CN104395473A - 具有叶中改变的硝酸盐水平的转基因植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可以用于制备转基因植物的遗传构建体。构建体可以具有降低植物特别是植物的叶中硝酸盐浓度的能力，和诱导衰老样表型的能力。本发明扩展至用这种构建体转化的植物细胞和转基因植物本身。本发明还涉及产生转基因植物的方法和涉及在植物中降低硝酸盐含量的方法。本发明还涉及已用遗传构建体转化的收获的植物叶(例如烟草叶)和涉及包含这种收获的植物叶的多种烟草制品(诸如吸烟制品)。

Description

具有叶中改变的硝酸盐水平的转基因植物
技术领域
本发明涉及可以用于制备转基因植物的遗传构建体。构建体可以具有降低植物特别是植物的叶中硝酸盐浓度的能力。本发明扩展至用此类构建体转化的植物细胞和转基因植物本身。本发明还涉及产生转基因植物的方法和在植物中降低硝酸盐含量的方法。本发明还提供用于改变植物氨基酸概况的方法。本发明还涉及已用遗传构建体转化的收获的植物叶(例如烟草叶)和包含此类收获的植物叶的各种烟草制品(诸如吸烟制品)。
背景
氮同化对于植物生长具有根本重要性。在植物所需的所有矿物质营养物中，氮是最大丰度需要的。在田间植物摄取的氮的主要形式是硝酸盐和氨，其是氮肥的主要组分。根据可用性，植物从土壤中摄取硝酸盐或铵离子。硝酸盐在充分氧化的非酸性土壤中会更丰富，而铵会在酸性或积水土壤中占优势。对烟草生长参数的实验清楚地表明，相对生长速率、叶绿素含量、叶面积和根面积响应于渐增的硝酸盐供应而急剧增加。
植物已经发展了非常高效氮摄取系统以处理耕种土壤的硝酸盐含量的巨大变化。植物根通过特定硝酸盐转运蛋白(NTR)的作用摄取硝酸盐和氨。已经显示两个硝酸盐转运系统共存于植物中，NRT1基因家族和NRT2基因家族。据信，两个转运蛋白家族合作地作用以便从土壤摄取硝酸盐并将其分布在植物各处。通常假定NRT1基因家族介导根低亲和力转运系统(LATS，即当外部硝酸盐浓度>1 mM时)，而NRT2基因家族介导高亲和力转运系统(HATS，即当外部硝酸盐浓度<1 mM时)。在拟南芥中，已知七个基因属于NRT2基因家族。还已知，这些基因的表达受植物暴露的硝酸盐的浓度调节。然而，除了Atnrt2.1、Atnrt2.4和Atnrt2.7，其它NRT2基因的功能尚未阐明。
NRT2基因家族的最佳表征成员之一是Atnrt2.1。在拟南芥中，AtNRT2.1与NAR2 (AtNRT3)蛋白相互作用，以形成HATS的重要组分。拟南芥中AtNRT2.1硝酸盐转运蛋白的突变的、非功能性形式的过表达引起高亲和力硝酸盐摄取系统活性的显著降低和叶片硝酸盐含量的降低。作为结果，当拟南芥在低硝酸盐浓度中生长时，这些Nrt2.1突变体植物的生长受到严重损害。
Nrt2.7是表征不足的基因。已知其在植物种子，特别是在液泡膜中表达，并且其调节植物种子的硝酸盐含量。最近已经表征了硝酸盐转运蛋白Nrt2.4。NRT2.4蛋白参与在非常低的外部浓度下植物的根对硝酸盐的摄取和将硝酸盐装载到植物枝条的韧皮部。
硝酸盐转运蛋白、和硝酸盐和亚硝酸盐还原酶的活性调节在整个植物中控制主要氮同化中是关键的，且对于植物的生长和发育具有显著影响。然而，在某些条件下，硝酸盐可能积累，主要是在绿色光合活跃组织中积累，在那里它被储存在叶肉细胞的液泡中。当具有较低同化储存的硝酸盐的光合能力时，或作为土壤中高硝酸盐水平的结果，高水平的硝酸盐积累可以在低温和/或太阳辐射(例如，在冬季期间的温室作物中)期间发生。硝酸盐水平的增加可以具有许多有害后果，不仅在植物生长的方面，而且在消耗植物的人或动物健康以及环境后果的方面。硝酸盐积累的许多不利后果通过产生亚硝酸盐所介导。
因此，为了防止硝酸盐聚集，一个策略将是增加植物中的氮再动员(nitrogen remobilisation)，例如当它们变得衰老时，这可能在作物生产中具有重要应用。首先，从叶再动员的氮可以被转运至较嫩叶以及正在发育的种子。增强氮从衰老叶离开的效率因此可以潜在增加对植物的种子和较嫩部分的氮供给，从而增加作物产量和氮使用效率。当世界人口不断增加，但作物产量没有增加到足以满足需求时，这显然是有价值的目标。一种潜在的目标作物是欧洲油菜(Brassica napus)(油菜)，其由于从营养组织的差的氮再动员而具有差的氮效率。另一个目标作物是小麦，因为增强籽粒蛋白含量的潜在益处是巨大的。籽粒蛋白含量不仅影响小麦的营养价值，而且决定籽粒使用，并因此决定市场价值。例如，增加的籽粒蛋白含量导致增加的面包体积。
此外，增加氮再动员的能力在烟草行业中可以是非常有用的，因为已知烟草叶中的残余氮有助于亚硝胺类的形成，如图1所示。具体而言，硝酸盐和亚硝酸盐在烤叶(cured leaf)中充当烟草特异性亚硝胺(TSNA)形成的前体。烟草工业对烟草叶的处理涉及去除被认为充当硝酸盐储存器官的烤叶的叶柄和中脉，其缺乏味道且TSNA高。
此外，亚硝胺在胃中的形成是由于内源性亚硝化作用。口腔细菌将食物和饮料中消耗的硝酸盐化学还原为亚硝酸盐，所述亚硝酸盐在胃的酸性环境中可以形成亚硝基化剂。这些与胺反应产生亚硝胺，且引起DNA链断裂或DNA的交联。与过量的硝酸盐有关的另一个问题是高铁血红蛋白的形成，其产生蓝婴综合征(blue baby syndrome)，其中血红蛋白的携氧能力被亚硝酸盐所阻断，在婴儿中引起化学窒息。
作为这些健康问题的后果，根据收获的时间，许多监管机构已对于绿叶蔬菜诸如菠菜和莴苣中允许的硝酸盐的量设置了限制(例如欧洲委员会法规653/2003)。这些限制已经导致任何具有高硝酸盐含量的产品不能出售。因此，已经存在通过管理含氮化肥的或改进的种植业系统的应用而进行降低植物的硝酸盐含量的努力。一些机构也已经对于饮用水中硝酸盐的量设置了限制。
因此，存在对于用于减轻植物中与硝酸盐积累有关的不利影响的方法的需要。考虑到这一点，本发明人已经开发了遗传构建体，其可用于转基因植物的制备中，所述转基因植物表现出令人惊讶的降低的硝酸盐浓度。
发明概述
因此，根据本发明的第一个方面，提供了遗传构建体，其包含与编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列可操作连接的启动子，其中所述多肽包含如SEQ ID No.3所述的氨基酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物，条件是该启动子不是SP6启动子。
如实施例中所述，本发明人已经研究了植物中氮的再动员(remobilization)，目的在于开发表现出(特别在叶中)硝酸盐浓度降低的植物。本发明人已经制备了遗传构建体(参见图2)，其中将编码硝酸盐转运蛋白的基因置于启动子的控制下，所述启动子不是SP6启动子，诸如组成型启动子或组织特异性启动子。
构建体中的编码序列可以编码拟南芥硝酸盐转运蛋白 AtNRT 2.5。编码拟南芥硝酸盐转运蛋白Nrt2.5的一个实施方案的基因组 DNA序列(包括内含子和外显子)在本文中作为SEQ ID No.1提供，如下：
编码拟南芥硝酸盐转运蛋白Nrt2.5的一个实施方案的cDNA序列(仅外显子)在本文中作为SEQ ID No.2提供，如下：
因此，编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列，可以包含基本上如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所述的核酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物。
拟南芥NRT2.5硝酸盐转运蛋白的多肽序列在本文中作为SEQ ID No.3提供，如下：
为了获得本发明的构建体的过表达如何影响转基因植物中的氮分布的指示，本发明人测量了转基因和野生型植物的氨基酸含量，如图3和4中显示。他们惊讶地观察到，经由遗传构建体的硝酸盐转运蛋白的过表达导致上部叶的氨基酸含量的显著下降。此外，如图5中显示，硝酸盐转运蛋白的过表达还引起顶部和底部叶中硝酸盐浓度的显著下降。基于这些结果，本发明还期望上部叶的TSNA含量降低。
启动子可以能够诱导RNA聚合酶与编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列的结合且开始使其转录。本发明的构建体中的启动子可以是组成型的、非组成型的、组织特异性的、发育调节型或诱导型/阻遏型的启动子。
