CN107074919A - 通过氯化物通道的异位表达调节植物中的生物质 - Google Patents

通过氯化物通道的异位表达调节植物中的生物质 Download PDF

Info

Publication number
CN107074919A
CN107074919A CN201580033181.0A CN201580033181A CN107074919A CN 107074919 A CN107074919 A CN 107074919A CN 201580033181 A CN201580033181 A CN 201580033181A CN 107074919 A CN107074919 A CN 107074919A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
seq
sequence
mutation
polynucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580033181.0A
Other languages
English (en)
Inventor
P·坎帕尼
L·博韦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Philip Morris Products SA
Original Assignee
Philip Morris Products SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Philip Morris Products SA filed Critical Philip Morris Products SA
Publication of CN107074919A publication Critical patent/CN107074919A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Manufacture Of Tobacco Products (AREA)

Abstract

在第一个方面，本发明描述了突变型、非天然存在的或转基因植物细胞，其包含：(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性；(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性；或(iv)包含(i)中所示的经分离的多核苷酸的构建体、载体或表达载体，并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，多核苷酸或多肽的表达或活性被调节，并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，含有突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物中的硝酸盐水平被调节。

Description

通过氯化物通道的异位表达调节植物中的生物质
技术领域
本发明公开了来自烟草属(Nicotiana)的编码CLC氯化物通道家族成员的基因的新型多核苷酸序列，以及其变体、同系物、片段和突变体。本发明还公开了多核苷酸序列以及其变体、同系物、片段和突变体。本发明还公开了这些基因中的一种或多种的表达或由其编码的蛋白质活性的修饰，以调节植物或其组分部分中的烟草特异性亚硝胺(TSNA)水平。
背景技术
烟草特异性亚硝胺(TSNA)主要在烟叶烘烤和加工期间形成。烟草烘烤是带出每个烟草品种的香气和风味的物理和生物化学变化过程。认为烘烤的烟叶中的TSNA量取决于亚硝酸盐的累积，所述亚硝酸盐在植物细胞的死亡期间累积，并且通过在接近厌氧(氧缺乏)环境的条件下的硝酸盐还原而在烘烤期间形成。将硝酸盐还原成亚硝酸盐被认为是
通过在厌氧条件下在叶表面上的细菌的作用而发生，并且该还原在某些条件下特别明显。一旦形成亚硝酸盐，这些化合物就被认为与多种烟草生物碱(包含含吡啶化合物)组合以形成亚硝胺。
四种主要的TSNA，即通常发现以最高浓度存在的那些，是N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟草碱(NAT)。次要化合物，即通常以明显低于主要TSNA的水平发现的那些，包含4-(甲基亚硝氨基)4-(3-吡啶基)丁醛(NNA)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)、4-(甲基亚硝氨基)4-(3-吡啶基)-1-丁醇(异-NNAL)和4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁酸(异-NNAC)。至少NNN和NNK据报道当应用于实验室研究中的动物时是致癌的。
使负责生物碱至TSNA的亚硝化的化合物浓度下降可导致烘烤的叶中的TSNA水平减少。烟叶中的主要亚硝化试剂是亚硝酸盐(NO2-)，起因于游离硝酸盐(NO3-)在烘烤期间通过可能由细菌催化的酶促反应的还原。改变白肋(Burley)植物中的硝酸盐水平的肥料研究导致烘烤的叶和烟中的不同TSNA水平。硝酸盐是土壤中可获得的主要氮源。在植物中，它通过根表皮细胞吸收且转运至全植物，以首先还原为亚硝酸盐，所述亚硝酸盐进一步还原为氨，且随后同化成氨基酸。不幸的是，在白肋生长期间的氮限制导致不利的农业表型，例如弱生物量得率和植物成熟中的延迟。因此，限制氮不是降低TSNA水平的商业上可行的方法。尝试控制烟叶中的硝酸盐累积从而是一项重大挑战。
WO98/58555描述了在烟熏之前或烟熏期间通过微波处理烟叶用于降低TSNA。US5,810,020描述了通过使烟草材料与捕集槽接触用于去除来自烟草的TSNA的方法，其中所述捕集槽包括选择过渡金属络合物，其容易亚硝化以形成亚硝酰基复合物，伴随很少的动力学或热力学阻力。US 6,202,649描述了通过尤其在受控环境中烘烤烟草，基本上阻止TSNA形成的方法，所述受控环境具有足够的气流以基本上阻止环绕烟叶附近的厌氧条件。受控环境通过控制一种或多种烘烤参数而提供，所述一种或多种烘烤参数例如气流、湿度和温度。然而，诸如此类的方法可增加相当大的烟草生产成本和时间，并且因此不太可能由烟草行业接受。因此，仍存在用于降低TSNA的有效和相对廉价方法的需要。
用于降低植物中的TSNA水平的基于分子的方法是高度期望的，因为它们不需要昂贵且通常复杂的方法来实现TSNA水平的降低。一种此类基于分子的方法公开于WO2011/088180中。公开了用于抑制根特异性烟碱脱甲基酶多肽的表达或功能的组合物和方法，所述根特异性烟碱脱甲基酶多肽涉及烟草植物的根中的烟碱至去甲烟碱的代谢转化。公开了CYP82E10烟碱脱甲基酶基因的基因序列。发现降低该基因的表达降低烘烤烟叶中的NNN水平。虽然可获得NNN水平的降低，但存在超过一种据报道是致癌物的TSNA，其仍保存于经修饰的植物中。其他烟碱脱甲基酶基因包括参与烟碱至去甲烟碱转化的CYP82E4和CYP82E5，且描述于WO2006091194、WO2008070274和WO2009064771中。
我们现在已经发现，修饰某些CLC族基因也可以提高植物的生物产量。
发明内容
本发明人已克隆了来自属于烟草属的植物，编码CLC氯化物通道家族的多个成员的新型基因，并且指名为CLC-Nt2和NtCLCe。源于两个祖先绒毛状烟草(N.tomentosiformis)和美花烟草(N.sylvestris)的两个直向同源基因拷贝存在于普通烟草(Nicotiana tabacum)中，并且在本文中分别指名为CLC-Nt2-t和CLC-Nt2-s或NtCLCe-t和NtCLCe-s。这些基因的多核苷酸序列在SEQ ID NOs:1-4、10和11中阐述，并且这些基因的多核苷酸序列在SEQ ID NOs:5-7和12-14中阐述。通过降低这些基因在烟草植物中的表达，可见植物中的硝酸盐水平的降低。特别地，可见在绿叶中的硝酸盐水平的降低。在叶烘烤后的总TSNA含量在这些植物中是降低的。这提示硝酸盐水平降低可促使烘烤的植物材料-例如烘烤的叶中形成更低水平的TSNA。在来自NtCLCe-RNAi和CLC-Nt2-RNAi植物两者的烘烤的植物材料中，可见至少NNK的降低。还观察到总TSNA含量中的降低。降低NtCLCe和/或CLC-Nt2的表达因此促成降低烟叶中的硝酸盐水平。在烘烤后，可降低至少NNK和任选的其他TSNA，其可包括NNN或NAB或NAT或者其中两种或更多种的组合。另外，植物的视觉外观基本上不改变，这是由行业接受且使植物得率达到最大等等的重要标准。发明者另外还意外的发现，本发明中某些CLC突变可导致植物中的生物产量增加。此外，发明者意外发现本发明中所述的某些CLC突变可致使一种以上的性质得到调节，例如调节硝酸盐/TSNA水平以及调节植物的生物量生产。本发明可能因此特别适合用于调节(例如增加或减少)植物中的硝酸盐水平、总TSNA和/或生物量生产。特别地，当与其他能够降低TSNA水平的方法组合时，本发明可以是特别有用的。因此，在某些实施例中，可能期望降低烟草植物中的本文所述一种或多种多核苷酸的表达，连同降低一种或多种烟碱脱甲基酶基因的表达。该组合将预期降低烘烤的植物材料中的至少NNK和NNN水平，这将是高度期望的，因为NNK和NNN两者据报道当应用于实验室研究中的动物时是致癌的。源自本文描述的烟草植物的烟草产品可用于降低这些烟草产品的致癌潜力且降低人对致癌亚硝胺的暴露的方法中。本发明中描述的多肽序列突变体可调节植物中的硝酸盐含量和/或生物量生产。因此，本发明中描述的某些突变体可能导致仅调节硝酸盐/TSNA含量，其中本发明中描述的多肽序列突变体可调节植物中的硝酸盐/TSNA含量和生物量生产。
本发明的方面和实施例
本发明的方面和实施例在所附权利要求中阐述。
在第一个方面，本发明描述了突变型、非天然存在的或转基因植物细胞，其包含：(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性；(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性；或(iv)包含(i)中所示的经分离的多核苷酸的构建体、载体或表达载体，并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，多核苷酸或多肽的表达或活性被调节，并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，含有突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物中的硝酸盐水平被调节。通过降低烟草植物中的一种或多种基因的表达，可降低硝酸盐水平。总TSNA含量和/或NNK水平在烘烤的植物材料中可以是降低的。
在一个实施例中，所述突变型、非天然存在的或转基因植物细胞包含所公开的多肽和多核苷酸中的一个或多个突变，与含有对照植物细胞的对照植物相比较，所述一个或多个突变减少含有突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物中的硝酸盐水平。一个或多个突变可包含在SEQ ID NO:5的位置G163处的置换突变。
在一个实施例中，所述突变型、非天然存在的或转基因植物细胞包含所公开的多肽和多核苷酸中的一个或多个突变，与含有对照植物细胞的对照植物相比较，所述一个或多个突变增加含有突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物中的硝酸盐水平。一个或多个突变可包含在SEQ ID NO:13的位置P143处的置换突变。
在一个实施例中，所述突变型、非天然存在的或转基因植物细胞包含所公开的多肽和多核苷酸中的一个或多个突变，与含有对照植物细胞的对照植物相比较，所述一个或多个突变增加含有突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物中的硝酸盐水平。一个或多个突变可包含在SEQ ID NO:13的位置P184处的置换突变。
在一个实施例中，所述突变型、非天然存在的或转基因植物细胞包含所公开的多肽和多核苷酸中的一个或多个突变，与含有对照植物细胞的对照植物相比较，所述一个或多个突变增加含有突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物中的硝酸盐水平。一个或多个突变可包含在SEQ ID NO:13的位置P184处的置换突变。
在另一方面，本发明描述了包含本文所述植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物或其组分。
在另一方面，本发明描述了用于调节植物或其组分的至少硝酸盐(例如4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK))含量的方法，其包括下述步骤：(a)调节下述的表达或活性：(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性；(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；或(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性；(b)测量步骤(a)中获得的突变型、非天然存在的或转基因植物的至少一部分中的至少硝酸盐(例如NNK)含量；和(c)鉴定与对照植物相比较，其中至少硝酸盐(例如NNK)含量已改变的突变型、非天然存在的或转基因植物，在所述对照植物中，(a)中所示的多核苷酸或多肽的表达或活性未被调节。
在另一方面，本发明描述了用于调节植物或其组分的至少硝酸盐(例如4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK))含量的方法，其包括下述步骤：(a)调节下述的表达或活性：(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性；(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；或(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性；(b)测量步骤(a)中获得的突变型、非天然存在的或转基因植物的至少一部分中的至少硝酸盐(例如NNK)含量；和(c)鉴定与对照植物相比较，其中至少硝酸盐(例如NNK)含量已改变的突变型、非天然存在的或转基因植物，在所述对照植物中，(a)中所示的多核苷酸或多肽的表达或活性未被调节。
适当地，硝酸盐(例如NNK)含量和/或总TSNA含量和/或烟碱含量在植物(例如烘烤的植物材料)中被调节。
适当地，NNN含量基本上与对照植物相同。
适当地，植物的组分是叶，适当地，烘烤的叶或烘烤的烟草。
在另一方面，提供了一种调节植物生物产量的方法，包括调节所述植物中至少一种CLC氯通道多肽的表达。
在一个方面，提供了一种调节植物生物产量的方法，包括调节所述植物中至少下列之一的表达(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQID NO:4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性；(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性；或(iv)包含(i)中所示的经分离的多核苷酸的构建体、载体或表达载体，并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，多核苷酸或多肽的表达或活性被调节，并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，含有突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物中的生物量水平被调节。
在另一方面，提供了一种调节植物生物产量的方法，包括调节所述植物中多肽的表达，所述多肽包含序列、由序列组成或基本上由序列组成，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性；其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，多核苷酸或多肽的表达或活性被调节，并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，含有突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物中的生物量水平被调节。
在另一方面，提供了一种调节植物中至少硝酸盐(例如NNK)含量和生物产量的方法，包括调节所述植物中至少一种CLC氯通道多肽的表达。
在一个方面，提供了一种调节植物中至少硝酸盐(例如NNK)含量和生物产量的方法，包括调节所述植物中至少下列之一的表达(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1或SEQID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性；(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性；或(iv)包含(i)中所示的经分离的多核苷酸的构建体、载体或表达载体，并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，多核苷酸或多肽的表达或活性被调节，并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，含有突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物中的至少硝酸盐(例如NNK)含量和生物产量被调节。
在另一方面，提供了一种调节植物的至少硝酸盐(例如NNK)含量和生物产量的方法，包括调节所述植物中多肽的表达，所述多肽包含序列、由序列组成或基本上由序列组成，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性；其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，多核苷酸或多肽的表达或活性被调节，并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，含有突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物中的至少硝酸盐(例如NNK)含量和生物产量被调节。
在另一方面，本发明描述了通过本文描述的方法获得或可获得的植物或其组分。
在另一方面，本发明描述了突变型、非天然存在的或转基因植物，其中NNK含量为约110ng/g或更少，任选地，其中硝酸盐含量为约7mg/g或更少。适当地，植物采取烘烤的植物材料的形式。
在另一方面，本发明描述了突变型植物，其中硝酸盐含量为约6mg/g或更少，并且烟碱含量为约13mg/g或更少。
在一个实施例中，与含有对照植物细胞的对照植物相比，突变的、非天然存在的或转基因植物具有至少1.5倍的生物量产量的增加。
适当地，下述的表达：(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性；(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；或(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性。
在另一方面，本发明描述了包括来自本文所述植物的生物量、种子、茎或叶的植物材料。
在另一方面，本发明描述了包含如本文所描述的植物细胞、植物的至少一部分或植物材料的烟草产品。
在另一方面，本发明描述了用于产生其中NNK水平降低的烘烤的植物材料(例如叶)的方法，其包括下述步骤：(a)提供如本文所描述的植物或植物材料的至少一部分；(b)任选从植物收获植物材料；和(c)将植物材料烘烤足以使其中的至少NNK水平降低的一段时间。
在另一方面，本发明描述了包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的经分离的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1的至少99.1％的序列同一性，或具有与SEQ ID NO:2的97.1％的序列同一性，或具有与SEQ ID NO:3的63％的序列同一性，或具有与SEQ ID NO:4的61％的序列同一性，或具有与SEQ ID NO:10的60％的序列同一性，或具有与SEQ ID NO:11的60％的序列同一性。
在另一方面，本发明描述了由本文描述的一种或多种多核苷酸编码的经分离的多肽。
在另一方面，本发明描述了包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的经分离的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5的至少99.1％的序列同一性，或具有与SEQ ID NO:6的至少98.1％的序列同一性，或具有与SEQ ID NO:7至少60％的序列同一性，或具有与SEQ ID NO:12的至少60％的序列同一性，或具有与SEQID NO:13的至少60％的序列同一性，或具有与SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性。
在另一方面，本发明描述了包含本文所述经分离的多核苷酸中的一种或多种的构建体、载体或表达载体。
在另一方面，本发明描述了包含在下述中的一个或多个突变的突变型植物细胞：(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性；(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；或(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性；并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，所述一个或多个突变调节多核苷酸或多肽的表达或活性，并且其中与对照植物相比较，含有突变型植物细胞的突变型植物中的硝酸盐水平被调节。
在另一方面，本发明描述了包含在下述中的一个或多个突变的突变型植物细胞：(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性；(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；或(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性；并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，所述一个或多个突变调节多核苷酸或多肽的表达或活性，并且其中与对照植物相比较，含有突变型植物细胞的突变型植物中的硝酸盐水平被调节。
在另一方面，本发明描述了包含在下述中的一个或多个突变的突变型植物细胞：(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性；(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；或(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性；并且其中与含有对照植物细胞的对照植物相比较，所述一个或多个突变调节多核苷酸或多肽的表达或活性，并且其中与对照植物相比较，含有突变型植物细胞的突变型植物中的生物量水平被调节。
在另一方面，本发明提供了用于降低烟草产品的致癌潜力的方法，所述方法包括由如本文所描述的烟草植物、或其植物部分或后代制备所述烟草产品。
在另一方面，本发明描述了如本文所描述的构建体在制备植物的方法中的用途，相对于对照植物，所述植物具有调节的硝酸盐和/或NNK或总TSNA水平。
在另一方面，描述了本文所述的构建体在用于制备相对于对照植物具有调节的生物量水平的植物的方法中的用途。
在另一方面，描述了本文所述的构建体在制备具有调节的硝酸盐(例如，NNK)含量和生物量产量的植物的方法中的用途。
在另一方面，本发明描述了相对于对照植物，如本文所描述的多核苷酸或多肽用于调节植物中的硝酸盐和/或NNK或总TSNA水平的用途。
在另一方面，本发明描述了包含一个或多个突变的突变型植物细胞，与包含对照植物细胞的对照植物相比较，所述一个或多个突变减少含有突变型植物细胞的突变型植物中的硝酸盐水平，其中所述一个或多个突变包含在SEQ ID NO:5的位置G163处的置换突变。
在另一方面，本发明描述了包含一个或多个突变的突变型植物细胞，与包含对照植物细胞的对照植物相比较，所述一个或多个突变减少含有突变型植物细胞的突变型植物中的硝酸盐水平，其中所述一个或多个突变包含在SEQ ID NO:13的位置P143处的置换突变。
在另一方面，本发明描述了包含一个或多个突变的突变型植物细胞，与包含对照植物细胞的对照植物相比较，所述一个或多个突变减少含有突变型植物细胞的突变型植物中的硝酸盐水平和/或增加生物产量，其中所述一个或多个突变包含在SEQ ID NO:13的位置P184处的置换突变。
在另一方面，本发明公开了包含SEQ ID NO.5中所示的序列或由SEQ ID NO.5中所示的序列组成的多肽序列，所述SEQ ID NO.5中所示的序列具有在位置G163处，适当地，在G163R处的置换突变。
在另一方面，本发明公开了包含SEQ ID NO.13中所示的序列或由SEQ ID NO.13中所示的序列组成的多肽序列，所述SEQ ID NO.13中所示的序列具有在位置P143处，适当地，在P143L处的的置换突变。
在另一方面，本发明公开了包含SEQ ID NO.13中所示的序列或由SEQ ID NO.13中所示的序列组成的多肽序列，所述SEQ ID NO.13中所示的序列具有在位置P184处，适当地，在P184S处的置换突变。
在另一方面，本发明公开了如本文所描述的突变型多肽。
上文讨论的实施例中的每一个作为本发明的方面中的每一个的实施例公开。预见到一个或多个实施例的组合。
附图说明
图1：三个代表性NtCLCe-RNAi品系(泳道1、2和3)、wt(泳道4、5和6)和CLC-Nt2-RNAi品系(泳道7、8和9)的半定量RT-PCR，显示微管蛋白(看家基因)NtCLCe和CLC-Nt2转录物的表达。
图2：wt(n＝11)、NtCLCe-RNAi(n＝5)和CLC-Nt2-RNAi(n＝5)植物的绿叶中的烟碱和硝酸盐分析(A)；在空气烘烤过程后的相应叶中的总TSNA含量。在该实验中，植物在3升罐中培养，并且最高的总TSNA值对应于200ng/g。
图3：wt(n＝4)、缺乏CLC-Nt2和NtCLCe转录物两者(CLC-RNAi品系)的NtCLCe-RNAi和CLC-Nt2-RNAi植物(n＝8)的绿叶中的烟碱、硝酸盐分析(A)、叶重(B)和叶数目(C)。在受控的温室条件下，在10升罐中的10周生长后收获叶。在该实验中，烟碱和硝酸盐的最大值分别为29.6和6.4mg/g。
图4：如图3中所示在10升罐中培养后，wt、NtCLCe-RNAi和CLC-Nt2-RNAi植物的空气烘烤的叶中的NNK百分比。在该实验中，最高NNK值对应于108ng/g。
图5：田间生长的CLCNt2-s G163R突变型植物的绿叶中的烟碱和硝酸盐水平的时间过程。从田间生长的CLCNt2-s G163R纯合植物(三角形)和在白肋方案下生长的外分离子(out-segregant)野生型(菱形)植物的杆中间位置处收获整片叶。样品在上午期间的三个不同时间(早、中和晚)进行收获且冷冻干燥。粉末状叶片材料就硝酸盐和烟碱含量进行分析。N＝4-8棵个别植物。在图中指出标准差。早＝8:00am-9:00am；中＝9:30am-10:30am；晚＝11:00am-12:00pm。
图6：田间生长的NtCLCe-t P143L突变型植物的绿叶中的烟碱和硝酸盐水平的时间过程。从田间生长的NtCLCe-t P143L纯合植物(正方形)和在白肋方案下生长的外分离子野生型(菱形)植物的杆中间位置处收获整片叶。样品在上午期间的三个不同时间(早、中和晚)进行收获且冷冻干燥。粉末状叶片材料就硝酸盐和烟碱含量进行分析。N＝4-8棵个别植物。在图中指出标准差。早＝8:00am-9:00am；中＝9:30am-10:30am；晚＝11:00am-12:00pm。
图7NtCLCe-T P184S纯合型、杂合型和分离子WT变异系的生物量比较。NtCLCe-TP184S变异系的生物量曲线，表示为曲线内每株植物烘烤的叶材料的克数。分离子野生型(WT)以黑色表示，杂合型以虚线表示，纯合型以白色表示。A:单个曲线的生物量(867,885等是曲线的识别编号/单个植物，并在横坐标上显示)。B:相同基因型的画线方式。误差线指示的是 95％的置信区间。
图8在2013LaSota领域不同类型曲线的生物量比较。NtCLCe-T P184S变异系的生物量曲线，表示为每株植物烘烤的叶材料的克数。对应于分离子野生型(WT)的曲线以黑色表示，杂合型以虚线表示，纯合型以白色表示。误差线指示的是 95％的置信区间。
图9打顶期单株叶片的平均数量。记录变异系NtCLCe-T P184S打顶期单株叶片的平均数量(分离子野生型(WT)以黑色表示，杂合型以虚线表示，纯合型以白色表示)。误差线指示的是 95％的置信区间。
定义
在本申请的范围内使用的技术术语和表达通常被赋予在植物和分子生物学的相关领域中经常应用于它们的含义。所有以下术语定义适用于本申请的整个内容。词语“包括”不排除其它元件或步骤，且不定冠词“一(a)”或“一(an)”不排除多个/多种。单个步骤可以完成在权利要求中列出的几个特征的功能。在给定数值或范围背景下，术语“约”、“基本上”和“大约”指在给定值或范围20％内，10％内或者5％、4％、3％、2％或1％内的值或范围。
术语“经分离的”指取自其天然环境的任何实体，但该术语不意味着任何纯化程度。
“表达载体”是包含允许核酸表达的核酸组分组合的核酸媒介物。合适的表达载体包括能够染色体外复制的附加体，例如环状双链核酸质粒；线性化的双链核酸质粒；以及其他具有任何起源的功能等价表达载体。如下文定义的，表达载体包含置于核酸、核酸构建体或核酸缀合物上游，且与核酸、核酸构建体或核酸缀合物可操作地连接的至少启动子。
术语“构建体”指包含一种或多种多核苷酸的双链重组核酸片段。构建体包括与互补“有义链或编码链”碱基配对的“模板链”。给定构建体可在两个可能定向上插入载体内，所述两个可能定向是就置于载体(例如表达载体)内的启动子定向而言的相同(或有义)定向或相反(或反义)定向。
“载体”指核酸媒介物，其包含允许核酸、核酸构建体和核酸缀合物等等转运的核酸组分组合。合适的载体包括能够染色体外复制的附加体，例如环状双链核酸质粒；线性化的双链核酸质粒；以及其他具有任何起源的载体。
“启动子”指通常置于双链DNA片段上游，且与双链DNA片段可操作地连接的核酸元件/序列。启动子可完全源自接近天然目的基因的区域，或可由源自不同天然启动子的不同元件或合成DNA区段组成。
术语“同一性、同一性或相似性”指通过序列比对比较的两个多肽或两个核酸分子之间的序列相似性程度。被比较的两个不连续核酸序列之间的同一性程度是在可比较位置处的相同或匹配核苷酸数目的函数。同一性百分比可通过目视检查和数学计算进行确定。作为另外一种选择，可通过使用计算机程序(例如ClustalW、BLAST、FASTA或Smith-Waterman)比较序列信息，确定两个核酸序列的同一性百分比。可使用这些程序的缺省参数。
术语“植物”指处于其生命周期或发育的任何阶段的任何植物及其后代。在一个实施例中，植物是“烟草植物”，这指属于烟草属的植物。优选烟草植物种类在本文中描述。
“植物细胞”指植物的结构和生理单位。植物细胞可采取不含细胞壁的原生质体、经分离的单细胞或培养细胞的形式，或作为更高等组构单位的一部分，例如但不限于植物组织、植物器官或全植物。
术语“植物材料”指可得自植物的任何固体、液体或气体组合物或其组合，包括生物量、叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条、分泌物、提取物、细胞或组织培养物、或任何其他植物部分或产物。在一个实施例中、植物材料包含生物量、茎、种子或叶，或者由生物量、茎、种子或叶组成。在另一个实施例中，植物材料包含叶或由叶组成。
术语“品种”指共享恒定特征的植物群体，所述恒定特征使其与相同物种的其他植物分开。虽然具有一种或多种独特性状，但品种的特征还在于该品种内的个体之间的极少总体变化。品种通常在商业上出售。
如本文使用的术语“品系”或“育种品系”指示在植物育种期间使用的一群植物。品系可与品种区分，因为它展示对于一种或多种目的性状在个体间的很少变化，尽管对于其他性状在个体间可能存在一些变化。
术语“调节”可指降低、抑制、增加或以其他方式影响多肽的表达或活性。该术语还可指降低、抑制、增加或以其他方式影响编码多肽的基因的活性，所述影响活性可包括但不限于调节转录活性。
如本文使用的，术语“降低”或“降低的”指数量或活性约10％至约99％的降低，或者至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％或更多的降低，所述活性诸如(但不限于)多肽活性、转录活性和蛋白质表达。
如本文使用的，术语“抑制”或“抑制的”指数量或活性约98％至约100％的降低，或者至少98％、至少99％但特别是100％的降低，所述活性例如但不限于多肽活性、转录活性和蛋白质表达。
如本文使用的，术语“增加”或“增加的”指数量或活性约5％-约99％的增加，或者至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％或更多的增加，所述活性例如但不限于多肽活性、转录活性和蛋白质表达。
在对照植物背景下的术语“对照”意指这样的植物或植物细胞，其中酶的表达或活性未进行修饰(例如，增加或降低的)，并且因此它可提供与其中酶的表达或活性已进行修饰的植物的比较。对照植物可包含空载体。对照植物或植物细胞可对应于野生型植物或野生型植物细胞。
具体实施方式
在一个实施例中，本发明提供了包含多核苷酸序列、由多核苷酸序列组成或基本上由多核苷酸序列组成的经分离的多核苷酸，所述多核苷酸序列与本文描述的序列中的任一种，包括序列表中所示的多核苷酸中的任一种的至少60％的序列同一性。适当地，经分离的多核苷酸包含序列、由序列组成或基本上由序列组成，所述序列与其具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在另一个实施例中，本发明提供了包含多核苷酸序列、由多核苷酸序列组成或基本上由多核苷酸序列组成的经分离的多核苷酸，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO.1或SEQID NO:2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性。适当地，经分离的多核苷酸包含序列、由序列组成或基本上由序列组成，所述序列与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11具有至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的序列同一性。
在另一个实施例中，本发明提供了包含多核苷酸、由多核苷酸组成或基本上由多核苷酸组成的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.3或SEQID NO.4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有基本同源性(即，序列相似性)或基本同一性。
在另一个实施例中，本发明提供了与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列具有至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性的多核苷酸变体。
在另一个实施例中，本发明提供了SEQ ID NO.1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的片段，以及与其具有基本同源性(即，序列相似性)或基本同一性的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的片段，所述片段与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的相应片段具有至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的序列同一性。
在另一个实施例中，本发明提供了包含与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO:2或SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有足够或基本同一性或相似性程度的多核苷酸，其编码充当CLC氯化物通道家族成员的多肽。
在另一个实施例中，本发明提供了包含多核苷酸、由多核苷酸组成或基本上由多核苷酸组成的多核苷酸聚合物，所述多核苷酸在本文中命名为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。
适当地，本文描述的多核苷酸编码CLC氯化物通道家族的成员。CLC构成电压门控通道家族。在植物中，氯化物通道促成许多植物特异性功能，例如调节膨压、气孔运动、营养素转运和/或金属耐受性等等。硝酸盐/质子反向转运蛋白AtCLCa介导植物液泡中的硝酸盐累积(参见Nature(2006)442(7105):939-42)。在该公开中，显示AtClCa充当2NO3-/1H+交换剂，其能够通过使用电生理方法将硝酸盐累积到液泡内。类似方法可用于测试CLC-Nt2的硝酸盐转运活性。“Solute transporters in plant thylakoid membranes:Key playersduring photosynthesis and light stress by Spetea C,Schoefs B.Communicative&Integrative Biology.2010；3(2)122-129and Monachello et al.,New Phytol.“Solutetransporters in plant thylakoid membranes:Key players during photosynthesisand light stress by Spetea C,Schoefs B.Communicative&IntegrativeBiology.2010；3(2)122-129，并且Monachello等人，New Phytol.2009；183(1):88-94公开了AtClCe预测为涉及亚硝酸盐从基质易位到类囊体腔内，从而接管叶绿体被膜的亚硝酸盐转运蛋白。本文描述的用于测量该活性的方法可用于测量NtCLCe的活性。
还考虑了SEQ ID NO.1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11的组合。这些组合包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的多种组合-包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的组合；SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的组合；SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的组合；SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:10的组合；SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:11的组合；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的组合；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的组合；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:10的组合；SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:11的组合；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:10的组合；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:11的组合；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的组合；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的组合；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4的组合；SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的组合；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的组合；或SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO.3的组合；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的组合；SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的组合；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的组合；SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的组合；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3和SEQ ID NO:4的组合；或SEQ ID NO.1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO.3的组合等。
如本文所描述的多核苷酸可包括核苷酸聚合物，其可以是未经修饰或经修饰的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。相应地，多核苷酸可以是(无限制地)基因组DNA、互补DNA(cDNA)、mRNA、或反义RNA或其一个或多个片段。此外，多核苷酸可以是单链或双链DNA，其为单链和双链区的混合物的DNA，包含DNA和RNA的杂交物分子，或具有单链和双链区的混合物的杂交物分子，或其一个或多个片段。另外，多核苷酸可由包含DNA、RNA或两者的三链区或者其一个或多个片段组成。多核苷酸可含有一个或多个经修饰的碱基，例如硫代磷酸酯，并且可以是肽核酸。一般地，多核苷酸可由经分离或克隆的cDNA片段、基因组DNA、寡核苷酸或个别核苷酸或前述的组合装配。尽管本文描述的多核苷酸序列显示为DNA序列，但序列包括其相应的RNA序列，及其互补(例如完全互补的)DNA或RNA序列，包括其反向互补体。
如本文所描述的多核苷酸一般含有磷酸二酯键，尽管在一些情况下，包括多核苷酸类似物，其可具有替代主链，包含例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或O-甲基亚磷酰胺(O-methylphophoroamidite)键；以及肽多核苷酸主链和键。其他类似多核苷酸包括具有阳性主链；非离子主链和非核糖主链的那些。磷酸核糖主链的修饰可出于多种原因而完成，例如以增加此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期，或作为生物芯片上的探针。可制备天然存在的多核苷酸和类似物的混合物；作为另外一种选择，可制备不同多核苷酸类似物的混合物，以及天然存在的多核苷酸和类似物的混合物。
多种多核苷酸类似物是已知的，包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亚磷酰胺键以及肽多核苷酸主链和键。其他类似多核苷酸包括具有阳性主链；非离子主链和非核糖主链的那些。还包括含一种或多种碳环糖的多核苷酸。
其他类似物包括其为肽多核苷酸类似物的肽多核苷酸。这些主链在中性条件下是基本上非离子的，与天然存在的多核苷酸的高度荷电的磷酸二酯主链形成对比。这可导致优点。首先，肽多核苷酸主链可显示出改善的杂交动力学。对于错配碱基对相对于完全匹配的碱基对，肽多核苷酸在解链温度中具有更大变化。对于内部错配，DNA和RNA通常显示出在解链温度中的2-4℃下降。通过非离子肽-多核苷酸骨架，所述温度下降接近7-9℃。类似地，由于其非离子性质，附着至这些主链的碱基的杂交对盐浓度相对不敏感。另外，肽多核苷酸可不被细胞酶降解或被细胞酶降解至更少程度，并且因此可以是更稳定的。
在所公开的多核苷酸及其片段的用途中有片段作为核酸杂交测定中的探针或用于核酸扩增测定的引物的用途。此类片段一般含有DNA序列的至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个邻接核苷酸。在其它实施例中，DNA片段包含DNA序列的至少约10、15、20、30、40、50或60个或更多个邻接核苷酸。因此，在一个方面，本发明还提供了用于检测编码CLC氯化物通道家族成员的多核苷酸的方法，其包括探针或引物或两者的使用。
