Leu Trp Thr Leu Trp Ile Leu Gln Thr Leu Gly

325 330 335

Gly Leu Phe Cys Phe Leu Leu Gly His Ala Asn Ser Leu Pro Ile Ala

340 345 350

Ile Ser Met Met Ile Leu Phe Ser Ala Gly Ala Gln Ala Ala Cys Gly

355 360 365

Ala Thr Phe Gly Ile Ile Pro Phe Ile Ser Arg Arg Ser Leu Gly Val

370 375 380

Ile Ser Gly Met Val Gly Ala Gly Gly Asn Phe Gly Ser Gly Leu Thr

385 390 395 400

Gln Leu Ile Phe Phe Thr Ser Ser Lys Tyr Ser Thr Gln Met Gly Leu

405 410 415

Ser Tyr Met Gly Val Met Ile Met Cys Cys Thr Leu Pro Val Met Phe

420 425 430

Val Asn Phe Pro Gln Trp Gly Gly Met Phe Val Gly Ala Ala Lys Glu

435 440 445

Gly Val Lys Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Tyr Gly Ser Glu Trp Ser Glu

450 455 460

Gln Glu Lys Glu Lys Gly Met His Gln Gly Ser Leu Lys Phe Ala Glu

465 470 475 480

Asn Ser Arg Ser Glu Arg Gly Arg Arg Val Ala Ser Val Ala Ser Pro

485 490 495

Leu Asp Ser Ser Pro Asn His Leu

500

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 3

agacaccttc aaaagttaca 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 4

gatacaaatc cgtcacct 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 5

ccgactactc cgccagattc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 6

ggaggaagca gaagagtccg 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 7

ttggcatcgt tgagggtct 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 8

cagtgggaac acggaaagc 19

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 9

cgcgagctca tggccaacat tgaagcac 28

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 10

gtcgacaaga tggtttggac tcgaatcc 28

Claims (7)

1.一种转运硝酸根的蛋白质，其特征在于该蛋白质的氨基酸序列为：

1）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

2）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求 1 所述蛋白质的基因,其特征在于该基因的核苷酸序列为：

1）SEQ ID No.1 所示的核苷酸；或

2）SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码 CsNRT2.4的核苷酸序列。

3.含有如权利要求2所述编码基因的重组载体。

4.如权利要求2 所述的编码基因在从营养介质中转运硝酸根到生物体中的应用。

5.如权利要求2 所述的编码基因在增强植物和微生物从外界土壤或培养基质中吸收硝酸根，以提高植物或微生物耐低氮胁迫能力的应用。

6.如权利要求2 所述的编码基因在增强植物和微生物提高硝酸根吸收效率中的应用。

7.一种提高植物和微生物耐低氮胁迫能力的方法，其特征在于包括如下步骤：将编码基因导入植物和微生物中，使该基因过量表达，以提高植物和微生物硝酸根吸收效率，增加植物和微生物耐低氮胁迫能力，所述的编码基因的核苷酸序列为：

1）SEQ ID No.1 所示的核苷酸；或

2）SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码 CsNRT2.4的核苷酸序列。