组成型启动子在植物发育期间持续地指导基因在整个植物的各个部分的表达，尽管基因可能在所有细胞类型中无法以相同的水平表达。已知组成型启动子的实例包括与水稻肌动蛋白1基因(Zhang等人, 1991, Plant Cell, 3, 1155-65)和玉米泛素1基因(Cornejo等人, 1993, Plant Molec.Biol., 23, 567-581)相关的那些。在本发明中特别优选组成型启动子，诸如香石竹蚀环病毒(Carnation Etched Ring Virus, CERV)启动子(Hull等人, 1986, EMBO J., 5, 3083-3090)。
组织特异性启动子是指导基因在植物的一个(或几个)部分中表达，通常在那些植物部分的整个生命期间的表达的启动子。组织特异性启动子的类别通常还包括其特异性不是绝对的启动子，即，它们也可以在除优选的组织以外的组织中指导以较低水平的表达。本领域已知的组织特异性启动子的实例包括与马铃薯块茎中表达的马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)基因和小麦、大麦或玉米胚乳中表达的高分子量麦谷蛋白基因相关的启动子。
发育调节型的启动子指导在植物发育期间的特定的时间，例如在衰老期间，在植物的一个或多个部分中基因表达的变化。该基因在其它时间在该植物部分中可以以不同(通常较低)水平表达，且也可以在其它植物部分中表达。
诱导型启动子能够响应于诱导物而指导基因表达。在诱导物不存在的情况下，基因将不表达。诱导物可以对启动子序列直接作用，或者可以通过抵消阻遏分子的效果而起作用。诱导物可以是化学试剂，诸如代谢物、蛋白、生长调节剂、或有毒元素、生理胁迫诸如热、损伤、或渗透压、或病原体或害虫作用的间接后果。发育调节型的启动子可以描述为对由植物产生的内源性诱导物或对在植物的生命周期中的特定点的环境刺激响应的特定类型的诱导型启动子。已知的诱导型启动子的实例包括损伤响应、温度响应、和化学诱导相关的启动子。
启动子可以从不同来源包括动物、植物、真菌、细菌和病毒而获得，且不同启动子可以在不同组织中以不同效率起作用。也可以合成地构建启动子。因此，合适的启动子的实例包括香石竹蚀环病毒(CERV)启动子、豌豆质体蓝素启动子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)启动子、胭脂氨酸合成酶启动子、叶绿素a/b结合启动子、高分子量麦谷蛋白启动子、α,β-麦醇溶蛋白启动子、大麦醇溶蛋白启动子、马铃薯块茎储藏蛋白启动子、或衰老特异性启动子。例如，合适的衰老特异性启动子可以是源自衰老相关基因(SAG)的启动子，且可以选自SAG12、SAG13、SAG101、SAG21 和SAG18。
优选地，启动子是CERV启动子，如图2中所述的构建体中所示。
因此，根据本发明的第二个方面，提供了遗传构建体，其包含与编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列可操作连接的香石竹蚀环病毒(CERV)启动子，其中所述多肽包含如SEQ ID No.3所述的氨基酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物。
启动子可以是香石竹蚀环病毒(CERV)启动子（其将是本领域技术人员已知的）或其功能变体或片段(Hull等人, EMBO J., 5, 3083-3090)。编码CERV启动子的DNA序列长度为232bp，且在本文中被称为如下SEQ ID No.4：
因此，本发明构建体中的启动子可包含基本上如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列或其功能变体或功能片段。CERV启动子可以从花椰菜花叶病毒属(Cauliovirus)或显示花椰菜花叶病毒(cauliovirus)迹象的植物物种诸如香石竹(Dianthus caryophyllus)(即康乃馨)获得。在启动子是CERV启动子的实施方案中，应理解的是，启动子可包含SEQ ID No:4的碱基1-232中的每一个。然而，启动子的功能变体或功能片段也可用于本发明的遗传构建体。
“启动子的功能变体或功能片段”可以是启动子的衍生物或部分，其在功能上足以起始与之可操作连接的任何编码区的表达。例如，在启动子是以CERV启动子为基础的实施方案中，技术人员应理解的是可对SEQ ID No:4进行修饰，或者可能只需要CERV启动子的部分，使得其仍将起始构建体中的基因表达。
可通过评价转录酶是否与推定的启动子区域结合，并然后引起编码区转录成具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽，来容易地鉴定启动子的功能变体和功能片段。或者，可通过在与编码区结合时对启动子进行诱变，并评价基因表达是否可以发生，来检测此类功能变体和片段。
第一或第二方面的构建体中具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽可以源自任何合适的来源，诸如植物。编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列可以源自合适的植物来源，例如源自拟南芥属物种(Arabidopsis spp.)、稻属物种(Oryza spp.)、杨属物种(Populus spp.)或烟草属物种(Nicotiana spp.)。编码序列可以源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、稻(Oryza sativa)、欧洲山杨(Populus tremula)或烟草(Nicotiana tabacum)。应该理解，直向同源物是不同物种中通过物种形成从共同的祖先基因进化且保留相同功能的基因或蛋白。
本发明人已经生成了其中CERV启动子已经用于驱动来自拟南芥的硝酸盐转运蛋白(NRT2.5)的表达的构建体。
在用本发明的构建体转化的植物中，与(优选在相同条件下生长的)野生型植物(即其还没有用本发明的构建体转化) 中的硝酸盐浓度相比，构建体可以能够使硝酸盐浓度降低至少5%、10%、15%、18%、20%、32%、35%、38%、40%、50%、60% 或63%。
在用构建体转化的植物中，与(优选在相同条件下生长的)野生型植物中的NNK浓度相比，构建体可以能够使4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)浓度降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、61%、62%、65%、69%、71% 或75%。
在用构建体转化的植物中，与(优选在相同条件下生长的)野生型植物中的NNN浓度相比，构建体可以能够使N-亚硝基降烟碱(NNN)浓度降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、71%、75%、78%、80%、82%、84%、85%、88%、90% 或94%。
在用构建体转化的植物中，与(优选在相同条件下生长的)野生型植物中的NAT浓度相比，构建体可以能够使N-亚硝基新烟碱(NAT)浓度降低至少5%、6%、10%、20%、23%、24%、30%、40%、46%、45%、48%、50%、60%、70%、80% 或85%。
在用构建体转化的植物中，与(优选在相同条件下生长的)野生型植物中的总TSNA浓度相比，构建体可以能够使总烟草特异性亚硝胺(TSNA)的浓度降低至少10%、20%、30%、40%、50%、56%、60%、64%、65%、70% 或75%。
优选地，在来自T0、T1和/或T2植物群体的植物的叶或茎中，构建体能够降低选自包括硝酸盐、NNK、NNN、NAT和总TSNA的化合物组的任何化合物的浓度。本发明人已经在实施例中显示，AtNrt2.5的过表达导致试验或转基因植物中叶中的硝酸盐再动员相比于野生型的硝酸盐再动员增加。该硝酸盐再动员据信是通过将氨基酸诸如Gln、Asn和Pro再动员离开叶而介导的。源组织(source tissues)(即下部叶)和槽叶(sink leaves)(即顶部叶)中这些氨基酸的较低水平表明了这一点(参见附图)。因此，该构建体可以能够降低叶中的Gln、Asn和/或Pro浓度。
在位于植物上的下部、中部或上部位置的叶中，构建体可以能够降低任何这些化合物(即硝酸盐，参与氮同化的氨基酸，总TSNA、NNN、NAT 或NNK)的浓度。“下部位置”可以意味着植物的下部的三分之一(例如，从植物基部的第4或第5片叶)，“上部位置”可以意味着植物的上部的三分之一(例如，从植物基部的第14或第15片叶)，且“中部位置”可以意味着植物的下部和上部位置之间的中间三分之一(例如，从植物基部的第10或第11片叶)。在采样时，叶的总数为约20。