影响杂交条件选择的基本参数和设计合适条件的指导由Sambrook,J.,E.F.Fritsch和T.Maniatis(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.) 说明。使用遗传密码的知识与本文描述的氨基酸序列组合，可制备简并寡核苷酸组。此类寡核苷酸可用作例如聚合酶链反应(PCR)中的引物，由此分离且扩增DNA片段。在某些实施例中，简并引物可用作遗传文库的探针。此类文库包括但不限于cDNA文库、基因组文库、以及甚至电子表达序列标签或DNA文库。通过这种方法鉴定的同源序列随后用作探针，以鉴定本文鉴定的序列的同源物。
另外的潜在用途是多核苷酸和寡核苷酸(例如引物或探针)，其在降低的严格条件下(通常为中等严格条件，且通常为高度严格条件下)与如本文所描述的一种或多种多核苷酸杂交。影响杂交条件选择的基本参数和设计合适条件的指导由Sambrook,J.,E.F.Fritsch和T.Maniatis(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.阐述，并且可基于例如多核苷酸的长度或碱基组成，由本领域普通技术人员容易地确定。
一种实现中等严格条件的方法涉及使用预洗涤溶液(所述预洗涤溶液含有5x标准柠檬酸钠、0.5％十二烷基硫酸钠、1.0mM乙二胺四乙酸(pH 8.0))，具有约50％甲酰胺、6x标准柠檬酸钠的杂交缓冲液，和约55℃的杂交温度(或其他相似的杂交溶液，例如含有约50％甲酰胺的杂交溶液，伴随约42℃的杂交温度)，以及在0.5x标准柠檬酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠中，约60℃的洗涤条件。一般地，高度严格条件定义为如上的杂交条件，但使用在大约68℃下的洗涤、0.2x标准柠檬酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠。SSPE(1x SSPE是0.15M氯化钠、10mM磷酸钠和1.25mM乙二胺四乙酸，pH 7.4)可替代杂交和洗涤缓冲液中的标准柠檬酸钠(1x标准柠檬酸钠是0.15M氯化钠和15mM柠檬酸钠)；洗涤在杂交完成后执行15分钟。应当理解的是通过应用控制杂交反应和双链体稳定性的基本原则，可根据需要调整洗涤温度和洗涤盐浓度，以实现所需的严格性程度，如本领域技术人员已知的和下文进一步描述的(参见例如，Sambrook,J.,E.F.Fritsch和T.Maniatis(1989,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y)。当使多核苷酸与未知序列的靶多核苷酸杂交时，杂交物长度假定为杂交多核苷酸的那种。当杂交已知序列的多核苷酸时，可通过比对多核苷酸的序列且鉴定一个或多个最佳序列互补性区域，来确定杂交物长度。长度预期为小于50个碱基对的杂交物的杂交温度应比杂交物的解链温度低5-10℃，其中解链温度根据下述等式进行确定。对于长度小于18 个碱基对的杂交物，解链温度(℃)＝2(A+T碱基数目)+4(G+C碱基数目)。对于长度在18个碱基对以上的杂交物，解链温度(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交物中的碱基数目，并且[Na+]是杂交缓冲液中的钠离子浓度(1x标准柠檬酸钠的[Na+]＝0.165M)。通常，每种此类杂交多核苷酸具有它与之杂交的多核苷酸的长度的至少25％(通常至少50％、60％或70％，且最通常至少80％)长度，并且和它与之杂交的多核苷酸的至少60％的序列同一性(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。
如本领域技术人员应当理解的，线性DNA具有两个可能定向：例如，如果参考序列以5'-至-3'方向放置，并且如果第二序列以5'-至-3'方向置于相同多核苷酸分子/链中，则参考序列和第二序列以相同方向定向，或具有相同定向。通常，启动子序列和处于给定启动子调节下的目的基因以相同定向放置。然而，就以5'-至-3'方向放置的参考序列而言，如果第二序列以3'-至-5'方向置于相同多核苷酸分子/链中，则参考序列和第二序列以反义方向定向，或具有反义定向。如果参考序列(5'-至-3'方向)和参考序列的反向互补序列(以5'-至-3'放置的参考序列)置于相同多核苷酸分子/链中，则就彼此而言具有反义定向的两个序列可替代地可描述为具有相同定向。本文所示的序列以5'-至-3'方向显示。
本文提供的重组构建体可用于转化植物或植物细胞，以便调节蛋白质表达或活性水平。重组多核苷酸构建体可包含编码如本文所描述的一种或多种多核苷酸的多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸可操作地连接至适合于在植物或植物细胞中表达多肽的调节区。因此，多核苷酸可包含编码如本文所描述的多肽的编码序列。蛋白质表达或活性水平在其中被调节植物可包括突变型植物、非天然存在的植物、转基因植物、人造植物或遗传改造的植物。适当地，转基因植物包含已通过重组DNA的稳定整合而改变的基因组。重组DNA包括已在细胞外部遗传改造且构建的DNA，并且包括含有天然存在的DNA或cDNA或合成DNA的DNA。转基因植物可包括由最初转化的植物细胞再生的植物，以及来自经转化的植物的以后世代或杂交的后代转基因植物。适当地，与对照植物相比较，转基因修饰改变本文描述的多核苷酸或多肽的表达或活性。
由重组多核苷酸编码的多肽可以是天然多肽，或对于细胞可以是异源的。在一些情况下，重组构建体含有可操作地连接至调节区，调节表达的多核苷酸。合适调节区的例子在本文中描述。
本发明还提供了含有重组多核苷酸构建体的载体，例如本文所描述的那些。合适的载体主链包括例如本领域常规使用的那些，例如质粒、病毒、人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、或噬菌体人工染色体。合适的表达载体包括但不限于源自例如细菌噬菌体、杆状病毒和逆转录病毒的质粒和病毒载体。众多载体和表达系统是商购可得的。
载体还可包括例如复制起点、支架附着区或标记。标记基因可对植物细胞赋予可选择表型。例如，标记可赋予杀生物剂抗性，例如对抗生素(例如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)、或者除草剂(例如草甘膦、氯磺隆或草胺膦)的抗性。另外，表达载体可包括设计为促进所表达多肽的操纵或检测(例如纯化或定位)的标签序列。标签序列例如萤光素酶、β-葡糖醛酸酶、绿色荧光蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、聚组氨酸、c-myc或血凝素序列，通常作为具有所编码多肽的融合物表达。此类标签可插入多肽内的任何地方，包括在羧基末端或氨基末端处。
植物或植物细胞可通过具有重组多核苷酸整合到其基因组进行转化，以变得稳定转化。本文描述的植物或植物细胞可以是稳定转化的。稳定转化的细胞通常伴随每次细胞分裂保留所引入的多核苷酸。植物或植物细胞还可进行瞬时转化，使得重组多核苷酸不整合到其基因组内。瞬时转化的细胞通常伴随每次细胞分裂丧失所引入的重组多核苷酸的全部或一部分，使得在足够数目的细胞分裂后，所引入的重组多核苷酸无法在子细胞中检测到。
用于转化植物细胞的许多方法是本领域可获得的，所述方法全部在本文中涵盖，包括生物射弹、基因枪技术、土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒载体介导的转化和电穿孔。用于将外源DNA整合到植物染色体内的土壤杆菌属系统已就植物遗传改造进行广泛研究、修饰且探究。包含对应于主题纯化的烟草蛋白质的DNA序列的裸露重组DNA分子，通过常规方法连接至适当的T-DNA序列，所述DNA序列以有义或反义定向可操作地连接至调节序列。通过聚乙二醇技术或电穿孔技术，将这些引入烟草原生质体内，所述两种技术均为标准的。作为另外一种选择，将此类包含重组DNA分子的载体引入活土壤杆菌属细胞内，所述重组DNA分子编码主题纯化的烟草蛋白质，所述活土壤杆菌属细胞随后将DNA转移到烟草植物细胞内。通过裸露DNA而无伴随T-DNA载体序列的转化可经由烟草原生质体与含DNA脂质体的融合或经由电穿孔来完成。不伴随T-DNA载体序列的裸露DNA也可用于经由惰性、高速度微弹转化烟草细胞。
如果细胞或培养的组织用作转化的受体组织，则需要时，通过本领域技术人员已知的技术，可由经转化的培养物再生植物。
待包括在重组构建体中的调节区的选择取决于几个因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、所需表达水平、和细胞或组织优先表达。通过适当选择调节区且相对于编码序列放置调节区，调节编码序列的表达对于本领域技术人员是常规工作。多核苷酸的转录可以相似方式进行调节。一些合适的调节区仅或占优势地在某些细胞类型中起始转录。用于鉴定且表征植物基因组DNA中的调节区的方法是本领域已知的。
合适的启动子包括由组织特异性因子鉴定的组织特异性启动子，所述组织特异性启动子存在于不同组织或细胞类型中(例如根特异性启动子、枝条特异性启动子、木质部特异性启动子)，或存在于不同发育阶段期间，或响应不同环境条件存在。合适的启动子包括组成型启动子，其可在大多数细胞类型中活化，而无需特异性诱导剂。用于控制RNAi多肽生产的合适启动子的例子包括花椰菜花叶病毒35S(CaMV/35S)、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或遍在蛋白或菜豆球蛋白启动子。本领域技术人员能够生成多种变化的重组启动子。
组织特异性启动子是仅在植物发育期间的特异性时间，在特定细胞或组织中(例如在营养组织或生殖组织中)活跃的转录控制元件。例如，当多核苷酸在某些组织中的表达是优选的时，组织特异性表达可以是有利的。在发育控制下的组织特异性启动子的例子包括可仅(或主要仅)在某些组织中起始转录的启动子，所述某些组织例如营养组织，例如根或叶，或者生殖组织，例如果实、胚珠、种子、花粉、雌蕊(pistol)、花或任何胚组织。生殖组织特异性启动子可以是例如花药特异性、胚珠特异性、胚特异性、胚乳特异性、珠被特异性、种子和种皮特异性、花粉特异性、花瓣特异性、萼片特异性或其组合。
合适的叶特异性启动子包括来自C4植物(玉蜀黍)的丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)启动子、来自玉蜀黍的cab-m1Ca+2启动子、拟南芥(Arabidopsis thaliana)myb相关基因启动子(Atmyb5)、二磷酸核酮糖羧化酶(RBCS)启动子(例如，在叶和光生长幼苗中表达的番茄RBCS 1、RBCS2和RBCS3A基因，在发育中的番茄果实中表达的RBCS1和RBCS2，或几乎专一地以高水平在叶片和叶鞘的叶肉细胞中表达的二磷酸核酮糖羧化酶启动子)。
合适的衰老特异性启动子包括在果实催熟、叶枯萎和脱落期间活跃的番茄启动子，编码半胱氨酸蛋白酶的基因的玉蜀黍启动子。可使用合适的花药特异性启动子。可选择本领域技术人员已知的合适的根优先启动子。合适的种子优先的启动子包括种子特异性启动子(在种子发育期间活跃的那些启动子，例如种子贮藏蛋白质的启动子)和种子发芽启动子(在种子发芽期间活跃的那些启动子)。此类种子优先的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)；milps(肌-肌醇-1-磷酸合酶)；mZE40-2，也称为Zm-40；nuclc；和celA(纤维素合酶)。γ-玉米醇溶蛋白是胚乳特异性启动子。Glob-1是胚特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于豆β菜豆球蛋白、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白启动子、22kDa玉米醇溶蛋白启动子、27kDa玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、27kDaγ-玉米醇溶蛋白启动子(例如gzw64A启动子，参见Genbank登记号S78780)、蜡质启动子、shrunken 1启动子、shrunken 2启动子、球蛋白1启动子(参见Genbank登记号L22344)、Itp2启动子、cim1启动子、玉蜀黍end1和end2启动子、nuc1启动子、Zm40启动子、eep1和eep2；lec1、硫氧还蛋白H启动子；mlip15启动子、PCNA2启动子；和shrunken-2启动子。
诱导型启动子的例子包括响应病原体攻击、厌氧条件、温度升高、光、干旱、寒冷温度或高盐浓度的启动子。病原体诱导型启动子包括来自发病机制相关蛋白质(PR蛋白质)的那些，所述发病机制相关蛋白质在通过病原体感染后诱导(例如PR蛋白质、SAR蛋白质、β-1,3-葡聚糖酶、壳多糖酶)。
除植物启动子之外，其他合适的启动子可源自细菌起源(例如章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合成酶启动子及其他源自Ti质粒的启动子)，或可源自病毒启动子(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S RNA 启动子、烟草花叶病毒的组成型启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子、或玄参花叶病毒35S启动子)。
在另一方面，本发明提供了包含多肽序列、由多肽序列组成或基本上由多肽序列组成的经分离的多肽，所述多肽序列与本文描述的序列中的任一种，包括具有序列表中所示的多肽中的任一种的至少60％的序列同一性。适当地，经分离的多肽包含序列、由序列组成或基本上由序列组成，所述序列具有与其的至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明提供了由下列序列编码的多肽：SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。
在另一个实施例中，本发明提供了包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的经分离的多肽，所述序列具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的序列同一性。
在另一个实施例中，本发明提供了包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成的多肽变体，所述氨基酸序列由多核苷酸变体编码，所述多核苷酸变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11具有至少约66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性。
在另一个实施例中，本发明提供了SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的多肽的片段，以及SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的片段，所述片段分别与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:14的相应片段具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％99.9％或100％的序列同一性。
多肽还包括包含与SEQ ID NO:5在SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有足够或基本同一性或相似性程度的序列，以充当CLC氯化物通道家族的成员。一种或多种多肽的片段通常保留全长序列的一些或全部活性。
多肽还包括通过引入任何类型改变(例如，氨基酸的插入、缺失或置换；糖基化状态的变化；影响重折叠或异构化、三维结构或自结合状态的变化)而产生的突变体，所述突变体可以是有意改造或天然分离的，条件是它们仍具有其作为CLC氯化物通道家族成员的功能或活性中的一些或全部。
多肽可采取线性形式或使用已知方法环化。
本发明还公开了具有与由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14编码的多肽的100％的序列同一性，或者包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列具有与由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14提供的100％的序列同一性。
还考虑了SEQ ID NO.5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14的多个组合。这些组合包含SEQ ID NO.5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的任何组合-包括SEQ ID NO:5和SEQID NO:6的组合；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的组合；SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的组合；SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的组合；SEQ ID NO.5、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO.7的组合；SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的组合；SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的组合；SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的组合；SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13 和SEQ ID NO:14的组合；SEQ ID NO.5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO.7、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的组合等。
多肽包括通过引入任何类型改变(例如，氨基酸的插入、缺失或置换；糖基化状态的变化；影响重折叠或异构化、三维结构或自结合状态的变化)而产生的变体，所述变体可以是有意改造或天然分离的。缺失指一个或多个氨基酸从蛋白质中的去除。插入指被引入多肽中的预定位点内的一个或多个氨基酸残基。插入可包含单个或多个氨基酸的序列内插入。置换指多肽的氨基酸由具有相似特性(例如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏a-螺旋结构或β-片层结构的倾向)的其他氨基酸替换。氨基酸置换通常为单个残基，但可以是成簇的，取决于对多肽施加的功能制约，并且范围可为约1至约10个氨基酸。氨基酸置换优选是如下所述的保守氨基酸置换。氨基酸置换、缺失和/或插入可使用肽合成技术例如固相肽合成或通过重组DNA操纵进行制备。用于操纵DNA序列以产生蛋白质的置换、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。变体可具有产生沉默变化且导致功能等价蛋白质的改变。有意的氨基酸置换可在残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和两亲性质中的相似性基础上作出，只要物质的二级结合活性被保留。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值含不带电极性首基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。保守置换可例如根据下表进行。第二列中的相同块和优选第三列中的相同行中的氨基酸可彼此置换：
多肽可以是成熟蛋白质或不成熟蛋白质或源自不成熟蛋白质的蛋白质。多肽可采取线性形式或使用已知方法环化。多肽通常包含至少10、至少20、至少30或至少40个邻接氨基酸。
突变型多肽变体可用于制备包含一种或多种突变型多肽变体的突变型、非天然存在的或转基因植物(例如突变型、非天然存在的、转基因、人造或遗传改造的植物)。适当地，突变型多肽变体保留未突变多肽的活性。与未突变的多肽相比较，突变型多肽变体的活性可更高、更低或大约相同。
本文描述的核苷酸序列和多肽中的突变可包括人造突变或合成突变或遗传改造的突变。本文描述的核苷酸序列和多肽中的突变可以是经由过程获得或可获得的突变，所述过程包括体外或体内操作步骤。本文描述的核苷酸序列和多肽中的突变可以是经由包括人为干预的过程获得或可获得的突变。
本文描述的多肽序列中的突变例子显示于表1中。相应地，进一步方面涉及如表1中所示的突变型多肽。
一个或多个突变可调节所编码多肽的活性。一个或多个突变可调节所编码多肽的活性，使得植物中的硝酸盐水平被调节。一个或多个突变可调节所编码多肽的活性，使得植物中的硝酸盐水平是增加或减少的。一个或多个突变可调节所编码多肽的活性，使得植物(例如烘烤的植物材料)中的NNK水平被调节。一个或多个突变可调节所编码多肽的活性，使得植物(例如烘烤的植物材料)中的NNK水平是增加或减少的。一个或多个突变可调节所编码多肽的活性，使得植物(例如烘烤的植物材料)中的总体TSNA水平被调节。一个或多个突变可调节所编码多肽的活性，使得植物(例如烘烤的植物材料)中的总体TSNA水平是增加或减少的。
在另一个实施例中，所述突变可以改变植物的生物产量。在一个实施例中，烟草NtCLCe-T P184S纯合突变体在每株植物烘烤的叶的生物量生产方面，比类似植物增加了一倍，例如所述突变的杂合型烟草植株和其它CLC突变的纯合型烟草植株。NtCLCe-T P184S纯合型突变株产量大约每个植株150g烘烤的叶，而普通的对照烟草植物是大约80g烘烤的叶。
因此，如本文所述，本发明提供一种含有突变的CLC多肽的植物。在一个实施例中，所述植物包括P184S突变。
某些CLC突变不会影响生物产量。因此本发明包括筛选突变植物以增加生物产量，选择与不包含所述突变的对照植物相比，生物产量至少增加1.5倍的突变，并培养具有理想生物产量的植物。
在生物产量增加的植物中，硝酸盐产量可能改变或不改变。在一个实施例中，与对照植物相比，硝酸盐产量不受到影响。
在一个实施例中，提供了一种筛选生物产量增加的植物的方法，包括筛选生物产量增加的CLC氯通道突变体，以及选择生物产量增加的植物。适当的情况下，产量增加至少1.5倍。适当的情况下，所述突变选自本文所述CLC突变中的一个或更多。
在另一个实施例中，与对照植物相比，CLC突变植物的生物产量可能增加，硝酸盐产量可能减小。因此本发明包括筛选突变植物以增加生物产量，选择与不包含所述突变的对照植物相比，生物产量至少增加1.5倍的突变，筛选选定的突变对硝酸盐的产生进行调节，并选择与对照植物相比硝酸盐产量下降的突变。
503、471、659、566、637、597、711、135、151、690、737、135、163、480、520、514、518、476、739、517、585或677或者其中两个或更多个的组合。在该位置处的一个或多个突变的类型可以是缺失、插入、置换或错义突变或其组合。一个或多个突变可以是杂合或纯合突变，适当地是纯合突变。在一个实施例中，一个或多个突变是置换突变。在一个实施例中，一个或多个置换突变选自G503E、G471R、V659I、S566N、P637S、A597T、P711L、G135R、A151V、G690D、G737R、G135R、G163R、P480S、S520F、A514T、A518V、G476E、R739S、G517E、E585K或V677I或者其中两个或更多个的组合。
514、537、593、749、524、408、503、547、691、478、749、713、550、586、670、678、631、657、737、525、597、674或者其中两个或更多个的组合。在该位置处的一个或多个突变的类型可以是缺失、插入、置换或错义突变或其组合。一个或多个突变可以是杂合或纯合突变，适当地是纯合突变。在一个实施例中，一个或多个突变是置换突变。在一个实施例中，一个或多个置换突变选自A514T、L537F、R593I、A749T、G524D、S408F、G503R、P547S、G691D、A478V、A749V、T713I、M550I、P586S、R670K、R678K、D631N、L657F、G737R、S525L、A597T、E674K或者其中两个或更多个的组合。
在一个实施例中，SEQ ID NO:7包括在选自下述的氨基酸位置处的一个或多个突变：21、58、141、175、5、34、124、40、8、35、30、177、42、88、155、158、170、174、126或131或者其中两个或更多个的组合。在该位置处的一个或多个突变的类型可以是缺失、插入、置换或错义突变或其组合。一个或多个突变可以是杂合或纯合突变，适当地是纯合突变。在一个实施例中，一个或多个突变是置换突变。在一个实施例中，一个或多个置换突变选自E21K、L58F、P141S、G175E、S5N、A34V、M124I、L40F、D8N、C35Y、A30V、A177V、G42D、G88D、G155R、D158N、A170V、A174V、A126V或G131R或者其中两个或更多个的组合。
SEQ ID NO:12中所示的序列对应于SEQ ID NO:7中所示的序列，伴随在5'末端处的额外88个氨基酸。SEQ ID NO:12可包括与SEQ ID NO:7相同的相应突变。109、146、229、263、93、122、212、128、96、123、118、265、130、176、243、246、258、262、214或219或者其中两个或更多个的组合。在该位置处的一个或多个突变的类型可以是缺失、插入、置换或错义突变或其组合。一个或多个突变可以是杂合或纯合突变，适当地是纯合突变。在一个实施例中，一个或多个突变是置换突变。在一个实施例中，一个或多个置换突变选自E109K、L146F、P229S、G263E、S93N、A122V、M212I、L128F、D96N、C123Y、A118V、A265V、G130D、G176D、G243R、D246N、A258V、A262V、A214V或G219R或者其中两个或更多个的组合。
在一个实施例中，SEQ ID NO:13包括在选自下述的氨基酸位置处的一个或多个突变：184、89、166、18、76、173、143、1、4、154、89、128、137或181或者其中两个或更多个的组合。在该位置处的一个或多个突变的类型可以是缺失、插入、置换或错义突变或其组合。一个或多个突变可以是杂合或纯合突变，适当地是纯合突变。在一个实施例中，一个或多个突变是置换突变。在一个实施例中，一个或多个置换突变选自P184S、G89D、K166N、G18R、G76R、G173R、P143L、M1I、S4N、V154I、G89D、A128V、S137F或G181S或者其中两个或更多个的组合。
SEQ ID NO:14中所示的序列对应于SEQ ID NO:13中所示的序列，伴随在5'末端处的额外88个氨基酸。272、177、254、106、164、261、231、89、92、242、177、269或225或者其中两个或更多个的组合。在该位置处的一个或多个突变的类型可以是缺失、插入、置换或错义突变或其组合。一个或多个突变可以是杂合或纯合突变，适当地是纯合突变。在一个实施例中，一个或多个突变是置换突变。在一个实施例中，一个或多个置换突变选自P272S、G177D、K254N、G106R、G164R、G261R、P231L、M89I、S92N、V242I、G177D、A269V、S225F或G269S或者其中两个或更多个的组合。
适当地，突变是在SEQ ID NO:5的位置G163处的突变。适当地，突变是在SEQ IDNO:5的位置G163处的纯合突变。适当地，突变是置换突变。适当地，所述置换突变是G163R。适当地，所述突变是位于G163R的纯合型置换突变。当包含该突变的多肽在突变型植物中表达时，突变型植物中的硝酸盐水平在早晨和半晌午期间低于对照植物。相应突变可在SEQID NO:14中制备，所述SEQ ID NO:14对应于SEQ ID NO:7的序列，伴随在其5'末端处的另外的氨基酸。
适当地，突变是在SEQ ID NO:5的位置G163处的突变。适当地，所述置换突变是G163R。适当地，所述突变是位于G163R的纯合型置换突变。这种突变可以减少包含此突变的植物的硝酸盐水平。与对照植物相比较，G163R纯合突变型烟草植物在早晨具有降低的硝酸盐水平。硝酸盐水平从对照植物中的约11mg/g降低到突变型植物中的约6mg/g。硝酸盐水平在半晌午继续减少。硝酸盐水平从对照植物中的约7mg/g降低到突变型植物中的约4.5mg/g。到上午晚些时候，硝酸盐水平与半晌午相比较在突变型植物中已增加，并且达到早晨存在的硝酸盐水平。关于对照，对照植物中的硝酸盐水平继续减少。到上午晚些时候，硝酸盐水平在突变型植物中增加至约6mg/g，并且在对照植物中减少至约3mg/g。尼古丁水平在上午期间略微相似。尼古丁水平对于突变型植物在约13mg/g和约11mg/g之间变化，并且对于对照植物在约9mg/g和约13mg/g之间变化。尼古丁结果指示突变型植物的代谢是正常的。突变型植物和对照植物的生物量水平也是可比较的。
适当地，突变是在SEQ ID NO:13的位置P143处的突变。适当地，所述置换突变是P143L。适当地，所述突变是位于P143L的纯合型置换突变。这种突变可以增加包含此突变的植物的硝酸盐水平。与对照植物相比较，P143L纯合突变型烟草植物在早晨具有增加的硝酸盐水平。硝酸盐水平从对照植物中的约7mg/g增加到突变型植物中的约14mg/g。硝酸盐水平在半晌午在突变型植物中减少，并且在对照植物中轻微增加。突变型植物中的硝酸盐水平降低至约9mg/g，并且对照植物中的硝酸盐水平增加至约9mg/g。到上午晚些时候，硝酸盐水平与半晌午相比较在突变型植物中已继续减少。关于对照，对照植物中的硝酸盐水平减少。到上午晚些时候，硝酸盐水平在突变型植物中减少至约2mg/g，并且在对照植物中减少至约4mg/g。对于突变型和对照植物各自，尼古丁水平在上午期间略微相似。尼古丁水平对于突变型植物在约20mg/g和约24mg/g之间变化，并且对于对照植物在约15mg/g和约17mg/g之间变化。尼古丁结果指示突变型植物的代谢是正常的。突变型植物和对照植物的生物量水平也是可比较的。
硝酸盐代谢中的昼夜调节是已知的，且已得到深入研究(参见Stitt&KrappPlant,Cell and Environment 22,583 621(1999))。在充满氮的植物中，硝酸盐还原酶的转录物水平在晚上结束时很高，在白天期间急剧下降，并且在夜间恢复。NIA活性在光周期的第一部分增加三倍，在光周期的第二部分期间减少，且在夜间保持很低。在照射后的NIA活性的增加是由于NIA蛋白质的增加。
本发明还公开了用于调节烟草植物或其植物部分中的硝酸盐、总TSNA含量或NNK水平的方法，所述方法包括下述步骤：(i)将在本文所述一种或多种多核苷酸序列的至少一个等位基因内的一个或多个突变引入所述植物的基因组内；和(ii)获得突变型植物，其中与对照相比较，所述突变调节所述多核苷酸序列的表达或由其编码的多肽的活性，并且烟草植物或其植物部分具有调节水平的硝酸盐和/或总TSNA含量和/或NNK。在某些实施例中，烟草植物或其植物部分是烘烤的植物材料。
用于制备突变体的过程是本领域众所周知的，并且可包括使用外源添加的化学品的诱变，所述化学品例如致诱变、致畸或致癌有机化合物，例如甲磺酸乙酯(EMS)，其在遗传材料中产生随机突变。通过进一步示例的方式，该过程可包括一个或多个遗传改造步骤-例如本文所描述的遗传改造步骤中的一个或多个或其组合。通过进一步示例的方式，该过程可包括一个或多个植物杂交步骤。TILLING还可如本文其他地方描述的使用。
多肽可通过在适合表达多肽的培养条件下培养经转化的或重组宿主细胞进行制备。所得到的表达多肽随后可使用已知的纯化过程由此类培养物进行纯化。多肽的纯化可包括含有与多肽结合的试剂的亲和柱；一个或多个在此类亲和树脂上的柱步骤；一个或多个涉及疏水作用层析的步骤；或免疫亲和层析。作为另外一种选择，多肽还可以促进纯化的形式表达。例如，它可作为融合多肽表达，例如麦芽糖结合多肽、谷胱甘肽-5-转移酶或硫氧还蛋白的那些。用于融合多肽的表达和纯化的试剂盒是商购可得的。多肽可用表位加上标签，并且随后通过使用针对此类表位的特异性抗体纯化。一个或多个液相层析步骤-例如反相高效液相层析可用于进一步纯化多肽。以多个组合的前述纯化步骤中的一些或全部可用于提供基本上同质的重组多肽。因此纯化的多肽可基本上不含其他多肽，并且在本文中定义为“基本上纯化的多肽”；此类纯化的多肽包括多肽、片段、变体等等。多肽和片段的表达、分离和纯化可通过任何合适技术实现，所述合适技术包括但不限于本文描述的方法。
还能够利用亲和柱例如针对多肽生成的单克隆抗体，以亲和纯化所表达的多肽。这些多肽可使用常规技术，例如在高盐洗脱缓冲液中，从亲和柱中取出，且随后透析到更低盐的缓冲液内用于使用，或取决于利用的亲和基质，通过改变pH或其他组分，或使用天然存在的亲和部分的底物竞争性取出。
多肽还可通过已知的常规化学合成来产生。通过合成方法用于构建多肽或其片段的方法是本领域技术人员已知的。由于与天然多肽共享一级、二级或三级结构或构象特征，合成构建的多肽序列可具有与之共同的生物特性，包括生物活性。
如本文使用的，术语‘非天然存在的’描述并非天然形成或在自然界中不存在的实体(例如多核苷酸、基因突变、多肽、植物、植物细胞和植物材料)。可通过本文描述或本领域已知的方法，制备、合成、起始、修饰、干预或操纵此类非天然存在的实体或人工实体。可由人制备、合成、起始、修饰、干预或操纵此类非天然存在的实体或人工实体。因此，例如，非天然存在的植物、非天然存在的植物细胞或非天然存在的植物材料，可使用传统植物育种技术(例如回交)或通过遗传操纵技术(例如反义RNA、干扰RNA、大范围核酸酶等等)进行制备。通过进一步示例的方式，可通过第一植物或植物细胞基因渗入第二植物或植物细胞(其自身可为天然存在的)内，或通过将一个或多个遗传突变(例如一种或多种多态性)从第一植物或植物细胞转移到第二植物或植物细胞内，来制备非天然存在的植物、非天然存在的植物细胞或非天然存在的植物材料，使得所得到的植物、植物细胞或植物材料或其后代包含并非天然形成或在自然界中不存在的遗传组成(例如基因组、染色体或其区段)。所得到的植物、植物细胞或植物材料因此是人工的或非天然存在的。相应地，可通过修饰第一天然存在的植物或植物细胞中的遗传序列，来制备人工的或非天然存在的植物或植物细胞，即使所得到的遗传序列在第二植物或植物细胞中天然存在，所述第二植物或植物细胞包含与第一植物或植物细胞不同的遗传背景。在某些实施例中，突变是非天然存在的突变，其天然存在于核苷酸序列或多肽(例如基因或蛋白质)中。
遗传背景中的差异可通过表型差异或本领域已知的分子生物学技术进行检测，所述分子生物学技术例如核酸测序、遗传标记(例如微卫星RNA标记)的存在或不存在。
本发明还提供了与本文描述的多肽免疫反应的抗体。如本文所描述的，多肽、片段、变体、融合多肽等等可用作生产与之免疫反应的抗体中的“免疫原”。此类抗体可经由抗体的抗原结合位点与多肽特异性结合。特异性结合抗体是特异性鉴定且结合多肽、同源物和变体，而不是其他分子的那些。在一个实施例中，抗体对于具有与如本文所示的氨基酸序列的多肽是特异性的，并且不与其它多肽交叉反应。
更具体而言，多肽、片段、变体、融合多肽等等含有引发抗体形成的抗原决定簇或表位。这些抗原决定簇或表位可以是线性的或构象的(不连续的)。线性表位由多肽的单个氨基酸区段组成，而构象或不连续表位由来自多肽链的不同区域的氨基酸区段组成，所述氨基酸区段在多肽折叠后达到紧密接近。表位可通过本领域已知的方法中的任一种进行鉴定。另外，来自多肽的表位可用作测定中的研究试剂，且纯化来自物质例如多克隆血清或来自培养杂交瘤的上清液的特异性结合抗体。此类表位或其变体可使用本领域已知的技术或使用重组DNA技术产生，所述本领域已知的技术例如固相合成、多肽的化学或酶促切割。
针对多肽的多克隆抗体和单克隆抗体两者均可通过常规技术进行制备。本文还考虑了产生对于多肽特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。此类杂交瘤可通过常规技术进行生产且鉴定。对于抗体生产，多种宿主动物可通过用多肽、其片段、变体或突变体注射进行免疫接种。仅举几个例子，此类宿主动物可包括但不限于兔、小鼠和大鼠。多种佐剂可用于增加免疫应答。取决于宿主物种，此类佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、普鲁兰尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚，以及潜在有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。单克隆抗体可通过常规技术进行回收。此类单克隆抗体可具有任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD，及其任何亚类。
抗体还可用于测定中，以在体外或体内检测多肽或片段的存在。抗体还可用于通过免疫亲和层析纯化多肽或片段。
可干扰一种或多种内源基因的转录的序列特异性多核苷酸；可干扰RNA转录物转译的序列特异性多核苷酸(例如双链RNA、siRNA、核酶)；可干扰一种或多种蛋白质的稳定性的序列特异性多肽；可干扰一种或多种蛋白质的酶促活性或者一种或多种蛋白质就底物或调节蛋白质而言的结合活性的序列特异性多核苷酸；显示出对于一种或多种蛋白质的特异性的抗体；可干扰一种或多种蛋白质的稳定性、或者一种或多种蛋白质的酶促活性、或者一种或多种蛋白质的结合活性的小分子化合物；结合一种或多种多核苷酸的锌指蛋白；以及具有针对一种或多种多核苷酸的活性的大范围核酸酶。基因编辑技术、遗传编辑技术和基因组编辑技术是本领域众所周知的。
一种基因编辑方法涉及转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-like effector nuclease)(TALEN)的使用，所述TALEN诱导细胞可以修复机制响应的双链断裂。非同源末端连接使来自双链断裂任一侧的DNA再连接，其中存在很少的序列重叠或无序列重叠用于退火。该修复机制经由插入或缺失、或染色体重排诱导基因组中的误差。任何此类误差可致使在该位置处编码的基因产物无功能。
另一种基因编辑方法涉及细菌CRISPR/Cas系统的使用。细菌和古细菌显示出称为规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromicrepeat)(CRISPR)的染色体元件，所述CRISPR是适应性免疫系统的一部分，所述适应性免疫系统保护不受侵袭性病毒和质粒DNA。在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA(crRNA)与反式激活crRNA(tracrRNA)和CRISPR相关(Cas)蛋白质起作用，以在靶DNA中引入双链断裂。通过Cas9的靶切割要求在crRNA和tracrRNA之间的碱基配对，以及在crRNA和靶DNA之间的碱基配对。靶鉴定通过称为原型间隔序列毗邻基序(protospacer-adjacent motif)(PAM)的短基序的存在得到促进，所述PAM符合序列NGG。该系统可用于基因组编辑。Cas9通常通过双重RNA按程序工作，所述双重RNA由crRNA和tracrRNA组成。然而，这些RNA的核心组分可组合成单一杂交物‘引导RNA’用于Cas9靶向。对靶DNA使用非编码RNA引导用于位点特异性切割有希望比现有技术(例如TALEN)明显更直截了当。使用CRISPR/Cas策略，再靶向核酸酶复合物仅要求引入新RNA序列，并且不存在再改造蛋白质转录因子的特异性的需要。将待阻遏的基因的多核苷酸克隆且可操作地连接至调节区和转录终止序列，使得RNA的反义链被转录。重组构建体随后转化到植物内，并且产生RNA的反义链。多核苷酸无需是待阻遏基因的整个序列，但通常与待阻遏基因的有义链的至少一部分基本上互补。
多核苷酸可转录成核酶，或催化RNA，其影响mRNA的表达。核酶可设计为与基本上任何靶RNA特异性配对，且切割在特定位置处的磷酸二酯主链，由此使靶RNA功能失活。异源多核苷酸可编码设计为切割特定mRNA转录物的核酶，从而阻止多肽的表达。锤头状核酶可用于破坏特定mRNA，尽管可使用切割在位点特异性鉴定序列处的mRNA的多种核酶。锤头状核酶在由侧翼区指示的位置处切割mRNA，所述侧翼区与靶mRNA形成互补碱基对。唯一要求是靶RNA含有5'-UG-3'核苷酸序列。锤头状核酶的构建和产生是本领域已知的。锤头状核酶序列可嵌入稳定RNA例如转移RNA(tRNA)内，以增加体内切割效率。
在一个实施例中，可干扰一种或多种RNA转录物转译的序列特异性多核苷酸是干扰RNA。RNA干扰或RNA沉默是进化上保守的过程，特异性mRNA通过其可被靶向用于酶促降解。一种双链RNA(双链RNA)通过细胞(例如双链RNA病毒、或干扰RNA多核苷酸)引入或产生，以起始干扰RNA途径。双链RNA可通过RNA酶III而转换成长度21-23bp的多重小干扰RNA双链体，所述RNA酶III是双链RNA特异性核酸内切酶。小干扰RNA随后可由RNA诱导沉默复合物鉴定，所述RNA诱导沉默复合物促进通过ATP依赖性过程的小干扰RNA的解旋。小干扰RNA的解旋的反义链将活化RNA诱导沉默复合物导向靶向mRNA，所述靶向mRNA包含与小干扰RNA反义链互补的序列。靶向mRNA和反义链可形成A形螺旋，并且A形螺旋的大沟可由活化RNA诱导沉默复合物鉴定。可在由小干扰RNA链的5'末端的结合位点限定的单个位点处，通过活化RNA诱导沉默复合物切割靶mRNA。活化RNA诱导沉默复合物可再循环，以催化另一切割事件。
干扰RNA表达载体可包含编码干扰RNA多核苷酸的干扰RNA构建体，其通过降低mRNA、mRNA前体或相关RNA变体的表达水平，显示出RNA干扰活性。表达载体可包含置于干扰RNA构建体上游，且可操作地连接至干扰RNA构建体的启动子，如本文进一步描述的。干扰RNA表达载体可包含合适的最小核心启动子、目的干扰RNA构建体、上游(5')调节区、下游(3')调节区，包括转录终止和多腺苷酸化信号，以及其他本领域技术人员已知的序列，例如多种选择标记。
多核苷酸可以多种形式产生，包括作为双链结构(即，包含反义链和互补有义链的双链RNA分子)、双链发夹样结构、或单链结构(即，仅包含反义链的ssRNA分子)。结构可包含具有自互补的有义链和反义链的双链体、不对称双链体、发夹或不对称的发夹二级结构。双链干扰RNA可酶促转换为双链小干扰RNA。小干扰RNA双链体的链之一可对靶mRNA和相关RNA变体内的互补序列退火。小干扰RNA/mRNA双链体由RNA诱导沉默复合物鉴定，所述RNA诱导沉默复合物可以序列依赖性方式切割在多个位点处的RNA，从而导致靶mRNA和相关RNA变体的降解。
双链RNA分子可包括以茎环结构由单个寡核苷酸装配的小干扰RNA分子，其中借助于一种或多种基于多核苷酸或基于非多核苷酸的接头，连接小干扰RNA分子的自互补的有义区和反义区；以及具有两个或更多个环结构和包含自互补的有义链和反义链的茎的环状单链RNA，其中所述环状RNA可在体内或体外加工，以生成能够调节干扰RNA的活性小干扰RNA分子。
还考虑了小发夹RNA分子的使用。它们包含通常由间隔物或环序列分开的，特异性反义序列加上反向互补体(有义)序列。间隔物或环的切割提供了单链RNA分子及其反向互补体，使得它们可退火以形成双链RNA分子(任选具有另外的加工步骤，其可导致来自任一或两条链的3'末端或5'末端的一个、两个、三个或更多个核苷酸的添加或去除)。间隔物可具有足够长度，以在间隔物切割(和任选地，可导致来自任一或两条链的3'末端或5'末端的一个、两个、三个、四个或更多个核苷酸的添加或去除的后续加工步骤)之前，允许反义和有义序列退火且形成双链结构(或茎)。间隔物序列通常为位于两个互补的核苷酸序列区域之间的无关核苷酸序列，当退火成双链多核苷酸时，所述两个互补的核苷酸序列区域含有小发夹RNA。间隔物序列一般包含约3至约100个核苷酸。
可通过选择用于生产发夹双链体的合适序列组成、环大小和茎长，生产任何目的RNA多核苷酸。用于设计发夹双链体的茎长的合适范围包括至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的茎长，例如约14-30个核苷酸、约30-50个核苷酸、约50-100个核苷酸、约100-150个核苷酸、约150-200个核苷酸、约200-300个核苷酸、约300-400个核苷酸、约400-500个核苷酸、约500-600个核苷酸、以及约600-700个核苷酸。用于设计发夹双链体的环长的合适范围包括约4-25个核苷酸、约25-50个核苷酸或更长的环长，如果发夹双链体的茎长是重要的。在某些实施例中，双链RNA或ssRNA分子长度在约15和约40个核苷酸之间。在另一个实施例中，小干扰RNA分子是长度在约15和约35个核苷酸之间的双链RNA或ssRNA分子。在另一个实施例中，小干扰RNA分子是长度在约17和约30个核苷酸之间的双链RNA或ssRNA分子。在另一个实施例中，小干扰RNA分子是长度在约19和约25个核苷酸之间的双链RNA或ssRNA分子。在另一个实施例中，小干扰RNA分子是长度在约21至约23个核苷酸之间的双链RNA或ssRNA分子。在某些实施例中，具有长于21个核苷酸的双链区的发夹结构可促进有效的小干扰RNA指导的沉默，与环序列和长度无关。RNA干扰的示例性序列在SEQ ID NO:8或9.