本发明的遗传构建体可呈表达盒的形式，其可以适合用于在宿主细胞中表达编码硝酸盐转运蛋白的编码序列。本发明的遗传构建体其无需整合到载体中便可导入宿主细胞。例如，可将可以是核酸分子的遗传构建体并入脂质体或病毒颗粒内。或者，可通过合适的方法(例如直接胞吞摄取)将纯化的核酸分子(例如不含组蛋白的DNA或裸DNA)直接插入宿主细胞中。可通过转染、感染、显微注射、细胞融合、原生质体融合或弹道轰击(ballistic bombardment)，将遗传构建体直接导入宿主受试者(例如植物)的细胞。或者，可使用粒子枪将本发明的遗传构建体直接导入宿主细胞中。或者，可将遗传构建体包含在用于在合适的宿主细胞中表达的重组载体内。
因此，在第三个方面，提供包含根据第一个或第二个方面的遗传构建体的重组载体。
重组载体可以是质粒、粘粒或噬菌体。此类重组载体高度可用于用本发明的遗传构建体转化宿主细胞和复制其中的表达盒。技术人员应理解的是，本发明的遗传构建体可与许多类型的骨架载体组合用于表达目的。骨架载体可以是双元载体(binary vector)，例如可在大肠杆菌(E. coli)和根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)两者中复制的载体。例如，合适的载体可以是pBIN质粒，诸如pBIN19 (Bevan M., 1984, Nucleic Acids Research 12:8711-21)。
除了启动子(例如CERV)以外，重组载体还可包括多种其它功能元件和编码硝酸盐转运蛋白的编码序列。例如，可设计重组载体，使得载体在宿主细胞的细胞溶胶中自主复制。在这种情况下，在重组载体中可能需要诱导或调节DNA复制的元件。或者，可设计重组载体，使得重组载体整合到宿主细胞的基因组中。在这种情况下，设想有利于靶向整合(例如通过同源重组)的DNA序列。
重组载体还可包含编码在克隆方法中可用作选择标记物的基因的DNA，即以能够选出已被转染或转化的细胞，并且能够选出包含整合异源DNA的载体的细胞。载体还可包含参与调节编码序列的表达或者用于将表达的多肽靶向宿主细胞特定部分(例如叶绿体)的DNA。因此，第三个方面的载体可包含至少一个选自以下的其它元件：选择标记物基因(例如抗生素抗性基因)；多肽终止信号；和蛋白靶向序列(例如叶绿体转运肽)。
合适的标记基因的实例包括抗生素抗性基因，诸如赋予对卡那霉素、遗传霉素(G418)和潮霉素(npt-II、hyg-B)抗性的基因；除草剂抗性基因，诸如赋予对草铵膦(phosphinothricin)和基于磺胺类的除草剂抗性的基因(分别为bar和suI；EP-A-242246、EP-A-0249637)；以及筛选标记物，诸如β-葡糖醛酸糖苷酶(GB2197653)、萤光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。标记物基因可受第二启动子控制，所述第二启动子允许在细胞(其可在种子中或不在种子中)中表达，从而允许在植物发育的任何阶段选出含有标记物的细胞或组织。合适的第二启动子是土壤杆菌属(Agrobacterium)的胭脂氨酸合成酶基因的启动子和来源于编码35S花椰菜花叶病毒(CaMV)转录物的基因的启动子。然而，可以采用任何其它合适的第二启动子。
可使用实施例中描述的克隆程序制备本发明的遗传构建体的各个实施方案，其可概括如下。可使用合适的引物，例如SEQ ID No’s 5 和 6，通过PCR从基因组或cDNA模板扩增编码硝酸盐转运蛋白的基因的基因组或cDNA形式。然后可采用琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。然后，可将PCR产物连接入合适的载体(例如，以商品名pCR4-TOPO(从Invitrogen可得)销售的载体)用于克隆目的。可使携带PCR产物的载体在合适的宿主(诸如大肠杆菌)中生长。然后，可以使用合适的引物通过PCR筛选大肠杆菌菌落，并且使用合适的引物对显示正确的限制性酶消化模式的质粒中的插入物进行测序。
可培养携带pCR4-TOPO-基因组DNA(Atnrt2.5)的大肠杆菌菌落以产生适量的各种质粒，然后可对质粒进行纯化。随后可消化质粒以释放编码Atnrt2.5的DNA片段，然后可将该片段克隆至携带合适启动子(例如CERV启动子)的载体，诸如pBNP质粒(van Engelen 等人, 1995, Transgenic Research,4:288-290)。
获得的Atnrt2.5构建体，含有CERV启动子并被命名为CRVAtNRT2.5。根据第三个方面的载体的实施方案基本上可如图2所示。
鉴于其令人惊讶的结果，本发明人相信，他们已经首次开发了使用转基因植物中外源硝酸盐转运蛋白基因(例如AtNRT2.5)的表达而降低植物叶中硝酸盐浓度的方法。
因此，在第四个方面，提供了使试验植物的叶中硝酸盐浓度降低至低于在相同条件下培养的野生型植物叶中对应的硝酸盐浓度的方法，该方法包括:-
(i) 用根据第一个或第二个方面的遗传构建体或根据第三个方面的载体转化植物细胞；和
(ii) 从转化的细胞再生植物。
在本发明的第五个方面，提供了产生以比在相同条件下培养的对应野生型植物更高的速率将硝酸盐转运出叶的转基因植物的方法，该方法包括：-
(i) 用根据第一个或第二个方面的遗传构建体或根据第三个方面的载体转化植物细胞；和
(ii) 从转化的细胞再生植物。
在第六个方面，提供了用于产生转基因植物的方法，该方法包括将编码硝酸盐转运蛋白多肽的外源基因引入未修饰的植物，其中所述多肽包含如SEQ ID No.3所述的氨基酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物，并且其中相对于未修饰的植物的叶中硝酸盐的浓度，外源基因编码的硝酸盐转运蛋白的表达降低了转基因植物的叶中的硝酸盐浓度。
与植物的其余部分有关的叶的位置(即，其是否被认为是在“下部”位置、“顶部”位置或“中间”位置内)对于烟草种植者是重要的。叶的生理学，和因此，叶的质量和味道与其在植物内的位置强烈相关。当植物接近开花时，发生被称为再动员(remobilization)的过程，其涉及营养物诸如氨基酸和含氮化合物从植物的基部转运至植物的顶部。再动员的营养物将被用作用于种子产生的能量源。因此，下部叶将具有与植物的上部叶相比不同的氮含量，这通过不同的氨基酸概况说明，如图3或图4中显示。下部叶被称为“源叶(source leaves)”，且顶部叶被称为“槽叶(sink leaves)”。中部叶是完全展开的成熟绿叶。
关于一些植物，诸如烟草，通过去除植物的头状花序，可以生成叶营养物代谢的改变。这些变化允许再动员的营养物在叶片中被使用，并导致叶变厚，叶总体生长和产生富含氮的次生代谢物，其中许多是后来在烤叶中发现的味道的前体。因此，可以使用本发明的构建体来改变转基因植物的味道。
如图7中显示，本发明人惊奇地观察到本发明的遗传构建体还可以能够相比于在相同条件下生长的野生型植物中发现的对应叶调节(即，增加和/或降低)转基因植物的在上部、中部或下部位置发现的叶中已知参与硝酸盐代谢的某些氨基酸(例如Gln、Asn、Asp、Glu和/或Pro)的浓度。
因此，在第七个方面，提供了相比于在相同条件下培养的野生型植物的对应叶的氨基酸概况调节参与试验植物的叶的氮同化的氨基酸概况的方法，该方法包括：-
(i) 用根据第一个或第二个方面的遗传构建体或根据第三个方面的载体转化植物细胞；和
(ii) 从转化的细胞再生植物。
在第八个方面，提供了相比于从在相同条件下培养的野生型植物采集的对应的收获的叶的氨基酸概况调节参与从转基因植物采集的收获的叶的氮同化途径的氨基酸概况的方法，其中所述叶是从由根据第五个或第六个方面的方法产生的转基因植物收获的。
根据本发明，参与植物和它们的叶的氮同化途径的氨基酸可以包含谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)或脯氨酸(Pro)，所以可以调节这些氨基酸的任何概况或任何或所有这些氨基酸。
在用该构建体转化的植物中，与在相同条件下生长的野生型植物中至少一种氨基酸的浓度相比，该构建体可以能够使参与氮同化途径的至少一种氨基酸的浓度降低或增加至少10%、20%、30%、40%、50%、56%、60%、64%、65%、70% 或75%。
优选地，该构建体导致氨基酸浓度的降低。优选地，与在相同条件下生长的野生型植物中发现的对应叶相比，该构建体可以能够降低转基因植物的叶(优选下部叶)中氨基酸Pro和Gln的浓度。与在相同条件下生长的野生型植物中发现的对应叶相比，该构建体还可以能够降低转基因植物的下部位置中发现的叶中氨基酸Gln、Asn、Asp、Glu和/或Pro的浓度。
在第九个方面，提供了包含根据第一个或第二个方面的遗传构建体或根据第三个方面的载体的转基因植物。
在第十个方面，提供了包含编码硝酸盐转运蛋白多肽的外源基因的转基因植物，其中所述多肽包含如SEQ ID No.3所述的氨基酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物，并且其中与未修饰的植物叶中的硝酸盐浓度相比，转基因植物叶中的硝酸盐浓度降低。
在第十一个方面，提供了编码硝酸盐转运蛋白多肽的外源核酸序列用于通过用所述外源核酸序列转化植物而降低植物叶中的硝酸盐浓度的用途，所述多肽包含如SEQ ID No.3所述的氨基酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物。
术语“未修饰的植物”可以意味着在用本发明的外源基因或构建体转化前的植物。因此未修饰的植物可以是野生型植物。
术语“外源基因”可以意味着被转化至未修饰的植物中的基因来自外部来源，即来自与被转化的物种不同的物种。外源基因可以具有与未修饰植物中编码硝酸盐转运蛋白的内源基因基本上相同或不同的核酸序列。外源基因可以源自编码拟南芥nrt2.5 基因或其直向同源物的基因组或cDNA序列。外源基因可以形成嵌合基因，其可以本身构成根据第一个或第二个方面的遗传构建体。外源基因可以编码具有基本上如SEQ ID No:3所述的氨基酸序列的硝酸盐转运蛋白，或其功能变体或片段或直向同源物。外源基因可以包含基本上如SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所述的核苷酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物。
用于确定植物叶中的硝酸盐水平的方法记载于实施例中。
本发明的方法和用途可以包括用根据第一个或第二个方面的遗传构建体、根据第三个方面的载体或本文所述的外源基因转化试验植物细胞或未修饰的植物细胞。
因此，在第十二个方面，提供了包含根据第一个或第二个方面的遗传构建体或者根据第三个方面的重组载体的宿主细胞。
细胞可以是植物细胞。细胞可采用已知技术用本发明的遗传构建体、载体或外源基因转化。用于将遗传构建体导入宿主细胞的合适方法可包括通过本领域已知方法(例如EP-A-0116718和EP-A-0270822中所述方法)，利用土壤杆菌属所携带的卸甲(disarmed)Ti-质粒载体。另一种方法可以是转化植物原生质体，这涉及先除去细胞壁并导入核酸，然后重新形成细胞壁。随后可使转化的细胞生长成植物。
优选地且有利地，本发明的方法和用途不损害生成的试验或转基因植物的健康或适用性。本发明人已经观察到，在植物宿主细胞中过表达Atnrt2.5硝酸盐转运蛋白在诱导硝酸盐转运离开植物叶时是有效的。因此，优选的是，本发明的方法和用途包括用本发明的构建体转化试验植物，使得过表达硝酸盐转运蛋白。
本发明的转基因或试验植物可包括十字花科(Brassicaceae family)，诸如芸苔属物种(Brassica spp.)。植物可以是欧洲油菜(Brassica napus)(油菜(oilseed rape))。转基因或试验植物的其它实例包括禾本科(family Poales)，诸如小麦族物种(Triticeae spp.)。植物可以是小麦属物种(Triticum spp.) (小麦)。提高小麦的籽粒蛋白含量可导致包含小麦的食品(诸如面包)的体积增加。
本发明的合适转基因或试验植物的其它实例可以包括茄科(Solanaceae)植物，其包括例如曼陀罗(jimson weed)、茄子、风茄(mandrake)、颠茄(deadly nightshade)(颠茄(belladonna))、辣椒(capsicum)(辣椒(paprika)、辣椒(chilli pepper))、马铃薯和烟草。茄科的合适属的一个实例是烟草属(Nicotiana)。烟草属的合适种可称为烟草植物，或简称烟草。
根据本发明的合适的转基因植物或试验植物的进一步实例可以包括多叶作物，诸如菊科(Asteraceae family)的植物，例如，其包括莴苣(莴苣(Lactuca sativa))。另一个实例可以包括藜科(Chenopodiaceae family)的植物，其包括菠菜(Spinacia oleracea)和甜菜(Beta vulgaris)，即分别为菠菜(spinach)和甜菜(chards)。
可以如下用本发明的构建体、载体和外源基因转化烟草。
采用基本上按Horsch等人(Science 227：1229-1231，1985)所述的叶盘共培养方法转化烟草(Nicotiana tabacum)。从7周龄的烟草植物采摘最幼嫩的两片展开的叶，在8% Domestos™中进行表面灭菌10分钟，用无菌蒸馏水洗涤(3次清洗)次。然后，用6号木塞钻孔器切取叶盘，并放于含有(如实施例中所述)合适双元载体的土壤杆菌悬浮液中持续约2分钟。然后，在两张无菌滤纸间将盘片轻轻吸干。可将10个盘片放在MS 3%蔗糖 + 2.2µM BAP + 0.27µM NAA平板上，然后将其在生长室中培育2天。可将盘片转移到补充了500 g/l头孢噻肟和100 g/l卡那霉素的MS培养基 + 3%蔗糖 + 2.2µM BAP + 0.27 µM NAA的平板中。2周后，将盘片转移到上述培养基的新平板上。再过2周后，将叶盘转移到含有补充了500 mg/l头孢噻肟和100 mg/l卡那霉素的LS培养基 + 3%蔗糖 + 0.5µM BAP的平板上。然后，每两周将叶盘转移到新鲜培养基中。在枝条出现时，将其切下，并转移到补充了500 mg/l头孢噻肟的LS培养基 +3%蔗糖+ 0.5µM BAP的广口瓶中。大约3周后，然后将广口瓶中的枝条转移到广口瓶中的LS培养基 + 3%蔗糖 + 250 mg/l头孢噻肟中。再过3-4周后，然后将植物转移到LS培养基 + 3%蔗糖(无抗生素)，并生根。一旦植物生根，便将其转移到温室的土壤中。
在第十三个方面，提供可根据第九个或第十个方面的转基因植物获得的植物繁殖产物(plant propagation product)。
“植物繁殖产物”可以是取自植物中的任何植物物质，自其可产生其它植物。合适地，植物繁殖产物可为种子。植物繁殖产物可以优选地包含本发明的构建体或载体或外源基因。
本发明人已经观察到，已经用根据本发明的构建体转化的试验植物(即转基因植物)的叶表现出硝酸盐再动员离开叶的增加，使得在该叶中硝酸盐(其是TSNA类的前体，诸如NNK、NNN和/或NAT)的浓度降低。很明显，因此，此类叶将是特别有利的。
因此，在本发明的第十四个方面，提供与采自培养在相同条件下的野生型植物的收获的叶中相应的硝酸盐水平相比含有较低硝酸盐水平的收获的叶，其中所述叶自根据第九个或第十个方面的转基因植物收获，或者由根据第五个或第六个方面的方法产生。
在本发明的第十五个方面，提供包含获自突变体烟草植物的硝酸盐降低的烟草的烟草产品，所述突变体烟草植物包含第一个或第二个方面的构建体或第三个方面的载体，所述突变体能够降低其叶中的硝酸盐浓度。
优选的是，烟草产品中的烟草从其衍生的突变体烟草植物包含本发明的构建体、载体或外源基因。
烟草产品可以是无烟烟草产品，诸如鼻烟。烟草产品可以是可通过嘴递送的口服烟草产品。烟草产品可以是潮湿的，且可以是湿鼻烟(snus)。然而，烟草产品也可以是吸烟制品。
因此，在第十六个方面，提供了吸烟制品，其包含获自突变体烟草植物的硝酸盐降低的烟草，所述突变体烟草植物包含第一个或第二个方面的构建体或第三个方面的载体，所述突变体能够降低其叶中的硝酸盐浓度。
硝酸盐降低的烟草可包括其中硝酸盐浓度小于培养在相同条件下的野生型植物中的相应浓度的烟草。此类吸烟制品可包含获自突变体烟草植物的烟草，所述烟草植物可以已用根据本发明第一个或第二个方面的遗传构建体或者根据第三个方面的载体或外源基因转化。优选地，突变体烟草植物包含硝酸盐转运蛋白AtNRT2.5。
术语“吸烟制品”可包括可点燃抽吸的产品，诸如不论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草(expanded tobacco)、再造烟草或烟草代用品的卷烟、香烟、雪茄和小雪茄，以及加热无燃烧产品(heat-not-burn products)。
应理解的是，本发明扩展至基本上包含本文提及的任何序列的氨基酸或核酸序列(包括其功能变体或功能片段)的任何核酸或肽或其变体、衍生物或类似物。术语“基本上氨基酸/多核苷酸/多肽序列”、“功能变体”和“功能片段”，可以是与本文提及的任一个序列的氨基酸/多核苷酸/多肽序列有至少40%序列同一性的序列，例如与如SEQ ID No.1或2标识的基因(其编码硝酸盐转运蛋白的一个实施方案)有40%同一性，或与如SEQ ID No.3标识的多肽(即硝酸盐转运蛋白的一个实施方案)有40%同一性。