靶mRNA序列通常长度为约14至约50个核苷酸。约2:1-约1:2的A+T/G+C比；在靶序列的5'末端处的AA二核苷酸或CA二核苷酸；对靶mRNA独特的至少10个连续核苷酸的序列(即，序列不存在于来自相同植物的其他mRNA序列中)；以及不超过三个连续鸟嘌呤(G)核苷酸或超过三个连续胞嘧啶(C)核苷酸的“运行”。这些标准可使用本领域已知的多种技术进行评价，例如计算机程序例如BLAST可用于搜索可公开获得的数据库，以确定所选择的靶序列是否对靶mRNA独特。作为另外一种选择，使用商购可得的计算机软件(例如商购可得的OligoEngine、Target Finder和小干扰RNA Design Tool)，可选择靶序列(和设计的小干扰RNA序列)。
在一个实施例中，选择满足上述标准中的一个或多个，长度在约14和约30个核苷酸之间的靶mRNA序列。在另一个实施例中，选择满足上述标准中的一个或多个，长度在约16和约30个核苷酸之间的靶序列。在进一步的实施例中，选择满足上述标准中的一个或多个，长度在约19和约30个核苷酸之间的靶序列。在另一个实施例中，选择满足上述标准中的一个或多个，长度在约19和约25个核苷酸之间的靶序列。
在示例性实施例中，小干扰RNA分子包含特异性反义序列，其与本文所述多核苷酸序列中的任何一个的至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个邻接核苷酸互补。
由小干扰RNA分子包含的特异性反义序列可与靶序列的互补体相同或基本上相同。在一个实施例中，由小干扰RNA分子包含的特异性反义序列与靶mRNA序列的互补体至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。确定的序列同一性的方法是本领域已知的，并且可例如通过使用University of Wisconsin Computer Group(GCG)软件的或NCBI网站上提供的BLASTN程序进行确定。
通过在一个、两个、三个或四个核苷酸处与靶mRNA的序列不同(例如，通过核苷酸置换，包括转换或颠换)，小干扰RNA分子的特异性反义序列可显示出变化性。当此类核苷酸置换存在于双链RNA分子的反义链中时，在有义链中置换核苷酸通常与之形成氢键碱基配对的互补核苷酸可相应地置换或不置换。还考虑了双链RNA分子，其中一种或多种核苷酸置换在有义序列而不是反义链中发生。如上所述，当小干扰RNA分子的反义序列包含在小干扰RNA的核苷酸序列和靶核苷酸序列之间的一个或多个错配时，错配可在反义序列的3'末端、5'末端或中心部分发现。
在另一个实施例中，小干扰RNA分子包括特异性反义序列，在严格条件下，所述特异性反义序列能够与天然存在的靶基因或靶mRNA的一部分选择性杂交。如本领域普通技术人员已知的，可通过改变用于杂交和洗涤步骤的时间、温度或溶液浓度，来实现杂交条件的严格性中的变化。合适条件还可部分取决于使用的具体核苷酸序列，例如靶mRNA或基因的序列。
一种用于在植物中引入双链RNA沉默的方法是用产生发夹RNA的基因构建体的转化(参见Smith等人(2000)Nature,407,319-320)。此类构建体包含由适当间隔物分开的，靶基因序列的倒转区。由于内含子剪接的发夹RNA的生成，功能植物内含子区作为间隔物片段的插入另外增加基因沉默诱导的效率(Wesley et al.(2001)Plant J.,27,581-590)。适当地，茎长为约50个核苷酸至约1千个碱基长度。用于生成内含子沉默发夹RNA的方法在本领域中充分描述(参见例如Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry(2008)72,2,615-617)。
具有双链体或双链结构的干扰RNA分子，例如双链RNA或小发夹RNA可具有平端，或可具有3'或5'突出端。如本文使用的，“突出端”指一个或多个不成对的核苷酸，当一个RNA链的3'末端延伸超出另一条链的5'末端(3'突出端)，或反之亦然(5'突出端)时，所述不成对的核苷酸由双链体结构突出。包含突出端的核苷酸可为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰形式。在一个实施例中，干扰RNA分子的至少一条链具有长度约1至约6个核苷酸的3'突出端。在其它实施例中，3'突出端长度为约1至约5个核苷酸、约1至约3个核苷酸、以及约2至约4个核苷酸。
当干扰RNA分子包含在分子的一个末端处的3'突出端时，另一个末端可为平端的或也具有突出端(5'或3')。当干扰RNA分子包含在分子的两个末端处的突出端时，突出端的长度可以是相同的或不同的。在一个实施例中，干扰RNA分子包含在分子的两个末端处约1至约3个核苷酸的3'突出端。在进一步的实施例中，干扰RNA分子是在分子的两个末端处具有2个核苷酸的3'突出端的双链RNA。在另外一个实施例中，干扰RNA的突出端包含的核苷酸是TT二核苷酸或UU二核苷酸。
当确定包含一个或多个突出端的干扰RNA分子与靶mRNA序列的同一性百分比时，一个或多个突出端可加以考虑或不加以考虑。例如，来自3'突出端的核苷酸以及来自双链的5'或3'末端的最高达2个核苷酸可进行修饰，而无小干扰RNA分子活性的明显丧失。
干扰RNA分子可包含一个或多个5'或3'帽状结构。干扰RNA分子可包含在干扰RNA分子的有义链、反义链、或有义链和反义链两者的3'末端处；或者在有义链、反义链、或有义链和反义链两者的5'末端处的帽状结构。作为另外一种选择，干扰RNA分子可包含在干扰RNA分子的3'末端和5'末端两者处的帽状结构。术语“帽状结构”指在寡核苷酸的任一末端处掺入的化学修饰，这使分子免于核酸外切酶降解，并且还可促进在细胞内的递送或定位。
另一种可应用于干扰RNA分子的修饰是干扰RNA分子与一个或多个部分或缀合物的化学连接，这增强干扰RNA分子的活性、细胞分布、细胞摄取、生物利用度或稳定性。多核苷酸可通过本领域充分确定的方法进行合成或修饰。化学修饰可包括但不限于2'修饰、非天然碱基的引入、与配体的共价附着、以及用硫代磷酸酯键替换磷酸酯键。在该实施例中，双链体结构的完整性通过至少一个，且通常为两个化学键得到加强。化学连接可通过多种众所周知技术中的任一种实现，例如通过引入共价、离子或氢键；疏水作用、范德华力或堆积相互作用；借助于金属离子配位，或通过使用嘌呤类似物。
在两条单链之一或两者处的核苷酸可进行修饰，以调节细胞酶例如但不限于某些核酸酶的活性。用于降低或抑制细胞酶活化的技术是本领域已知的，包括但不限于2'-氨基修饰、2'-氟修饰、2'-烷基修饰、不带电的主链修饰、吗啉代修饰、2'-O-甲基修饰和氨基磷酸酯。因此，双链RNA上的核苷酸的至少一个2'-羟基替换为化学基团。另外，至少一个核苷酸可进行修饰，以形成锁核苷酸。此类锁核苷酸含有连接核糖的2'-氧与核糖的4'-碳的亚甲基或亚乙基桥。锁核苷酸引入寡核苷酸内改善互补序列的亲和力，且使解链温度增加几度。
配体可缀合至干扰RNA分子，例如以增强其细胞吸收。在某些实施例中，疏水配体缀合至分子，以促进细胞膜的直接渗透。这些方法已用于促进反义寡核苷酸的细胞渗透。在某些情况下，阳离子配体与寡核苷酸的缀合通常导致对核酸酶的抗性改善。阳离子配体的代表性例子包括丙铵和二甲基丙铵。当阳离子配体分布遍及寡核苷酸时，反义寡核苷酸可保留其与mRNA的高结合亲和力。
本文描述的分子和多核苷酸可使用众所周知的固相合成技术进行制备。可另外或可替代地采用本领域已知的用于此类合成的任何其他方法。
“靶向诱导基因组局部损伤(Targeted Induced Local Lesions In Genomes)”(TILLING)是另一种诱变技术，其可用于生成和/或鉴定编码具有经修饰的表达和/或活性的多肽的多核苷酸。TILLING还允许选择携带此类突变体的植物。TILLING组合高密度诱变与高流通量筛选方法。用于TILLING的方法是本领域所众所周知的(参见McCallum等人.,(2000)Nat Biotechnol 18:455-457和Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2):145-50)。
多个实施例涉及包含本文描述的多核苷酸中的一种或多种或者一种或多种干扰RNA构建体的表达载体。
多个实施例涉及包含本文描述的多核苷酸中的一种或多种或者一种或多种干扰RNA构建体的表达载体。
(a)本文描述的多核苷酸中的一种或多种；(b)编码间隔物元件的第二序列，所述间隔物元件形成发夹结构的环；和(c)包含置于与第一序列相同的定向、第一序列的反向互补序列的第三序列，其中所述第二序列置于第一序列和第三序列之间，并且第二序列可操作地连接至第一序列和第三序列。
所公开的序列可用于构建不形成发夹结构的多种多核苷酸。(1)通过可操作地连接至第一启动子，来转录DNA的第一条链，和(2)通过可操作地连接至第二启动子，来转录DNA片段的第一条链的反向互补序列。多核苷酸的每条链可由相同表达载体或不同表达载体转录。具有RNA干扰活性的RNA双链体可酶促转换为小干扰RNA，以调节RNA水平。
(a)本文描述的多核苷酸中的一种或多种；和(b)包含置于与第一序列相同的定向、第一序列的互补(例如反向互补)序列的第二序列。
本发明提供了通过促进基因表达的共抑制，用于调节本文所述多肽中的一种或多种(或如本文所描述的其任何组合)的内源表达水平的多种组合物和方法。由于将转基因的多个拷贝引入植物细胞宿主内，发生共抑制现象。转基因的多个拷贝的整合可导致转基因和靶向内源基因的调节表达。共抑制程度取决于靶基因和靶向内源基因之间的序列同一性程度。内源基因和靶基因两者的沉默均可通过沉默基因座(即内源启动子和内源目的基因)的广泛甲基化而发生，所述广泛甲基化可阻碍转录。作为另外一种选择，在一些情况下，内源基因和转基因的共抑制可通过转录后基因沉默而发生，其中可产生转录物，但增强的降解速率阻碍转录物的累积。通过转录后基因沉默的共抑制机制被认为类似RNA干扰，因为RNA看起来是这些过程中的重要起始子和靶，并且可至少部分地通过相同分子机制、可能通过RNA指导的mRNA降解进行介导。
可通过将核酸或其片段的多个拷贝作为转基因整合到目的植物的基因组内，来实现核酸的共抑制。宿主植物可用表达载体进行转化，所述表达载体包含可操作地连接至核酸或其片段的启动子。多个实施例涉及用于促进内源基因的共抑制的表达载体，所述内源基因包含可操作地连接至多核苷酸的启动子。
多个实施例涉及通过将一种或多种多核苷酸的多个拷贝整合到(烟草)植物基因组内，用于调节本文描述的多核苷酸中的一种或多种(或如本文所描述的其任何组合)的表达水平的方法，其包括：用表达载体转化植物细胞宿主，所述表达载体包含可操作地连接至多核苷酸的启动子。
本发明提供了通过调节mRNA的转译用于调节内源基因表达水平的多种组合物和方法。可操作地连接至多核苷酸的启动子，所述多核苷酸以就启动子而言的反义定向放置，以允许与mRNA的一部分具有序列互补性的RNA多核苷酸的表达。
用于调节mRNA转译的多种表达载体可包含：可操作地连接至多核苷酸的启动子，其中序列以就启动子而言的反义定向放置。反义RNA多核苷酸的长度可改变，并且可为约15-20个核苷酸、约20-30个核苷酸、约30-50个核苷酸、约50-75个核苷酸、约75-100个核苷酸、约100-150个核苷酸、约150-200个核苷酸、以及约200-300个核苷酸。
本发明还提供了用于获得突变型多核苷酸和多肽的方法。任何目的植物包括植物细胞或植物材料，可通过多种已知诱导诱变的方法进行遗传修饰，所述方法包括定点诱变、寡核苷酸指导的诱变、化学诱导的诱变、辐射诱导的诱变、利用经修饰的碱基的诱变、利用缺口双链体DNA的诱变、双链断裂诱变、利用修复缺陷型宿主株的诱变、通过全基因合成的诱变、DNA改组及其他等价方法。
作为另外一种选择，可通过将转座子(例如IS元件)引入目的植物的基因组内，靶向基因以灭活。这些活动基因元件可通过伴性异花受精而引入，并且可就蛋白质活性的丧失筛选插入突变体。通过例如伴性异花受精，通过使亲本植物与未实施转座子诱导诱变的植物杂交，可将亲本植物中的破坏基因引入其他植物内。可利用本领域技术人员已知的任何标准育种技术。在一个实施例中，可通过插入一个或多个转座子灭活一种或多种基因。突变可导致一种或多种基因的纯合破坏，一种或多种基因的杂合破坏，或如果破坏超过一种基因，则可导致纯合和杂合破坏两者的组合。合适的可转座元件包括反转录转座子、反转座子和SINE样元件。此类方法是本领域技术人员已知的。
作为另外一种选择，可通过将源自许多小环状RNA的核酶引入植物中，靶向基因以灭活，所述小环状RNA能够自切割和复制。这些RNA可单独复制(类病毒RNA)或伴随辅助病毒(卫星RNA)而复制。合适RNA的例子包括源自鳄梨日斑病类病毒的那些，以及源自烟草环斑病毒、苜蓿短暂条纹病毒、绒毛烟草斑驳病毒、茄属植物斑驳病毒和地下三叶草斑驳病毒的卫星RNA。多种靶RNA特异性核酶是本领域技术人员已知的。
在一些实施例中，多肽的表达通过非转基因方法进行调节，例如在基因中制备突变。在基因序列中随机引入突变的方法可包括化学诱变、EMS诱变和辐射诱变。将一个或多个靶向突变引入细胞内的方法包括但不限于基因组编辑技术，特别是锌指核酸酶介导的诱变、tilling (靶向诱导基因组局部损伤)、同源重组、寡核苷酸指导的诱变和大范围核酸酶介导的诱变。
突变的一些非限制性例子是至少一个核苷酸的缺失、插入和错义突变，单核苷酸多态性和简单序列重复。在突变后，可执行筛选，以鉴定产生提前终止密码子或以其他方式无功能的基因的突变。在突变后，可执行筛选以鉴定产生功能基因的突变，所述功能基因能够以升高水平表达。可通过测序或使用对于基因或蛋白质特异性的一个或多个探针或引物，进行突变体的筛选。还可制备多核苷酸中的特异性突变，其可导致调节的基因表达、mRNA的稳定性调节、或蛋白质的稳定性调节。此类植物在本文中被称为“非天然存在的”或“突变型”植物。通常，突变型或非天然存在的植物包括外源或合成或人造核酸(例如DNA或RNA)的至少一部分，其在被操纵前不存在于植物中。外源核酸可以是单个核苷酸、两个或更多个核苷酸、两个或更多个邻接核苷酸、或者两个或更多个不邻接核苷酸-例如至少10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500个或更多个邻接或不邻接核苷酸。
突变型或非天然存在的植物可具有一个或多个突变的任何组合，所述一个或多个突变导致调节的蛋白质水平。例如，突变型或非天然存在的植物可具有单个基因中的单个突变；单个基因中的多个突变；两种或更多种或者三种或更多种基因中的单个突变；或者两种或更多种或者三种或更多种基因中的多个突变。通过进一步示例的方式，突变或非天然存在的植物可以在基因的特定部分中具有一个或多个突变，例如在编码蛋白质的活性位点的基因的区域中，或其一部分中。通过进一步示例的方式，突变或非天然存在的植物可在一个或多个基因之外的区域中具有一个或多个突变，例如在其调节的基因的上游或下游的区域中，只要它们调节基因的活性或表达。上游元件可包括启动子、增强子或转录因子。一些元件例如增强子可置于它调节的基因的上游或下游。一种或多种元件无需定位接近于它调节的基因，因为一些元件已发现位于它调节的基因上游或下游几百上千个碱基对处。突变型或非天然存在的植物可具有位于一种或多种基因的前100个核苷酸内、一种或多种基因的前200个核苷酸内、一种或多种基因的前300个核苷酸内、一种或多种基因的前400个核苷酸内、一种或多种基因的前500个核苷酸内、一种或多种基因的前600个核苷酸内、一种或多种基因的前700个核苷酸内、一种或多种基因的前800个核苷酸内、一种或多种基因的前900个核苷酸内、一种或多种基因的前1000个核苷酸内、一种或多种基因的前1100个核苷酸内、一种或多种基因的前1200个核苷酸内、一种或多种基因的前1300个核苷酸内、一种或多种基因的前1400个核苷酸内、或一种或多种基因的前1500个核苷酸内的一个或多个突变。突变型或非天然存在的植物可具有位于一种或多种基因的100个核苷酸的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四或第十五集合或其组合内的一个或多个突变。本发明公开了包含突变型多肽变体的突变型或非天然存在的植物(例如，如本文所描述的突变型、非天然存在的或转基因植物等等)。
在一个实施例中，使来自植物的种子诱变且随后生长成第一代突变型植物。随后允许第一代植物自花授粉，并且使来自第一代植物的种子生长成第二代植物，所述第二代植物随后就其基因座中的突变进行筛选。尽管诱变的植物材料可就突变进行筛选，但筛选第二代植物的优点在于所有体细胞突变均对应于种系突变。多种植物材料包括但不限于种子、花粉、植物组织或植物细胞可进行诱变，以便制备突变型植物。然而，当植物核酸就突变进行筛选时，可影响诱变的植物材料类型。例如，当在非诱变植物授粉前对花粉实施诱变时，使起源于授粉的种子生长成第一代植物。第一代植物的每一个细胞将含有在花粉中制备的突变；因此这些第一代植物随后可就突变进行筛选，代替等待直到第二代时。
主要制备点突变和短缺失、插入、颠换和或转换的诱变剂包括化学诱变剂或辐射，可用于制备突变。诱变剂包括但不限于甲磺酸乙酯、甲磺酸甲酯、N-乙基-N-亚硝基脲、三乙基蜜胺、N-甲基-N-亚硝基脲、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、美法仑、氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N'-硝基-亚硝基胍、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7,12-二甲基苯并蒽、环氧乙烷、六甲基磷酸胺、白消安、二环氧烷烃(二环氧辛烷、二环氧丁烷等等)、2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯乙基)氨丙基氨基]吖啶二盐酸盐和甲醛。
还考虑了无法由诱变剂直接引起的基因座中的自发突变，条件是它们导致所需表型。合适的诱变试剂还可包括例如电离辐射，例如X射线、γ射线、快中子照射和UV辐射。本领域技术人员已知的植物核酸制备的任何方法均可用于制备用于突变筛选的植物核酸。
可任选合并由个别植物、植物细胞或植物材料制备的核酸，以便加速源于诱变的植物组织、细胞或材料的植物群体中的突变筛选。可筛选植物、植物细胞或植物材料的一个或多个后续世代。任选合并的组的大小取决于使用的筛选方法的灵敏度。
在核酸样品任选合并后，可对它们实施多核苷酸特异性扩增技术，例如聚合酶链反应。对于基因或与基因紧相邻的序列特异性的任何一个或多个引物或探针可用于扩增任选合并的核酸样品内的序列。适当地，一个或多个引物或探针设计为扩增基因座的区域，在所述区域中有用的突变最可能出现。最优选地，引物设计为检测多核苷酸区域内的突变。另外，优选一个或多个引物和一个或多个探针避免已知的多态性位点，以便容易筛选点突变。为了促进扩增产物的检测，一个或多个引物或探针可使用任何常规标记方法进行标记。使用本领域充分理解的方法，可基于本文描述的序列来设计一个或多个引物或一个或多个探针。
为了促进扩增产物的检测，可使用任何常规标记方法来标记一个或多个引物或一个或多个探针。使用本领域充分理解的方法，可基于本文描述的序列来设计这些。
多态性可通过本领域已知的方法进行鉴定，并且一些已在文献中得到描述。
在另一方面，本发明提供了制备突变型植物的方法。该方法涉及提供包含编码本文所述功能多核苷酸(或如本文所描述的其任何组合)的基因的植物的至少一个细胞。接下来，植物的至少一个细胞在有效调节本文所述一种或多种多核苷酸的活性的条件下进行处理。至少一个突变型植物细胞随后繁殖成突变型植物，其中与对照植物的那种相比较，所述突变型植物具有调节水平的一种或多种所述多肽(或如本文所描述的其任何组合)。在制备突变型植物的该方法的一个实施例中，处理步骤涉及使至少一个细胞经受如上所述的化学诱变试剂，及有效获得至少一个突变型植物细胞的条件。在该方法的另一个实施例中，处理步骤涉及在有效获得至少一个突变型植物细胞的条件下，使至少一个细胞经受辐射源。术语“突变型植物”包括这样的突变型植物，与对照植物相比较，所述突变型植物中的基因型适当地通过除了遗传改造或遗传修饰之外的方式进行修饰。
在某些实施例中，突变型植物、突变型植物细胞或突变型植物材料可包含一个或多个突变，所述一个或多个突变在另一种植物、植物细胞或植物材料中天然存在，且赋予所需性状。该突变可引入(例如基因渗入)另一种植物、植物细胞或植物材料(例如具有与突变源自于其的植物不同的遗传背景的植物、植物细胞或植物材料)内，以对其赋予该性状。因此，例如，在第一植物中天然存在的突变可引入第二植物内，例如与第一植物具有不同遗传背景的第二植物。技术人员因此能够搜索且鉴定在其基因组中天然携带本文所述基因的一种或多种突变等位基因的植物，所述基因赋予所需性状。可通过多种方法包括育种、回交和基因渗入，将天然存在的一种或多种突变等位基因转移至第二植物，以产生在本文所述基因中具有一个或多个突变的品系、品种或杂交物。可在突变型植物的库中筛选显示所需性状的植物。适当地，利用如本文所描述的核苷酸序列的知识进行选择。因此，能够与对照相比较筛选遗传性状。此类筛选方法可涉及如本文讨论的常规核酸扩增和/或杂交技术的应用。因此，本发明的进一步方面涉及用于鉴定突变型植物的方法，其包括下述步骤：(a)提供来自植物的包含核酸的样品；和(b)确定多核苷酸的核酸序列，其中与对照植物的多核苷酸序列相比较，在多核苷酸序列中的差异指示所述植物是突变型植物。在另一方面，本发明提供了用于鉴定突变型植物的方法，与对照植物相比较，所述突变型植物累积降低水平的至少NNK和/或硝酸盐，所述方法包括下述步骤：(a)提供来自待筛选的植物的样品；(b)确定所述样品是否包含在本文所述的多核苷酸中的一种或多种中的一个或多个突变；和(c)确定所述植物的(i)硝酸盐含量；和/或(ii)至少NNK含量。适当地，在绿叶中测定至少NNK和/或硝酸盐含量。在另一方面，本发明提供了用于制备突变型植物的方法，与对照植物相比较，所述突变型植物具有降低水平的至少NNK和/或硝酸盐，所述方法包括下述步骤：(a)提供来自第一植物的样品；(b)确定所述样品是否包含在本文所述的多核苷酸中的一种或多种中的一个或多个突变，所述一个或多个突变导致降低水平的至少NNK和/或硝酸盐；和(c)将一个或多个突变转移到第二植物内。适当地，在绿叶中测定NNK和/或硝酸盐含量。可使用本领域已知的多种方法，例如通过遗传改造、遗传操纵、基因渗入、植物育种、回交等等，将一个或多个突变转移到第二植物内。在一个实施例中，第一植物是天然存在的植物。在一个实施例中，第二植物具有与第一植物不同的遗传背景。在另一方面，本发明提供了用于制备突变型植物的方法，与对照植物相比较，所述突变型植物具有降低水平的至少NNK和/或硝酸盐，所述方法包括下述步骤：(a)提供来自第一植物的样品；(b)确定所述样品是否包含在本文所述的多核苷酸中的一种或多种中的一个或多个突变，所述一个或多个突变导致降低水平的至少NNK和/或硝酸盐；和(c)将一个或多个突变从第一植物基因渗入第二植物内。适当地，在绿叶中测定NNK和/或硝酸盐含量。在一个实施例中，基因渗入步骤包括植物育种，任选包括回交等等。在一个实施例中，第一植物是天然存在的植物。在一个实施例中，第二植物具有与第一植物不同的遗传背景。在一个实施例中，第一植物不是栽培变种或优良栽培变种。在一个实施例中，第二植物是栽培变种或优良栽培变种。进一步方面涉及通过本文所述方法获得或可获得的突变型植物(包括栽培变种或优良栽培变种突变型植物)。在某些实施例中，“突变型植物”可具有仅定位于植物的特定区域，例如在本文所述的一种或多种多核苷酸的序列内的一个或多个突变。根据该实施例，突变型植物的剩余基因组序列将与诱变前的植物相同或基本上相同。
在某些实施例中，突变型植物可具有定位于植物的超过一个区域，例如在本文所述的多核苷酸中的一种或多种的序列内以及基因组的一个或多个进一步区域中的一个或多个突变。根据该实施例，突变型植物的剩余基因组序列将与诱变前的植物不同或基本上不同。在某些实施例中，突变型植物可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或者五个或更多个外显子中的一个或多个突变；或可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或者五个或更多个内含子中的一个或多个突变；或可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的启动子中的一个或多个突变；或可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的3’非转译区中的一个或多个突变；或可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的5’非转译区中的一个或多个突变；或可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的编码区中的一个或多个突变；或可不具有在本文描述的一种或多种多核苷酸的非编码区中的一个或多个突变；或其部分中的其两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个；或者六个或更多个的任何组合。
在另一方面，本发明提供了鉴定在基因中包含突变的植物、植物细胞或植物材料的方法，所述基因编码本文描述的多核苷酸，所述方法包括：(a)对植物、植物细胞或植物材料实施诱变；(b)由所述植物、植物细胞或植物材料或其后代获得核酸样品；和(c)测定编码本文描述的多核苷酸的基因或其变体或片段的核酸序列，其中所述序列中的差异指示其中的一个或多个突变。
锌指蛋白可用于调节本文描述的多核苷酸中的一种或多种的表达或活性。在多个实施例中，通过锌指核酸酶介导的诱变，修饰包含多核苷酸编码序列的一部分或全部的基因组DNA序列。在基因组DNA序列中搜索锌指蛋白结合的独特位点。作为另外一种选择，在基因组DNA序列中搜索锌指蛋白结合的两个独特位点，其中两个位点在相反链上且紧靠在一起，例如相隔1、2、3、4、5、6个或更多个碱基对。相应地，本发明提供了与多核苷酸结合的锌指蛋白。
锌指蛋白可进行改造，以鉴定基因中的所选靶位点。通过截短或扩增或与选择方法偶联的定点诱变过程(所述选择方法例如但不限于噬菌体展示选择、细菌双杂交选择或细菌单杂交选择)，锌指蛋白可包含源自天然锌指DNA结合结构域和非天然锌指DNA结合结构域的任何基序组合。术语“非天然锌指DNA结合结构域”指锌指DNA结合结构域，其结合靶核酸内的三碱基对序列，并且在包含待修饰的核酸的细胞或生物中不存在。用于设计结合特异性核苷酸序列的锌指蛋白的方法是本领域已知的，所述特异性核苷酸序列对于靶基因是独特的。
可通过制备编码结合多核苷酸的锌指蛋白的第一多核苷酸以及编码非特异性核酸内切酶的第二多核苷酸(例如但不限于IIS型核酸内切酶的那些)的融合物，来构建锌指核酸酶。在锌指蛋白和核酸酶之间的融合蛋白可包含由两个碱基对组成的间隔物，或作为另外一种选择，间隔物可由三个、四个、五个、六个、七个或更多个碱基对组成。在多个实施例中，锌指核酸酶在多核苷酸的基因组DNA序列的调节区、编码区或非编码区中引入双链断裂，且导致多核苷酸的表达水平降低，或由其编码的蛋白质活性中的降低。通过锌指核酸酶的切割通常导致在通过非同源末端连接的DNA修复后，在切割位点处的DNA缺失。
在其它实施例中，锌指蛋白可选择为结合多核苷酸的调节序列。更具体而言，调节序列可包含转录起始位点、起始密码子、外显子区、外显子-内含子边界、终止子或终止密码子。相应地，本发明提供了在本文描述的一种或多种多核苷酸附近或其内通过锌指核酸酶介导的诱变产生的突变型、非天然存在的或转基因植物细胞，以及通过锌指核酸酶介导的诱变用于制备此类植物或植物细胞的方法。用于将锌指蛋白和锌指核酸酶递送至烟草植物的方法类似于下文对于大范围核酸酶递送描述的那些。
在另一方面，本发明描述了使用大范围核酸酶例如I-CreI，用于产生突变型、非天然存在的或转基因或以其他方式遗传修饰的植物的方法。天然存在的大范围核酸酶以及重组大范围核酸酶可用于特异性引起在植物基因组DNA的单个位点或相对少数位点处的双链断裂，以允许破坏本文描述的一种或多种多核苷酸。大范围核酸酶可以是具有改变的DNA鉴定特性的经改造的大范围核酸酶。大范围核酸酶蛋白质可通过本领域已知的多种不同机制递送到植物细胞内。
本发明涵盖大范围核酸酶的使用，以使植物细胞或植物中的本文所述一种或多种多核苷酸(或如本文所描述的其任何组合)失活。(a)提供包含如本文所描述的多核苷酸的植物细胞；(b)将大范围核酸酶或编码大范围核酸酶的构建体引入所述植物细胞内；和(c)允许大范围核酸酶使一种或多种多核苷酸基本失活。
大范围核酸酶可用于切割在多核苷酸的编码区内的大范围核酸酶鉴定位点。此类切割通常导致在通过非同源末端连接的诱变DNA修复后，在大范围核酸酶鉴定位点处的DNA缺失。基因编码序列中的此类突变通常足以使基因失活。这种修饰植物细胞的方法首先涉及使用合适的转化方法，将大范围核酸酶表达盒递送至植物细胞。为了最高效率，期望将大范围核酸酶表达盒连接至可选标记，且在选择试剂的存在下选择成功转化的细胞。这种方法导致大范围核酸酶表达盒整合到基因组内，然而，如果植物可能需要监管机构批准，则这可能是不期望的。在此类情况下，使用常规育种技术，大范围核酸酶表达盒(和连接的可选标记基因)可在后续植物世代中分离开。作为另外一种选择，植物细胞可最初用缺乏可选标记的大范围核酸酶表达盒进行转化，并且可在缺乏选择试剂的培养基上生长。在此类条件下，经处理的细胞的一部分获得大范围核酸酶表达盒，并且瞬时表达经改造的大范围核酸酶，而不将大范围核酸酶表达盒整合到基因组内。因为它不负责转化效率，所以后面一种转化操作需要筛选更多数目的经处理的细胞，以获得所需基因组修饰。当利用锌指蛋白或锌指核酸酶时，上述方法还可应用于修饰植物细胞。
在大范围核酸酶表达盒递送后，植物细胞最初在对于使用的具体转化操作典型的条件下生长。这可意指在26℃以下的温度下，通常在黑暗中，使经转化的细胞在培养基上生长。此类标准条件可使用一段时间，优选1-4天，以允许植物细胞从转化过程恢复。在该最初恢复期后的任何点，生长温度可上升，以刺激经改造的大范围核酸酶的活性，以切割且突变大范围核酸酶鉴定位点。
对于一些应用，可能期望精确地从植物的基因组中去除多核苷酸。此类应用使用一对经改造的大范围核酸酶是可能的，所述一对大范围核酸酶各自切割在预期缺失的任一侧上的大范围核酸酶鉴定位点。还可使用TAL效应物核酸酶(TALEN)，其能够鉴定且结合基因，并且将双链断裂引入基因组内。因此，在另一方面，考虑了使用TAL效应物核酸酶，用于生产如本文所描述的突变型、非天然存在的或转基因或以其他方式遗传修饰的植物的方法。
适用于遗传修饰的植物包括但不限于单子叶和双子叶植物和植物细胞系统，包括来自下述科之一的物种：爵床科(Acanthaceae)、葱科(Alliaceae)、六出花科(Alstroemeriaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、棕榈科(Arecaceae)、菊科(Asteraceae)、小檗科(Berberidaceae)、红木科(Bixaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、大麻科(Cannabaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、三尖杉科(Cephalotaxaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、秋水仙科(Colchicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)、麻黄科(Ephedraceae)、古柯科(Erythroxylaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、唇形科(Lamiaceae)、亚麻科(Linaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、锦葵科(Malvaceae)、黑药花科(Melanthiaceae)、芭蕉科(Musaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、蓝果树科(Nyssaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、松科(Pinaceae)、车前草科(Plantaginaceae)、禾本科(Poaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、杨柳科(Salicaceae)、无患子科(Sapindaceae)、茄科(Solanaceae)、红豆杉科(Taxaceae)、山茶科(Theaceae)或葡萄科(Vitaceae)。
合适物种可包括下述属的成员：黄葵属(Abelmoschus)、冷杉属(Abies)、槭属(Acer)、剪股颖属(Agrostis)、葱属(Allium)、六出花属(Alstroemeria)、凤梨属(Ananas)、穿心莲属(Andrographis)、须芒草属(Andropogon)、蒿属(Artemisia)、芦竹属(Arundo)、颠茄属(Atropa)、小檗属(Berberis)、甜菜属(Beta)、红木属(Bixa)、芸苔属(Brassica)、金盏菊属(Calendula)、山茶属(Camellia)、喜树属(Camptotheca)、大麻属(Cannabis)、辣椒属(Capsicum)、红花属(Carthamus)、长春花属(Catharanthus)、三尖杉属(Cephalotaxus)、菊属(Chrysanthemum)、金鸡纳属(Cinchona)、西瓜属(Citrullus)、咖啡属(Coffea)、秋水仙属(Colchicum)、鞘蕊花属(Coleus)、甜瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、曼陀罗属(Datura)、石竹属(Dianthus)、洋地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、油棕属(Elaeis)、麻黄属(Ephedra)、蔗茅属(Erianthus)、古柯属(Erythroxylum)、桉树属(Eucalyptus)、羊茅属(Festuca)、草莓属(Fragaria)、雪花莲属(Galanthus)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、橡胶树属(Hevea)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、麻风树属(Jatropha)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、石松属(Lycopodium)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、薄荷属(Mentha)、芒属(Miscanthus)、芭蕉属(Musa)、烟草属、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、罂粟属(Papaver)、银胶菊属(Parthenium)、狼尾草属(Pennisetum)、矮牵牛属(Petunia)、虉草属(Phalaris)、梯牧草属(Phleum)、松属(Pinus)、早熟禾属(Poa)、一品红属(Poinsettia)、杨属(Populus)、萝芙木属(Rauwolfia)、蓖麻属(Ricinus)、蔷薇属(Rosa)、甘蔗属(Saccharum)、柳属(Salix)、血根草属(Sanguinaria)、赛莨菪属(Scopolia)、黑麦属(Secale)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、米草属(Spartina)、菠菜属(Spinacea)、菊蒿属(Tanacetum)、红豆杉属(Taxus)、可可属(Theobroma)、小黑麦属(Triticosecale)、小麦属(Triticum)、北美穗草属(Uniola)、藜芦属(Veratrum)、长春花属(Vinca)、葡萄属(Vitis)和玉蜀黍属(Zea)。
、大须芒草(Andropogon gerardii)(大蓝秆草)、象草(Pennisetum purpureum)(象草)、虉草(Phalaris arundinacea)(草芦)、狗牙根(Cynodon dactylon)(狗牙根)、高羊茅(Festuca arundinacea)(高羊茅)、互花米草(Spartina pectinata)(草原索草)、苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、芦竹(Arundo donax)(芦竹)、黑麦(Secale cereale)(黑麦)、柳属物种(Salix spp.)(柳树)、桉树属物种(Eucalyptus spp.)(桉树)、小黑麦(Triticosecale)(小麦杂交黑麦)、竹、向日葵(Helianthus annuus)(向日葵)、红花(Carthamus tinctorius)(红花)、桐油树(Jatropha curcas)(麻风树)、蓖麻(Ricinuscommunis)(蓖麻)、油棕(Elaeis guineensis)(棕榈)、亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻)、芥菜(Brassica juncea)、甜菜(Beta vulgaris)(甜菜)、木薯(Manihot esculenta)(木薯)、番茄(Lycopersicon esculentum)(番茄)、莴苣(Lactuca sativa)(生菜)、香蕉(Musyclise alca)(香蕉)、马铃薯(Solanum tuberosum)(土豆)、甘蓝(Brassicaoleracea)(绿花椰菜、花椰菜、抱子甘蓝(Brussels sprouts))、山茶(Camellia sinensis)(茶)、草莓(Fragaria ananassa)(草莓)、可可(Theobroma cacao)(可可)、咖啡(Coffe49ycliseca)(咖啡)、葡萄(Vitis vinifera)(葡萄)、菠萝(Ananas comosus)(菠萝)、辣椒(Capsicum annum)(辣椒和甜椒)、洋葱(Allium cepa)(洋葱)、甜瓜(Cucumismelo)(甜瓜)、黄瓜(Cucumis sativus)(黄瓜)、笋瓜(Cucurbita maxima)(南瓜)、南瓜(Cucurbita moschata)(南瓜)、菠菜(Spinacea oleracea)(菠菜)、西瓜(Citrulluslanatus)(西瓜)、秋葵(Abelmoschus esculentus)(秋葵)、茄子(Solanum melongena)(茄子)、蔷薇属物种(Rosa spp.)(玫瑰)、香石竹(Dianthus caryophyllus)(康乃馨)、矮牵牛属物种(Petunia spp.)(矮牵牛)、一品红(Poinsettia pulcherrima)(一品红)、白羽扇豆(Lupinus albus)(羽扇豆)、燕麦(Uniola paniculata)(燕麦)、翦股颖(翦股颖属物种(Agrostis spp.)(松树)、冷杉属物种(Abies spp.)(冷杉)、槭属物种(Acer spp.)(枫木)、大麦(Hordeum vulgare)(大麦)、草地早熟禾(Poa pratensis)(早熟禾)、黑麦草属物种(Lolium spp.)(黑麦草)和猫尾草(Phleum pratense)(梯牧草)、柳枝稷(Panicumvirgatum)(柳枝稷)、高粱(Sorghu49yclise49)或(高粱、苏丹草)、芒草(Miscanthusgiganteus)(芒草)、甘蔗属物种(Saccharum sp.)(能源蔗)、香脂杨(Populusbalsamifera)(白杨)、玉蜀黍(Zea mays)(玉米)、大豆(Glycine max)(黄豆)、油菜(Brassica napus)(芸苔)、小麦(Triticum aestivum)(小麦)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)(棉花)、水稻(Oryza sativa)(稻)、向日葵(Helianthus annuus)(向日葵)、苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、甜菜(Beta vulgaris)(甜菜)或珍珠粟(Pennisetum glaucum)(珍珠粟)。
多个实施例涉及经修饰的突变型烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因烟草植物，以调节基因表达水平，由此产生与对照植物相比较，其中多肽的表达水平在目的植物组织中被调节植物(例如烟草植物)。所公开的组合物和方法可应用于烟草属的任何物种，包括黄花烟草(N.rustica)和普通烟草(例如LA B21、LN KY171、TI 1406、巴斯玛、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1和Petico)。其他物种包括无茎烟草(N.acaulis)、N49yclise4949ta、N49yclise4949ta var.multiflora、N46yclise46na、花叶烟草(N.alata)、抱茎烟草(N.amplexicaulis)、阿伦兹氏烟草(N.arentsii)、N49yclise4949ta、贝纳莫特氏烟草(N. benavidesii)、本赛姆氏烟草(N.benthamiana)、印度烟草(N.bigelovii)、博内里烟草(N.bonariensis)、洞生烟草(N.cavicola)、克利夫兰氏烟草(N.clevelandii)、心叶烟草(N.cordifolia)、伞床烟草(N.corymbosa)、迪伯纳氏烟草(N.debneyi)、木丝烟草(N.excelsior)、福尔吉特氏烟草(N.forgetiana)、香烟草(N.fragrans)、粉蓝烟草(N.glauca)、粘烟草(N.glutinosa)、古特斯比氏烟草(N.goodspeedii)、哥西氏烟草(N.gossei)、杂交烟草(N.hybrid)、因古儿巴烟草(N.ingulba)、卡瓦卡米氏烟草(N.kawakamii)、奈特氏烟草(N.knightiana)、郎氏烟草(N.langsdorffii)、渐尖叶烟草(N.linearis)、长花烟草(N.longiflora)、N50yclise50ma、特大管烟草(N.megalosiphon)、摩西氏烟草(N.miersii)、夜花烟草(N.noctiflora)、裸茎烟草(N.nudicaulis)、欧布斯特烟草(N.obtusifolia)、西方烟草(N.occidentalis)、西方亚种香芥烟草(N.occidentalis subsp.hesperis)、耳状烟草(N.otophora)、圆锥烟草(N.paniculata)、少花烟草(N.pauciflora)、矮牵牛状烟草(N.petunioides)、蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)、夸德瑞伍氏烟草(N.quadrivalvis)、雷蒙德氏烟草(N.raimondii)、波缘烟草(N.repanda)、莲座烟草(N.rosulata)、莲座亚种因古儿巴烟草(N.rosulata subsp.ingulba)、圆叶烟草(N.rotundifolia)、赛特氏烟草(N.setchellii)、拟似烟草(N.simulans)、茄叶烟草(N.solanifolia)、斯佩格茨氏烟草(N.spegazzinii)、斯托可通氏烟草(N.stocktonii)、香甜烟草(N.suaveolens)、美花烟草、拟穗状烟草(N.thyrsiflora)、绒毛烟草(N.tomentosa)、绒毛状烟草(N.tomentosiformis)、三角叶烟草(N.trigonophylla)、荫生烟草(N.umbratica)、N50yclise50ta、颤毛烟草(N.velutina)、序叶烟草(N.wigandioides)和花烟草(N.xsanderae)。
本文还考虑使用烟草栽培变种和优良烟草栽培变种。因此，转基因、非天然存在的或突变型植物可以是烟草品种或优良烟草栽培变种，其包含一种或多种转基因、或者一个或多个遗传突变或其组合。一个或多个遗传突变(例如，一种或多种多态性)可以是非天然存在于个别烟草品种或烟草栽培变种(例如，优良烟草栽培变种)的突变，或可以是的确天然存在的一个或多个遗传突变，条件是所述突变并非天然存在于个别烟草品种或烟草栽培变种(例如，优良烟草栽培变种)中。
特别有用的普通烟草品种包括白肋烟型、深型、烤烟型和东方型烟草。品种或栽培变种的非限制性例子是：品种或栽培变种的非限制性例子是BD 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker371 Gold、Coker 48、CD 263、DF911、DT 538LC Galpao烟草、GL 26H、GL 350、GL 600、GL737、GL 939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、杂交403LC、杂交404LC、杂交501LC、K149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、窄叶Madole、窄叶Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD 7302 LC、PD7309 LC、PD 7312 LC‘'Periq’e'烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA309、VA359、AA 37-1、B 13P、Xanthi(Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC 2号杂交49、白肋21、KY 8959、KY 9、MD 609、PG 01、PG 04、PO1、PO2、PO3、RG 11、RG8、VA 509、AS44、Banket A1、巴斯玛Drama B84/31、巴斯玛I Zichna ZP4/B、巴斯玛XanthiBX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel81、DVH 405、Comum、HB04P、希克斯阔叶、Kabakulak Elassona、Kutsage E1、LA BU21、NC 2326、NC 297、PVH 2110、红色俄罗斯、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、YakaJK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、TI-1070、TW136、巴斯玛、TKF 4028、L8、TKF2002、GR141、巴斯玛xanthi、GR149、GR153、Petit Havana。即使本文未特别指明，也考虑上述的低转化亚变种。
实施例还涉及用于产生突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物的组合物和方法，所述植物已进行修饰，以调节本文所述的一种或多种多核苷酸(或如本文所描述的其任何组合)的表达或活性。有利地，所获得的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物可在整体外观上与对照植物相似或基本上相同。多种表型特征，例如成熟程度、每植物叶数、杆高、叶插入角度、叶大小(宽度和长度)、节间距离、以及叶片-中脉比可通过田间观察进行评价。
一个方面涉及本文所述的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物的种子。优选地，所述种子是烟草种子。进一步方面涉及本文所述的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物的花粉或胚珠。另外，本发明提供了如本文所述的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物，其还含有赋予雄性不育的核酸。
本发明还提供了如本文所述的突变型植物、非天然存在的植物、杂交植物或转基因植物或其一部分的可再生细胞的组织培养物，其中培养物再生为能够表达亲本的所有形态和生理特征的植物。叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、根、根尖、花药、花及其一部分、胚珠、枝条、茎、杆、髓和荚膜或源自其的愈伤组织或原生质体。
一个目标是提供突变型、转基因或非天然存在的植物或其一部分，其在植物材料例如烘烤的叶中显示出调节(例如降低)水平的TSNA。适当地，与对照植物相比较，突变型、转基因或非天然存在的植物或其一部分显示出调节(例如降低)水平的至少NNK和/或硝酸盐。在某些实施例中，至少NNN水平将是基本上相同的。在某些实施例中，至少NNN、NAB和NAT水平将是基本上相同的。在某些实施例中，与对照植物相比较，至少NNN水平将是基本上相同的，并且NAB水平将是降低的。在某些实施例中，与对照植物相比较，至少NNN水平将是基本上相同的，并且NAT水平将是降低的。在某些实施例中，与对照植物相比较，至少NNN水平将是基本上相同的，并且NAT和NAB水平将是降低的。突变型、转基因或非天然存在的植物或其一部分中的烟碱含量可与对照或野生型植物基本上相同，或者可低于对照或野生型植物。适当地，突变型、转基因或非天然存在的植物或其一部分具有与对照植物基本上相同的视觉外观。
四种主要的TSNA，通常发现以最高浓度存在的那些，是N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟草碱(NAT)。次要化合物，通常以明显低于主要TSNA的水平发现的那些，包括4-(甲基亚硝氨基)4-(3-吡啶基)丁醛(NNA)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)、4-(甲基亚硝氨基)4-(3-吡啶基)-1-丁醇(异-NNAL)和4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁酸(异-NNAC)。至少NNN和NNK据报道当应用于实验室研究中的动物时是致癌的。