还设想了与所提及的任何序列具有以下序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列：大于65%、更优选大于70%、甚至更优选大于75%、还更优选大于80%的序列同一性。优选地，氨基酸/多核苷酸/多肽序列与所提及的任何序列有至少85%同一性，更优选与本文提及的任何序列有至少90%同一性、甚至更优选至少92%同一性、甚至更优选至少95%同一性、甚至更优选至少97%同一性、甚至更优选至少98%同一性和最优选至少99%同一性。
技术人员应理解如何计算2个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性。为了计算2个氨基酸/多核苷酸/多肽序列间的百分比同一性，首先必须准备好2个序列的比对，接着计算序列同一性值。2个序列的百分比同一性可根据以下方面采用不同的值：(i)用于比对序列的方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman (在不同的程序中执行)，或来自3D比较的结构比对；和(ii)由比对方法所采用的参数，例如局部相对于整体比对、所采用配对评分矩阵(例如BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)和空位罚分，例如功能型和常数。
如果已完成了比对，则有许多不同的计算2个序列之间的百分比同一性的方法。例如，一种可将同一性的数目除以：(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位位置的数目；或(iv)突出端以外的等同位置的数目。此外，应理解的是，百分比同一性还是强烈地长度依赖性的。因此，序列对越短，可预期越高的序列同一性会偶然发生。
因此，应理解的是，蛋白质或DNA序列的准确比对是一个复杂过程。常用的多重比对程序ClustalW (Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research, 22，4673-4680；Thompson等人，1997，Nucleic Acids Research, 24，4876-4882)是用于产生本发明的蛋白质或DNA的多重比对的优选方法。ClustalW的合适参数可为如下：对于DNA比对：空位开放罚分= 15.0，空位延伸罚分= 6.66，且矩阵=同一性。对于蛋白质比对：空位开放罚分= 10.0，空位延伸罚分= 0.2，且矩阵= Gonnet。对于DNA和蛋白质比对：ENDGAP = -1，且GAPDIST = 4。本领域技术人员应清楚，对于最佳序列比对可能需要改变这些参数和其它参数。
优选地，然后由这样的比对如(N/T)*100计算出2个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性计算值，其中N为其中序列具有相同残基的位置的数目，且T为所比较的包括空位但不包括突出端的位置总数。因此，用于计算2个序列之间的百分比同一性的最优选的方法包括(i)应用ClustalW程序，采用一组合适参数(例如上文所述)准备序列比对；和(ii)将N值和T值插入下列公式：序列同一性= (N/T)*100。
用于鉴定相似序列的替代方法为本领域技术人员所知。例如，基本相似的核苷酸序列可由与SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示序列或其互补序列在严格条件下杂交的序列编码。所谓严格条件，意指核苷酸在3x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45℃与滤膜结合的DNA或RNA杂交，接着在0.2x SSC/0.1% SDS中于约20-65℃洗涤至少一次。或者，基本相似的多肽可因至少1个但少于5、10、20、50或100个氨基酸而不同于SEQ ID No. 3所示序列。
由于遗传密码的简并性，显然，任何核酸序列可在基本上不影响由其编码的蛋白质的序列的情况下被变化或改变，以提供其功能变体。合适的核苷酸变体是以下核苷酸变体，其具有通过编码相同氨基酸的不同密码子在序列内的取代从而产生沉默改变(silent change)而改变的序列。其它合适的变体是具有同源核苷酸序列但包含通过不同密码子的取代而改变的全部或部分序列的变体，所述不同密码子编码与其取代的氨基酸具有类似生物物理学性质的侧链的氨基酸以产生保守改变。例如小的非极性、疏水性氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性、疏水性氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性的中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此应理解的是，何种氨基酸可被具有相似生物物理学性质的氨基酸替代，且技术人员将知道编码这些氨基酸的核苷酸序列。
为了解决本领域中的各种问题和进展，本公开的整体通过说明的方式显示了其中要求保护的一个或多个发明可被实施的多个实施方案，并且为降低转基因植物叶中的硝酸盐浓度提供了优异的方法。本公开的优点和特征仅仅是实施方案的代表性样本，而不是穷举的和/或排他的。呈现它们仅用于帮助理解和教导要求保护的特征。应当理解的是，本公开的优点、实施方案、实施例、功能、特征、结构和/或其它方面不应被认为是对权利要求所定义的公开内容的限制或对权利要求的等同方案的限制，并且可以利用其它实施方案，并且可以在不脱离本公开的范围和/或精神的情况下进行改变。各个实施方案可以合适地包含所公开的要素、组分、特征、部分、步骤、方式等的各种组合，由其组成或基本上由其组成。此外，本公开包括目前没有要求保护、但可以在将来要求保护的其它发明。
本文所述的全部特征(包括任何随附的权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的全部步骤都可以以任何组合与任何上述方面组合，其中这些特征和/或步骤的至少一些是互为排斥的组合除外。
为了更好地理解本发明，并显示可如何实现本发明的实施方案，现参照附图举例说明，其中：
图1显示各种烟草烟雾亚硝胺4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基降烟碱(NNN)、N-亚硝基新烟草碱(NAB)和N-亚硝基新烟碱(NAT)的化学结构；
图2是本发明被称为pGNP024 0096 001的构建体的一个实施方案的质粒图谱。该构建体包括在香石竹蚀环病毒(CERV)启动子控制下的Atnrt2.5 硝酸盐转运蛋白基因；
图3A – E显示携带启动子CERV::NRT2.5构建体的两个Burley PH2517植物株系(即28.1和36.01)的顶部叶中各种氨基酸(即，分别为谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和脯氨酸(Pro))的浓度(野生型[WT] Burley PH2517充当对照)；
图4A – E显示携带启动子CERV::NRT2.5构建体的两个Burley PH2517植物株系(即28.1和36.01)的底部叶中各种氨基酸(即，分别为谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和脯氨酸(Pro))的浓度(野生型[WT] Burley PH2517充当对照)；和
图5A显示携带启动子CERV::NRT2.5构建体的两个Burley PH2517植物株系(即28.1和36.01)的底部叶中硝酸盐的浓度(野生型[WT] Burley PH2517充当对照)，
图5B显示携带启动子CERV::NRT2.5构建体的两个Burley PH2517植物株系(即28.1和36.01)的顶部叶中硝酸盐的浓度(野生型[WT] Burley PH2517充当对照)；
图6显示携带启动子CERV::NRT2.5构建体的两个T2株系(即36.01和28.03)的中部叶中硝酸盐的浓度(野生型[WT] Burley PH2517充当对照)；和
图7显示携带启动子CERV::NRT2.5构建体的两个T2株系(即28和48)的中部叶中氨基酸概况(野生型[WT] Burley PH2517充当对照)。
详述和实施例
本发明人已经开发了如图2中所示的构建体和两个转基因植物株系，被称为28.1和36.01，其中硝酸盐和各种氨基酸(Gln、Asn、Asp、Glu、Pro)的浓度在组成型启动子香石竹蚀环病毒(CERV)启动子(Hull等人, 1986, EMBO J., 5, 3083-3090)的控制下表达硝酸盐转运蛋白基因拟南芥nrt2.5之后显著降低。