相应地，本文描述了突变型、转基因或非天然存在的植物或其一部分或植物细胞，与对照细胞或对照植物相比较，其具有调节(例如降低)水平的至少NNK和/或硝酸盐。在某些实施例中，NNN水平将是基本上相同的。突变型、转基因或非天然存在的植物或植物细胞已进行修饰，以通过调节本文所述相应多核苷酸序列中的一种或多种的表达，来调节(例如降低)本文所述多肽中的一种或多种的合成或活性。适当地，在至少绿叶、适当地烘烤的叶中，观察到调节水平的至少NNK和/或硝酸盐。在某些实施例中，植物(例如绿叶，适当地烘烤的叶或烘烤的烟草)中的总TSNA水平可以被调节(例如降低的)。在某些实施例中，植物(例如绿叶，适当地烘烤的叶或烘烤的烟草)中的烟碱水平可以被调节(例如降低的)。
进一步方面涉及突变型、转基因或非天然存在的植物或细胞，其中本文所述多肽中的一种或多种的表达或活性被调节(例如降低的)，并且与其中所述一种或多种多肽的表达或活性未被调节的对照植物相比较，所述植物的一部分(例如绿叶，适当地烘烤的叶或烘烤的烟草)在其中具有至少5％的硝酸盐和/或至少NNK水平降低。在某些实施例中，NNN水平将是基本上相同的。在某些实施例中，植物(例如绿叶，适当地烘烤的叶或烘烤的烟草)中的总TSNA水平也可以被调节(例如降低的)，例如至少约5％。在某些实施例中，植物(例如绿叶，适当地烘烤的叶或烘烤的烟草)中的烟碱水平也可以被调节(例如降低的)，例如至少约5％。在某些实施例中，植物(例如绿叶)中的总TSNA水平也可以被调节(例如降低的)，例如至少约5％，并且植物(例如绿叶，适当地烘烤的叶或烘烤的烟草)中的烟碱水平也可以被调节(例如降低的)，例如至少约5％。
再进一步方面涉及源自或可源自突变型、非天然存在的或转基因植物或细胞的烘烤的植物材料，例如烘烤的叶或烘烤的烟草，其中本文所述多核苷酸中的一种或多种的表达或者由其编码的蛋白质的活性是降低的，并且其中与对照植物相比较，硝酸盐和/或NNK水平降低至少5％。在某些实施例中，NNN水平将是基本上相同的。
再进一步方面涉及突变型、非天然存在的或转基因的烘烤的植物材料，例如烘烤的叶或烘烤的烟草，与对照植物相比较，其具有降低至少5％的硝酸盐和/或NNK水平。在某些实施例中，NNN水平将是基本上相同的。在某些实施例中，烘烤的植物材料中的总TSNA水平还可降低例如至少约5％。在某些实施例中，烘烤的植物材料中的烟碱水平还可降低例如至少约5％。在某些实施例中，烘烤的植物材料中的总TSNA水平还可降低例如至少约5％，并且烘烤的植物材料中的烟碱水平还可降低至少约5％。
在再进一步的方面，本发明提供了突变型、非天然存在的或转基因植物或植物细胞，其中与对照或野生型植物相比较，本文所述多肽中的一种或多种的表达是降低的，并且其中(i)硝酸盐含量为约7mg/g或更少，例如约6.9mg/g或更少、约6.8mg/g或更少、约6.7mg/g或更少、约6.6mg/g或更少、约6.5mg/g或更少、约6.4mg/g或更少、约6.3mg/g或更少、约6.2mg/g或更少、约6.1mg/g或更少、或者约6mg/g或更少；和(ii)NNK含量为约110ng/g或更少，例如约109ng/g或更少、约108ng/g或更少、约107ng/g或更少、约106ng/g或更少、约105ng/g或更少、约104ng/g或更少、约103ng/g或更少、约102ng/g或更少、约101ng/g或更少、或者约100ng/g或更少。在某些实施例中，烟碱水平为约30mg/g或更少，例如约29.9mg/g或更少、约29.8mg/g或更少、约29.7mg/g或更少、约29.6mg/g或更少、约29.5mg/g或更少、约29.4mg/g或更少、约29.3mg/g或更少、约29.2mg/g或更少、约29.1mg/g或更少、或者约29mg/g或更少。在某些实施例中，总TSNA含量为约250ng/g或更少，例如约240ng/g或更少、约230ng/g或更少、约220ng/g或更少、约210ng/g或更少、约200ng/g或更少、约190ng/g或更少、约180ng/g或更少、约170ng/g或更少、约160ng/g或更少、或者约150ng/g或更少。
在再进一步的方面，本发明提供了突变型、非天然存在的或转基因植物或植物细胞，其中与对照或野生型植物相比较，本文所述多肽中的一种或多种的表达是降低的，并且其中(i)硝酸盐含量为约7mg/g或更少，例如约6.9mg/g或更少、约6.8mg/g或更少、约6.7mg/g或更少、约6.6mg/g或更少、约6.5mg/g或更少、约6.4mg/g或更少、约6.3mg/g或更少、约6.2mg/g或更少、约6.1mg/g或更少、或者约6mg/g或更少；和(ii)NNK含量为约110ng/g或更少，例如约109ng/g或更少、约108ng/g或更少、约107ng/g或更少、约106ng/g或更少、约105ng/g或更少、约104ng/g或更少、约103ng/g或更少、约102ng/g或更少、约101ng/g或更少、或者约100ng/g或更少。在某些实施例中，烟碱水平为约30mg/g或更少，例如约29.9mg/g或更少、约29.8mg/g或更少、约29.7mg/g或更少、约29.6mg/g或更少、约29.5 mg/g或更少、约29.4mg/g或更少、约29.3mg/g或更少、约29.2mg/g或更少、约29.1mg/g或更少、或者约29mg/g或更少。在某些实施例中，总TSNA含量为约250ng/g或更少，例如约240ng/g或更少、约230ng/g或更少、约220ng/g或更少、约210ng/g或更少、约200ng/g或更少、约190ng/g或更少、约180ng/g或更少、约170ng/g或更少、约160ng/g或更少、或者约150ng/g或更少。
在再进一步的方面，本发明提供了突变型、非天然存在的或转基因植物或植物细胞，其中与对照或野生型植物相比较，本文所述多肽中的一种或多种的表达是降低的，并且其中(i)硝酸盐含量为约7mg/g或更少，例如约6.9mg/g或更少、约6.8mg/g或更少、约6.7mg/g或更少、约6.6mg/g或更少、约6.5mg/g或更少、约6.4mg/g或更少、约6.3mg/g或更少、约6.2mg/g或更少、约6.1mg/g或更少、或者约6mg/g或更少；和(ii)NNK含量为约110ng/g或更少，例如约109ng/g或更少、约108ng/g或更少、约107ng/g或更少、约106ng/g或更少、约105ng/g或更少、约104ng/g或更少、约103ng/g或更少、约102ng/g或更少、约101ng/g或更少、或者约100ng/g或更少。在某些实施例中，烟碱水平为约30mg/g或更少，例如约29.9mg/g或更少、约29.8mg/g或更少、约29.7mg/g或更少、约29.6mg/g或更少、约29.5mg/g或更少、约29.4mg/g或更少、约29.3mg/g或更少、约29.2mg/g或更少、约29.1mg/g或更少、或者约29mg/g或更少。在某些实施例中，总TSNA含量为约250ng/g或更少，例如约240ng/g或更少、约230ng/g或更少、约220ng/g或更少、约210ng/g或更少、约200ng/g或更少、约190ng/g或更少、约180ng/g或更少、约170ng/g或更少、约160ng/g或更少、或者约150ng/g或更少。
适当地，所述植物或其一部分(例如叶)的视觉外观与对照植物基本上相同。适当地，所述植物是烟草植物。
实施例还涉及用于产生突变型、非天然存在的或转基因植物的组合物和方法，所述植物已进行修饰，以调节本文所述多核苷酸或多肽中的一种或多种的表达或活性，所述修饰可导致与对照植物相比较，具有调节水平的硝酸盐和/或NNK和/或NNN和/或TSNA和/或烟碱的植物或植物组分(例如叶，例如绿叶或烘烤的叶，或者烟草)。
有利地，根据本文所述方法获得的突变型、非天然存在的或转基因植物在视觉外观上与对照植物相似或基本上相同。在一个实施例中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶重与对照植物基本上相同。在一个实施例中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶数目与对照植物基本上相同。在一个实施例中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶重和叶数目与对照植物基本上相同。在一个实施例中，例如在田间移植后一、二或三或更多个月或者在打顶后10、20、30或36或更多天，突变型、非天然存在的或转基因植物的杆高与对照植物基本上相同。例如，突变型、非天然存在的或转基因植物的杆高不低于对照植物的杆高。在另一个实施例中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶绿素含量与对照植物基本上相同。在另一个实施例中，突变型、非天然存在的或转基因植物的杆高与对照植物基本上相同，并且突变型、非天然存在的或转基因植物的叶绿素含量与对照植物基本上相同。在其它实施例中，突变型、非天然存在的或转基因植物的叶的大小、或形状、或数目、或着色与对照植物基本上相同。适当地，所述植物是烟草植物。
在另一方面，本发明提供了用于调节(例如降低)植物的至少一部分(例如叶，例如烘烤的叶，或者烟草)中的硝酸盐和/或至少NNK 的量的方法，其包括下述步骤：(i)调节(例如降低)本文所述多肽中的一种或多种(或如本文所描述的其任何组合)的表达或活性，适当地，其中所述一种或多种多肽由本文所述的相应多核苷酸序列编码；(ii)测量在步骤(i)中获得的突变型、非天然存在的或转基因植物的至少一部分(例如叶，例如烘烤的叶，或者烟草)中的硝酸盐和/或至少NNK含量；和(iii)鉴定与对照植物相比较，其中的硝酸盐和/或至少NNK含量已进行调节(例如降低)的突变型、非天然存在的或转基因植物。适当地，所述突变型、非天然存在的或转基因植物的视觉外观与对照植物基本上相同。适当地，所述植物是烟草植物。
在另一方面，本发明提供了用于调节(例如降低)烘烤的植物材料(例如烘烤的叶)的至少一部分中的硝酸盐和/或至少NNK的量的方法，其包括下述步骤：(i)调节(例如降低)多肽中的一种或多种(或如本文所描述的其任何组合)的表达或活性，适当地，其中所述一种或多种多肽由本文所述的相应多核苷酸序列编码；(ii)收获植物材料，例如一片或多片叶，并且烘烤一段时间；(iii)测量在步骤(ii)中获得的烘烤的植物材料的至少一部分中的硝酸盐和/或至少NNK含量；和(iv)鉴定与对照植物相比较，其中的硝酸盐和/或至少NNK含量已进行调节(例如降低)的烘烤的植物材料。
与对照植物相比较，表达中的增加可为约5％-约100％，或者至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％或更多，例如200％或300％或更多的增加，这包括转录活性或蛋白质表达或两者中的增加。
与对照型植物相比较，活性中的增加可为约5％-约100％，或者至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％或更多，例如200％或300％或更多的增加。
与对照植物相比较，表达中的降低可为约5％-约100％，或者至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的降低，这包括转录活性或蛋白质表达或两者中的降低。
与对照型植物相比较，活性中的降低可为约5％-约100％，或者至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的降低。
本文描述的多核苷酸和重组构建体可用于调节本文描述的酶在目的植物物种(适当地，烟草)中的表达。
许多基于多核苷酸的方法可用于增加基因在植物中的表达。例如，可制备与待转化的植物兼容的构建体、载体或表达载体，其包含目的基因连同能够在植物中过表达所述基因的上游启动子。示例性启动子在本文中描述。在转化后且当生长在合适条件下时，所述启动子可驱动表达，以便调节(例如，降低)这种酶在植物或在其特定组织中的水平。在一个示例性实施例中，生成携带本文所述一种或多种多核苷酸(或如本文所描述的其任何组合)的载体，以在植物中过表达所述基因。所述载体携带位于转基因上游的合适启动子(例如花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子)，从而驱动所述转基因在植物的所有组织中的组成型表达。所述载体还携带抗生素抗性基因，以便对经转化的愈伤组织和细胞系赋予选择。
因此，多个实施例涉及通过将多核苷酸的多个拷贝整合到植物基因组内，用于调节(例如，降低)本文所述的一种或多种多核苷酸(或如本文所描述的其任何组合)的表达水平的方法，其包括：由重组多核苷酸编码的多肽可以是天然多肽，或对于细胞可以是异源的。
携带本文所述的一种或多种多核苷酸(或如本文所描述的其任何组合)的突变等位基因的烟草植物可用于植物育种计划，以制备有用的品系、品种和杂种。特别地，可使所述突变等位基因基因渗入上述商业上重要的品种内。因此，本发明提供了用于植物育种的方法，其包括将如本文所述的突变型植物、非天然存在的植物或转基因植物与含有不同遗传同一性的植物进行杂交。所述方法还可包括将后代植物与另一植物杂交，且任选重复杂交直到获得具有期望的遗传性状或遗传背景的后代。此类育种方法发挥的一个目的是将期望的遗传性状引入其他品种、育种品系、杂种或栽培变种，尤其是具有商业利益的那些。另一个目的是便于在单一植物品种、品系、杂种或栽培变种中叠加不同基因的遗传修饰。考虑种内和种间交配。起于此类杂交的后代植物也称为育种品系，是本发明的非天然存在的植物的例子。
在一个实施例中，本发明提供了用于生产非天然存在的烟草植物的方法，其包括：(a)将突变型或转基因烟草植物与第二烟草植物杂交，以获得后代烟草种子；(b)在植物生长条件下，使后代烟草种子生长，以获得非天然存在的烟草植物。该方法还可包括：(c)将非天然存在的烟草植物的上一代与自身或另一烟草植物杂交，以获得后代烟草种子；(d)在植物生长条件下，使步骤(c)的后代烟草种子生长，以获得另外的非天然存在的烟草植物；和(e)将(c)和(d)的杂交和生长步骤重复多次，以获得非天然存在的烟草植物的更多世代。该方法可任选包括在步骤(a)之前提供亲本植物的步骤，所述亲本植物包含得到表征且不同于突变型或转基因植物的遗传同一性。在一些实施例中，取决于育种计划，杂交和生长步骤重复0至2次、0至3次、0至4次、0至5次、0至6 次、0至7次、0至8次，0至9次或0至10次，以便生成非天然存在的烟草植物的世代。回交是此类方法的例子，其中后代与其亲本之一或与其亲本遗传相似的另一植物进行杂交，以便获得在下一代中具有更接近于亲本之一的遗传同一性的后代植物。用于植物育种、特别是烟草植物育种的技术，是众所周知的且可用于本发明的方法中。本发明还提供了通过这些方法产生的非天然存在的烟草植物。某些实施例排除选择植物的步骤。
在本文所述方法的一些实施例中，使用标准田间操作，在田间评估起因于育种和筛选变体基因的品系。包括原始未诱变亲本的对照基因型包括在内，并且按随机化的完全区组设计或其他适当的田间设计，将入选者(entry)排列于田间。对于烟草，使用标准的农学实践，例如将烟草收获、称量且取样，用于在烘烤之前和烘烤期间的化学及其他常见测试。执行数据的统计分析，以确认所选择品系与亲本品系之间的相似性。任选执行所选植物的细胞遗传学分析，以确认染色体组和染色体配对关系。
DNA指纹鉴定、单核苷酸多态性、微卫星标记或类似技术可用在标记辅助选择(MAS)的育种计划中，以如本文所述的，将基因的突变等位基因转移或培育到其他烟草内。例如，育种者可由含有突变等位基因的基因型与农学期望的基因型的杂交，而制备分离的群体。可使用本文所列出的技术之一，使用从基因组序列或其片段所开发的标记来筛选F2中的植物或回交世代。鉴定为具有突变等位基因的植物可以回交或自花授粉，以制备待筛选的第二群体。取决于预期遗传模式或所用MAS技术，有必要在每轮回交之前对所选择的植物进行自花授粉，以帮助鉴定期望的个体植物。可重复进行回交或其他育种操作，直到恢复轮回亲本的所需表型。
根据本公开内容，在育种计划中，成功的杂交获得能育的F1植物。所选择的F1植物可与亲本之一杂交，并且第一回交世代植物进行自花授粉，以产生再次筛选变体基因表达(例如，基因的无效版本)的群体。将回交、自花授粉和筛选的过程重复例如至少4次，直到最终筛选产生能育且与轮回亲本相当相似的植物。如果需要的话，这种植物进行自花授粉，并且随后再次筛选后代，以确认植物显示出变体基因表达。在一些实施例中，在F2代的植物群体中筛选变体基因表达，例如，根据标准方法如通过使用具有引物的PCR方法，鉴定由于基因缺失而未能表达多肽的植物，所述引物基于本文所述的一种或多种多核苷酸(或如本文所描述的其任何组合)的核苷酸序列信息。
阻止第一品种的雌性亲本植物(即，种子亲本)的自花授粉，允许来自第二品种的雄性亲本植物的花粉使雌性亲本植物受精，且允许F1杂种种子在雌性植物上形成。可通过在花发育早期阶段将花朵去雄，来阻止雌性植物的自花授粉。作为另外一种选择，可使用雄性不育的形式阻止在雌性亲本植物上的花粉形成。例如，通过细胞质雄性不育(CMS)或转基因雄性不育可产生雄性不育，其中转基因抑制小孢子和/或花粉形成、或自交不兼容。含有CMS的雌性亲本植物是特别有用的。在其中雌性亲本植物是CMS的实施例中，从雄性能育植物收获花粉且人工应用于CMS雌性亲本植物的柱头，并且收获所得到的F1种子。
本文所述品种和品系可用于形成单杂交烟草F1杂种。在此类实施例中，亲本品种的植物可生长为基本上同质的相邻群体，以便于雄性亲本植物与雌性亲本植物的天然异花授粉。通过常规方式选择性收获在雌性亲本植物上形成的F1种子。还可大批种植两个亲本植物品种，且收获由于自花授粉在雌性亲本上形成的F1杂种种子和在雄性亲本上形成的种子的掺和物。作为另外一种选择，可进行三系杂交，其中单杂交F1杂种用作雌性亲本，并且与不同的雄性亲本杂交。作为另一选择，可制备双杂交杂种，其中两个不同单杂交的F1后代进行自身杂交。
可在突变型、非天然存在的或转基因植物群体中，筛选或选择具有所需性状或表型的那些群体成员。例如，可在单一转化事件的后代群体中，筛选具有由其编码的一种或多种多肽的所需表达或活性水平的那些植物。物理和生物化学方法可用于鉴定表达或活性水平。这些包括用于检测多核苷酸的DNA分析或PCR扩增；用于检测RNA转录物的RNA印迹、S1RNA酶保护、引物延伸或RT-PCR扩增；用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶促测定；以及检测多肽的蛋白质凝胶电泳、蛋白质印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定。其他技术如原位杂交、酶染色和免疫染色以及酶测定也可用于检测多肽或多核苷酸的存在或表达或活性。
如本文所述的突变型、非天然存在的或转基因植物细胞和植物包含一种或多种重组多核苷酸、一种或多种多核苷酸构建体、一种或多种双链RNA、一种或多种缀合物或者一种或多种载体/表达载体。
无限制地，在表达或活性已根据本发明进行调节之前或之后，本文所述的植物可出于其他目的进行修饰。下列遗传修饰中的一种或多种可存在于突变型、非天然存在的或转基因植物中。在一个实施例中，修饰涉及含氮代谢中间产物转化的一种或多种基因，导致当烘烤时，产生比对照植物或其部分更低水平的至少一种烟草特异性亚硝胺的植物或植物部分(例如叶或烟草)。可进行修饰的基因的非限制性例子包括编码烟碱脱甲基酶的基因，例如CYP82E4、CYP82E5和CYP82E10，其参与烟碱至去甲烟碱的转化，并且在WO2006091194、WO2008070274、WO2009064771和PCT/US2011/021088中描述。在另一个实施例中，修饰涉及重金属摄取或重金属转运的一种或多种基因，导致比不含一种或多种修饰的对照植物或其部分具有更低重金属含量的植物或植物部分(例如叶)。多药抗性相关蛋白质家族、阳离子扩散协助蛋白(CDF)家族、Zrt-,Irt样蛋白(ZIP)家族、阳离子交换剂(CAX)家族、铜转运蛋白(COPT)家族、重金属P型ATP酶家族(例如HMA，如WO2009074325中所述)、天然抗性相关巨噬细胞蛋白(NRAMP)同系物家族、以及参与重金属如镉转运的ATP结合盒(ABC)转运蛋白家族(例如MRP，如WO2012/028309中所述)。如本文使用的，术语重金属包括过渡金属。其他修饰的例子包括除草剂耐受性，例如，草甘膦是许多广谱除草剂的活性成分。通过转移aroA基因(来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(E.coli)的草甘膦EPSP合成酶)，已开发草甘膦抗性转基因植物。通过转化来自拟南芥属(Arabidopsis)的突变型ALS(乙酰乳酸合成酶)基因，已产生磺脲抗性植物。来自突变型绿穗苋(Amaranthus hybridus)的光系统II的OB蛋白已转移到植物内，以产生莠去津抗性转基因植物；并且通过掺入来自细菌肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的bxn基因，已产生溴苯腈抗性转基因植物。另一示例性修饰导致对昆虫抗性的植物。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)毒素可提供延迟Bt抗性害虫出现的有效途径，如最近在绿花椰菜中所示，其中金字塔式的(pyramided)cry1Ac和cry1C Bt基因控制小菜蛾(diamondback moth)对任一单一蛋白质的抗性，且明显延迟抗性昆虫的进化。另一示例性修饰导致对由病原体(例如病毒、细菌、真菌)引起的疾病抗性的植物。已改造了表达Xa21基因(对白叶枯病的抗性)的植物，以及表达Bt融合基因和壳多糖酶基因(对三化螟的抗性和对鞘(sheath)的耐受性)两者的植物。另一示例性修饰导致改变的生殖能力，例如雄性不育。另一示例性修饰导致耐受非生物胁迫(例如，干旱、温度、盐度)的植物，并且通过转移来自拟南芥属的酰基甘油磷酸酶，已产生耐受的转基因植物；编码甘露醇脱氢酶和山梨糖醇脱氢酶的基因改善抗旱性，所述甘露醇脱氢酶和山梨糖醇脱氢酶涉及甘露醇和山梨糖醇合成。另一示例性修饰导致这样的植物，其产生可具有在人中使用有利的免疫原性特性的蛋白质。例如，可使用能够产生蛋白质的植物，所述蛋白质在其N-聚糖中基本上缺失α-1,3-连接的岩藻糖残基、β-1,2-连接的木糖残基或两者。其他示例性修饰可导致具有改善的贮藏蛋白和油的植物、具有增强的光合效率的植物、具有延长的贮存期限的植物、具有增强的碳水化合物含量的植物以及对真菌抗性的植物；编码涉及生物碱生物合成的酶的植物。也可考虑这样的转基因植物，其中S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)和/或胱硫醚γ-合酶(CGS)的表达已被调节。
一种或多种此类性状可基因渗入来自另一烟草栽培品种的突变型、非天然存在的或转基因烟草植物，或可直接转化到其内。将性状渐渗杂交至本发明的突变型、非天然存在的或转基因烟草细胞中，可以通过本领域已知的植物育种方法实现，例如纯种繁育、回交、双单倍体育种以及类似方法(Wernsman,E.A,and Rufty,R.C.1987.ChapterSeventeen.Tobacco.Pages 669-698In:Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr(ed.),MacMillan Publishing Co,Inc.,New York,N.Y761pp.)。如上所述的基于分子生物学的技术特别是RFLP和微卫星标记，可用于此类回交中，以鉴定与轮回亲本具有最高遗传同一性程度的后代。这允许加速生产与轮回亲本具有至少90％、优选至少95％、更优选至少99％遗传同一性的烟草品种，再更优选与轮回亲本遗传上相同的烟草品种，且还包括由供体亲本基因渗入的一种或多种性状。此类遗传同一性的确定可基于本领域已知的分子标记。
最后的回交世代可进行自交，以给出对于被转移的一种或多种核酸纯的育种后代。除转移的一种或多种性状(例如，一种或多种单基因性状)之外，所得到的植物一般具有本发明的突变型、非天然存在的或转基因烟草植物的基本上所有形态和生理特征。确切的回交方案将取决于被改变的性状，以确定合适的测试操作方案。虽然当被转移的性状是显性等位基因时，回交方法是简化的，但也可转移隐性等位基因。在这种情况下，可能有必要引入对后代的测试，以确定是否已成功转移所需性状。
多个实施例提供了突变型植物、非天然存在的植物或转基因植物以及生物量，其中多核苷酸(或如本文所描述的其任何组合)的表达水平被调节，以调节其中的硝酸盐和/或至少NNK含量和/或生物产量。
此类植物特别是烟草植物的一部分，以及更特别地烟草植物的叶片和中脉，可掺入或用于制备多种消费品，包括但不限于气雾形成材料、气雾形成装置、吸烟物品、可抽吸物品、无烟产品和烟草产品。气雾形成材料的例子包括但不限于烟草组合物、烟草、烟草提取物、烟丝、切丝填料、烘烤的烟草、膨胀烟草、均质烟草、再造烟草和烟斗烟草。吸烟物品和可抽吸物品是气雾形成装置的类型。吸烟物品或可抽吸物品的例子包括但不限于香烟、小雪茄和雪茄。无烟产品的例子包括嚼烟和鼻烟。在某些气雾形成装置而不是燃烧中，烟草组合物或另一气雾形成材料被一个或多个电加热元件进行加热，以产生气雾。在加热气雾形成装置的另一类型中，通过将热从可燃性燃料元件或热源转移到物理上分开的气雾形成材料来产生气雾，所述气雾形成材料可位于热源之内、热源周围或热源下游。无烟烟草产品和多种含烟草的气雾形成材料可包含任何形式的烟草，包括沉积在其他成分上、混合于其他成分中、由其他成分包围或以其他方式与其他成分组合的干燥颗粒、碎片、小颗粒、粉末或浆料，所述其他成分采取任何形式，例如絮片、膜、卡(tab)、泡沫或珠。如本文使用的，术语“烟”用于描述一类气雾，其由吸烟物品如香烟、或通过燃烧气雾形成材料而产生。
在一个实施例中，本发明还提供了来自本文所述的突变型、转基因和非天然存在的烟草植物的烘烤的植物材料。烘烤绿色烟叶的工艺是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于空气烘烤、火烘烤、烟熏和日光烘烤。烘烤绿色烟叶的工艺取决于收获的烟草类型。例如，弗吉尼亚烟烤(淡色)烟草通常是烟道烘烤的，白肋烟草和某些深色品系通常是晾干的，且烟斗烟草、嚼烟和鼻烟通常是火烤的。
在另一个实施例中，本发明描述了包括含有烟草的气雾形成材料的烟草产品，所述气雾形成材料包含来自本文所述的突变型烟草植物、转基因烟草植物或非天然存在的烟草植物的植物材料，例如叶，优选烘烤的叶。本文所述的烟草产品可以是混合的烟草产品，其还可包含未修饰的烟草。
当与源自非突变型、非天然存在的或非转基因的配对物的消费品相比较时，在这些可抽吸物品和无烟产品及其气雾中的NNK量，可低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％，例如低约200％或300％。
当与源自非突变型、非天然存在的或非转基因的配对物的消费品相比较时，在这些可抽吸物品和无烟产品及其气雾中的NNN量，可低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％，例如低约200％或300％。
当与源自非突变型、非天然存在的或非转基因的配对物的消费品相比较时，在这些可抽吸物品和无烟产品及其气雾中的硝酸盐量，可低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％，例如低约200％或300％。
当与源自非突变型、非天然存在的或非转基因的配对物的消费品相比较时，在这些可抽吸物品和无烟产品及其气雾中的烟碱量，可低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％，例如低约200％或300％。与源自非突变型、非天然存在的或非转基因的配对物的消费品相比较，在这些可抽吸物品和无烟产品及其气雾中的烟碱量可大致相同。
当与源自非突变型、非天然存在的或非转基因的配对物的消费品相比较时，在这些可抽吸物品和无烟产品及其气雾中的总TSNA量，可低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％，例如低约200％或300％。
突变型、非天然存在的或转基因植物可具有在例如农业中的其他用途。例如，本文描述的突变型、非天然存在的或转基因植物可用于制备动物饲料和人食物产品。
培养本文所述的突变型植物、非天然存在的植物或转基因植物，并且从培养的植物中收集种子。来自本文所述植物的种子可通过本领域中已知的方式进行条件处理，且包装在包装材料中，以形成制造物品。包装材料例如纸和布是本领域众所周知的。种子的包装可带有描述其中种子的性质的标记，例如固定至包装材料的标签或标记、印刷在包装上的标记。
用于植物基因分型以鉴定、选择或育种的组合物、方法和试剂盒可包括检测多核苷酸样品中的多核苷酸(或如本文所描述的其任何组合)存在的手段。相应地，本发明描述了组合物，其包含用于特异性扩增多核苷酸中的一种或多种的至少一部分的一个或多个引物，以及用于进行扩增或检测的任选的一个或多个探针和任选的一种或多种试剂。
相应地，本发明公开了基因特异性的寡核苷酸引物或探针，其包含对应于本文所述的一种或多种多核苷酸的约10个或更多个邻接多核苷酸。所述引物或探针可包含约15、20、25、30、40、45或50个或更多个邻接多核苷酸，或者由约15、20、25、30、40、45或50个或更多个邻接多核苷酸组成，所述引物或探针与本文所述的一种或多种多核苷酸杂交(例如，特异性地杂交)。约10至50个邻接核苷酸、约10至40个邻接核苷酸、约10至30个邻接核苷酸、或约15至30个邻接核苷酸，其可用于基因鉴定(例如，DNA杂交)、或分离(例如，细菌菌落或细菌噬菌体噬菌斑的原位杂交)、或基因检测(例如，作为核酸扩增或检测中的一个或多个扩增引物)的序列依赖性方法。可设计一个或多个特异性引物或探针，且用于扩增或检测一种或多种多核苷酸的部分或全部。作为具体例子，两个引物可用于聚合酶链反应方案中，以扩增编码核酸例如DNA或RNA的核酸片段。还可使用源自核酸序列的一个引物和第二引物(其与核酸序列上游或下游的序列杂交，所述序列例如启动子序列、mRNA前体的3'末端或源自载体的序列)，执行聚合酶链反应。可用于多核苷酸体外扩增的热和等温技术的例子是本领域众所周知的。样品可以是或可源自植物、植物细胞或植物材料，或者从如本文所述的植物、植物细胞或植物材料制备或衍生的烟草产品。
在另一方面，本发明还提供了检测样品中本文所述的一种或多种多核苷酸(或如本文所描述的其任何组合)的方法，其包括下述步骤：(a)提供包含或疑似包含多核苷酸的样品；(b)使所述样品与多个引物之一或一个或多个探针接触，用于特异性检测所述一种或多种多核苷酸的至少一部分；和(c)检测扩增产物的存在，其中所述扩增产物的存在指示样品中存在一种或多种多核苷酸。在另一方面，本发明还提供了使用一个或多个引物或探针，用于特异性地检测一种或多种多核苷酸的至少一部分。本发明还提供了用于检测一种或多种多核苷酸的至少一部分的试剂盒，其包含用于特异性检测一种或多种多核苷酸的至少一部分的多个引物或探针之一。试剂盒可包含用于多核苷酸扩增(例如PCR)的试剂，或用于探针杂交检测技术(例如DNA印迹、RNA印迹、原位杂交或微阵列)的试剂。试剂盒可包含用于抗体结合检测技术(例如蛋白质印迹、ELISA、SELDI质谱法或测试条)的试剂。试剂盒可包含用于DNA测序的试剂。试剂盒可包含试剂和说明书，用于确定硝酸盐含量和/或至少NNK含量和/或NNN含量和/或烟碱含量和/或总TSNA含量。适当地，试剂盒可包含试剂和说明书，用于确定植物材料、烘烤的植物材料或烘烤的叶中的硝酸盐含量和/或至少NNK含量和/或烟碱含量和/或NNN含量和/或总TSNA含量。
在一些实施例中，试剂盒可包含用于所述方法中的一种或多种的说明书。所述试剂盒可用于遗传同一性确定、系统发育研究、基因分型、单倍体分型、谱系分析或植物育种，特别是共显性评分。
本发明还提供了对包含如本文所述的多核苷酸的植物、植物细胞或植物材料进行基因分型的方法。基因分型提供了区分染色体对的同源物的手段，并且可用于区分在植物群体中的分离子。分子标记方法可用于系统发育研究、表征作物品种之间的遗传关系、鉴定杂交或体细胞杂种、定位影响单基因性状的染色体节段、图位克隆和定量遗传研究。基因分型的具体方法可采用任意数目的分子标记分析技术，包括扩增片段长度多态性(AFLP)。AFLP是由核苷酸序列变异性引起的扩增片段之间的等位基因差异的产物。因此，本发明还提供了使用诸如AFLP分析这样的技术，来跟踪一种或多种基因或核酸、以及遗传连锁至这些基因或核酸的染色体序列的分离的手段。
在一个实施例中，本发明还提供了来自本文所述的突变型、转基因和非天然存在的植物的烘烤的植物材料。例如，烘烤烟叶的工艺是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于空气烘烤、火烘烤、烟熏和日光烘烤。烘烤绿色烟叶的工艺取决于收获的烟草类型。例如，弗吉尼亚烟烤(淡色)烟草通常是烟道烘烤的，白肋烟草和某些深色品系通常是晾干的，且烟斗烟草、嚼烟和鼻烟通常是火烤的。
在另一个实施例中，本发明描述了烟草产品，其包括包含来自本文所述的突变型、转基因和非天然存在的植物的植物材料(例如叶，适当地烘烤的植物材料，例如烘烤的叶)的烟草产品，或通过本文所述的方法生产的烟草产品。本文所述的烟草产品还可包含未修饰的烟草。
在另一个实施例中，本发明描述了烟草产品，其包含来自本文所述的突变型、转基因和非天然存在的植物的植物材料，优选叶，例如烘烤的叶。例如，所述植物材料可加入烟草产品内部或外部，并且因此在燃烧后释放期望的香气。根据此实施例的烟草产品甚至可以是未修饰的烟草或经修饰的烟草。根据此实施例的烟草产品甚至可源自突变型、转基因或非天然存在的植物，其在除了本文公开的基因之外的一种或多种基因中具有修饰。
本发明还在下文实例中描述，提供所述实例以更详细地描述本发明。这些实例阐述目前考虑用于进行本发明的优选方式，意欲举例说明而不是限制本发明。
实施
实例1：NtCLCe-s序列的鉴定
为了鉴定NtCLCe-s，通过RT-PCR分析和潜在匹配的EST毗连群的存在，在普通烟草叶中检测相关转录物(NtCLCe-s:NCBI_43350-v4ctg-in)。来自Affymetrix定制的烟草外显子阵列的数据(来自NtPMIa1g22230e1-st的序列探针)用于确认NtCLCe-s在普通烟草的根、绿叶和衰老叶中同等表达。此外，发现冷应激和强镉应激不影响NtCLCe-s表达水平，由此提示NtCLCe-s在烟草根和叶器官中是组成型表达的。组成型NtCLCe表达可与其在质体中的基本细胞作用的维持关联，所述质体据推测与氮同化途径联系。根据WoLFPSORT软件，NtCLCe-s高度预测为质体膜蛋白。RNAseq研究确认转录物在其祖先美花烟草中的存在。
实例2：NtCLCe-t序列的鉴定
为了鉴定NtCLCe-t，通过RT-PCR分析和相应EST毗连群的存在，在普通烟草叶中检测相关转录物。RNAseq研究确认转录物在其祖先绒毛状烟草中的存在，由此提示在进入异源四倍体状态后，NtCLCe-t拷贝的表达在普通烟草中可能丧失，可能是由于基因破坏和/或重排。
实例3：NtCLCe-s或NtCLCe-t在普通烟草叶中的表达
CLC-Nt2-s和CLC-Nt2-t基因两者均在普通烟草叶中表达，如通过两种转录物在普通烟草叶中的存在(通过RT-PCR验证的定制的烟草外显子阵列研究)和相应EST毗连群(CLC-Nt2-s:MIRA_20760-v4ctg-in；CLC-Nt2-t:NCBI_56794-v4ctg-in)。另外，RNAseq研究确认相应转录物在两个祖先美花烟草和绒毛状烟草中的存在。
当更仔细地查看来自烟草外显子阵列的转录组数据时，所述烟草外显子阵列使用分别对于CLC-Nt2-t和CLC-Nt2-s特异性的探针NtPMIa1g19904e2-st和NtPMIa1g50210e2-st，可见两个拷贝在普通烟草中差异表达。CLC-Nt2-s在白肋根(TN90)中弱表达，并且CLC-Nt2-t对昼夜节律敏感。两种基因均在烟熏的烟草的根和叶中表达且对镉处理不敏感。
实例4：CLC-Nt2-t表达在普通烟草中的沉默
在CLC-Nt2的编码序列中鉴定并且在普通烟草(Hicks阔叶)中侧接内含子(与CLC-Nt2-s具有100％同一性并且与CLC-Nt2-t具有97％同一性)的DNA片段(SEQ ID NO:8)，以便使用RNAi方法使烟草中的CLC-Nt2复本沉默。确切地如由制造商(Invitrogen)详述的，经由入门载体，将相应的DNA片段插入Gateway载体pB7GWIWG2(II)内。该载体含有用于转基因在所有植物组织中的组成型表达的启动子(花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子)，以及用于卡那霉素抗生素抗性的kan基因。随后使用常规叶盘操作，经由根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefasciens)，将该构建体插入白肋烟草肯塔基14(KY14)的基因组内。由愈伤组织再生个体品系。转基因品系的选择通过对来自小植株的经分离的基因组DNA的PCR执行。RNAi沉默T0品系通过RT-PCR进行监控，并且生长用于种子生产，所述RT-PCR使用侧接用于沉默的插入片段的特异性引物。将T1种子收集，在琼脂平板上再生长，并且确切地与T0小植株一样进行监控。阳性植物在罐中生长且在温室中培养。在收获时间(10周龄植物)，将在杆中间位置处的一片叶取样，且使用硝酸盐比色测定试剂盒(Cayman,US)或Skalar实施硝酸盐测定。所有剩余叶均是使用本领域已知的标准方法，通过植物在小型实验空气烤房中两个月的烘烤植物。在烘烤后，将每棵植物的叶装配且实施TSNA分析。
实例5：NtCLCe表达在普通烟草中的沉默
使用RNAi方法克隆在NtCLCe编码序列中鉴定的DNA片段(SEQ ID NO:9)使NtCLCe复本均沉默。随后确切地如由制造商(Invitrogen)详述的，经由入门载体，将相应的DNA片段插入Gateway载体pB7GWIWG2(II)内。该载体含有用于转基因在所有植物组织中的组成型表达的启动子(花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子)，以及用于卡那霉素抗生素抗性的kan基因。随后使用常规叶盘操作，经由根瘤土壤杆菌，将该构建体插入白肋烟草肯塔基14(KY14)的基因组内。由愈伤组织再生个体品系。在琼脂平板上的选择通过对来自小植株的经分离的基因组DNA的PCR执行。RNAi沉默T0品系随后通过RT-PCR进行监控，并且生长用于种子生产，所述RT-PCR使用侧接用于沉默的插入片段的特异性引物。将T1种子收集，在琼脂平板上再生长，并且确切地与T0小植株一样进行监控。阳性植物在罐中生长且在温室中培养。在收获时间(10周龄植物)，将在杆中间位置处的一片叶取样，且使用硝酸盐比色测定试剂盒(Cayman,US)或Skalar实施硝酸盐测定。剩余的叶均是使用本领域已知的标准方法，通过植物在小型实验空气烤房中两个月的烘烤植物。在烘烤后，将每棵植物的叶装配且实施TSNA分析。
实例6：在CLC-NT2-RNAi和NtCLCe-RNAi植物中的TSNA分析
执行使用对基因组DNA的PCR的CLC-NT2-RNAi和NtCLCe-RNAi植物选择，以鉴定转基因插入片段，随后为对cDNA(得自经分离的总RNA)的RT-PCR。如图1中所示(半定量RT-PCR分析)，与野生型植物相比较，发现CLC-Nt2或NtCLCe基因在CLC-Nt2-RNAi和NtCLCe-RNAiT1植物的绿叶中完全或部分沉默(示出了三棵代表性植物)。有意思的是，在两种RNAi植物中，NtCLCe和CLC-Nt2基因不依赖于使用的构建体进行沉默，由此提示在叶中这两种基因之间可能的串扰调节。在第一实验中，T1小植物在发芽后在小罐(3升罐)中生长。在收获时间(移植后10周)，在CLC-Nt2-RNAi和NtCLCe-RNAi绿叶(杆中间位置)两者中观察到硝酸盐降低，然而，与CLC-Nt2植物相比较，硝酸盐降低在NtCLCe-RNAi植物中明显(P<0.01)更有效(～95％)(约seq id no:5％，参见图2A)。当与wt植物相比较时，在两种转基因植物中也可见烟碱降低(～35％)。该烟碱降低提示NtCLCe和CLC-Nt2在某些生长条件下影响根中的硝酸盐再分布，所述某些生长条件影响烟碱合成。在烘烤后的两种CLC-RNAi植物中测定总TSNA(NNN、NNK、NAT(N9-亚硝基新烟草碱)和NAB(N9-亚硝基假木贼碱)(参见图2B)。NNK、NNN、NAB和NAT是商购可得的，其可用作参考标准。NNK、NNN、NAB和NAT的标准分析方法是本领域已知的(参见例如Nicotine&Tobacco Research(2006)2:309 313)。可使用超高效液相层析-串联质谱法(UPLC-MS/MS)。用于测量烟碱的方法也是本领域已知的(参见例如International Journal of Cancer(2005)；116:16 19)。数据指示硝酸盐水平的强烈降低阻止烘烤的叶中的TSNA形成，这可能是因为硝酸盐是叶中亚硝化试剂的主要来源，促成TSNA形成。当与NtCLCe-RNAi 植物相比较时，在CLC-Nt2-RNAi植物中发现的硝酸盐降低不导致这样强的TSNA效应。
为了阻止根生长的任何应激条件，使用10升罐重复先前实验。在此类条件下，当与先前实验相比较时，野生型烟草植物累积约五倍更多的烟碱。确切地如前所述，选择显示基因表达降低的NtCLCe-RNAi和CLC-Nt2-RNAi植物。因为来自两种构建体的大多数转基因植物显示出NtCLCe和CLC-Nt2的表达降低(参见图1)，所以将显示出两种CLC表达降低的RNAi植物组合在一起(CLC-RNAi植物)，并且实施烟碱和硝酸盐分析(参见图3A)。在该实验中未发现在CLC-RNAi植物的第一实验中观察到的烟碱降低，由此确认与野生型植物相比较，通过使用小罐约束根发育可触发NtCLCe-RNAi和CLC-Nt2-RNAi植物两者中的另外烟碱降低(比较图2A和3A)。然而，与野生型植物相比较，硝酸盐在两种CLC-RNAi植物中仍明显降低(>40％)。从而确认NtCLCe和CLC-Nt2的表达降低导致烟草叶中的硝酸盐含量减少。在此类生长条件下，转基因植物未显示与wt植物相比较的任何表型差异，如通过比较总叶重和叶数目可见的(参见图3B和3C)。
这些植物中的TSNA分析显示与野生型植物相比较，NNN在空气烘烤的叶中不降低。然而，与野生型植物相比较，在NtCLCe-RNAi和CLC-Nt2-RNAi植物两者中可见24和10％NNK降低(参见图4)。NNK降低在NtCLCe-RNAi(P<0.01)中比在CLC-Nt2-RNAi植物中更明显，由此确认在第一实验中对于总TSNA获得的数据(参见图2)。
尽管转基因和野生型植物未在田间环境中生长，并且未在典型空气烘烤烟草房中进行烘烤，但我们的数据显示限制NtCLCe(NtCLCe-s)和CLC-Nt2(s和t拷贝)的表达促成有效降低烟草叶中的硝酸盐。在烘烤后，发现TSNA(NNK)在叶中降低，从而指示降低绿叶中作为烘烤期间的亚硝化试剂提供者的硝酸盐含量有效促成降低相应的烘烤的叶中的TSNA形成。该降低可对应于NNK中的至少20％降低。
实例7：在普通烟草中的CLC-Nt2-s、CLC-Nt2-t、NtCLCe-s或NtCLCe-t的甲磺酸乙酯诱变
普通烟草AA37的M0种子用甲磺酸乙酯(EMS)以不同浓度和暴露时间进行处理，以便生成具有随机点突变的植物群体。对于每个处理在M1代时估计杀死曲线，连同致死率、能育性和嵌合率。使M1植物自花授粉以生成M2种子家族，以允许隐性等位基因恢复为纯合的并且致命的等位基因恢复为杂合的。提取来自每个EMS诱变群体家族的8棵M2植物的基因组DNA且筛选突变体，同时将M2植物材料和M3种子收集且贮存用于未来分析。为了鉴定且表征突变型变体，将来自M2植物的基因组DNA样品按组合并，并且通过靶向基因片段的测序进行筛选。使用表2中所示的引物扩增靶基因片段。通过测序个别DNA片段检索靶基因中的突变。多种突变体显示于表1中。
实例8：田间生长的CLCNt2-s G163R纯合突变型烟草植物的分析
田间生长的CLCNt2-s G163R突变型烟草植物的绿叶中的硝酸盐和烟碱水平的时间过程显示于图5中。从CLCNt2-s G163R纯合突变型烟草植物(三角形)和在白肋方案下在田间生长的外分离子野生型(菱形)烟草植物的杆中间位置处收获整片叶。样品在上午期间的三个不同时间(早、中和晚)进行收获且冷冻干燥。粉末状叶片材料就硝酸盐和烟碱含量进行分析。N＝4-8棵个别植物。在图中指出标准差。
该实验的结果显示与对照植物相比较，CLCNt2-s G163R纯合突变型烟草植物在早晨具有降低的硝酸盐水平。硝酸盐水平从对照植物中的约11mg/g降低到突变型植物中的约6mg/g。硝酸盐水平在半晌午继续减少。硝酸盐水平从对照植物中的约7mg/g降低到突变型植物中的约4.5mg/g。到上午晚些时候，硝酸盐水平与半晌午相比较在突变型植物中已增加，并且达到早晨存在的硝酸盐水平。关于对照，对照植物中的硝酸盐水平继续减少。到上午晚些时候，硝酸盐水平在突变型植物中增加至约6mg/g，并且在对照植物中减少至约3mg/g。尼古丁水平在上午期间略微相似。尼古丁水平对于突变型植物在约13mg/g和约11mg/g之间变化，并且对于对照植物在约9mg/g和约13mg/g之间变化。尼古丁结果指示突变型植物的代谢是正常的。突变型植物和对照植物的生物量水平也是可比较的。
实例9：田间生长的NtCLCe-t P143L纯合突变型烟草植物的分析。
田间生长的NtCLCe-t P143L突变型植物的绿叶中的烟碱和硝酸盐水平的时间过程显示于图6中。从田间生长的NtCLCe-t P143L纯合植物(正方形)和在白肋方案下生长的外分离子野生型(菱形)植物的杆中间位置处收获整片叶。样品在上午期间的三个不同时间(早、中和晚)进行收获且冷冻干燥。粉末状叶片材料就硝酸盐和烟碱含量进行分析。N＝4-8棵个别植物。在图中指出标准差。
该实验的结果显示与对照植物相比较，NtCLCe-t P143L纯合突变型烟草植物在早晨具有增加的硝酸盐水平。硝酸盐水平从对照植物中的约7mg/g增加到突变型植物中的约14mg/g。硝酸盐水平在半晌午在突变型植物中减少，并且在对照植物中轻微增加。突变型植物中的硝酸盐水平降低至约9mg/g，并且对照植物中的硝酸盐水平增加至约9mg/g。到上午晚些时候，硝酸盐水平与半晌午相比较在突变型植物中已继续减少。关于对照，对照植物中的硝酸盐水平减少。到上午晚些时候，硝酸盐水平在突变型植物中减少至约2mg/g，并且在对照植物中减少至约4mg/g。对于突变型和对照植物各自，尼古丁水平在上午期间略微相似。尼古丁水平对于突变型植物在约20mg/g和约24mg/g之间变化，并且对于对照植物在约15mg/g和约17mg/g之间变化。尼古丁结果指示突变型植物的代谢是正常的。突变型植物和对照植物的生物量水平也是可比较的。
实施例10现场试验
植物的不同CLC变异突变呈现阳性(包括选定的改变对氯气灭菌敏感度的种类)，在La Sota(Payerne，瑞士)的现场试验中进行基因分型和检测，采用经典的白肋烟施肥制度，参照涉及到氮代谢的不同CLC基因或其他基因。根据基因型绘制10个植物，至少重复三次，沿着可用区段随机分布，为便于比较，保持分离野生型(黑实线)，杂合型(虚线)和纯合型(白色)在相邻区段中。
打顶后,成熟叶片被晾在茎上。加工之后，从每个植物的茎上摘下15个叶片(如果可能)，收集在纸包里用于进一步的分析。为了检测生物量，还记录了每条线的植物数量和烟叶材料重量。
如图7B所示，纯合型CLCe T P184S突变植株的生物量几乎达到在相同条件下生长和处理的杂合型和分离野生型植株的两倍。生物量的增加在统计上是有效的(可信区间为95％)，三个纯合型曲线(图7A)一致，这一对应于NtCLCe-T P184S纯合型植物的结果是独特的。如图8中所示，事实上所有其他变异体的曲线(CLC基因家族甚至是其它基因内不同突变的分离野生型或纯合型植株)显示相同的平均值，和仅NtCLCe-T P184S纯合型植物达到其它类型平均生物量的将近2倍。
通过在打顶期分析每个植物的叶片数量，结果显示NtCLCe-T P184S纯合型植物的生物量增加很可能是因为单个叶片的生物量增加，而不是叶片数量，如图9所示没有的基因型NtCLCe T P184S植株的任何基因型都与其它类型植物的叶片数量明显不同。
在本文中引用的或描述的任何出版物提供了在本申请的提交日期之前公开的有关信息。本文中的陈述不应解释为承认：发明人丧失先于这样的公开的资格。在上面的说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的各种修改和变化对于本领域技术人员是显而易见的。尽管已经结合具体优选实施例描述了本发明，但应当理解，要求保护的发明不应当不适当地限于这样的具体实施例。实际上，细胞生物学、分子生物学和植物生物学或有关领域的技术人员显而易见的用于实现本发明的所描述模式的不同改进意图在以下权利要求的范围内。
序列
SEQ ID NO:1(来自普通烟草的CLC-Nt2的DNA序列；序列源于祖先美花烟草)