实施例 1 - 拟南芥硝酸盐转运蛋白基因的分离
在这些实验中使用的拟南芥硝酸盐转运蛋白基因是Atnrt2.5。
引物设计
鉴定了编码来自拟南芥的硝酸盐转运蛋白2.5的全长基因组序列(序列的登录号为：AT1G12940)。设计在PCR中用于分离基因组序列的引物，其在5’末端用4 bp间隔序列和合适的限制性位点加尾。在片段的5’末端和3’末端生成attB限制性位点，以实现片段克隆到适当的载体中。
技术人员将理解的是，可以设计并入引物的所需特征和可替代的限制性酶位点的其它PCR引物。
编码nrt2.5的拟南芥基因组DNA的分离
使用Qiagen DNA Easy小规模制备提取试剂盒从3周龄植物的莲座叶提取拟南芥哥伦比亚品种(Arabidopsis thaliana var. Columbia) 基因组DNA。简而言之，根据制造商的说明书使用QIAGEN DNeasy植物DNA提取试剂盒 (#69106) (QIAGEN Ltd., Crawley, UK)从叶样品提取基因组DNA。这种方法提供了大量非常干净的适于基因分离和克隆策略的DNA。该试剂盒的原理利用DNA在高盐条件下特异性吸附至基于硅胶的膜，而污染物诸如蛋白、碳水化合物、多酚类化合物和其他植物代谢物则被洗走。
硝酸盐转运蛋白DNA片段的分离
拟南芥nrt2.5的基因组序列是1933bp长(登录号At1G12940)。用引物对SEQ ID No.5和SEQ ID No.6(如下所示)扩增基因组拟南芥nrt2.5，其在片段的5’末端生成attB限制性位点且在片段的3’末端生成attB限制性位点。
PCR 条件
循环程序：1个循环的98℃持续30秒，随后30个循环的98℃持续10秒，59℃持续30秒，和72℃持续1分钟30秒，这随后为1个循环的72℃持续5分钟。遵循制造商的说明书使用Advantage 2聚合酶(Clonetech)分离条带。
然后通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应的等分试样。沉淀反应物，然后储存。然后如下所述将硝酸盐转运蛋白DNA片段克隆到pCR4-TOPO载体中(购自Invitrogen)。
连接反应
取1μl pCR4-TOPO与1 μl盐溶液和4 μl PCR反应物混合。混合物在室温下放置20 min。然后，取2 μl连接反应混合物与TOP10化学感受态大肠杆菌细胞混合，然后在冰上放置30 min。在42℃下对细胞进行热激，然后在冰上放置2分钟。然后在37℃下将细胞在250 μl SOC培养基中孵育90分钟。然后将细胞铺板在含有卡那霉素的琼脂平板上，且在37℃下放置过夜。对于每个基因序列，含有质粒的细胞生长成菌落，并且然后挑取16个单一菌落并在LB培养基中培养。对于每个单独菌落进行DNA微量制备(Qiagen)并使用用BamHI/SspI和SacI/ KpNI的限制性消化来确定基因是否已经并入具有成功插入的基因组DNA片段的pCR4-TOPO载体中。
序列分析
对多个独立pCR4-TOPO克隆中存在的硝酸盐转运蛋白DNA片段进行测序。序列分析显示所述克隆含有硝酸盐转运蛋白2.5基因。
实施例 2 –用于烟草转化的载体的构建
编码Atnrt 2.5的基因组DNA克隆入pBNP CERV双元载体
用BamHI和KpnI (Promega)消化含有NRT 2.5基因的质粒以分离NRT2.5基因片段，然后将其克隆到也已经用BamHI/KpnI消化的pBNP双元载体(pBNP-CERV-nosT)中。连接的载体随后用于转化到化学感受态的大肠杆菌细胞中。pBNP载体是从pBNP双元载体生成的自用(in-house)载体(van Engelen等人, 1995, Transgenic Research, 4:288-290)，其含有CERV启动子和胭脂氨酸合成酶终止子。遵循制造商的说明书通过添加Gateway转化盒(Invitrogen)将其转化为Gateway即用载体。在卡那霉素板上选择含有该质粒的细胞。然后分离克隆且提取DNA，并通过限制性消化和随后的测序进行分析。
CERV启动子是植物病毒的花椰菜花叶病毒组的组成型启动子。其在1986年由Hull等人分离且表征，是CaMV 的特征(Hull等人, 1986)，但与CaMV 35S启动子具有很小的序列相似性。
产生了下列双元载体：pGNP024 0096 001 (参见图2): 香石竹蚀环病毒(CERV)启动子：Nrt2.5基因组: Nos 终止子。然后通过电穿孔将双元载体转化到根癌土壤杆菌LBA 4404中。这通过将40 µl根癌土壤杆菌电感受态细胞和0.5μg质粒DNA混合且置于预冷的小杯中而进行。然后在1.5伏特、600欧姆和25 µFD将细胞电穿孔。将1 ml 2YT培养基添加至小杯，将混合物倾入30 ml通用容器且在摇床中在28℃下孵育2小时。然后将100 μl细胞铺板在卡那霉素(50 µg/ml)和链霉素(100 µg/ml)LB琼脂平板上。放置板以在28℃下孵育2天。
实施例 3 - 烟草转化
如Horsch等人所述，使用叶盘共培养的方法用pGNP024 0096 001转化Burley PH2517植物 (Science 227: 1229-1231, 1985)。
从7周龄的烟草植物取最幼嫩的两片展开的叶，且在8% Domestos中进行表面灭菌10分钟，且用无菌蒸馏水洗涤3次。然后使用6号木塞钻孔器切取叶盘，且放置在转化的土壤杆菌悬浮液中约两分钟。然后将盘片在两片无菌滤纸之间轻轻地吸干。将10片盘片置于MS 3％蔗糖+2.2µM BAP + 0.27µM NAA平板上，然后将其在生长室中培养2天。然后将盘片转移至补充500 g/l头孢噻肟和100 g/l卡那霉素的MS培养基 + 3%蔗糖+ 2.2µM BAP + 0.27 µM NAA的平板上。2周后将盘片转移至上述培养基的新鲜板上。再两周后，将叶盘转移到含有补充500 mg/l头孢噻肟和100 mg/l卡那霉素的LS培养基 +3%蔗糖+ 0.5µM BAP的平板上。每2周将叶盘转移至新鲜培养基上。当枝条出现时，将它们切除，且转移到补充500 mg/l头孢噻肟的LS培养基 +3%蔗糖+ 0.5µM BAP的广口瓶中。约3周后，将广口瓶中的枝条转移至LS培养基 + 3%蔗糖+ 250 mg/l头孢噻肟。再3-4周后，最终将植物转移至LS培养基 + 3%蔗糖(无抗生素)中且生根。一旦植物生根，将它们转移至温室中的土壤。
实施例 4 - 分析转化植物中 Atnrt2.5 构建体的存在
再生的烟草转化体的分析
从再生的烟草植物获取叶材料，且分离基因组DNA。从体外生长的植物中切割叶盘(约30 mg)，且置于1.5ml Eppendorf管中。使用微杵将组织均质化，且添加400µl提取缓冲液(200mM Tris HCL pH 8.0; 250mM NaCl; 25mM EDTA; 0.5% SDS; 40μg/ml Rnase A)，且再次仔细研磨以确保彻底混合。将样品旋涡混合约5秒，且然后以10,000rpm离心5分钟。将获得的上清液的350µl等分试样置于新的Eppendorf管中，且添加350µl氯仿。混合后，允许样品静置5分钟。然后将其以10,000rpm离心5分钟。将上清液的300µl等分试样移入新的Eppendorf管中。为此，添加300µl丙-2-醇，且通过反转几次Eppendorf而混合。然后允许样品静置10分钟。通过以10,000rpm离心10分钟而收集沉淀的DNA。弃去上清液，且沉淀在空气中干燥。将DNA沉淀再悬浮于50µl蒸馏水中，且在Q PCR中用作模板。通过Q-PCR 分析Burley PH2517植物以检查转基因事件。
实施使用ΔΔCt或比较Ct法的QPCR分析以计算每一代植物的插入的拷贝数。在T0，取具有单一插入的植物来播种以产生在T1分离的植物。然后选择2-拷贝纯合株系，其中所有然后都将产生纯合后代。为了实施该程序，使用Qiagen DNA easy试剂盒从约40mg 烟草叶中分离基因组DNA。然后，在以下成对的水解探针PCR反应中使用2.5μl该基因组DNA。
用载体插入的亲环蛋白(Cyclophylin)(参考或持家基因)和NPTII标记基因。
在ABI7900HT QPCR机器上在总共25μl中一式两份设置反应，使用以下程序 - 1个循环50℃ 2分钟，1个循环95℃ 10分钟，然后40个循环的95℃ 15秒60℃ 1分钟。这种充分证明的技术允许将未知拷贝数材料与已知校准线(已知拷贝数的DNA)进行比较，而不需要DNA定量。
结果：
pGNP024 0096 001: Virginia/Burley 2个单拷贝。
实施例 5 - 分析转化植物中的硝酸盐转运蛋白表达
通过RT-PCR测定的mRNA水平
使用Ambion RNAqueous试剂盒(Ambion Inc., Canada)从烟草叶盘分离总RNA。使用组织研磨机(tissuelyser)将所有冷冻样品在液氮下研磨成细粉。通过在4℃下以13,000 rpm离心5分钟而沉淀胞外膜、多糖和高高分子量DNA。将上清液转移到与试剂盒一起提供的过滤筒，且使用离心以洗涤和纯化RNA，然后用洗脱缓冲液洗脱RNA。RNA样品在-80℃保存，直至进一步使用。
使用Invitrogen的1步RT-PCR superscript III对总RNA进行RTPCR。然后使用对于Atnrt2.5特异性的引物(SEQ ID No:13和14)扩增获得的cDNA以证实基因表达。
对于两条RT-PCT引物的退火温度为59.1℃。在没有RT反应的情况下使用RNA实施对照以确认没有任何DNA污染。运行野生型对照连同转基因株系和质粒对照以给出正确的条带大小。
实施例 6 - 分析“上部”和“下部”烟草叶硝酸盐含量
使用HPLC进行野生型和转基因Burley PH2517植物中硝酸盐和/或亚硝酸盐水平的定量。这种用于确定植物组织中的硝酸盐浓度的方法描述于Sharma等人, 2008 (Malaria Journal, 7:pp71)。HPLC提供来自植物样品的硝酸盐和/或亚硝酸盐水平的高度精确的测量，还由于与方法相关的自动化水平的增加而降低了与操作危险试剂相关的担忧。
材料为：
运行缓冲液：5mM K2HPO4, 25mM KH2PO4 ，pH3
提取缓冲液：5mM K2HPO4, 25mM KH2PO4 ，pH3
方法：首先，将2ml磷酸盐缓冲液添加至250-300 mg研磨的叶材料并用研杵在研钵中均质化。这些比率可以根据硝酸盐的预期水平进行改变。然后将均质物在+4℃以16000 rpm离心10分钟。然后将1ml上清液过滤通过注射器滤器(0.2µM)进入HPLC小瓶中。用0 -1 mM(对硝酸盐)和0-100µM (对亚硝酸盐)的浓度范围构建硝酸盐和亚硝酸盐标准曲线。注射体积为20µl。
根据出峰时间(peak timing)进行峰鉴定。取决于柱龄和许多其它因素，出峰时间是可变的。因此，应当使用标准品来评价峰位置并将其与样品中的峰流出时间关联。
图5中显示的硝酸盐结果显示，存在具有本发明的CRV-AtNrt2.5构建体的转化植物中叶硝酸盐浓度的降低。尽管他们不希望被理论所束缚，但是发明人假设，AtNrt2.5蛋白充当氮再动员物。这导致叶被耗尽硝酸盐。
实施例 7 - 分析烟草“上部”和“下部”叶氨基酸含量
如实施例6(图5)中显示，本发明人已经确定，遗传修饰的试验植物株系，28.1和36.01，相比于它们的野生型对应物，具有其上部和下部叶内显著降低浓度的硝酸盐和增强的硝酸盐再动员。然而，可以想象的是，由于植物内氮、而不仅仅是硝酸盐的分布和管理的总体变化，这种硝酸盐含量的降低可能已经发生。一些氮使用效率(NUE)的研究表明，谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn)水平的改变对应于硝酸盐(即氮)的同化及其再动员。因此，为了确定试验植物是否表现出它们的氮总体分布的差异，测量野生型和试验植物叶的氨基酸含量。
使用Phenomenex 提供的EZ:Faast LC/MS试剂盒测量野生型和转基因Burley PH2517植物的氨基酸含量。所有试剂和供应品(包括HPLC柱)都是试剂盒的组分。该程序的所有步骤都在被用作方案的用户手册KH0-7338中提供。
方法： 原则上，其涉及待分析样品的固相提取和随后的衍生化和液/液提取。通过液相色谱-质谱(LC-MS)快速分析衍生化的样品。
固相提取经由吸附剂装填的尖端进行，所述吸附剂装填的尖端在允许干扰化合物流经的同时结合氨基酸。然后将结合在吸附剂上的氨基酸挤压至样品小瓶中，并在室温在水溶液中迅速地用试剂衍生化。衍生化的氨基酸伴随地迁移至有机层，用于与干扰化合物的额外分离。然后将有机层去除，蒸发，并重新溶解在含水流动相中，并在LC-MS系统上进行分析。
图3A - E显示，过表达Atnrt2.5硝酸盐转运蛋白的两种试验植物株系的顶部叶相比于它们的野生型对应物的顶部叶内的氨基酸具有所有测量的氨基酸的降低含量。因此，这表明，在试验植物的顶部叶内，CRV-AtNrt2.5的过表达已经降低了氨基酸含量。鉴于试验植物叶的降低的硝酸盐含量(如实施例6中显示)和两个植物株系的上部叶的降低的氨基酸含量，本发明人已得出过表达CRV-AtNrt2.5的植物的上部叶中可用于TSNA形成的硝酸盐降低的结论，这将是明显有利的。
图4A – E显示试验植物株系的底部叶相比于它们的野生型对应物具有可变浓度的氨基酸。试验植物株系36.01的谷氨酰胺(图4A)、脯氨酸(图4E)和天冬酰胺含量(图4B)是仅有的相比于它们的野生型对应物表现出降低含量的氨基酸。像上部叶一样，尽管不太一致，但两个植物株系的下部叶的降低的氨基酸含量和两个植物株系的下部叶的降低的硝酸盐含量(如实施例6中显示)已导致本发明人得出过表达CRV-AtNrt2.5的植物的下部叶中可用于TSNA形成的硝酸盐降低的结论。
实施例 8 -T2 植物中烟草“中部”叶硝酸含量的分析
方法： 使用实施例6中所述的方法进行野生型和转基因Burley PH2517植物中硝酸盐和/或亚硝酸盐水平的定量。
图6显示，过表达Atnrt2.5硝酸盐转运蛋白的两种(T2)试验植物株系的中部叶相比于它们的野生型对应物的中部叶具有降低的硝酸盐含量。因此，这表明，在试验植物的中部叶内，CRV-AtNrt2.5的过表达已经降低了硝酸盐含量。
如上所提及(实施例6中)，尽管不希望被以下理论所束缚，但是本发明人假设，AtNrt2.5蛋白充当氮再动员物，这引起叶的硝酸盐含量的降低。
实施例 9 -T2 植物中烟草“中部”叶氨基酸含量的分析
叶的生理学取决于其相对于植物的其余部分的位置。因此，烟草种植者当考虑叶可能具有什么味道时必须记住该信息。
在开花过程中，发生被称为再动员(remobilization)的过程，其导致营养物诸如氨基酸和含氮化合物从植物的基部转运出至植物的顶部。此外，再动员的营养物将被用作用于种子产生的能量源。因此，下部和上部叶将具有不同的氮含量，这通过不同的氨基酸概况说明。鉴于上述情况，本发明人决定测量氨基酸的浓度，所述氨基酸据信参与Burley植物的中部叶中的氮同化途径。
方法： 使用实施例7中所述的相同方法测定野生型和转基因Burley PH2517植物的氨基酸含量。
图7总结了二个植物株系(28和48 )中Atnrt2.5 硝酸盐转运蛋白过表达对Glu、Asp、Pro、Gln 和Asn(即，据信参与植物的氮同化途径的氨基酸)的浓度的影响。该图清楚地显示，携带Atnrt2.5 硝酸盐转运蛋白构建体的植物表现出所有测量的氨基酸浓度的显著降低(相比于其野生型对应物的中部叶)。鉴于试验植物叶的硝酸盐含量的降低(如实施例6和8中显示)和分析的二个植物株系的中部叶的氨基酸含量的降低，本发明人得出过表达CRV-AtNrt2.5的植物的叶中可用于TSNA形成的硝酸盐降低的结论，这对于烟草植物将是明显有利的。此外，氨基酸概况的操作可以用来改变烟草的味道。
总结
本文所述的实验在At NRT2.5由氮饥饿调节(并且在硝酸再动员中具有作用)的知识和显示被鉴定为氮再动员的标记物的一些氨基酸的增加的结果之间确立了有趣的连接。拟南芥和烟草中的研究已经显示，某些氨基酸可以被用作确定氮化合物的再动员的标记物(Diaz等人, 2005, Plant Physiology, 138: 898-908; 和Masclaux等人 2000, Planta, 211:510-518)。尤其是氨基酸谷氨酰胺(GLN)和天冬酰胺(ASN)是被转位到韧皮部用于转运到槽组织(sink tissues)(即植物的繁殖器官和光合活跃区域)的主要氨基酸。Seebauer等人, 2004 (Plant Physiology, 136(4):4326-34)暗示ASN和GLN作为信号传导分子，其表明植物再动员氮源用于种子产生。Diaz显示，在拟南芥中，ASN和天冬氨酸(ASP)是良好的衰老标记物，所述衰老的特征还在于植物中较低水平的硝酸盐和氮化合物。Masclaux还得出烟草中的脯氨酸(PRO)在正在经历营养物再动员的较老衰老叶中显著降低的结论。

Claims (34)

1.遗传构建体，其包含与编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列可操作连接的启动子，其中所述多肽包含如SEQ ID No.3所述的氨基酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物，条件是所述启动子不是SP6启动子。
2.根据权利要求1所述的遗传构建体，其中所述启动子是组成型的、非组成型的、组织特异性的、发育调节型或诱导型/阻遏型的启动子。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的遗传构建体，其中所述启动子是香石竹蚀环病毒(CERV)启动子、豌豆质体蓝素启动子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子、胭脂氨酸合成酶启动子、叶绿素a/b结合启动子、高分子量麦谷蛋白启动子、α,β-麦醇溶蛋白启动子、大麦醇溶蛋白启动子、马铃薯块茎储藏蛋白启动子、或衰老特异性启动子。
4.遗传构建体，其包含与编码具有硝酸盐转运蛋白活性的多肽的编码序列可操作连接的香石竹蚀环病毒(CERV)启动子，其中所述多肽包含如SEQ ID No.3所述的氨基酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物。
5.根据任何前述权利要求所述的遗传构建体，其中所述编码序列包含基本上如SEQ ID No.1或SEQ ID No. 2所述的核酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物。
6.根据任何前述权利要求所述的遗传构建体，所述启动子包含基本上如SEQ ID No. 4所述的核苷酸序列，或其功能变体或功能片段。
7.根据任何前述权利要求所述的遗传构建体，其中所述编码序列源自拟南芥属物种(Arabidopsis spp.)、稻属物种(Oryza spp.)、杨属物种(Populus spp.)或烟草属物种(Nicotiana spp.)。
8.根据任何前述权利要求所述的遗传构建体，其中所述编码序列源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、稻(Oryza sativa)、欧洲山杨(Populus tremula)或烟草(Nicotiana tabacum)。
9.重组载体，其包含根据前述权利要求中任一项所述的遗传构建体。
10.使试验植物的叶中硝酸盐浓度降低至低于在相同条件下培养的野生型植物叶中对应的硝酸盐浓度的方法，所述方法包括:-
(i) 用根据权利要求1-8中任一项所述的构建体的遗传构建体或根据权利要求9所述的载体转化植物细胞；和
(ii) 从转化的细胞再生植物。
11.产生转基因植物的方法，所述转基因植物以比在相同条件下培养的对应野生型植物更高的速率将硝酸盐转运出叶，所述方法包括:-
(i) 用根据权利要求1-8中任一项所述的构建体的遗传构建体或根据权利要求9所述的载体转化植物细胞；和
(ii) 从转化的细胞再生植物。
12.用于产生转基因植物的方法，所述方法包括将编码硝酸盐转运蛋白多肽的外源基因引入未修饰的植物，其中所述多肽包含如SEQ ID No.3所述的氨基酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物，并且其中相对于所述未修饰的植物的叶中的硝酸盐浓度，由所述外源基因编码的硝酸盐转运蛋白的表达降低了所述转基因植物的叶中的硝酸盐浓度。
13.转基因植物，其包含根据权利要求1-8中任一项所述的遗传构建体或根据权利要求9所述的载体。
14.转基因植物，其包含编码硝酸盐转运蛋白多肽的外源基因，其中所述多肽包含如SEQ ID No.3所述的氨基酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物，并且其中与未修饰的植物叶中的硝酸盐浓度相比，所述转基因植物叶中的硝酸盐浓度降低。
15.编码硝酸盐转运蛋白多肽的外源核酸序列用于通过用所述外源核酸序列转化植物而降低植物叶中的硝酸盐浓度的用途，所述多肽包含如SEQ ID No.3所述的氨基酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物。
16.根据权利要求12所述的方法，根据权利要求14所述的转基因植物，或根据权利要求15所述的用途，其中所述外源基因包含基本上如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所述的核苷酸序列，或其功能变体或片段或直向同源物。
17.宿主细胞，其包含根据权利要求1-8中任一项所述的遗传构建体或根据权利要求9所述的载体。
18.根据权利要求17所述的宿主细胞，其中所述细胞是植物细胞。
19.根据权利要求12所述的方法，根据权利要求14所述的转基因植物，或根据权利要求15所述的用途，其中所述植物来自十字花科，诸如芸苔属物种(Brassica spp.)，且优选为欧洲油菜(Brassica napus) (油菜)。
20.根据权利要求12所述的方法，根据权利要求14所述的转基因植物，或根据权利要求15所述的用途，其中所述植物来自禾本科，诸如小麦族物种(Triticeae spp.)，且优选为小麦属物种(Triticum spp.)(小麦)。
21.根据权利要求12所述的方法，根据权利要求14所述的转基因植物，或根据权利要求15所述的用途，其中所述植物来自茄科，例如曼陀罗、茄子、风茄、颠茄(颠茄)、辣椒(辣椒、辣椒)、马铃薯或烟草。
22.根据权利要求12所述的方法，根据权利要求14所述的转基因植物，或根据权利要求15所述的用途，其中所述植物来自烟草属，优选烟草。
23.根据权利要求12所述的方法，根据权利要求14所述的转基因植物，或根据权利要求15所述的用途，其中所述植物来自菊科的植物，其例如莴苣(莴苣(Lactuca sativa))，或来自藜科的植物，其包括菠菜(Spinacia oleracea)和甜菜(Beta vulgaris)。
24.植物繁殖产物，其可从根据权利要求13或权利要求14所述的转基因植物获得。
25.收获的叶，其含有比从在相同条件下培养的野生型植物采集的收获的叶中对应的硝酸盐水平更低的硝酸盐水平，其中所述叶是从根据权利要求13或权利要求14所述的或通过根据权利要求11或权利要求12所述的方法产生的转基因植物收获的。
26.烟草产品，其包含从突变体烟草植物获得的硝酸盐降低的烟草，所述突变体烟草植物包含根据权利要求1-8中任一项所述的构建体或根据权利要求9所述的载体，所述突变体能够降低其叶中的硝酸盐浓度。
27.根据权利要求26所述的烟草产品，其中所述烟草产品是无烟烟草产品，诸如鼻烟，或可通过嘴递送的口服烟草产品，诸如湿鼻烟，或吸烟制品。
28.吸烟制品，其包含从突变体烟草植物获得的硝酸盐降低的烟草，所述突变体烟草植物包含根据权利要求1-8中任一项所述的构建体或根据权利要求9所述的载体，所述突变体能够降低其叶中的硝酸盐浓度。
29.相比于在相同条件下培养的野生型植物的对应叶的氨基酸概况，调节参与试验植物的叶的氮同化的氨基酸概况的方法，所述方法包括:-
(i) 用根据权利要求1-8中任一项所述的遗传构建体或根据权利要求9所述的载体转化植物细胞；和
(ii) 从转化的细胞再生植物。
30.相比于从在相同条件下培养的野生型植物采集的对应的收获的叶的氨基酸概况，调节参与从转基因植物采集的收获的叶的氮同化途径的氨基酸概况的方法，其中所述叶是从由根据权利要求11或12所述的方法产生的转基因植物收获的。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中参与植物和它们的叶的氮同化途径的氨基酸包含谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)或脯氨酸(Pro)。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的野生型植物中至少一种氨基酸的浓度相比，所述构建体能够使用所述构建体转化的植物中参与氮同化途径的至少一种氨基酸的浓度降低或增加至少10%、20%、30%、40%、50%、56%、60%、64%、65%、70% 或75%。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的野生型植物中发现的对应叶相比，所述构建体能够降低转基因植物的下部叶中氨基酸Pro和Gln的浓度。
34.根据权利要求29-33中任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的野生型植物中发现的对应叶相比，所述构建体能够降低在转基因植物的上部位置中发现的叶中氨基酸Gln、Asn、Asp、Glu 和/或 Pro的浓度。
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