atggaggagccaactcgattagtagaagaagcaacgattaataacatggacggacaacagaatgaagaagaaagagatccagagagcaattcactgcatcagcctcttctcaagagaaacagaacactatcatccagtccatttgccttggttggagctaaggtctcccacatcgaaagtttggattatgagtaagaacaactaataatcttatcatagatcaagtatagcttttctttacttgtgcattaaaagggccaacagaaattggatgtcctaattgtgtgtgtctgttttaggatcaacgagaatgatctcttcaagcatgactggagaaggagatctagagttcaagtattacagtatgtgttcttgaaatggacactggcatttttggtcggcctgcttacaggagttacagccaccctcatcaatcttgcaatcgaaaacatggctggttacaaacttcgagctgttgtgaactatatcgaggatagaaggtaggtgatgttttccctatgatcaacaattcataaatgcttccagaagtcttactactgattcttcaatacgataccactagctaatgactaagaacaagaccaaagatcacttatttgacttgaattatgttattgatttattcataattgagattgtaacaatggttacaggtaccttatgggatttgcatattttgcgggtgctaattttgtgctcactttgatagctgcccttctctgcgtgtgctttgcacctactgctgcagggcctggaattcctgaaatcaaagcttatctcaacggtgtagatactcccaatatgtatggagcaaccacactttttgtcaaggtgcgtcacacacccaattttatcagtgctggcaattcagatagcaggcagattataacgccatcagtatagtattgagattctgtcgaaccagatgtataaatagatagaatagcagcaaataacacatttttatcttagtcgtgatggcacctaatccgacccgctagataagccaaatacaatcaacacatatttatggaattcaatctcatttgggaagtgatctctatctttcagtaatcagataggaagtggtttaagaataaaaagagaattttagaatcgaatgcactcatccagcgaggaagatccatcagtggtatctaatttactcttgaacttccagcagttcaatcctttggtaccgtcactgtaacttgtttttttcaatctttgtgactaacatggaagggaggaaaatcctgactttcagtgattttcctcgcttacagtgaaagtcaggatatagcttcggtgagactcagcttatatgtcttaattgaatatgctatttgttgactaacatggatttgccctatcatgaaaatgaaggaagcgccaaaaatacatatacttaaacaggggcggacccaagtggtgagaagtgggttcaactgaacccgcttcgtcaaaaaaatactgtgtatatgtataaattatggctaaagcaaggtaaattttgtatagaaataagcttatgttagttatggacttctcctgggtccgctactgtacttaaaagcacatacgaagagatacacaaactaagggcaaaggttcataatttaaggcagttgtgtccagaagaacaaattttgcttgcatgttgcagtgtgaatttaacaataaaagaattatgatcgcaaatttccacttgtaattgtactataagattctaaattttgagagatttgacatgtttgctttccctttgactgaatcgtaaaagtgaaagtgaagttcatcagaagtagattatgatacttaccaacccctttttcccttaaacaatctttaatctgttcactcacagatcattggaagcattgcagcagtttctgctagcttagaccttggaaaagaagggccattggttcacattggcgcttgctttgcttccttactaggtcaaggtggtccagataattaccggctcaggtggcgttggctccgttacttcaacaacgatcgggacaggcgagatcttatcacatgtgggtcatcatcaggtgtgtgtgctgctttccgttctccagtaggtggtgtcctatttgctttagaggaagtggcaacatggtggagaagtgcactcctctggagaactttcttcagcacggcagttgtggtggtgatactgagggccttcattgaatactgcaaatctggcaactgtggactttttggaagaggagggcttatcatgtttgatgtgagtggtgtcagtgttagctaccatgttgtggacatcatccctgttgtagtgattggaatcataggcggacttttgggaagcctctacaatcatgtcctccacaaaattctgaggctctacaatctgatcaacgagtaagcacctactcttccacattcccaactggatcatcaaacattcagttggttctctatattttaaaggcaatgcatatccacacaaaaatgagcttacttggattagaatcatcttgagacattgatccaactgtcttgcatctttttaagtttaaatcctaattcctatccaaacatggccttcttatcacatttaactgccaaaaaaaaagggaaaactatagatgcaaaatcctgactttcaatctttgatccttttttatcttgcaggaagggaaaactacataaggttcttctcgctctgagtgtctcccttttcacctccatttgcatgtatggacttccttttttggccaaatgcaagccttgtgatccatcacttcccgggtcttgtcctggtactggagggacaggaaacttcaagcagttcaactgcccagacggctattacaatgatcttgctactcttctccttacaaccaacgatgatgcagtccgaaacattttctccataaacactcccggtgaattccaagttatgtctcttattatctacttcgttctgtattgcatattgggactcatcacttttgggattgctgtgccatctggtctcttccttccaatcatcctcatgggttcagcttatggtcgcttgcttgccattgccatgggatcttatacaaaaattgatccagggctgtatgcggttctcggagcagcttcccttatggctggttcaatgagaatgactgtttctctttgcgtcatatttcttgagctaacaaacaatcttctccttctgccaataacaatgctggttcttctaattgccaaaagtgtaggagactgcttcaacctaagtatttatgaaataatattggagctgaaaggtctacctttcctggatgccaacccggagccatggatgagaaatatcactgctggtgagcttgctgatgtaaagccaccagtagttacactctgtggagttgagaaggtgggacgtatcgtagaggccttgaagaacaccacatataacggattccctgtcgtcgatgaaggagtagtgccaccggtgggtctgccagttggggcaactgaattgcacggtcttgtcctaagaactcaccttcttttggttctcaagaaaaagtggttccttcatgaaagacggaggacagaggagtgggaagtgagagagaaattcacctggattgatttagctgagaggggcggtaagatcgaagatgtgttagttacaaaggatgaaatggagatgtatgtcgatttgcatcccctgactaacacaaccccttatactgtggtagaaagcttgtcagtggctaaggcaatggtgcttttcaggcaggtggggctccgccacatgctcattgtacccaaataccaagcagcaggggtgagattataagcaaatttcagttatttttcttatgcaaatatctccctcctatcatagtataaagatgcacagaaatagtcatatggtaatataagcacttgtttagaataattataggtggcaaagttattttacattagaagtgataaaagcattacttacatcacacttgtgctccttttgtaggtatctcctgtggtgggaatcttgaccaggcaagacttgagagcccacaacattttgagtgtcttccctcatctggagaagtcaaaaagcggtaaaaaggggaactga
SEQ ID NO:2(来自普通烟草的CLC-Nt2的DNA序列；序列源于祖先绒毛状烟草)
atggaggagccaactcgattagtagaagaagcaacgattaataacatggacagacaacagaatgaagaagaaagagatccagagagcaattcactgcatcagcctctcctcaagagaaacagaacactatcatccagtccatttgccttggttggagctaaggtctcccatattgaaagtttagactatgagtaagaacaactaataatcttatctttagatcaagtatagcttttctttataaatgggccaacagaaattggatgtcctaattttgtgtatctgctttaggatcaacgagaatgatctcttcaagcatgactggagaagaagatccagagttcaagtattacagtatgtattcttgaaatggacactggcatttttggtcgggcttcttacaggagtgacagcctcccttatcaatcttgcaatcgaaaacattgctggctacaaacttagagctgttgtgaactatatcgaggatagaaggttggtgatgttttccctatgatcagcaattcataaaggctactataattcttcaatatgattccactagctaatgactaagaacaagatcaaagatcacttatttgacttgaattatgttattgatttgttcataattgagattgtaacaatggttacaggtaccttgtgggatttgcatattttgcgggtgctaattttgtgctcactttgatagctgcccttctctgcgtgtgttttgcgcctactgctgcagggcctggaattcctgaaatcaaagcttatctcaacggtgtagatactcccaacatgtacggagcaaccacactttttgtcaaggtgcgtcacgcacccaattttatcagtgctggcaattcaggtagcaggcagattataacgccatcagtatagtattgagatcctgttgacctagatgtataaatagaaagaatagcagcaaataacacatttttagcctacatatttatggaattcaatctcatttgggaagtgatatctatctttcagtaatcagataggaagttgtttaagaataaaaagagaattttatcgaatgcactcatccagcaaggaagatccatcagtggtatctaatctactcttgaacttccagtagttcaatcctttggtactgtcactgtaacttgttttctcatccaccattaaaatacaatagcttccatgagactcagcttatatgtctcaattgaatatgctatttggtgactaacatgaatttgccctatcatgaaaataaatggaagtgacaaaaatacatatacttaaaagcacatatgtagagacacgcagactaagggcaaaggttcacaattttaaggcagttgtgtccagaagaacaaatgaagaattatgatcacaaatttccacttgtaattgtactataaaatttttaattttgagagattctgacatgtttgctttccctttgattgaatcgtaaaagtgaaagtgaagttcatcagaagtagattatgatacttaccaactcctttttccccctaaacaatctttaatctcttcacttacagatcattggaagcattgcagcagtttctgctagcttagaccttggaaaagaagggccgttggttcacattggcgcttgttttgcttccttactaggtcaaggtggtccagataattaccggctcaaatggcgctggctccgttacttcaacaacgatcgggacaggcgagatctcatcacatgtgggtcatcatcaggtgtgtgtgctgctttccgttctccagtaggtggtgtcctatttgctttagaggaagtggcaacatggtggagaagtgcactcctctggagaactttcttcagcacggcagttgtggtggtgatactgagggccttcatagaatactgcaaatctggctactgtggactttttggaagaggagggcttatcatgtttgatgtgagtggtgtcagtgttagctaccatgttgtggacatcatccctgttgttgtgattggaatcataggcggacttttgggaagcctctacaattgtgtcctccacaaagttctgaggctctacaatctcatcaacgagtaagcaccaactcttccacattcccaactggatcatcaaacattcagttggttctctatatttaaaaggcaatgcatatccacacaaaaatgagcttacttggattagaatcatcttgagacattgatccaactgccttgcatctttttaagtttgaatcccaattcctatccaaacatggtctttttatcacatttaactgccaaaaaaagttactctatagatgtaaaatcctgactttcaaactttgatccttttttatcttgcaggaagggaaaactacataaggttcttctcgctctgagcgtctcccttttcacctccatttgcatgtatggacttccttttttggccaaatgcaagccttgtgattcatcacttcaagggtcttgtcctggcactggaggtacaggaaacttcaagcagttcaactgccctgacggctattacaatgatctcgctactcttctccttacaaccaacgatgatgcagtccgaaacattttctccataaacactcccggtgaattccatgttacgtctcttattatctacttcgttctgtattgtatcttgggactcatcacttttgggattgctgtgccatctggtctcttccttccaatcatcctcatgggttcagcttatggtcgcttgcttgccattgccatgggatcttatacaaaaattgatccagggctgtatgccgttctgggagcagcttcccttatggctggttcaatgagaatgactgtttctctttgcgtcatatttcttgagctaacaaacaatcttctccttctgccaataacaatgctggttcttctaattgccaaaagtgtaggagactgctttaacctaagtatttatgaaataatattggaactgaaaggtctacctttcctggatgccaacccggagccatggatgagaaatatcactgctggtgagcttgctgatgtaaagccaccagtagttacactttgtggagttgagaaggtgggacgtatcgtcgaggtcttgaagaacaccacatataacggattccctgtcgtcgatgaaggagtggtgccaccggtgggtctgccagttggggcaactgaattgcacggtcttgtcctaagaactcaccttcttttggttctcaagaaaaagtggttccttaatgaaagacgaaggacagaggagtgggaagtgagagagaaattcacctggattgatttagctgagaggggcggtaagatcgaagatgtggtagttacgaaggatgaaatggagatgtatgtcgatttgcatcccctgactaacacaaccccttatactgtggtagaaagcttgtcagtggctaaggcaatggtgcttttcaggcaggtggggctccgccacatgctcattgtacccaaataccaagcagcaggggtgagattataagcaaatttcagttattattcttatgcaaatatctccctcctatcatagtattaagatgcacagaaatagtcatatcgtggcaaagttattttacgttagtaagtgataaaagcattacttacatcacacttgtgctccttttgtaggtatctccggtggtgggaatcttgaccaggcaagacttgagagcccacaacattttgagtgtcttccctcatctggagaagtcaaaaagcggtaaaaaggggaactga
SEQ ID NO:3(来自普通烟草的NtCLCe的DNA序列；序列源于祖先美花烟草；一个起始密码子)
atgaatcacggaagttgttgggtcgtcatccaaattgctggccttgggctcgacgaccatctcttcctccgggacgttcctctgacggaaacattgaaaaagaacaagatatgtgcgacagcagcaaagtcgatagtgatagtggcatccagataggatctctgctcgaggaagttatcccacaaggcaataataccgctataatctcggcttgctttgttggcctcttcaccggtatcagtgtcgtgcttttcaacgctgcggtacgtgcgctataggtctttcatttctcttttcatgtactattcctccttacttacttggcctcagtcaatcagccccctgcctactttaaattattgtacattttatcagaggagtgtcctatacatcaaattcacataacttagtaaaatatgctgatattctgaattttaaacttaccagcttagaacatccaggttagttcagaaacagataatctaaattggtctcatttataagtcattttgttattcaagacatacaatttggctcttgataaaagattatgcagcgcccgatgattacctaatatttatcagcaacccatgtaatttaacaatattgtcaccatataaaagagaactgaagagaatgttcaatttgtggtcatataacggatatctcccttggttaggttcatgaaatacgtgatctttgttgggatggaattccatatcgagctgcctcagaggagcccattggagtacattggcaacgtgtaatcttagtaccagcttgtggcggtttggtagtcagctttttgaatgccttccgagccactctggaggtttcaactgaaggaagttggacatcatctgttaaatctgtattggaaccagttttgaagacaatggccgcttgtgtcacattaggaactgggaattccttaggaccagaaggccctagtgttgaaattggcacatctgttgccaagggagttggagctctgcttgataaaggtggtcgtagaaagctgtcactcaaggctgctggatcagctgctggaatcgcttctggtttgttccccatattattcttggttctgaaccatacatggtacattttccttataattacatgtagcctgttgtatgctttcctctttcccgggaagcctttttgtaaatacaagtgtgtttgcactcaaaccaataaactgtaaaaaaggtgaactccttaagcaagcaaaagcattagaaatgtaaactagacatatttctcagattgagagtctgagagattagaacacgagtgtttccattagagagagaaaagagacttctagatatttctattatctctgtaagagtgaatccgttcctatacaaaaaataggccttcattaaatacaagcttgggctgggtactactgggccaaagtaaaaaataaaaagaatcacccactatcaaatgggcctagtctaacaacccccttcaagctggagggtgacacaacccctagcttgcgaatatgaaaatgatgagcaggcccaagtaacactttggtaagaacatcaaccacttgagaagcactggagttgtgaaatagactgatcaggccattcccaagcttgccacaaacaaaatgacagtccagcttaatgtgtttagtgcgttcatggaaaacttggttttttgcaatgtggacttcctgattatcacaaaataaaggaacaggtaaagaaggagaaactccaatatcagacaataatttggtgagccaagacacctctgcaacagccttactcatggacctatactcagcttcaattgatgatagtgagacaacaggttgcttctttgatttccagctcaccaagctgccccccaagaaaaatacaaaaaccagtgacagacctgcggctgtctgggcaagaagcccaatcactgcacaataaagctgcaaagacaagtctggagagttattgcggaagattccaaagtcaaaagtgcccttgaggtatcttagcaagtgcagggcagcctgcatgttaggaacacagggagactgcataaactgactcagatgctgaacaacaaaactaaggtcaggccttgtgcgtatcaaaaagtttagcttgtgcattagactcctgtactcttcaggcctgggcaaaggagtgccaatcttagcttttaacttcacattcaattcaagggggcaagtgacagaagagcaattcgaggaatgaaaatcagcc agcaaatcatgaatgaactttttctgatgaagaagaaccccagaatcagtgtataaaacctcaatgctaaggaagtaattaagagagcccatgtccttaatcttgaactggtcactgagaaaggacttcaaagcagccaattcagctagatcacacctagtcaatatgatatcattcacatagacaaccaagatgaccaaggaatccctagaacccttggtaaaaatagagaaatcattcaaggaacgagagaagccattagagcacaaggcttgagataatttagcatactattgtcttgaagccagtcttaaaccataaagagacttctggagtttgcatactaaaggagcagaagaagagtgaggaacagttaggcccggtggcagcttcatgaatacctcctcatcaaggtccccatgtaagaagacattattcacatctagttgaaagaggggccagtgttgtttaacagctacaacaataagagttttgacaatagacatattgaccacaggagaaaaagtttcattaaagtcaataccctcaacttgagtgacctagctttatatctctcaatactttcattagccctatatttaaccttgtatacccacttacaactagtaggtttcttgccaggaggcaattcaacaatgtcccaagttctgttggcatccaaggcctcaaattcacatctcatggctgcctgccattcaggaacagctgcaacctgagagtaagaataaggctcaggaacatgaagttgactaagagaaggagcattagaaatagatctggagggaggaggagaagaagtggaggtgcagacataactcttgagatagttggttggattgtgtggcacggaagatcttctcaaagcaggaggaggtacaagagagttagaataatgagaaggagaagagatggaagtgggaacagagaagattgagaagcagtagaaggagaaagtgaaggagatgaaggagaggaagaagacggaaaggaacattcatcaaaacaagcagaaaagggaaaggggaagacttgaggtactacatgagaggattgaaagaaaggaaaaatggtgttcataaaaaatgacatcttttgatacaaaacaggtgttattctgaagattaaggcgcttgtagccctttttggcaaaagggtagccaatgaaaacacaaggaagggacctaggatgaaatttgttttgtgaggggtggtgacagttgagtaacagaggcacccaaaagctctaaggtggtgataagtagggtggaagaatgaagcaattcatagggacttttgtgattaagaagaggaaaaggaaatctgttaattaaatatgtggcagttaaaaagcagtcaccccaaaatttaagtggtagatgagactgaaacataagtgacctagcagtctctagtaaatttctgtgttctctttctacaataccattttattggggggtgtgaggacaggaggtttggtgtactatccctttttctgaaaagaaaaggcaaccagaagaactagatcccagttccaaagcattatcactcctaacagtttgaactttagattggaattgggtttcaaccatagcaatgaaaaccttgagcaaatcaaaggcattgcggcacccattaaatgtgtccaagtagccctagagtagtcatctacaatggttaaaaaatacctagaaccattataggtaggagtagaatagggtcaccaagtatttatgtgtattagctgaaaaggctgggtggagtgaatagaactatcagggaaggacaacctggtctgcctcgctaaaggacaaaccggactagtgaatgaccgtttggaagacagtttgcaattaagaccagaaatgcatttcattttatagaagggaatatggccaagtttgtaatgccaaacaacatcatctttattcacattatgcaaagcagtactagtatttacaattggagtatcatcaggtacagaaataggagcagaaactgaattaagcaaacaagaaataaggaaattagaaagaggtaaaggagatgatgttggaggcctggcattctgaaatagtttgtagagtccattgtccaatctaccaagaaccactggcttcctcactgaagggccctgtagggtacaagtagccttggtaaattgtacaatatcatcatcatgggaaagtaatttgtacacaaagatgagattatattgaaaactaggaatatagagcacattataaagaatcaagtcagggaacaaggctaaggaaccaatattagtgaccttaaccttatacccattaggaagggagacaaggtatggtacaggaagtgtttgaacattaaaaaaacaaatgtttaagggaggtcatgtggtcagatgcccagggtctattactcaaactacactatctatcatagtcagcataaatgcaccataagacaacccttgtgaggtaataactcaccagcaaagttggtagaagcaagatagttggttgaagaagtagatgatgctgatgaagacagttgagattgttgaagtaacattagctgagaatattggttcttggtaagaccaggaactggataggactgttcaggagcagaggtaccttcaggaccagctgacattgcagaaccaccagaggtatccacctcagcatgggcaacagaccttctgggaggaagagatctatttgacttgaaatttggaggaaagccattgagcttatagcacttatcaatgctatgtccgggtttcttacaatagtagacatgtgaagctcaaaagatcccttagaggtagtaccggacctttgaggttcaaaatttattttaggagagggaggaggcctggatacaccaacactgaaagaagcagaatttgaggcatattgagttctagcaaaaatttgtctttgcttctcatcagatagcaaaatcccatatacattaccaatggaaggtaagggcttcatcatgatgatgttgcttcttgtttggacataagtatcattcagtcccataaagaactggtagaccttttgttccctgtcttcagcagatttacccccacaagtacacattcaaactctcccggcagacaaagatgcaatatcatcccatagtcgtttaattttgttgaaatatgatgctatgtccatggacccttgggaaatatgagccagttccttctttagctcaaagatcctagtacctctcttctaactcagtccaaatattcttagcaaactcagagtattcaacactcttggatatttccttgtacatagagttagtcaaccaagagaccacaaggtcattgcaacgttaccactgtctggctagaggagaaccttcaggaggtctgtgagaagtaccattaatgaaatctagcttgttacgaatagacaaggcaactaggacattacgtctccaattgccataacagcttccatcaaaaggaccggaaactaaggaagttcccagcacgtctgatggatggacatataaggggcgacagggatgggtataatcatcttcatggaaaattaggcgtaagggagtagaagaagtcgcatcagcactggtgttattatcatttgccatttttttcaacagattgtcaatcaaccaacacaatacagatacacatatatagattgtgagaaagcacgagagaaaaatctatattattgatattctatttaattataatacaatgagccctatttatacaatacatatcatactcctattctatgtgggactaggactaattcatattatgtacataactatctaacactccccctcaagccggtgcatacaaatcatatgtaccgaacttgttacatatgtaactaatacaaggaccagtaaggaacttggtgaaaatatctgcaaactgatcatttgacttcacaaactttgtagcaatatctcatgagagtatcttttctctgacgaaatgacaattaatctcaatgtgtttagttctctcatgaaacaccggatttgatgctatatgaatggcagcttggttatcacacatcagttccatcttgctgacctcaccaaatttcaactaattaagtaaatgtttgatccaaactagctcacaagttgtcacagccattgctcgatattctgcttctgcactagaccgagcaaccacattttgtttcttgctcttccaagacacctaattacctcctactaaaacacaatatccagacgtagaacatctgtcaaaaggtgatcctgcctagccagcatttgagtacccaacaatttgctcatggcctcgatcttcaaacaataatctgttacctggagctgattttatatatcgaagaatgcagacaactgcatcccaatgactatcacaaggagaatccaagaactgacttaccacactcactggaaaggaaatatcaggtctaatcactgtgaggtaatttaatttaccaaccagccgcctatatctagcaggatcgctaagcggctccccctgtcctggtagaagtttagaattccgatccataggagtgtcaataggtctacaacgtgtcattcctgtctcctcaagaatgtctaaggcatacttcctttgtgagataacaatacatgtgctagactaagcgacctcaatacctagaaaatactttaatctgcccagatccttagtctgaaagtgctgaaagagatgttgtttcaacttagtaataccatcttgatcattgccggtaataacaatattatcaacataaaccaccagataaatactaagatttgaagaagaatgccgataaaacacagagtgatcagcttcactacgagtcatgccgaactcttgaataactgtgctgaacttaccaaaccaggctcgaggagactgttttagaccatagagggaccgacgcaaccgacatacaaggccactagactccccctgagcaacaaaaccaggtggttgctccatataaacttcacctcaaggtcaccacgaagaaaagcattcttaatgtccaactgatagagaggccaatggagaacaacaaccatggatagaaaaaggcggactgatgctattttagccacaggagagaaagtatcactgtaatcaagcccaaatatctgagtataccctttggcaacaagacgagccttaagtcgatcaacctggccatctggaccaactttgactgcatacacccaacgacaaccaacaataaatttacccgaaggaagaggaacaaactcccaagtaccactcgtatgtaaagcagacatctcgtcaatcatagcctgtcaccaccctagatgagacagtgcttcacctggatggaaatagaggacaaagatgatacaaatgcacaatagggtgatgacagacgatggtaacttaaaccgacataatggggattagcatttagtgtagaccgttcacctttccggagtgcaatcaattgactaagaggagacaagtccgcagtattagcaggatcaggtgcaggacgtgaatcagctgggcctgatgctgggcgcggacgacgatgataagttaggagtggtagagctgtagaaggttgaactggactaggcagtggaactgaagctatatgtggtggaactggagctataggtggtggagctggagctgtaggtgaagatgaatgggagatagtgactgaatctccaaaagatggaactggtagcacctcagatatatctaagtgattacctggactggtgaagtatgattgggtttcaaagaaggtaacatcagcagacataaggtaccacctgaggtcaggagaatagcatcgatatcccttttgtgttctcgagtaacccaaaaatacgcacttaagagcacgaggagctaatttatcttttcttggagtaaggttatgaacaaaacacgtgctcccaaaggcacggggtggaagagagaacaaaggtaagtggggaaacaagacagagaatggaacttgattctggatagctgaagatggcatacgattaataagatagcaagatgtaagaactgcatccccccaaaaacgcaacggaacgtgagattgtatgagtaaggtacgagcagtttcaataagatgtctattctttctttcagctacccgattttgttgggatgtgtatggacaagatgttttatgaataatcccatgagagttcataaactgttgaaatgggaaagacaaatactctaaggcattatcactacgaaatatgcggatagaaaccccaaattgattttgaatttcagcgtggaaggtctggaaagtagaaaacaactcagatcgattttttatcaaaaatatccaagtgcacctgtaataatcatcaatgaaactgacaaagtagcggaatcccaaggtagaactgacctgactaggaccccaaacatctgaatggactaaagtaaaaggtgactgactctgctcgattatcaagacggcgagggaaatgggagcacgtatgcttaccgagctgacatgactcacactctagagtggacaagtgagataaaccagataccattttttgaagttttgacaaactgggatgtcccaaccgtttatgtaatagatctggtgaatcagtaacaggacaagttgttgaagaaagacaagatgtaagtccatgtgattttgcaagaataaggtagtaaaatccatttaattcacgcccggtaccaatgatccgccctgtactgcgttcctgtataaaaacaaggtcatcaagaaataaaacagagcatttaagtgatttggctaagcgactaacggctatgagattaaaaagactaacgagaacataaagaactgaatctaaaggtaaggaaggaagtggacttacttggcttattccagttgccatggtttgagactcgttatccattgtgactgttgggagtgattgagaatatgaaatagtaatgaaaagagatttgttaccaaaaatatgatcagatgcacctgaatcaatgacccaagactcagaggttgaagattgggagacacaagtcacactactatctgtttgagcaacggaagctatccctgaagatgtttgtttacatgttttgaactgaaggaactcaatataatccggtagagaaaccatccaactcttcgtagtattggattccattttgctacaaccaatttctcaaattcttgattacaacttgtgtggttaaccttggaatgccaaatcagaacaccccttttttttttttggaaaacattgttcactcgctggaaaataaaaaaggttgccggaatttgatgaaacttgaatagaccgactcggaataatgtcctaagaaggctgtccaaaaggagttttgtcagaaactgaccagaaggaggtccacgcaccggcgcgtggacagatctcgccgaaaaaaaaaatcactttggttggcgcgtgatggcgcgtgggtggggtttttccggtcgggttttgtggggtttgctcccccggagatggagaacactgtggtggtgttggtttatgcacaacactggtaaaaagtggttttgatgcgaacagctactcaggtcaccaaaaaattgcacggtgacgactgatttcttcccggatgtcgttggaatgacgcacaacgataattatctcaccaatgctctgataccatgtgagaaagtacgggagaaaaatctatattattgatattctatttaattataatacaatgagccctatttataagactaggattaattcatattatgtacataactatctaacatagatcaaataggcatgcaattcacaataatggtgaataaaatgatacgaagttacccagctcttttcgcgatcgaaaaggagaaaatagccttcaatcacaaacgagaaagaagaatctccggcttgacagtagacgacttcgaaaccctagctcgagatgaaaaccacaaaatccccaaatcacattaccaaccaaacaatttgagatcacaaatgttgaatatgtgagaatccgactaagaaatcaacaaaaaatcaatagaaatggttgaagaataccgacttgaaccctaaatgagtcagacatcacctagaatgaaatacaccttcgaaattgacgaaaacaggaccggttgaaagcggagaacgtgccatagaaggatctacgctctgataccatgtaaacttgacatacttctcagattgagagtctgagagattagaaaacgagtgtttccattagaaagagagaaaagagacttctagatatttcgattatctgtgtaaaaatgaatccgttcctatacaaaaattaggccttcattaaatacaagattcggccgggtattactggcccaaagtaaaatataaaaagaatcacccactatcaaatgggcctagtctaacaagaaaaccaacaaatagtccccccccccccccccaaaagataccactgaaatgacaccgggtgcccaaaaataaagcagcttacttcttgactttgagaggaactgcaatccttatcggtttgagaggaactgcaatcagctataagtagcttattaatttccagtgcctgcattctgccaagtactatgatatatttctgaagctttgtttccccagttcctttttcagacgtttgctgtcaataaagttgagccagccaacttggctcccacaagctactaattttgtccaagcttactctatgggagaagttaaatttcccaaattccttgagcggaaaatgaaaaatggactcaaagtgtcatattatgcaactatctaaagaaaaatactcaattgaagtttagataagaaaagtgaatgtatattgatgtagtctccgttaggtgagaagcgtatcacttacccagcaacatatggacctaacattttactagtgaagttttcacattgtatcaaaagctcaacaaacggaaaggtgactaatcctaaaatgttatttcacatatatgggcacacggtttgtcaaccttctcatacgtgcattatttgttctctatctttctatttcatccgatataaccaatcgttattgtaaattctataatgcctgtggttacttttgtctttagtgacaaatgacatttaggataaccatgtagttattgacttatttcacttgaggtctcttccaattatgtagtagtagagtgttgagatatggatatgttaccttctaaaaaaaagagtgtagagatgcggatagtttgctagctggcttttgtctcccttcaagttgaattagcaaaagcttgtctcataagttggatagctagacaagaaaaactccaaattactttatgtagagtattcttaagcttgagtcgcgagttggaaactggaattatgtaaaaaaacctggaattatttggttgagcctgctttttagttttgtcaatatttccagtatctaacccaacatgtttagagtgattcccggagagcctcagtacaaggcatttgcagagtctttatgagagtccaggaaggggcacacattctgtagaggtatagtcttgtccttattttcagggttgaactagttctttagaagttacctaggcttcctaatttccaaatttctgccaggtccttttttggtgaagtacttgaagtttaataaatcaaattttaatttctaacatatcctgagaaatttattcacaaattcaactggtgacttctgatgcagaaacataagcaactgcttatgggttcatatgttcctgcaattttattgttgacatggattggcttcatatggttttgttcctgcaattttatcgctgacactaatcctttcatatggttttatgtggagtgttaaatagaggttaagagacaagaagaggctgaaaaaggtgggcagttcatttgttagtagactactctatttactaagagatatgatgtcccatacattactcgaattggctccgaatccagattccacttctttgccgagtttccttattgtacatagttcgactcgtcaagggaaattcacttcctttgactgaataatgctagtttgagtagtaccttacattaaatggaccatttagttctatctacttgatagaatagactggtcatcaactagttgcaaatacaatgacaactttgccatgtttgcagagtcacctgatgaagaagtacctcaattagtagaacatttcttgaatgttctacagtattctctatgcctacatgaccacatcacttttccttttgcgttgtgagaacttgaacttggtgagcgggggttccccaggaatggcatcttgatggcagatgaccattctgtccttgtcttagctaatgcttcttgcattgcctcactagatttattatacctttaaaaaatgtttgccattgttctgccataatagaaggatgtacccagctggtgcttcaaaactaatgaaatgctttacaattgtcgagtcctaaaggatgatttgtggaatcagatctcaaacaattctttttgaggaagaaaaataccaaaggttttttctgtttgttggaagattaaaaatcctttaaatggtaaagatttatgaacttaattcagcgtttttgtggccattgctggaaaagagaaaaaacaatggcacttcttcgagtttgcttatccaaaaaaaagaagaagagaatgtcacgtaatgcaatttcatcttaggaaactttgcaggagaaaagcaagagtgataaaacagaactatttgttttttttaacaagttgttgtgacctatttcttgtcattcttatttgctaataagctaatgtactatagttcctgtactatggtttgttttgacttaatacggggatgttcaatgagcattttcttgttttttctgctttcagcatctgctgccttacaggaattcattttctggaaatttacttcttgttctgctaacattttcctgttatatcttgtcagtcattttctctccatggttatactgtttgtgtcactttaaactctccttgttttctactttaaaggatttaatgctgctgtcgggggctgtttctttgctgtggaatctgtgttatggccatcacctgcagagtcctccttgtccttaacaaatacgacttcaatggttattctcagtgctgttatagcttctgtagtctcagaaattggtcttggctctgaacctgcatttgcggtcccaggatatgattttcgtacacctactggtaattttggacttctttctcgagtttgattcttaaatacaattgtacccgtcacttacagcaacaactacatttcaacagctagttggggttggctacacagatcatcactatccatttcaattcatttagtcccatttctttcgaatattgagtactttgggattctataatatcaaggttctttatattttctactttgacgtacaaatctctaaatagattaaagaagactcctagagacactggcctaatgcaaatgtaccaccatgaataaactttaatctgaaatagctggtatcttatataaggacccttagctttaattgtgttctatattgatcttttgggacaacttccttccaatattatgtcttacttatacagttatacttatccttaagccttactctttagagtggttatccctaattcaagcttttgttggcaccatagctagtttggttctaagtaaaaagttactctttagagtggtaactttttgtcaattttcttagtgaaaatataacctctgtgacaaatctaccaagtataaatccaatttggttctatgtcatccttgtagtttatccaagtcaatgctccatcactcttacaaaggttcatcgtatgactaatcttttttggagaaaggtaacagtttgtattgataataagatcagcgccaggttggtcattagtgctaatagctgtacgtacaactccaaaagagcaaaagacaagcacctgatgtaaggtaaattacaagctgcctataaaatctatcaggtgtcctatctcactaaacatttcttgtttacaccaaaaaaataaaacaaggaaagacaatccatcttaatcttctgaatggagtttctttttccttcaaaacatctggagttccttccgttccatgcaatccaccatatacaagctgggatgattttccatttgtctttatccatttcttctaccaattcccttccaattgattagaagttccaatgtggttctagatatgacccaattaactcccaacagataaaagaagatgtgccacggatttgtagtgattctgcaatgtaggaacaagtgagcattactttctacttcctgtccacaaagaaaacatcttgagcaaatctggaaacctcttctttgtaagttatcatgtgttaaacatgcctttttcaccaccaaccagacaaaacatgatactttgggaggagttttaaccctccaaatgtgtttccaaggccacacctcagttgttgaaacattaggatgtagagtccagtatgctcttttactgaaaatgcaccttttctattcagcttttaaactactttatctatggtctgtgatgtacccttgaaaggttcaagagtttggaggaagatagaaactctgtttatctcccaatcatccaaagatcttctaaagttccagctccatccttgtgagctccagactgacttaccaatgcttggctttgaagacttagagagaataagtcaggaaaatatctttcaaccttccttgccctatccggtgatcttcccaaaaagatgtctgcaacccattgccaatattgatcttgatattgctactgaaagatttcttttggtggcaggattactctcattaacaatgtacttgacaatctccatacatactaatgtctctttaccctcttgccattaaggttgtaaagagacttgtcaaattaagaaaaggtttcctatggaactgtttcaaggaaggaacctcctttcctttggtcaagtggagttaagtcatataatctaggaagtggaggcttgggtatgaaatagctgcaaatacagaaaaggagcatcttatttaaatgatcacggaaatgtgcccaaaactttaaatatctgcacagcatatggttgtagcaaaatttgaatcttcctgtcaatggtgctcatgtccagtgaatacccctgatggtgaaagtgtcctgaagggaagcaggaacttattggaagaattggcatctaacactcagcttttcggtgggtcatagcccattgaaaattgagtgcccagatttatatagttttgctctaaactgacgatgcagttgcacaacatacgacaaactaaggtgggacatcatcttcttcggaaggaattttgaggattaagagatagagtggttgattcagttgcaaatgaagcttcaagggttcaatatcatccaggagacaccggattctgatagataaaacaacagaaagatgagcactactttgttaggcttgttacaagttgctatcgtctttcttatctcggtacacaatttagatttgggaacttagttggaaaagcagagtggttgtttttgtgaatagcatcagacaaagcttctgagctggtacgacagaaaactcaacagggagaatagaagactgtggttcacaatttctgcatgcatcttgtaggttatttggtgggtaaattatttaatgttttgaagggaaggtagaacatgttcataggcttagattcaaatgtttgtatttttttggctctttggtgagagatgctgaacgtaaatgacataggcagctgactataatttctcagctccttgctttttaaattgacaggcactgatatgtacatgtgaacatccaacacttttgtggtgccgttccgatgaataaagaacattaatcacttactgatcaggagtaatagtttaggagttctagaatttttgtacataaaatgaaccaaaaagaagatcggaatgagaacatgtttctttttttgttttttctttttcgtgaaaacttcaataacacttctgatagaatagctaggtccatttgaattcctttggagacccttacacaaccaatgaatgacaagtatagcatttctaactccctcccacacgtataacccagattttagggtttagatgtggatctgatttgaccttattgcctttttttgtttttgttctttttgaagtagagagtgaggaggctcaacaattaattcggctcaacgggctaatgattggacttacatgctacgacaatgttaggagagagagagagagagagaagcccagagcagttacatgagttaagaaagagaagtccaaagcgatagaatatgaagagagaaagcggttgtgctaacaggctccctgaagtttggctctgagcatccaactcaaaaccttaaggcaatgagtagagtagcccaggaccatttaaattgctgttgaaaaccttacacaaccaataagggaacaagtgtaacattctcttacaaccctaccgtcttataagtcagtgctctaatttagcataaaatcaaagtgaggcgatctacaatgaaatgaagtaaataactgataaatacaaagaatgttaattctccaatatagcctgaatgttcccagaacaaaataaactagtctcaggatttatcattaacatgatgttcctcttattttgagtgattaggaaggttaatcaaggtataaattctttctaatttgtatcgtctagaattatttatctaacaaattttcagattaccggttcaaaagaggaatatattttgcatacaacgttaccataccttacaaaagggagatgaacatttttttattttattattgtcctttttttcaattagggattatgcagtcttcctccacgtgatattactcttagaatcacgtttttgtcattgctattacttaatgtggtaagtacaaatgtgttttgaactctttttggtatgtaatattgagttaatttttggtttccatttcagagctgccgctttatcttctgctgggcatcttttgtggcttagtttcagtggcattatcaagttgtacatcatttatgctgcaaatagtggaaaatattcaaacgaccagcggcatgccaaaagcagcttttcctgtcctgggtggtcttctggttgggctggtagctttagcatatcctgaaatcctttaccagggttttgagaatgttaatattttgctagaatctcgcccactagtgaaaggcctctccgctgatctgttgctccagcttgtagctgtcaaaatagtaacaacttcattatgtcgagcctctggattggttggaggctactatgcaccatctctattcatcggtgctgctactggaactgcatatgggaaaattgttagctacattatctctcatgctgatccaatctttcatctttccatcttggaagttgcatccccacaagcatatggcctggtatgaatttgtcttttgttagaagtagcattacatatctggataagtgagttttttattattgaaaagtaataacaggagagcaagagaatatagcacccaaatctacttctttcctctcttctattcttctgaaattcaaggtcctttaactcctccacggcctgtctagttattgatcctgtagacttaattcacataggtttaggacattcaagtttatccaaacttcgtgaaaaggtttctaatttttttacattacagtatgagtcgtgtctacttgagaaacatatcactccatgtttctatagagtctgttttctcctcagtttattttgatatatggggtcctattaagacagttcaaccttggattttcattatttttgttgtttcattgataattattcaagatgtacttggattttcttaacaagagatagttctcagttgttttttgtgttcctaagtttttgtgctgcaatacaaaattagtttgatgtctctatttgcatttttcccaatgataatgccttagaatattttcttctcggtttcagtagcttatgatttctttagaaactctctatcagaaatctcaactgagatagatgagaggaagaataagcatatcattgagacggctcgtacccttctcattcagtcccctgtcaagcttagtttcttgggcgatgcagtttcacgtcctttgattagattaattggatgcctcatctgctatccaaaatcagattcaactttcgatattgtttcctcgcttacctttatactctctttccctcgagtctttgggagcacatgttttgttcaataacatagctcctggaaagtgaccagcgcaaccgacaagcaaggccttcttaatatagaaggagggcatatgctattctagccacgagggagaaagtaatattgtaatcaaacccaaatatctgagtataacctttggcaatggcgatcaatttgattatatggaccaactttgcctacatatacccaccgatagatttacggggaggtagagaaataagctcccaagtaccactaatatgtaaagcagacatctctttgatcatagcctgtccttgtggacatagggatagaaattgaggactaagatgacacaaaagcataatgctgtgatgataaacgatgataactcaaatcaatatgatggggatgggaattaagagtggattgaatatctttgcggaatgtgattggtagactaggaggagacaagtccgcaataggtaaaagatccagtacatggaatgaatcttctggacatgatgttggactgacgtcaatgataagtcaagagtggtggagttgcagaacatggaactggagctgtaggtgacataatcgaagttgtagggggtggagctatagaggaaggtgaaggagagatagtgactgaatctccaaaatatgaaaccggtaatacctcaaaaaatgtctaagagatcatttggacctatgaagtatggttgcgttttaaagaaggtaacatcagcagacataaggtaccgcggaaagtcaggtgaataacattgatatccttgttgcgtcctcgagtaacttagaaatacatatttgagagcacggggagctaacttatcttttctggagtaaggttataaaaaaacacatgctcccatagacacgaggtggaagagagaaaggtgagtggggaaacaagacagagtatgaaacttgattcttgatagttgaagatggcatacaattaataagacaataggatgtgagaactgtatccccacgtaaacacaacagaacatgagattgtacgagttgggtatgagcagtctcaatgagatacctattcttcctttcagctatcccattttattgagatgtgtatggacaaaatatttgatgtatgatcctatgagagttcatgaactgctgaaatggagaagacaaatactctggggcattatcactatgaaatgtgcggttagaaaccccaaattgattttggatttcagagtgaaaggtctgaaaaatagagaccaactcagattgatttttcatgagaaatatccaagtggacttggaataatcatcaatgaaactgacaaagtagcagaattccaaggtagaactaactcgacaaggacctcaaacatctgaatggactaaagtgaaaggtgactctattcgattatcaagacaccgaggaaaatgagagcgagtatgccttctgagcggatatgactgacgctctagagtggacaagtgagacaaaccaggtaccattttctgaagttctgataaattgggatgtcctaaccgtttatgtaataaatctggtggatcagtaaaaggacaagctgtaaggggacaaaaataccaaatatttccagaagatggcaaactacaacagaagaagcaactacattaacaggctcaggatatgtgatgaaatgaggacaaagagttgatcaagaaggagattctggaattctaccagaacttatatagtgaaaatgaaccgtggaggcccagtgcaaattttgaaggcatctcctcactaagcatagaagagaagaactagttggaagctccatttgaagaaatagaggtgcttgaagctttgaaatcatgtgcccctgataaagcaccaggtccagacggcttcaccatggctttctttcagaaaaattgggatactcttaaaatggacatcatggccgcacttaatcactttcaccagagctgtcacatggttagggcttgcaatgccaccttcatcgccttaattccaaagaaaaagggtgctatggagctcagagactacagatctattgacaaactagtctcgggggaacaaaatgctttcatcaagaacaggcacatcactgatgcttccttgattgccagtgaagtgctggattggagaatgaaaagtggaaaaccaggcgtgttgtgcaaactggacattgaaaaggcttttgatcaattaagatggtcttacctcatgagtatcttgaggcagatggctttggggagaaatggataagatggataaactattgcatttcaactgtcaagaactctgttttggtgaatagtggcccgaccggttttttctcctgccaaaagggcctaaggcaggggatctcctctcccctttcctattcattttggcgatggaaggactcactaaaatgttggagaaggctaagcaactacaatggatacaaggctttcaggtgggaaggaatcctgccagctcagttacagtatcccatctactctttgcggatgatactcttattttttgtggtactgagagatcacaagcacgaaatctcaacctgacgctgatgatcttcgaggcactatcaggactccacaacaatatgataaagagcatcatataccctgtgaatgcagtccccaacatacaggagctagcagacatcctatgctgcaaaacagatactttcccaacatatcttggacttcccttgggagctaaattcaaatcaaaagaagtttggaatggagtcctagagaagtttgaaaagaggcttgcgacttggcgaatgcaatacctctccatcggtggcaagttaactttaatcaatagtgtactggacagtcttcctacataccacatgtctttgttcccaattccaatctcagtcctaaagcagatggacaaactcagaaggaagttcttacgggaaggatgcagcaaaacacacaaatttccactagtgaaatgactcaaggtaactcaaccaaaattcaaaggaggcttgagcatcagggatctacaagcacacaacaaagctatgctcttaaaatggctctggagatatggacaggaggaatctaggctatggaaggacatcatagttgctaaatatggagcacacaatcactggtgttccaagaaaacaaacactccttatggagttggtctgtggaagaacatcagcaaccactgggatgaattcttccaaaatgtaactttcaaagttgggaatggaactcgtattaagttttggaaggatagatggctcggaaatacacctttgaaagacatgtttcccggtatgtatcagattgccttgaccaaagactccactgttgctcaaaatagagacaatggcacttggtgcccattttcagaagaaatttgcaggattgggaggtcaacagcctactcacaatgttaagctccctagaaggtcataatatcgaagatcaacagcctgacaaacttatttggggaaattctgagagaggcaagtacacagtcaaagaatgatacattcacctctgtgaccagaatccaataatagataactagccatggaaacacatctggagaactgaagtgcctaccaaggtgacttgcttcacatggttgactctaaatggggcatgtctcactcaagacaacttaatcaagaggaatatcatactagttaatagatgctacatgtgccaacaacagtcagaaagtgtaaaccacctattcctccactgctcagttgcaaaagacatttggaacttcttctacactacctttggtctgaaatgggttatgccacaatcaacaaagcaagcttttgaaagttggtatttttggagagttgacaaatccatcaaaaaaatctggaaaacggtgccggctgcatttttttggtgtatttggaaagaaaggaaccgaagatgttttgatgacatattaactccactctactccctcaaggctgcgtgtttagttaacttatttagttttgtggattttattagctccctgatagtagcataggcttttgtaaatggagctaattatcctatctcttttgtactctttgcatcttcttgatgccttttaatgaatctaatttacttcataaaaaataaaaggacaagttgttgaaggaggaaaagatgtgagtccatgtgatttagcaaggataaggtactaaagtccatttgattcacgcccggtaccaatgatccatcccgcattgcattcctgtattaaaacagagtcatcaagaaataaaatagagcaaataagtgattggccaaacgactagtggatatgagattaaaaggactatcgggaacataaagaactgaattcaaaggtaaggaaggaagtggactagcttaacctattccagttgccatggtttgagaatagttggccattgtgactgttggaagtgattgagagtaagaaatagtagtgaaaagagatttgttaccagaaatataatcagatgcaactgaatcaataacctaagagtcggaaaaagaaacacaagtcatgttattacctgtttgaacaatagaagttatctccgaagaggattatttacatgttttgtactgatggaactcaatataagccgataaagaaaccatccggatattcaaagtattggatcaacagcttataagccaaaagcatccgatacgagtgccattataatggatcaagagagatcaaacaacaaatcaccaaatatcataaacaaccaagaatctcgctggaatgtgaacaaagattgaaaaacaacaatgtagctcgccaaaaatgtgcaaagtgatcgaaaaatattgaatcgtgagtggagagaaataggagcttcaatcgacccacacagtaccaaaaaatccaaaaacggttgtcggagctcaagaaagttgtcaaaaagtatattgtatgcttcgaaagtagccgaaaaaggttggaagtgggatgtgtcaactccgaattatgatacgagcaccacagaagatcaatttgtgtcaaaactaccgaaaaaaatacttcacaccccgacgcgtggagtactcgctcgttggaacccttgctgccaacgtcgcatgtaggatcagttttcgaagaatcttattggggtttggtcgccggacgatgtcggatcttgtggtgccgttggaattcgcacaaccctgaaggaaaagaaggttacacaaatcagatctgaaagtcaccgaaaagacacatggcgattgacttttttgtctcagatgtttctcaccgtcgctctgataccagttgttgggctcaactcgtttgaagatactcttaacatagtgtgatattgtcccttttggaatgtgagtcatcttagctcggtaagcatactcgctcttccaactagcccgaagatacttttaacagagtgtaatattatctgctttgagccaagctggcgcggttttcatcaaaagacctcatactattaaaagatccatacaccttatatgtaggcttctaagttgctcggacacgggtgcgagtacccgacacaggtgcaaatctagaggtcagatcctttaaaatgtaaattctaagatttggggatacgaatcctagtacggatacgggtgcgaggatccgattaaaaataattcaaaaaaataagaaaataaaaaagtctctaaattatgtgaaattttgtggaataactacgtatagcttgtaaagtgtggatttattttttattctcaagttgtagataagtaaatgattgatttcctagataaggtatgttattttcttcaaatttaccctagtttggttcgaatttcgggaaattgtatcttgtctcgaatttttccttctgtcctgattaaactactcaaaatcgtctgaccagatccggtacggatcccatacccacatccacactagtgtcgtgtggacaagggtgcggcacctaaacttccgtgtaggagcaatttaggtaggctcctaatcttttcagctattaatgtgggacttttacgcacctctatcaaattccccaataaactaagtttcacgtggtccatcatcgcaatccacgggtctcttcctctagttaagtcccacatggcccattaccatgatccacgggtcaattttcgtgattcatcgtgtgccacccacatcgttagtatttatggtaactaaagtacgcaactagcttttgcttgtgagcgtgtctccaagctcgtaaaggtaagaaaaccgagccgcatattccatcactctatcatcaccatactcgtcccgcgaaacttgtaagataaaggtggctggttggtcagttgaactacctcagagtgacttggtatagtatttcctttcttgtgaatatttaactcaattatggactctctgtgtgatagtcattgagagccattttctatatagccggtgcacacaaatcatatgtaccaagcttgttatatatgtaactaatacgaggaccagtgaaggactcggtgaaaatatctgcaatctggtcattcgacatacaaggccaatagactccccagcaataaaatcagggggttgctgataaatagaattggccgaaatgttgccagaaaaatttgaaaatagtgagactaagccgaattctacactacaaaataggttttaaaacacaaccagaaaacaaaaacttttttggaaattactgttcacatcgaaaaaataaaagttgtcagaatttgatgtaatttatatggataggctcgtaatcactggacgagtaagttgtcctgaagaagttttgtcaaaaggtggccggaatggctcacacatgccggaaaacttattgtagctcgccggaaccctagttctggcggtgcgtagaggcgtgtgactttctgccagactgattgactgtggtttgtcgcctgacttttcctaacaagatggtagtattggttttcgcacaacaattaccgatgaggagataacgcaaatcaatcttgagtcgtcaatcggaaagacgcacggtggctgactttctatttagatgggactggaatttctggagtttaatcgcacaagcgttttggatctgatggtaatactggtatgcacagtaccactgtagcagtgatgaaccctcaaaataagacaaagttgccagaaaattgcacggcgatgagatctttcttccggatgtcaccggaatgacgcacaacgataatttctcactgaagctctgacaccatgtgagaatacacgggagaaaaatctatttttattaacaatgatacaatgagccctatatataatacatattctactctactacatatgggaatagggcatattttactcctactacatatgagactaggactatttacacataactatctaacaagggctatatctcagatttatgagaatatctacccaacgacccagagagacgagcctaatcattttgcagtggcacagactataacaacaaaaaacctactcataatggttaaaccaactgattaagatgcttacaggactatcttgagaaatgtacatattatatagatgcttgagttgcgtcccaatcctaaatagaagcttttattcgtaagcaagaagggaagcagctttacttgagccaatagctttcaaggtgcatgttgtcacaccaaggacatccagaatttgattttatagtgggaatatcgtttaaagataaaaaagatagcgtgcagaagattgcatacattagagatgcaaaatacggaatacccatactcccagataatgcagtatgccttttgcatgacctactggttgaatggaagcacctggtgaatttactaggtgtgttagtgatttctgctgcttccttcccctttctaaactgcatactatctaaaatgttaggggggcagaagcccagtcaatctgactaggtgatgttagtggtttccgcttcttcctcccacttctaaatgcgtactttctcaaatttaggagcatagaaacttaagcagctgcctacctgaggagttgcatgggaacataagagaatagactttacctgtcatattttccataccttagttaattacagtgttatcctgataatgatctgttttctggatctaggctgaatcgagattcaatcgcttttggttgaaaggatgctgctacagatccttagtttacatcattttggttcttattctataagtacttcccctatcaactacttccttcttttttcttaggttatttgcctctttaggttgtttggaaggaaaggaacagtagatgttttgatggaatagcaactccaaaccacttccttaaggctaatatcctgattggccaagtttctccaaagtccaaaacactttttttttccttcaaaaaagtacctttttttttcaaagttgaggtgtttggccaagcttttggaaggaaaaaaagtgtttttgagtagaagcagatgctcttgagaagcagaagaagtagcttcttcccggaagcacttttgagaaaaataaatttagaaacactttttaaaagcttggccaaacactaattgctgcttaaaagtattttcagatttattagacaaacacaaactgcttctcaccaaaaatacttttttgaaaagtacttttcaaacaaagcacttttcaaaataagttttttagaagcttggctaaacaggctataaatgtcttttatttttacagctggagtaccctaacacctgtaaattcccctatacatttttttcgactttggtagctcattaaccctagtataggactctttgttttggagctagcaaactcttttgttttcctatttttgcatcttcttggtgccatttataatatctcttcaccaaaaaaaaaaagttcccaaactatgactaccttgagttggtcaaagcataaccaaagcatgggcacaccagtgtttgcgtgaattttatggatgttccttacctttatccttctgtgcttatgtagcatctgtcttggtcaatcttttctgaagtctatattgtatttctgtgttgcaacatgagtttactgttaatcttactgtttgacctcaattttgggttctttttgattttggaagacatcgtttaacaggttggcatggctgctactcttgctggtgtctgtcaggtgcctctcactgcggttttgcttctctttgaactgacacaggattatcggatagttctgcccctcttgggagctgtggggttgtcttcttgggttacatctggacaaacaaggaaaagtgtagtgaaggatagagaaaaactaaaagatgcaagagcccacatgatgcagcgacaaggaacttctttctccaacatttctagtttaacttattcttcaggttcaccttcacagaaagagagtaacctctgcaaacttgagagttccctctgtctttatgaatctgatgatgaagaaaatgatttggcaaggacaattctagtttcacaggcaatgagaacacgatatgtgacagttctaatgagcaccttgctaatggagaccatatccctcatgctagctgagaagcaatcttgtgcaataatagttgatgaaaataattttctcattggtctgctgacacttggtgatatccagaattacagcaagttgccaagaacagagggcaatttccaggaggtagcttcttggtacatttcaatattcttaactgatgaaaaaataagggaaattgatctagcatgaaatgaagctaattataagttttacacagtagaactggtaaaacagggttggctggatatttctttgttgaatttttaggattatatatattgttttagttttgtaggttgttttctgatgtgctttttgactcggcagaatcttaagatgaaatggaaggttgtatcatcaaatgttaaataagggaatatgtgactttcaaagttaagcacggagtattttggagtcaatagttacttcctgaatcttttaggatggaggagacagtttctataggaataggaaaaggggacctgatttcattatttgtgtgtatatacatttgttatctgaattcgcattactttctaacaaccaacaaaaggaaagtggacattcaatttgagccggagggagaaaatttaactagaaaatgacctggccgtgaaataaaattattgatccgtcctttaactagttttcatggattgcctccttgcggatgatttttccaaccggtagaactactgttagtcgtccaaattctgaccccctactatgaataaaaatgtattagtaagtttagtgggtaatctccttgagaaataaaggaacaggagaaatattttattgatatatgctaagtgttttacaatagccctatttatatacaatgtttacataaacctaaagccttctatataaatgtgggacactatacatgaactaactctaacactatccctcaagctagtgcatataaattatatatatgcttgttacatatataattaatttctctactttttggtatacttcttgtatacgggagttatctcccttttgattaatacaatttaccttatcaaaaaaaaattaatacgaggaccagtgagggacttggtgaaaatatctgcaagttgatcatttgacttctcaaactttgtaacaatatctcctgagaatcttctctctcgtgaagtgacagtcaatctcagtgtgtttggtcctctcatggaacactggatttgatgcaatatgaaggacaacttgattatcacacacaagttccatctgactgattgctccaaattttaattatttgagcaattgtttgatccaaactagctcacatggtgcaagagtcatgactcgatattcggcttctgcgctagatcgagcaactacattctgtttcttgcttttccgagagacaaattacctcctattaaaacacaatatccagatacgtaacgtctatcagaaggtgaccctgcccaattagcatctgtgcgtccaacaatatgctcatggcatcgatcttcgaatattagtcatttgtctggagctgattttatataacgaacaatgcgaacaactgcatcccaatgactatcgcaaggaaattccataaactgacttacaacactcacaggaaataaaatatcaggtctagtaattatgaggtaattcaattttccaaccaggcgcctatattttgcaggattgctaagaggctcccccctatcctggcagaagcttagcattcggattcataagagtatcaatagttctgcagcccattattcatgtctcctcaagaatgtctaaagcatacttcctttgcgaaataacaacctgaactagaccgagcgacctcaatacctacaaagtacttcaatctgctaaggtcgttagtctggaagtgttgaaagtgatgttgtttcaaattagtaataccatcctgatcattgcgagtaataacaatatcatcaacataaaccaccagataaatacagagattaggagcagaatgccgataaaatacagagtgatcagcttcactattagtcatgccaaattcccgaataattgtcctgaacttacgaaactaggctcgacgagattgttttaaaccatagagacttgcataagtgacatacaatacctctagactccccttgagcaacaaaaccaagtggttgctccatattaactttatcctcaagatcaccatggagaaaggcattctttatgtccaactgataaagaggccaatgatgaacaatagccatggacaggaaaaggcgaacagatacgactttagccacgggagaaaagtgtcattattatcaagcccaaatagctgagtatatccttttgcaatcagacgagccttgagccaatcaacctggccatccaggtagactttgactgcataaacccaacgacaaccaacagtagacttacttgaaggaagagaacaaactcccatgtaccactcactcacatgtaaagcaaacatctcgtcaatcatagcctgtcgccatcctggatgagatagtgcctcacctgtaaacttaggaatggaaacagtggacaaagatgatacaaaatcataatagggtgatgagatgcggtgataacttaaaccaacataatggggactaggattaagtttggatcatacaccctttcgaagtgcaatcagtggactaggaggagccaagtccgcactagacgtggatgacaatgataagtcaagagtggtggcctcgtggttggagatgtaggatgagcaactgtagactcctcagaagtcggtataggtaggagtacctgtgatgttgatgtggatttaagaggaggaacaatagattcctcacaagtagatacaggtaagacctcagatatatcaagatgattagatgaagtaaagtaaggttgagactcaaaaaatgtgacatcgactgacataagatatctacgaagatcaggtgagtagcagcgataccccttttgaacccgagaatagccaagaaagacacacctgagaacacaaggagctattttatctttttcaggagctaagttatgaacaaatgtactccttaaaacactaggaggaaagagtataaagatgacctagggaacaatactgagtgtggaaactgattctagatggaagatgaaggcatccgattaattaagtaacaggttgtaagaactgcatcgtcccaaaaacgttgtggaacataggactgaatgagaagtgtgcgagcagttttaatgagatacctattctttctctctactaccctataatgttgaggagtatacagacataggataatattttgagaagtcataaactattgaaactaagagaatacatattttaaggcattatcactacgaaaagcgaataaaaacaccaagcggagttttaatttcagcataaaaactctagaatattgaaaacaactcaaaacgatctttcatttggaaaatccaaatacatcttgagtaatcattaatgaaactaacaaaatccaaatcttaaggttgtgactctactaagaccccatatatcataatgaactaaagacaaaacagactctacacgactcttagcacgacgtgaaaatgtagctcgaatatatttcccaagttgacacgaatcacaatctaatgtggacaaaccagacaccatcttctgaagcttggataaactcggatgtcctaaacgtttgtgaattaggtctagaggatctgtagttggacatgttgtagagggattgagtgagttaagatagtcaaggtcttgtgattcacgccatgtgccaatcgtctgtaccgtactgcggtcctgcatagtaaaagaatcatcaataaaatatatatcacaatggaattcacgagtcaaatgactaacagatgcgagattaaaggacaaccggggacataaaaaatagaatctaaagtgacagaggacatgtgattagcttgtccaactccttttgcttttgtttagacttcatttgctaaagtatcattgggaagagattgtgaataaacaattatttgacaaaagtgacatattaccactggggtatcaagttgcttagtcatactaagaatgtttgggagagggtggtggaagtgagggtaaggaggacagtgtctctatccgagaaccagttcggattcatgcatgatcgttcaactgcggaagctatccgtcttattaggaggctggtggaacagtacaaggataggaagaaggatttgcacatgatgtttacctagagtaagcgtatgacaaggtccctaaggaggttccttggagatgtcagaaggttaaaggtgttccggtagcatatactagggtgatgaaggacatgtatgatggagctaagactcgggttaggacaatggaaagagactctaagcattgtttggttgttatggggttacagtaaggatctacgctcaaaccgttcttatttgccttggcgatggacgcattaacgtaccatattcagggagatgtgccatggtgtatgttattcgcggatgatatagttctgattgatgagacgcgaggcggtgttaacgagaggttgggggtttggagacagacccttgaatttaaaggtttcaagttgagcaggactaagacagaatacttggaatgtaagttcagcgacgtgacggaggaagctgacatggacgcgaggcttgattcataagtcatccccaagagaggaagtttcaagtatcttgagtcagttatacagggagaagatggggagattgacaaggatgtcacgcaccgtattaagggcggggtggatgaaatggaggttagcattcggtatcttttgtcacaagaatgtgccaccaaaacttaaaggtaagttctatagagcggtggttagaccaaccatgttgtatggggcagagtgttggccagtcaagaattctcatatctagaagatgaaagtagcagaaatgagaatgttgagacggatatgcgggcatactacgttggaagattaagaatgaaaatatttgggtgaaggtgggcgtggccccatggaagttgtgcccaccattaaagactgctatctgaaaactaattctttgggcccaaacattctggcccaaagtacctcgtgaataataatattgagctcatgtctgacatgttggaagaggagttactagcaaacacttatacacctatgttggtaacacaattgaagaactacgaaaaacactcttctgcaaaggaaaatgagaagaagaagaagaagaagacgaagaagaaggatgatgcaatgatcattgaagaaaaaggagagcaggaggacccatctaaacttacaaagtctagaggaagaggaggacccagagtttgatgcttccctctgggtacaccaaaacatcgtcaaacttaggcaaggagtttggggtaaacattcaggggtgtgagaaggaagctttggagcttttcgtaaaattacaactagaggcataaaaaaaaaaaaggcaatccaggcatggaggtgacaaccttcgaaaagaaagggattcaaagaactgaaagggctggatttttggagtaacttcaagagtaatagaacaagaagtagggggttgcattattatcaaagatcaatgaagattaacattgaagaagtgggaaatccaaaaagactccaccgagaaggatgatgcaatgatcattgaagaaaaaggagagcatgagaaaaaacccgtagaaattgacagcactcacacacaataagacgagataataaagtagtgagttggccaattgaagaagctttacctcttaacttacaaagtctagaggaagaggaggacccagagtttgatgcttccctctgggtacaccaaaacatcgtcaaacttaggcaaggagtttggggtaaactttcaggggtgtgagaaggatgttttggagcttttcataaaattataacaagaggcatgggaaaaaaaaggaaatccaggcatgcaggtgacaaaaccttccaaaagaaagggactggaagaactgaaagggctggatttttggcgtaacttcaagagtaataggacaagaagtacgggattgcattattatcaaagatcaatgaagattaacattgtatcatggaatgtcagggggttaaatcgacatagaaaaagaatgttgattaggagtttaattcataggtggaaagcagatgttttctgtttccaagattcaaaattaaaaggggacattagggagtttataagagaactatgggcaaataggtggtttaaatatgcacagttggaggctagtgggcctagagggggtattattgtcttatgggatagtaaaattggggagggggagatcagcagcctgagctcctattctgttacttgtaaatttataggtaaaactcaggagtatacttggaatttatccactgtatacgctccaaatgatagggaggaaaggaaagaagtatggtgggaattagcaggtgccaggggaatttttatggaccttgggtaatttctggggatttcaatactgtgaggtacccaccagagaaaaagaattacagcaaaatcactagagcaataaatgaattctcataatttattgaagatatggaactggtggatctacaacttgcaggaggaagttacacttggaggacaggagatagacatgtgataacagctagactggataggttcttggtttttatggattggaatgagagcatcagaaacaccaagcaatcagttctccattgaattacctctgaccattcccctgtgatgcttcaatgtggtaaccggtaccctgtcaaatcctattacaagtttgagaattggtggctggaaacagagggcttcaaagaaaggattaaagtctggtggagctcttttgcttgtgaaggaagacgtgactttattctggctttcaaacttaaagcatcgaaggaaaaaattgaagaaatggagtaaatctattcaaggaaacttggagatgcagaaattgagtattcttagtcaacttgcagaactagaagagacacatgatcaaaggagccttactgaagaagaaatacacactaaatatgcagtctatggagtttggggagattgcaaaacatgaggaggtggcttggagacaaagatctagggctctttggttgaaagaagggacaaaaacatcaattttttcctcaaaattgcaagtgcacataggaaatacaataacatagaccaactgttacttgaaggaaaatttgtggcgaatccaacatacataacaaataatattggtacattttatcaaaaactatatataaagattgctagaggacaatcttatgttgcaaagtcttttcgaagcttaggaaatttgggatagtgtcaggcatgtgaaagggataaagcacctggacctgagaactgggaggtgataaacacggatatgatagctgcagttctttgttcatggaatgtttgaggaaagctttaatgttacctttgtggtattgattcctaagaagatggaagctaaggaatagaaggactttaggcctattatgataggcaatgtgtacaagatcttgatagaaagacttaagaaattggtgaacaagttggtgaagggtcaacggatgacttttattaaaggtagacagataatggatgttgttctaattgccaaatgaatgtgtagatgcaagaacaaaggcgagaaacctacaatactatgcaaactagatattgagaaggcatatgaccatctaaattggaactttctattggaatcgctgatgaggatgggctttggtgtaagatgggtcagctggatcaaattctgcatcagcacaatgaaattctcaattttgataaatgtttcaccagtaggtttcttcccttctcagagggatttgagacagggtgatccactatctccttttattattcattagtgctatgggaggcttaaatgatatgttaaagactactcaagataacaactgcatacggggttttaaggtgaagtccagggcagacagtactattgagatttttcatcttcgatatgcagatgacgcacttatgttctgtgaggttgacaatgaacaattgaaagtgctgaaggtgatcttcattctgtttgaagccacatctgtattacaaattaactggaatgaaagctttatctatctagttaatgaggtaactaagatccactttttggttggaatcctagaaggtaaaattggggaattgcctacagttatttggggatgccatgggggccaagagcaattttaaggggatttggactagggtcgtagagatatgtgaaaaaattttaacaaactggaagagttagtatttatccttaagggacaaactaatactaatcaattctatacttgatgattttcctacttacatgatgttcctcttctcaatccatgtgaatgttgtgaagagaatatatacccttagaaggaacttcctatggggaggaaactatgacaaggaaagatctatttggtcaaatggaagtctctcacagtcagcaagaagtaagagtgttttggaatcaagaattggagaattcagaaccaaagtttgatgatgaagtggctatggagatttactacagaagaacattgtttgtggaaagaggtgatcatggagaagtatggcatagaagataaacggataacaaagtctgtaaatagatcttatggagttagtcgatggaaatccatcagggacctatagcttcagctcttgaataagtccaaattctgaataggaaatggattgaaaatatctttttggaaggataattggctaaccaaggaactttgaaacaactctttcttgacatttacattccaaatcaacagcataaagcaataatagtagaattatgggctaatcaaggttggaatctcacatacagaagactatcaaaagacccggagattggcaggtcaacagagttcaaaggcactttggaacaatttaaagaggtctatacttctatagactatttgacttggcaagggaagtttattgttaattcagcctataaggaattcaacttctcagctaactggattggttgttggccatagaagttgatttggaaagttaaaattccttatagagttgcttgtttctcttggcttttggctaaagaggcagttctgacgcatgataatctaaccaagagagattaccatttatgttcaagatgttatttatgtgaagagcaggcagagacaaccaatccacttttttttgcattgtaagttcactgcagttatggaggattttcattagtttaaagggtatcatgtgggctatgcgtagaagtatacctgaagttctagcatactggaaaaaagaaagaaatctttccaattataaaaagagatggaggattatcctagcttgcatctggtggaccatttgggaagaaagaaatcaaagatgcttcaaagataaatcagtcatattcagataattaaaatgaagtggctagtcttgttttatttttggtgttaagtgttagatagttatgtattatgtataagttgtctagtcccacattggaacgggagtaatatgtactatgtagagtatagctataaataggacttcttgtactttattgtagagaatatattaataatatatttttcccgtgttgtctcacatggtatcagagaaaccgtgagatatcagtcgttgtgaaaaataccagcggcttcgggaagaaaaaaatcaatcaactgctaggtatattagtcttcggcgaccgatccattaaatttctctggcaaagaaccactcatgggccctcacgcgcccaccgaaagaaatatttccggcgaggttccaatttcatgcgcccgcgcgtgaggcagtttccggtcaaattttgacaaaggtcctttttgacagtttgttcaccctgtaattcccagtctatccatcattttttttatttcgatcacttcgcaatttctcgggcagctacagtgatttttccggcagaagcggtgtttcctttgcctgcttcagcgagatacagttgattatttctattatttgtttctagacctctctccaatccaacgatgtctttggaatttgatgtatttggttctgaaaacacgagttctagaaagtcaagcttcatgattactttagagccattaatggggagttcaaactatttagcttgggtttcctctgttgaattgtggtgtaaaggtcaaggtgttcgagatcacttaatcaaaaaggctagtgagggctgtgaaaaggtcaatttaagcagtttatgacgtctgtataccactcagcagaataggatagcaaagaaagaatatgcacatcattgagactgctcgcacacttctcattgagtctcacgttctgctacattttctgagcgatgcagttctaacggcttgttatttgattaatcggatgcctttatcttccatccagaatcagattctgcagttagtattgttttctcagtcacccttatacttttttcgtcctcgtgcttttgggagcatgtgtttgttcataacttagctcccgaaaaaaataagttagctcctcgtgctctcaagtgtgtcttccttggatattcccgagtttaaaagtgatattgttgctactcacctgatcgtaggtaccttatgtcagttgatgttgcattttttgagtctagaccttactttacctcttctgaccaccttgatatatatatgaggtcttacctataccgactcttgaggggtttactatagctcctcctctacatactgagccacagaaatcttactcatacctaccattggggaatctagtgttgctcctcctagatccccagctacaggaacacttttaacttatcgtcgtcgtccgcgcccagcatcatgtccagctgattcacgttctgcacctgctcctactgcggactagtctcatcctaatctaccaattgcacttcggaaaggtatatagtccacacttaatcctaatccatattatgtcggtttgagttatcatcgtgtcatcacctcattatgcttttataacttctttgtccactgtttcaattcataagtttacaggtgaagcactgtcacatccaggatggcaacatgctatgattgacgagatgtctgctttacatacgagtagtacttgtgaacttgttcctcttccttcaggcaaatctactgttggttatcgttgggtttatgccgtcaaagttggtccagatgaccagattgccaaagggtatagtcaaatatttggggcttggttacagtgatattttctctcccgtggctaaaataccatcagttcatctctttatatccatggttgttgttcgtcattggcatctctatcagtttgacattaagaatgtttttcttcacagtgagattgaggatgaagtttatatgaattaaccacctaattttgttgcttagggggagtctagtggctttgtatgttggttgcctcagacgctctatggtctaaagtaatctcctcgagccttgtttagtaagttgagcacagttattcgggaatttggccaactcgtagtgaagcttatcactttgtgctttattggcattttacttcaaatctctgtatttatttggtggtttatgttgacgatattgttattaccggcaatgaacaggatggtattactgagttgaagcaacatctctttcagcacttttagactaaggatctgagtagattgaagtattttttaggtattgtgattgctcagtctagcttaggttttgttatttcacattggaagtagaaaaacttcaatcatttttctttatttgaaaggaagaaaaaaaaggtaatatctagacctaaatattaatctgaagacaagtgaggcttgctcagttggtaaaagcacctccacctacgatcgttaggtcctgggttcgagtcaccatggaggggaagtgtggaaacactatagatcctcctaatttgggagggggaaaaaaatattaatctgaattgacatgaatctcaatgacaatgaccaacgatttcctgcaattcttttcagtatggaatgaataaaaaatcaagctacaagtctctattaaacgaaatgcactaacagggatcactctcaagaaaggaagtggttttggttgttgttattccaggttggataaatcactttctttataaatatcataaaagacaagggctttcttgcttcagcacatgtgggaaatgccggggggcttggctggtaccaagctcgagcggtctttctatctttttggattgcatgcccaaggcaatgctttttgtagattgggatggattgatcttcgcagaagtatgctttagacattcttgaggagacaggaatgacggattgtagacccattgacacacctatggatccaaatgccacacttctaccaggatagggggagcctcttagtgatcctgcaagatataggcggctggttggcaagttgaattacctcacagtaactagaccttatatatcctttcctgtgagtgttgtaagtcagtttatggactctccttgtgatagtcattgggatgtggttttccgaattcttcgatataaaatcagctccaagcaaagaactgttgttcgaggatcgaggcccatgagcagatgttgattgggcacgatcaccttctaatagacattctatatctggatattgtatgttaataggagttaatttggtgtcttggaagatcaagacgtaaaatgtagttgatcggtctagtgcggaagcaaataatcgagcaattgttatggtaacacgtgagctagtttggatcaaacaactgctcaaagaattgaaatttggagaaattgatggaaccagtgtgtaataatcaagcagctcttcatattgcgtcaaatccggtgttccatgacagaattaaacacattgagattgactctcactttgccggagaaaagatactctcaggagataccgttacaaagattgtgaagtcgaatgatcagcttagagatatttttaccaagtcccttgctggtcctcgtattagttatatttgtagcaaactcggtatatatgatttatatgcaccaacttaagggagagtgtgagatagttatgtacaacaaaatacccggtataatcccacaagtggggtatggagggtagtgtatacgtagagcttacccttaccctgtgaaggtagagaagctgtttccaaataccctcggctccagtacaaatgaaaaggagcagtagcaacaagcagtaacaacaatgatatagtaaaataactgaagaaagaaataacatgtagacatataactccactaacaaacatgcaaggttaatactattgccacgagaatggcaaaggaatgttagatagttatgtattatatgtatattaatagtctagtctcacgttggaataggagtaatatgtactatgtagagtatagctataactaggacttcttgtaatatattgcatagagatatcaataatatatttttcctgtgctttctcacgtaaaggaatgtaatgtacttagaagatcatgaatctatctttgatgttttagacacctcgtgagaacacaaaggtttaggaactttattgtgttctttgtaattatgggtgactgccaatatgttaccttttcataaaaatgattatttggccattggattagtttcaacagcctctctgcccctccgggtaggggtaaggtctgcgtacatattaccctctccagaccccacttgtgggattatactgggttgttgttgttgttgttgtggattagtttcaacaattttgatagttcttttatttgaatcaaactactcattcacatggattttgtatcgtatcattgagttaaaaaaattggttttgctaatttatcctcatgtataacaactacctatttttcaatatattggattcaggagcttgtagtagctggagtttgctcttcaaagggcaataagtgccgggtatcatgcacagtgactccaaatacagatctcctttctgctctaactcttatggagaaacatgatctaagtcagctacctgttatactaggggacgtggaggatgaaggcatccatcctgtgggcattttggacagagaatgcatcaatgtagcttgcaggtttttgacattcaacttttacttcaaagatataatgctttctggaaccattgatgataaaatatgcaagaaacttgtgcagaagtcgcactttactatcgattaccagataaagttacttatcaagaagtcaaatatattgaacatatttctctaaaacactttgactggactgtaagcagaaacttactaaagtaggtcgtaagaaatggtttgatagggaaatcaccatctacacttaaaagagttgtgtgaatttgaattcttaaagcatgtgaaagttataaaaacttgttattatctaagcatctgaagcattttggccatccaaaggatcaaaaataggaaataatttcatttgtacaatgaactccctgcacaaattctcacactaggtgtattctctattcatcactagcactacatgtgtcactacgaatcatatacaataaatctttgtaacataaaagacgacacataatatggaagtaagccgagtatacaagggaagtttcatcattacggtgagctttttataagataatcaagttttactggaaaagggcaaaaactctcccgtatagaagtataccaaaaagtagaataccttacaaaaatatgattttctatgaacaacaccctatcttctatacttgtagggatctcatcggggcaccaaaaagagataaagggataagaggcttttcctcaaatgtacaaaatccttctctattccttcaaaagctctcctatttctctctctgcacactgtccacataagttcaatggagcaacatccacgccctgtgtcttcttttccgtcttctataggtccagctgaacatggcttctttgactgagtgtggcatcaacgttgaagaccaaaccatcccagtacttccaaccacaaacgagacactatatgacaatttagaagaagatgattcacatcttctcccgaacatttacacataaaacaccagctgatacatgtaatcttcctcttcctcaaattatcagccgtcaggatcacccgtctcgtagctaactaggtgaagaagcacacctttctcgaaaacctcaggatccatacagagagatatggaaaagctgattcctccatgcccagaagcttctcataataagacttaacaaagaaacaccactacttccccccccccccaaaaaaaaaaaatctccatacatcgactttcatgtgtaattcttgttcgtgaaacgacccaatcaacctttggcacaaatctcccagtcttgcgagttcctcctaaacttcaaatcacaatgaacttctccaccttgtagcctccgtgtcccttggactggcaactcctttggcatgaaactttgtacatattaggagatgtgatactcaaagtgttgttcctgcaccaattgtacccccaaaaaacttaccatgctcccatcacctaacattgaatgatacgttccaaaatcttcgcactccttcaagaaacttttccgtaggccccacccataagggagtgtgattttttttgctctccatcccctctccaagaatccattccctaaaccactgcaggacactttaacaatcactatgtcactttttctactagttctacattgagtgatatcttgatgtcattgaaatgcctctggaaaatcttcttctcatctaaaagaacacttgtttgccttttgaatccccctctaacattttctatgtttcattcatctttggtggaacagagcattagcaactagagaacagctttgctag
SEQ ID NO:4(来自普通烟草的NtCLCe的DNA序列；序列源于祖先绒毛状烟草；一个起始密码子)
atgaatcacgaaagttgttgggtcgtcatccaaattgctggccttgggctcgacgaccatctcttcctccgggacgttcctgtgacggaaacattgaaaaagaacaagatatgtgcgacagcagcaaagacgatagtgatagtgatagtggtatccagataggatctctgctcgaggaagttatcccacaaggcaataataccgctataatctcggcttgctttgttggcctcttcaccggtatcagtgtcgtgcttttcaacgctgcggtaagtgcgctataggtctttcatttctcttttcatctactattctcccttacttacttggcctcagtcaatcagccccctgcctactttaaattattgtacaatttatcagaggagtatcctatacatcaaattcacataacttagtaaaatatgctgacattctgaattttaaccttaccagcttagaacatccaggctagttcagaaacagataatctaaattggcctcatttataagtcattttgttaatcaagacatacaatttggctcttgataaaagattatgcagcgcccgatgataacctaatatttatcagcaacccatatgtcactttcttttgtttaaatgctctcccatgtaatttaacaatattgtcaccatacaaaagagaactgaagtgaatgttccatttgtggtcatataacggatatctcccttggttaggttcatgaaatacgtgatctttgttgggatggaattccatatcgagctgcctcagaggagcccattggagtacattggcaacgtgtaatcttagtaccagcttgtggcggtttggtagtcagctttttgaatgccttccgagccactctggaggtttcaactgaagaaagttggacatcatctgttaaatctgtgttggggccagttttgaagacaatggccgcttgtgtcacattaggaactgggaattccttaggaccagaaggccctagtgttgaaattggtacatctgttgccaagggagttggagctctgcttgataaaggtggtcgtagaaagctgtcactcaaggctgctggatcagctgctggaatcgcttctggtttgttccccatattattcttggttctgaaccatacatggtacattttccttataattacatgtagcctgttgtatgctttcctctttcctgggaagcctttctgtaaatgcaaatgtgtttgcactcaaaccaataaactgtaaaaacagtgaaccccttgagcaagcaaaagcactagaaaaccaacaaatagatcccccccccaagataccagtgaaatgacaccgggtgacccaaaaataaagcagcttacatcttgactttgagaggaactgcaatcagctataagtaggttattaatttccagtgcctgcattctgcccaagtactatgatatatttctgaagctttgtttccccagttcctttttcagacgtttgctgtcaataaagttgagccagccaacttggttcccacaagctactaattttgtccaagcttactctatgggagaagttaaatttcccaaattccttgagcagaaaatgaaaaatgaactcaaagtgtcatattaggcaactatctaaagaaaaatacttaattgaagtttagataagaaaagtgaatatatattgatgtagtctccgttaggtgagaagcgcatcacttacccagcaacatatggacctaaaatttactagtgaacttttcacattgtatcaaaagctcaacaaacagaaagatgactagtcctaaaatgttatttcacatcaaccttatcatacgtgcattatttgttctctatatttctatttcatccgatataaccaatcgtcattgtaaattctataatgcctgtggttacttttgtctttagtgacaaatgacatttaggctaaccatgtagttattgactgatttcgcttgacgtctcttccaattatgtagtagtagagtgttgagatatggatatgttaccttctaaaaaaaaagagtgttgagatgcggatggtttgctagctggcttttgtctcccttcaagttgaattagcaaaagcaatgtctcataagttggatagctagacaagaaaaactccaaattactttatgtagagtattcttaagcttgagtcgcgagttggaaattggaattatgtaaaaaaacctggaattatttggttgagcctgctttttatttttgtcaatatttccagtatctaacccaacatgtttagagcaattcccagagagcctcaatacgaggcatttgcagagtctttatgagagtccaggaaggggcacacactgtagaggtatagtgttgtccttatttttttttttttgataaggtaagattttattaaaaggtaccaagatggtgcaaaattacaaacatccaaactaatacaacaaagcaactacattcctcctagctcctctagaaaattcatatattgttccatatttttcattacatgtcttttacaccagaaatacaagtttaataagcatctgtttttaatcctggatacatgctgcctttccccttcaaagcaaatcctgtttctttccaaccatattgtccagaacacacatagaggaattgttcttcatactatctgttgactctttgccactttttgttgttgccatgtctccaacaaactttacactggcaggcattgcccacttgacatcatatatatttaggaagagctaccaacactgctttgccactttgaaatggatgattagatggttgactgtttctgcctcttcttcacacatgtaacaccggttacatagagcaaaacctctcttctgcaagttctcctgagttagaaaagcttcctttgctccaatccaaccaaaacgggctactttaataagtgcttttgacttccatattgctttccatggccaatttgactgataaagcccttgtagtttttgtaacaagctataacaactgctgactgtgaaaataccatcattacttgctgcccagattaatgagtctctcctgttttcctccaatctaacattattcaataactgcatcaattgggaaaattcatcaacttcccagtcattgaggcccctcttgaagattagctgccagccggtgcttgaatagaagtctaacactcttccatttttgttaatagagcagctatatagaccaggaaactttgatctaagacttccattttccaaccacatatcagaccaaaacagggtattattaccatttccaagtttcagtttcacaaactgactatatttattccaaagattactaattgtgctccaaactcccccttttgaagaagattgaattgaacgaggagcccacatgtccttcataccatacttggcatctatcacctttttccataatctattcccatcataattatatctccatagccatttaaataaaagacttttgttatgcatctttagattcctcactcctaatccccctctttctttttttttcatcacctcttgccatttgaccaagtgaaatttcttgttatcattattaccttcccacaaaaatttattcctcatagtattcaattttttctccactgatgttggcattttaacgagagatattagataagtaggtataccatccatcacactattgaccagtgtaagcctaccaccaagagataaatattgtcttttccatgacaccagtttactgctacatctatccaagaccccctgccacatctttgcatcattcttttttgctccaagtggtaggcccagataggtggatggtagctgctccactttacaacccaaaacatctgccagatcatcaatacaatgctcggcattaatactaaacacattactctttgccaagttcactttcaatcccgagacagcttcaaaagctagtagtactcctatgaggtgtaagagttgctctttttcagcttcacataatatcaatgtatcatcagcatagagtatgtgtgagaaatacagttcttccccctctctttttctaattttcaatcctctaatccaccctaacttttctgcttttaaaagcattctgctaaagatttccatcaccaacaaaaataaatagggggatattggatccccctgtcttaaccccctctgagaattaaagtatctatgtggactcccattaattaaaactgagaagctaattgaggatatgcagaattttatccacccaatccatctttccccaaaattcgtatgtttcatcagatttaacagacatgaccaatttacatgatcataagccttttccacgtcaagtttgcaggccacccctttaatcttcctcttgaatagatattcaagacactcattagctaccatagcagcatcaataaattgccttcctcttacaaaggcattctgattatctaatatcaattttcctatcaccatctttaatctttcagctatcgactttgcaattattttatagacactgcccaacaagctgataggtctaaaatctttcacttccgctgccccctttttcttaggaataagagcaatgaaaattgagtttaggctcttagtcttgtccttattttcagggttgaactagttctttagaagtttcctaggcttcctaatttccaaagttctgccaggtccttttctagtgaagtacttgaagtttaataaatcaaattttaatttctaacatatcccgagaaattcattcacaaattcaactggtgacttctgatgcagaaacataagcaactgcttatgggttcatatgttcctgcaattttattgttgacatggattggcttcatatggttttgttcctgcaattttatcgctgacactaatcctttcatatggttttatgtggggtggtaaatagaggttaagagacaagaagaggctggaaaaggtgggcagttcatttgttagtagactactctatttactaagagatatgatgtcccatacattactcgaattggctccaaatacagattccacttctttgtcgagtttccttattgtacagagttcgactcgtcaagggaaattcacttcctttgactgaataatgctagtttgagtagtaccttaaattaaatggaccatttaattctatctacttgatagaatagactggtcatcaactagttgcaaatataatgacaactccgccatgtttgcagagtcacctgatgaagaagtacctcaattagtagaccatttcttgaatgttctacagtattctctatgcctacatgaccacatcacttttccttttgcgttgtgagaacttgaacttggtgagcgggggttccccaggaatggcatcttggtggcagatgaccattctgtccttatcttagctaatgcttcttggattgcctcactagatttattatacctttaataaatgtttgccattgttctgccataatagagggatgtacctagctggtgcttcacatcacatagtccaaaactaatgaaatgctttacaattgtcgagtactaaaggatgatttgtggaatcagatctcaaacaatttattttgaggaagaaaaataccaaaggttttttctgtttgttggaagattaaaaatcctttaaaaggtaaagatttatgaacttaattcagcatttttgtggccattgctgaaaaagagaaaacaatggcacttattcgagtttgcttatccaaaaaaaaagaagaagagaatgtcacgtaatgcaatttcatcttaggaaactttgcaggagaaaagcaagagtgataaaacagaactatttgtttttttgataagttgttgtgacctatttctttgtcattcttatttgctaataagctaatgtaccctgtactatggttgttttgacttaatccggggatgttcagtgagcattttcttgttttttctgctgtcagcatctgctgccttacaggaattcattttctggaaatttacttcttgttctgctaacattttcctgttatatcttgtcagtcattttctctccatggttatactgtttgtgtcactttgaaactctccttgttttctactttaaaggatttaatgctgctgtcgggggctgtttctttgctgtggaatctgtgttatggccatcacctgcagagtcctccttgtacttgacaaatacgacttcaatggttattctcagtgctgttatagcttctgtagtctcagaaattggtcttggctctgaacctgcatttgcagttccaggatatgatttccgtacacctactggtaattttggacttctttctcgagtttgattcttaaatacaattgtacccgtcacttacagcaacaacaactacatttcaacagctagttggggttggctacacagatcatcactatccatttcaatttctttagtcccatttctttcgaatattcagtactttgggattctctattatcagaggttctctttattttctactttgacgtacaaatctctaaatagattaaagaagactcctagagacactggcctaatgcaaatgtaccaccatgaataaaccttaatctgaaatagctggtatcgtatataagaacctttagctttaattgtgttctatattgatcttttgggacaacttccgtccaataatattatgtcttacttatacagttatacttatccttaaactttactctttagagtggttatccgtagttcaagcttttgttggcaccatagctagtttggttcttagtaaaaagttactctttagagtggtaactttttgtcaattttcttagtgaaaatataacctctgtgacaaatctaccaagtataaatccaatatggttctgtgtcatacttgtagtttatccaagtctatgctccatcactcttacaaaggctcatcgtatgactaattttttttgagaaaggtaacagtttgtattgataataagatcagcgccaggttagtcattagtgctaatagctgtatgtacaactccaaaagagcaaaagacaagcacctggtgtaacgtaaattacaagctgcctataaaatctatcaggtctcctacctcactaaacatttcttgtttacaccaaaaaaataaaacaaggaaagacaatccatcttaatcttctgaatggagtttcttttgccttcaaacatctcgagttcctttcgttccatgcaatccaccatatacaagctgggatgcttttccatttgtctttatccattttttctaccaattcccttccaattgactagaagttccaatgtggttctagatatgacccaattaactcccaacatataaaagaacatgttccacggatttgtagtgattctgcaatgtaggaacaagtgagcattactttctacttcctgtccacaaagaaaacatcttgagcaaatctggaaacctcttctttgtaagttatcatgtgttaaacatgcttttttaccactaaccagacaaaacatgatactttgggaggagttttaaccctccaaatgtgtttccaaggccacacctcagtcattgaaacattatgatttagagtccagtatgcatcttttactgaaaatgcacctttgctattcagcttccaaactattttatctatggtcttgttagtttacagctatgtatatagtgtagtcttgtcccacattggaataggagtagtatgtccttgtatagtatagctataaataaggacctcttgtattgtattgaacatccaatatcaataacatattttctcccgtgctttctcacatggtatcagagcaattgtgagagatttatcgctgcgcataaattccagcgactccgggaagagaaatcagtcaccggaagtctttttccgacgactctttcaaggttgtttgcgtttgctttataaatccaacactaccacaagagtaatcactgtccggcgaccaaaccccagtaaaaatctccggcagcagcctcctcacgccaccagaagctcacgcgccggcgcgtacgaccacttccgtccattttttgaaaaacttccttcagaacagttgggtcgcctggtaattcctatcctacccctactgttttcatttcattccgaccactttgagttttttccggctgctacagtactattccggcagctatagtactattccgacaactacagtaagattccggctgctacagtatttcattattctgtttttgtgtttccttactctgtttcagtggattacaattgattctttctcttatttggtaataatttgcaacaatgtctatgggatttgatgtttttgggtctagaaacatgagttctggaagctctagtgttattattacctcagaaccttaaatgggaggttcaaactacttagcttgggcttcatctgtcgagttgtggtgtagaggccaaggtgttcaagatcatctaatcaaaccgtctagcgaaggagatgaaaaggcaataacactttggacaaaaatcgatgctcagttatgtagcatcttgtggcgatctattgattccaagttgatgcccttgtttcgtccattcctgacatgttatttggtttgggcaaaggcacacaccttatacactaatgacatatctcgcttctatgatgtgatatcgcggatgacaaactgaaagaagcaagaattagatatgtctacttacttgggtcaagtacaagcaatcatgggggaatttgagaagttgatgccagtttctgctagtgttgaaaaacaacaagagcagcgacaaaagatgtttctcgctcttaccctcgctgaacttcctaatgatcttgattcagtacgcgaccatattttagctagtccgactgtcccgacagttgatgaattattctctcgattactccgccttgctgtagcaccaagtcacccagtgatctcatcacagatacttgattcctctgttcttgcatcccagacaatggatgttcgggcatctcaaactatggagcatagacgaggaggaggtcgttttggaagatctagacccaagtgttcttattgtcacaaacttggacacactcgtgaaatgtgttattccttacatggtcgtccacccaaaaatgcttacattgctcagaccgagactccaggtaaccagggattttctttatctaaagaagaatataatgaactccttcagtatcgaacaagtaagcagacatctccacaagtagcctcagttgcttagactgatacttcttttactggtaatttttttgcttgtgtttcccagtctagcactcttggcccatgggtcatggactcaggcgcttctgatcacatctctggtaatatatcacttttgttaaatattgtatattcatagtctcttcccattgttactttagccaatggatgtcaaattacggcaaaaggagttggacaagctaatcccttgtcttctatcaccctagattctgttctttatgtccctggctgtctttttcgtcttgcatctgttagtcgtttgactcgtgccctccattgtggtatatattttattgacgattcttttattatgcaggactgcagtacgggacagacaattggtggaggacgtgaatcagaaggcctttactaccttaactcacccagtccttccacaacatgtctggttacagatcctccagatctaatccacagacgtttaggacatccgagtttatccaaacttcagaagatggtgcctagtttatctagtttgtctacattagattgtgagtcgtgtcagcttgggaaacatacccgagcctccttttcgcgtagtgttgagagtcttgcatagtctgccttctccttagttcattctgatatatggggtcctagtagagtaagttcaaccttgggatttcgttattttgttagtttcattgatgattattcaagatgtacttggcttttcttaatgaaagaccgttctgagttattttctatattccagagtttctgtgctgaaatgaaaaaccaatttggtgtttctattcgcatttttcgcagtgataatgccttagaatatttatcttttcaatttcagcagtttatgacttctcaaggaattattcatcagacatcttgtccttatacccctcaacaaaatggggttgctgagagaaagaataggcaccttattgagattgctcgcacacttctaattgaatctcgtgttccgttgcgtttttggggcgatgcagtgctcacaacttgttatttgattaatcggatgccttcatctcccatcaaggatcagattccacattcagtattgtttccccagtcacccttatactctcttccaccccgtatttttggaagcacgtgttttgttcataacttagcccctgggaaagataagttagctcttcgtgctctcaagtgtgtcttccttggttattctcgtgttcagaagggatatcgttattattctccagatcttcgtaggtaccttatgtcagctgacgtcacattttttgagtctaaacctttctttacttttgctgaccaccatgatatatctgaggtcttacctataccgacctttgaggagtttactatagctcctcctccaccttcgaccacagaggtttcatccataccagccgttgaggagtctagtgttgttcctcgtagttccccagccacaggaacaccactcttgacttatcatcatcgttcgcgccctacatcgggcccaactggttctcgtcctgcacctgacccttctcctgctgcggaccctgctcctagtacactgattgcacttcggaaaggtatacgaaccatacttaaccctaatcctcattatgtcggtttgagttatcatcgtctgtcatttccccattatgcttttatatcttctttgaactcggtttccatccctaagtctacaggtgaaacgttgtctcacccaggatggcgacaggctatgagtgacgagatgtctgctttacatacaagtggtacttgggagcttgttcctcttccctcaggtaaatctactgttggttgtcgttgggtttatgcagtcaaagttggtcccgatggccagattgatcgacttaaggcccgtcttgttgccaaaggatatactcagatatttgggctcgattacagtgataccttctctcccgtggctaaagtggcttcagtccgtctttttctatccatggctgcggttcgtcattggcccctctatcagctgaacactaagaatgccttttttcacggtgatcttgaggatgaggtttatatagagcaaccacctggttttgttgctcaggagggggtctcgtggccttgtatgtcgcttgcgtcggtcactttatggtctaaagcagtctcctagagcctggtttggtaagttcagcacggttatccaggagtttggcatgactcgtagtgaagctgatcactctgtgttttatcggcaccctgttgacattccgatggatccgaattctaaacttatgccaggacagggggagccgcttagcgatcctgcaagctataggcggctggttggaaaattaaattatctcacagtgactagacccgatatttcttatcctgtaagtgttgtgagtcgatttatgaattctccctgtgatagtcattgggttgcagttgtccgcattattcggtatataaaatcggctccaggcaaagggttactgtttgaggatcaaggtcatgagcagatcgttggatactcagatgctgattgggcaggatcaccttctgatagacgttctacgtctggatgttgtgttttagtaggaggcaatttggtgtcttggaagagcaagaaacagaatgtagttgctcggtctagtgcagaagcagaatatcgagcaatggctatggcaacatatgagctagtctcgaccaaacaattgctcaaggagttgaaatttggtgaaatcaatcggatggaacttgtgtgcgataatcaagctgcccttcatattgcatcaaatccggtgttccatgagagaactaaacacattgagattgattgtcacttcgtcagagaaaagatactttcaggagagattgctacaaagtttgtgaggtcgaatgatcaacttgcagatattttcaccaagtctctcactggtcctcgtattggttatatatgtaacaagctcggtacatatgatttgtatgcaccggcttgagggggagtgttagtttacagctatgtatatagtgtagtcttgtctcacattggaataggagtagtatgtccttgtatagtatagctataaataagacagtactaacgtcccttttgccgggggttctgcatctttaaatagatgcacgtggttccatagcagaccgtgttgatcacagatcgtgctgcatcctcttcccagcggactcggtgagcccctcttgtattgtattgaacatccaatatcaataacatattttctctcgtgctttctcacaggtctgtgatgtacccttgaaaggttcaagagtttggaggaagatagaaactctgtttatctcccaatcatccaaagatcttctaaagttccagttccatccttgtgagctccagactgacttaccaatgcttggctttgaagacttagagagaataagtcaggaaaaatctttcaaccttccttgccctatccggtgatcttcccaaaaagatgtcttcaacccattgccaacattgatcctgatattgctactgaaagatttcttttggtggcaggattactctcattaacaatgtacttgacaatctccatacatacgaatgtctctttaccctcttgccattaaggttgtaaagagacttgtcaaattaagaagaggtttcctatggaactgtttcaaggaaggaacctcctttcctttggtcaagtggagttaagtcatataatctaggaagtggagacttgggtataaaatagctgcaactacagaaaaggagcatcttatttaaatgatcacgcaaatgtgcccaaaactttaaatatctgcggagcatatggttgtagcaaaatttgaatcttccggtcaatgttgctcatgtccagtgaatacccctgatggtgaaagtgtcctgaagggaagcaggaacttattggaggaattggcatttaacactcagcatttcgttaggtcatagcccgctgaaaattgagtgcccagatttatatagttttgctctaaactgacgatgcagttgcacaacatacgacaaactaaggtgggacatcttcttcggaaggaattttgaggattaagagatagagtggttgattcagttgcaaatgaagcttcaagggttcaatatcatccaggagacaccggattctgatagataaaacaacagaaagatgaacactactttgttaggcttgttacaagttgctatcgtctttcttatctcggcacacaatttagatttgggaacttatttggaaaatagagtggttgtttttgtgaatagcatcagacaaagcttctgagctggtacgacagaaaactcaacagggagaataaaagactgtggttcacgatttctgcatgcatcttgtaggttatttggtgggtaaaatatttaatgttttgaagggaaggtagaacatgttcataggcttagattcaaatgtttgtatttttttggctctttggtgagagatgctgaatgtaaatgacataggcagctgactataatttctcagctccttgctttttaaattggcaggcactgatatgtacatgtgaacatccaacacttttgtggtgccgttccgatgaataaagcacattaatcacttactgatcaggagtaatagtttaggagttctagaatttttgtacataaaatgaaccaaaaagaatatcggaatgagaacatgtttctttttttgtttcttctttttcgtacaaatttcaataacacttctgatagaatagctaggtccatttgaattcctttggagacccttacacaaccaatgaatggcaagtatagcattttctaacaccctcccacatgtataatccagtttttagggtttagatgtggatttgatttgaccttattgcctttttttgtttttgttctttttgaagtagagagtgaggaggctcacaacgacgggctacgtagagcgagattaattcggctcaacgggctaatgattggacttacatgctacaacaatgttaggagaaagagagagagagagagagaagcccagagcagttccacgagttaagaaagagaagtccaaagcgattgaatatgaagagagaaagcggttgtgctaacaggctccctcaagtttggctctgagcatccaactcaaaaccttaaggcaatgagtagagtagcccaggaccatttaaactcctgttgaaaaccttacacaaccaataagggaacaagtgtaacattctcttacaaccctaccgtcttataagtcagggctctaatttagcataaaatcaaagtgaggcgatctactatgaaatgaagaaaataactgataaatataaagaatgttaattctcccatatagcctgaatgttcccagaacaaaataaattagtctcatgatttatcattaacatgatgttcctcttattttgagtgattaggaaggttaatcaaggagtaaattctttctaatttgtatcgtctagaattatttgtctaacaaattttcagattaccggtgatcaaaagaggaaaatattttgcatacaacgttaccataccttacaaaagggcgatgaacatttttttattttattattgtcctttttttcaattaggggttatgcagtcttcctccacgtgatattactcttagaatcacgtttttgtcattgctattacttactgtggtaagtacaaatgtgttttgaactctttttggtatgtattattgagttaatttttcgtttccatttcagagctgccgctttatcttctgctgggcatcttttgtggcttagtttcagtggcattatcaagttgtacatcatttatgctgcaaatagtggaaaatattcaaatgaccagcggcatgccaaaagcagcttttcctgtcctgggcggtcttctggttgggctggtagctttagcatatcctgaaatcctttaccagggttttgagaatgttaatattctgctagaatctcgcccactagtgaaaggcctctccgctgatctgttgctccagcttgtagctgtcaaaatagtaacaacttcattatgccgagcctctggattggttggaggctactatgcgccatctctattcatcggtgctgctactggaactgcatatgggaaaattgttagctacattatctctcatgctgatccaatctttcatctttccatcttggaagttgcatccccacaagcttatggcctggtatgaatttgtcttttgttagaagtagcattacatatctggataagtgagttttttattattgaaaagtaataacaggagaacaagagaatatatcacccaaatctacttctttcctctcttctattcttctgaaattcaaggtcctttaactcctccacagtctgtctagttattgatcctgtagacttaattcacataggtttaggacattcgagtttatccaaacttcatgaaaaggtttctaatttttttacattacattatgagtcgtgtctacttgagaaacatatcactccatgtttctatagtctgttttctccttagtttattctgatatgtggggtcctattaagtcagttcaaccttgtattttcattatttttgcagtatcattgataattattcaagatgtacttggattttctttacaagagatagttctcagttgttttttgtgttcctaagtttttatgctgcaatacaaaattggtttgatgtctctatttgcatttttcccaatgataatgccttagaatattttcttttccgtttcagtagcttattatttctttaggaactctttatcagaaatctcaactgagatagatgagaggaagaataagcatatcattggtctcattcagtcccctgtcaagcttagtttcttgagcgatgcggtttcacgtccttttattagattaattggatgcctcatctgctatccaaaatcagttaactttcgatattgtttcctcgcttacctttatactctctttccctcgagtctttgggagcacatgttttgttcaataacatagctcctggaaagtgaccagcgcaaccgacaaacaaggccttcttaatgtagaaggtggacatatgctattctagccacgggaaagaaagtaatattgtaatcaaacccaaatatctgagtataacctttggcaatggcgatcaatttgattatatggaccaactttgcctgcatatacccaccgacaaccaataatagatttaccgggaggtagagaaacaagctcccaaataccactaatatgtaaagcagatatatctctgatcatagcttgtccttgtggacatagggatagaaattaaggacaaagatgacacaaaagcataatgcggtgatgataaacgatgataactcaaatcaatataatggggatggggattgagagtggatcgaatatctttgcggaatgcgattggtagactaggaggagagaagtctgtggacatgatgttggactgagatcaataataagtcaagaatggtggagctacagaacatggaactggagctgtaggtgacataatcggagctgtaggaggtggagctatagaggaaggtgaaggagagatagcgactgaatctccaaaagatgaaaccggtaatacctcaaaaaatgtctaagagatcatttggacctatgaagtatgattgcgtttttaaaaaggtaacatcataaggtcaggtgaataacattgatatccccgttgcatcctcgagtaacttagaaatatacatttgagagcacggagagctaacttatcttttctggagcaaggttgtaaacaaaacacgtgctcccaaagacacgaggtggaagagagaaaggtgagtggggaaacaagacagaggatgaaacttgactcttgatagttgaagatgacatacaattaataagacaataggatgtgagatccaatgacagttctcatgaactgctgaaatggagaagacaaatactctggggcgttatcactacgaaatgtgcagttagaaaccccaaattgattttggatttcagtgtggaaggtctaaaaaatagagaacaactcagattgatttttcatcaagaatatccaagtggacttggaataatcatcaatgaaactgacaaagtagcggaattccaaggtagaactaacccgacaaggaccccaaacatctgaatggactaaagtgaaaggtaactctacccgattatcaggatgtcgagggaaatgagagtgagtatgccttctgagcggatatgactcacgctctagagtggacaagtgagacaaacgaggtactattttctaaagttctgataaattgggatgtcctaactgtatatgtaataaatctggtggatcagtaaaaggacaagctgtagggggaaaaaaataccaaatatttccagaagatggcaaactacaacagaagatgcaactgcattaacatgctcaggataggtgatgaaatcattgaggacaaagagttgatcaagaaggagattctggaattttaccagaacttatatagtgaaaatgaaccctggaggcgcagtgcaaatttcgaagacatctcctcactaagcatagaagagaagaactggttggaagctccatttgtagaaatagaggtgcttgaagctttgaaatcatgtgccccttataaagcaccaggtccagaaggcttcactatggatttctttcagaaaaattgggatactcttaaaacagacatcatggctgcacttaatcattttcaccagagctgtcacatggttagggcttgcaatgccaccttcattgccctaattccaaagaaaaatggtgctatggagctcagagactacagacctattagcttgacaggtattgtatacaaattggtttcaaagattttagcagagaggctcaagaaggtaattgacaaactagtctcgggggaacaaaatgctttcatcaagaacaggcagatcactgatgcttccttgattgccaatgaagtgctggattggagaatgaaaagtggagaaccaggcgtgttgtgcaaactggacattaaaaaggcttttgatcaattaagctggtcttacctcatgagtatcttgaggcagatgggctttggggagaaatggagaagatggataaactattgcatttcaactgtcaagtactctgttttggtgaatagggacccaatcggttttttctccccccaaaagggcctaaggcagggggatcccctctcccccttcctattcattctggcgatggaaggactcactaaaatgttggagaaggctaagcaactgcaatggatacaaggctttcaggtgggaaggaatcctgccagctcagttacagtatctcatctactctttgcggatgatactcttattttctgtggtactgagagatcacaagcacgaaatctcaacctgacactgatgatcttcgaggcactatcaggactccacatcaatatgataaagagcatcatataccctgtgaatgcagtccccaacatacaagagctagcagacatcctatgccgcaaaacagacactttcccaaccacatatcttggacttcccttgggagctaaattcaaatcaaaagaagtttggaatggagtcctagagaagtttgaaaagaggcttgcgacttggcaaatgcaatacctccccatgggtggcaggttaactttaatcaatagtgtactggacagtcttcccacataccacatatctttgttcccaattccaatctcagtcctaaagcagatggacaaactcagaaggaagttcttatgggaaggatgcagcaaaacacacaaatttccactagtgaaatggctgaaggtaactcaaccaaaattcaaaggagtcttgggaatcagggatgctatgctcttaaaatggctctggagatatggacaggaggaatctaggctatggaaggacatcatatttgctaaatatggagcacacaaccactggtgttccaagaaaacaaactctccttatggagttggtctgtggaagaacatcagcaaccactgggatgaattcttccaaaatgtaactttcaaagttgggaatgtaactcgtataagttttggaaggatagatggcttggaaatacacctttgaaagacatgtttcccagtatgtatcagattgccgtgaccaaagactccactgttgctcataatagaaacaatgacacttggtacccacttttcagaagaaatttgcaggattgggaggtcaacaacctactcacaatgttaagctccctagaatgtcataacattgaagatcaacaacctgacaaacttatttgggaaaattctaagagaggcaagtacacagtcaaagaatgatacattcacctctgtgaccagaatccaatatataactggccatggaaacatatctggagaactaaagtgcctaccaagatgacttgcttcacatgattgtctctaaatggggcctgtctcactcaagacaacttaatcaagaggaacatcatataagttaatagatgctacatgtgccaacaacagtcagaaagtgtaaagcacttattccttcactgctcagttgcaaaagaaatttggaacttcttctacactacctttggtctaaaatgggttatgccacaatcaactaagcaagcttttgaaagttggtatttttggagagttgataaatccattagaaaaatctggaaaatggtgtcggccgcaagtttttggtgtatttggaaagaaaggaactgaagatgttttgatggcatatcaactccactcaaggctgcgtgtttagttaacttattttgctggaactatctcacccctgttaatagtgctgatacttctgtggatttcattagccccctgatagtagcataggcttttgtaaatggagctaattatcctttctcttttgtactctttgcatcttcttgatgccttttaatgaatctaatttacttcatcaaaaagaaaatgacaagttgttgaaggaggaaaagatgtgagtccatgtgatttagcaaggataaggtactaaagtccatttgattcacgtccggtaccaatgatccgtctcgtgctgcattcctgtattaaaacagagtcatcaagaaataaaatagagcaaataagtgattggccaagcgactagtggatatgagattaaaaggactatggggaacataaaaaactgaattcaaaggtaaggaaggaagtggactagcttaacctattctagttgccatggtttgagaatcgttggccattgtgactattggaagtgattgagagtaagaaatagtagtgaaaggagatttgttacccgaaatataattagatgcacctgaatcaatgacccaaaagtcggaagaagaggaaacacaagtcacgctattacctgtttgaacaatagagattagtttggatcaaatagttgtatagagaactgaaatttggagaaatcaatcatatagaacttgtatgtgattattgttgccctttatattgcgtcaaatcctaaaacacattgagattaactgccacttatcacagaaaagatattctctagagacattgttacaatttcatgaagtcaagtaattagcttgaacatatcttcagcaagtccctcgtcagtcctcatattagttacatttgtaacaatgtcggtacataagacttataagcaccagtttgaggaggagtggtagagagttgatgtacatagttaaagtagatatacttacacttagtgttatgtaaagagtggatataaaaagggatcagcataagacaattgtcttcgcgcgtcttaacatttttttcctgtctttatttctctcatggtatcagataacctatctctatcttggtttacccaatggttggcccccatattgtattagccatgctccagttgactaggcttggacgggcagaggtgttaaattatcccatattggttgaaagaatgagctattgtctccttatatggtcttagacaattctccaactcatgagatattttgttttggctgagttagccctaaggtttattttttgtcatattctttaaccttatggcaatgcttgtacacggaaaaaccggagtgcaagacttaaattaggagaaggaaactattgaaggtgaggaacttaaagggttgtgagaatacacgggagaaaaaaatcttaatactatctagtggccttgtatatcaaatgatcagcttgcaaatattttcaccaagtccctcactggtcctcgtattagttacatatgtaacaagttcggtatatatgatttgtatgcaccggcttgaggttatgcatattctattcctcctactatatatgtgactaggaaatattttactcctactgcatatgggactaggactatttacacataactatctaacattcccctcaagccagtgcacacaagtcatatgtaccgagcttgttacatatgtaactaatacgaggaccagtgagggatttagtaaaaatatctgcaagctggtcattcgacatacaaggccactagactccccccgagcaacaaaaccaggtggttgctgataaacagaaactggccgaaaagttgccggaaaaatttgaaaatagtgagactaagccgaattctacactacaaaataggttctaaaacaccaccagaaaacaaaaacttttctagaaattactcttcacaccggaaaaaataaaagttgtcagaatttgatgtaatttatatagataggttcggaatcactggaggagtaagttgtcccgaagaagttttgtcaaaaagtggccggaatggctcacatgcgccggaaaacttactgtagctcgcaggaaccctagttctggcggtgcgtggaggcgcgtgacttaagattaagatgcttacaggactatcttgagaaatatacatattatatagacgcttgagttgcttcccaatcctaaatagaagcttttattcgtaggcaagaagggaagcagctttacttgagccaatagctttcaaggtgcacgttgtcacaccaaggacatccagaatttgattttatagggggtgtgagaaagcacgggagaaaatatgttattgatatttggataataaatacaatacaagaggtccctatttatagctatacactacaaggagatattactcctcttccaatgtgggacaagaatacactatacatatctgtaaactaacactccccctcaagtcggtgcatacacatcatatgtaccgatcttgttacacatgtagctaatacgagaaccaataagagacttagtgaaaatatctgctagttgatcattcgactttacaaactttgtaacaatatctcctgaaagtattttttctctgacaaagtgacagtcgatctcaatgtgtttagtcctctcatggaacaccggatttgacacaatatgaagagtagcttggttatcacacattagttccatcttgctgatttctccgaattttaactccttgagcaactgcttgacccaaaataactcacacgtcgtcatagccatggcccgatattcggcttcggcgctagatcgagcaactacattctgtttcttgctcttccacgagaccaaattacctcctactagaacacaatatccagacatagaacgtctatcaaaaggtgatcttgcccaatcagcatctgtgtacccaacaatctgctcgtggccttgatcctcgaatagtaatcctttgcccggagctgactttatataccgaagaatgcgaacaactgcatcccagtgactatcacagggagaatccataaactgacttacaacactcaccggaaaagaaatgtcaggtctagtcactgtgaggtaattcaatttgccaaccaacctcctatatctcgtagggtctctaagaggctccccctgtccaggcagaagcttagcattcagatccataggagagtcaataggtctgcaacccatcattccagtctcctcaagaatgtctaagacatacttccgctgtgaaataacaatacctgagctagactgagcgacctcaatacctaaaaaatacttcaatctgcccagatccttagtctggaagtgctgaaagagatgttgcttcagattagtaataccatcctgatcattgccagtaataacaatatcatcaacataaatcactagataaatacacagattaggagcagaatgccgataaaacacagagtgatcagcctcactacgagtcataccgaactcctgaataattgtgctgaacttaccaaaccaagctcgaggggactgtttcaaaccatatagtgacctgcgcaatctgcacacacaaccattaaactcccctaagcaacaaaaccaggtggttgctccatataaacttcttcctcaagatcactgtggagaaaagcattcttaatgtctaactgataaagaggccaatgacgtacaacagccatggacaaaaagagacgaacagatgctactttagccacgggagagaacatatcactataatcaagcccaaaaatctgagtatatccttttgcaacaagacgagccttaaaccgatcaacctggccatccggaccgactttgactgcataaacccaacgacaaccaacagtagacttacctgcaggaagaggaacaagctcccaagtgcaactcgcatgtaaagcagacatctcgtcaatcatagcatgtcgccatcctggatgagatagtgcctcacctgtagacttagggatagaaacagtggacaaagaagatataaaagcataatgaggtgacgacagacgatgataacttaaaccgacatagtggggattaggattaagtgtggatcatacacctttgcggagtgcaattggttgactaagaggagacaagtccgcagtaggtgcagaatctgatgcggggcgtgaatcacctgggcctgatgctggatatggacgacgatgataagtcaagagtggtggagctgccgaaggttgaactggattatgtggaggaactggagctataggtggtggagctacaactggagctgtaggtggtggaactagagtaactgaatctccaaaagatgaaactggtagtacctcagaaatatctaagtgatgacctgaacctgtgaagtatgattgggtttcaaagaaggtaacatcagcagacataaggtactgctggaggttaggagagtagcatcgataccccttttgtgttctcgagaaacctagaaatacgcacttaagagcacgaggagctaacttatccgttcctggaataaggttatgcacaaaacaagtgcttccaaagatacgaggtggaagagagaacaaaggtaagtggtaaaacatgacagagaatggaacttggttctggatagctgatgatgtcatacgattaataagatagcaagatgtaagaactgtatcccccaaaaacgcaacggagcatgagattgtatgagtagggtacgagcagtttcaataaaatgtctattctttctttcagctaccccattttgttgagatgtgtacagacaagatgtttgatgaataatcccatgagatttcataaactgctgaaatggggaagacaaatactctcgggcattatcactacgaaatgtgcgaatagaaaccccaaattgattttgaatttcagcgtggaaggtctggaaaatagaaaacagctcagatcgattttttatcaaaaatatccaagtgcacctggaataatcatcaatgaaactgacaaaatagcagaatcccaaggtggaactgacccgactaggaccccaaacatctgaatggactaaagtaaaaggtgactctgctcgattatcaagacgcctaaggaaatgggagcgagtatgcttaccgagctgacatgactcacactctagagctgacaagtgagataaaccagataccattttctgaagttttgacaaactgggatgtcccaaccgtttatgtaataaatctggtgaatcagtaacaggacatattgtagatggaagacaagatgcgagtccatgtatttagcaaggataaggtaataaagtccgtttgattcacgcccggtaccaatgatccgccccgtactgcgttcttgtataaaaacatggtcatcaagaaataaaataacgcatttaagtgatttggctaagcgactaacaactatgagattaaaaggactattgcgaacataaaggactgaatctaaaggtaaggaagaaagtgggcttgcttgacctattgcagttgccatggtttgagacccattggctattgtgacttttggaaaagattgagaatacgaaatagtagtgaaaagagatttgttaccagaaatatgatctgatgcacctgaatcaatgacccaagactcagaggatgaagattgggaaaaacaagtcacgctattacctgtttgaacaacagaagctatctcagaagatgtctgcttacatgctttgtactaaaggaactcaatataatctgctaaagaaaccatccgactattcaaagcatcggttcccatgtcgctacaatttgtagtagtagggttaacttgaaatagtggaaataagtaactccggtgagaaaactgaagaaatagcttgaaaacactgtttacaacagtaaaaacagaacactgttctgcgccggaatctactgtagctgacggaaaaactcaaagtagtcggaatgaaacgaaaaacagtaggggtaggatcggaattaccaggcgacccaactattctgaaggaagtttttcaaaaaatggccggaagtggtcgtacgtgtcggcgcgtgagctcacgcgcgtgagcttctggtggcgcgtggaggcgcgtgaggaggctgctgccggagattttcactggggtttggtcgccggacagtgactactcttgtggtagtgttggattttgcacaacactgacggagataaagcagacgcaaacagccttgaaaaagtcgccggaaaagacttccggtgactgatttctcttcctggaatcgctggaatttatgcacagcgataaatctctcacaattgctctgataccatgtgagaaagcatgggagaaaatatgttattgatatttggataataaatacaatacaagaggtccctatttatagctatacactacaaggagatattacttctcttccaatgtgggacaaaaatacactatacatatctgtaaactaacaaggggaatatcgtttaaagataaaaaagatagcgtgcagaagattgcatacattagagatgcaaaatacagaatacccatactcccagataatgcagtatgccttttgcatgacccactggttgaatggaagcacctggtcaatttactaggtgtgttagtgatttttgctgcttccttcccctttctaaactacatactatctaaaatgttagggggacagaagcccagtcaatctgactaggtgatgttagtggtttccgcttctttctcccacttctaaatgcgtactttctcaaatttaggagcatagaaacttaagcagctgcctacctgaggaggtgcatgggaacataagagaatagactttacctgtcatattttccataccttagttaattacagtgttatcctgataatgatctgttttctgtatctaggctgaatcgagattcaatcgcttttggctgaaaggatgctgctacagatccttagtttacatcattgtggttcttattctataagtacttcccctatcaactacttccttcttttttcttaggttatttgcctcttaggttgtttgcaaggaaaggaacaatagatgttttgatggaatagcaactccaaaccacttccttaaggctaatatactgtttggccaagcttcttcaaagtccaaagcccttttttgtcttcaaaaaagtatctttttttcccaaagttgaggtgtttggccaaacttttggaaggaaaaaaaagtgcttttgagtaaagcagaagctcttgagaagtagaaaaagtagttttttcccggaagcatttttttgaaaagcacttttgagaaaaataaacttagaaacactttttaaaagtttggccaaacactaattgctgcttaaaagtgtttttcagatttattagccaaacacaaactgcttctcaccaaaagtacttttttgaaaaatacttttttgaaaagtgattttcaaacaaagcacttttcaaaataagtttattttagaagcttgtcaaccggctataaatgtcttttatttttacagctagagtaccctaacacctgtaaattcccctagacatttttttcgactttgttagctcattaaccctagtataggactctttgttttggagctagcaaactcttttgttttcctatttttgcatcttcttggtgccatttataatatctcttacttcaccaaaaaaaataagttcccaaaatatgactaccttgagttggccaaagcataaccaaagcttgggcacaccagtgtttgcgtgaattttatggatgttccttacctttatccttctgtgcttatgtagcatctgtcttggttaatcttttctgaagtctatagtgtatttctgtgttgcaacatgagtttactgtcaatcttactgtttgacctcaattttgggttctttttgattttgaaagacatcgtttaacaggttggcatggctgctactcttgctggtgtctgtcaggtgcctctcactgctgttttgcttctctttgaactgacacagaattatcggatagttctgcccctcttgggagctgtggggttgtcttcttgggttacatctggacaaacaaggaaaagtgtagtgaaggatagagaaagactaaaagatgcaagagcccacatgatgcagcgacaaggaacttctttctccaacatttctagtttaacttattcttcaggtgtgaaaccttcacagaaagagagtaacctatgcaaacttgagagttccctctgtctttatgaatctgatgatgaagaaaatgatttggcaaggacaattctagtttcacaggcaatgagaacacgatatgtgacagttctaatgagcaccttgctaacggagaccatatccctcatgctagctgagaagcaatcttgtgcaataatagttgatgaaaataattttctcattggtctgctgacacttagtgatatccagaattacagcaagttgccaagagcagagggcaatttccaggaggtagcttcttggtacatttcaatattcttaactgatgaaaaaataagggaaattgatctagcatgaaattaagctaattataagttttacactgtagaactggtaaaacagggttggctggatatttctttgttgaatttttaggattatatgtattgttttagttttgtaggttgttttctgatgtgctttttgacttggcagaatcttaagatgaaatggaaggtgtttaaccaaaaaatagaattttcagtcaaagcctatatttagaagaaaacgggttattgataaccaagttttactttacttccccaacaatctatttggtaaatagcaaaagtaatgcgtatgtgagaaagcacgggagaaaatatattattgatattagatattcaatataatacaagaggtcctacacatcatatagctatagtctacaaactacatattactctcattccaatgtgggactacacataactaacactccccctcaagccggtgcatacatatcatatgtaccgagcttgttacacatgtaactaatacgagaaccagtaagagacttagtgaaaatatctgctagttgatcatttgactttacaaactttgtaaaaatatctcctgaaagtattttttctctgacaaagtaacagtcgatctcaatgtgtttagtcctctcatggaatagcggatttgacgcaatatgaagagcagcttggttatcacacaccagttccatcttgctgatttctccaaactttaactccttgagcaactgcttgacccaaactaactctcacgttgccatagccattgcccgatattcgacgtcggcgccagatcgagcaactacattctgtttcttgctcttccacgagaccaaattacctcctactagaacacaatatccaggcgtagaacgtctatcaaaaggtgatcctgcccaatcagcatttgtgtacccaacaatttgctcgtggcctcgatcctcgagtagtaatcctttgcttggagatgactttatataccgaagaatgcgaacaactgcatcccagtgactatcacagggagaatccataaactgacttacaacactcaccggaaaagaaatgtcaggtctagtcactgtgaggtaattcaatttgccaaccaacctcctatatctcgtagggtctctaagaggctccccgtgtctaggcagaagcttagcattcggatccataagagagtcaataggtctgtaacccatcattccagtctcctcaaaaatgtctaaggcataattccgctgtgaaataacaatacctgagctagactgaggcactgagcaacctcaatacctagaaaatacttcaatctgcccagatccttagtctggaagtgctgaaagagatgttgcttcagattagtaatatcatcctgatcattgccagtaataacaatatcatcaacataaaccactagataaatacacagattaggagtaaagtgccgataaaacacagagagatcagcctcactacgagtcatggcgaactcctgaataattatgctgaacttaccaaaccaagctcgaggggactgtttcaaaccatataatgacctgcacaatctacacacacaaccattaaactccccctgagcaacaaaaccaggtggttactccatataaacttcttcctcaagatcaccgtggagaaaagcattcttaatgtctaactgataaagaggccaatgacgtacaacagccatggacaaaaagagacgaacaaatgctattttagccacgggagagaaagtatcactataatcaagcccaaaaatctgagtatatccttttgcaacaagacgagccttaagccgatcaacctggccatccgggccgactttgaccgcataaacctaatgacaaccaacattagacttacctgcaggaagaggaacaagctcccaagtgccactcgcatgtaaagcagacatctcgtcaatcatagcatgtcgccatcctggatgagatagtgcctcacctgtagacttagggatagaaacagtggacaaagaagatataaaagcataatgaggtgatgacacacgatgatgacttaaaccgacatagtggggattaggattacgtgtggatcgtacgcctttgcggagtgcaattggttgactaagaggagacaagatcgtagtaggtgcagaatctgatgcagggcgtgaatcacttgggcatgatgttggatgtggacgacgatgataagtcaagagtggtggagctgcagaaggttgaactggattatgtggaggaactggaggtggagctacaactggagctgtaggtggtggaactggagctataagtggtggagctacaactggagctggagatgtagaggaagatgaatgagagatagtgactgaatctccaaaaaataaaattggtagtacctcagaaatatctaagtgatgacatgaacctgtgaagtatgattgagtttcaaagaaggtaacatcagcggacataaggtaccgctgaaggtcaagagagtagcatcgataccccttttgtgttctcgagtaacctagaaatacgcacttaagagcacgaggagctaacttatctgttcctggagtaaggttatggacaaaacaagtgattccaaagatacagggtggaagagagaacaaaggtaagtggggaaacatgacaaagaatggaacttggttttggataactgaagatggcatacgattaataagatagcaagatataagaactgcatccccccaaaaacgaaacggagcatgagattgtatgagtagggtacgagcaatttcaataagatgtctattttttctttcagctaccccattttgttgagatgtgtacagacaagatgtttgatgaataatcccatgagatttcataaactgctgaaatggggaagacaaatactctcgggcattatcactaggaaatgtgcgaatagaaaccccaaattgattttgaatttttagcgtggaaggtctggaaaaatagaaaacaactcagatcgattttttatcaaaaatatccaagtgcaccttgaataatcatcaattattcaataaaactgacaaagtagcagaatcccaaggtggaactgacccgactaggaccccaaacatttgagaatggactaaagtaaaaggtgactctgcttgattatcaagacgccgagggaaatggaagcgagtatgcttatcgaactgacatgactcacactctagagctgacaagtgagataaaccagataccattttatgaagttttgacaaattgggatgtcccgaccgtttatgtaataaatttggtgtattagtaacaggacaagttgttgaaggaagacaagatgtgagtccgtgtgatttagcaaggataaggtaataaagtccgtttgattcacgtccggtaccaataattcgtcccgtactgcgttcctgtataaaaacatggtcatcaagaaataaaacaacgcatttaagtgatttggctaagcgactaatagttatgagattaaaaggactattgggaacataaatgactgaatataaaggtaaggaaggaagtgagcttgcttgacttattgttgttgccattgtttgagacctattggccattgtgactcttgaaagagattgaaaatacgaaatagtagtgaaaagagatttgttaccagaaatatgatctgatgcacctgaatcaatgacccaaaactcagatgatgaagattgggagaaacaagtcacgctattacctgtttaaacaacagaagctatcacagaagatgtctgcttacatgctttgtaccgaaggaactcaatataatctgctaaagaaaccatccgactattcaaagtatcggttcccatgtcgctacaatttgtagtaataggatggatagactcggaaaattgtaaagttatcggaatttgtcgtaaccaggatcgagcaagctgtcttgaagaaatggtttcaaaaaatgtccggaaaggtcacttttacgccggaaaaatataaaaatggtcgaaatttgatttgaattagatgggtaggctcggaattgtgaggagagcagactgtcctgaagaagcttaatgaaaaaatggccggaaagtggccggaaccctcgccgtaaaagttgttaccggcgcgtgaaggcgcgtggcattttttctgccagataaattttcaggggttggtcgtcggagggtgatcccttgtggtggtgttggtttttgcacaataccgacaggccttaggtcacccgaaaatttgcacgatgactaagttctttcttcccggttaacgctggaatgacgcacatcgatcttttctcactaatgctatgataccatgtgagaaagcacgggagaaaatatattattgatattagatactcaatataatacaagaggtcatatttatagctatagtctacaaagtacatattactctcattcaaatgtgggactacacataactaacaacgtaaattaacaaagagaaataaggaatgtaacaacagtcaatccctaaaatcaaggtagaaaactttgataaagcagagaattatagaatgtatttcagtagtacttggaacttgtccttacaaataaaattctttatccttatataggggcgtacaatcataacatttttcgcacttaattcgaattcattatgagcattaattgtattgattgcccgttatcatagataaccataactgacgtatttgtaactataaatgccttataacggctctgattccccttccttatttacttctggtttgtgtatctttccttctttttagcctttattcattcagttctcgcctcttctttgacaactgtcaagcccgatcctctgttctgtactgtctcgtgggtgtttcccccgtaccttccttatattcttaattctgttaattgagagtgtcacttgtcactatgccattgttccacgcgtcatgtttcatccacgtgtaatatcttttttccaccaatacagataatcccccactttctgaatattctcaactgaatattcgggtaagtttttatggcgggaattctttgccgtcgtttttcgagtatcatcgtgtcatcttcagaaccgatgtgacgtacgtcacgtctatttaatgcctatgccaggtggcttctatcgattggctctgcagttttttagcgctttttagggtttttcagcggctgcgtcagtcacgaagtgacggttccattatgacgcttcataatgactaactttaatgatggtcgtgtcttcttattaatacttcattcctttttgatctcttggagtcttccttcttcagtatccaccacattacttctttgtatttctgcatcttctctttgatattcctttggacaatcatgtcttcttctacaccagacccccgtaaggttgtgattgttgacgaacttgatctttctactgctcctactagaagtaggagaggtggtagacttcgtagtcttggttcactatctaatcgtggttcttcttcccagggtagtgctgctaagccatcttcttctagacctagggctcctttaacccctagatcttcttctaggaatagagatttaaatgatccagtgcgcgaacctacagttgcagagattgttcctcaagaattttcttttgtaactgaccgtgaaaccataaggaatcaaatttcttctatagcctccctcaataccgctaacctttatccaagtttaatcagtaatggtcttctctcccgggttcgaagagaatattactgaaaccagatttcccaattttagtccctggtgccaaccagagaattactccataccatgttggtttttcctttgtttacacctacccttttactttagggttcaaaccacctattgaaccagtaatcattgaattctgtcgttatttcaacgtgtgtcttggccagattgaccacatagtatggagggctgttcatgccttcgttatttatcagatttggtttccatgcctttcacttttcagcacttgcttcatctctactcccctaaattgtttcgtgaagtagtttttactctcgtggctagaagtaagagagtgttggttagccttgaagacgattgggaccgtggctggtacgctcgttttgttgctgctcccactagtgcattagtgggtgaagaaaatatgcctttcccggagaaatggaactttgcacgtaagctttcttctcctctttttttttgtcttaaaaaaactccatgtaatcatatacccacttcttcagcaactatggaagttttttatgcttgggtagaaaagatgttaactgctgcgcctatggagaaaagatcctggaaatacttttctcaaagatttggttggaaagtgaagacgcacggtactttttaccttcattgtttttccttttctcttccttgtttgttcaatgatttctcatccttccctttttttttactagggtttccgattcgtggtattagtcccgcgtctgttccatcaactaggctttccgtgattcttgttcaggaaagaattttaagtgcttcttcttcaaaaaggaaaactgacggagcccgtggctctgatgacgaagaagaaacagaggagggttctttggtgcgaaggtcacgcgtcaggagacgcgtggtttctgatgatgaaactactccttctcatgaccctctatctagttcaatcccttttagactcacggatgagctagagagtacccctttagtgatttcttatgatgatgctgttgatccccctccaagttctgttgatagattgtttgctcatggcttcgagggtgatgaagttttgggcctgtttctgaagaattgccccttgcttcccttccagtttcagttttcattaacccttccgtgtccttacctgatgatactcctgttgttattctcgtggctgcttctactccgtcatctattcccgtgactgcttctcatgcagaggccaaaccttctagcagcagaagggcaatgaaaagagttgttgttgaggttcctgaaggtgagaacttattaagaaaatccggtcaagccgacgtgtagttgaaacctatgctcggccccgtagagaagaagaagttagaaagccatagctcactcactttaatgaatgatatcgttcattcttccttgaaagtacaagcttaattatatttcctttcttttctctttcttattcataactcttcctccttttttgcagatcaacttgattggcacagagcttatgaaaagagtttctcaggcggaccggcaagttatagatttgcgcaccgaggctgataactggaaggaacaattcgaaggtcttcaattggaaaaagaggttccggcggaagagaagaatgctttggaacaacagatgagagtgattgcctctgaattagcagttgaaaaagcttcctcgagccaggttggaaaggataagtatatacttgaatcctcctttgctgaacaactttccaaggcaactgaagaaataaggagtttgaaggaactccttaatcaaaaagaggtttatgcgagagaattggttcaaacacttactcaagttcaggaagatctccgtgcctctacttataagattcagttcttggaaagttctctcgcttctttgaagacagcttacgatgcctctgaagcagaaaaagaagagctgagagctgagatttaccagtgggagaaggattatgagattctcgaggataatctatcgttggatgtaagttgggctttcttaaacactcgtctcgagactctagttgaagccaaccatgagggttttgaccttaatgctgagattgctaaggctaaagaagcaattgataaaactcagcaacgtcaaatcttttcctcacctgaagacgaaggtcccgaaggtgatggagattga
SEQ ID NO:5(来自普通烟草的CLC-Nt2的蛋白质序列，由SEQ ID NO:1转译)
MEEPTRLVEEATINNMDGQQNEEERDPESNSLHQPLLKRNRTLSSSPFALVGAKVSHIESLDYEINENDLFKHDWRRRSRVQVLQYVFLKWTLAFLVGLLTGVTATLINLAIENMAGYKLRAVVNYIEDRRYLMGFAYFAGANFVLTLIAALLCVCFAPTAAGPGIPEIKAYLNGVDTPNMYGATTLFVKIIGSIAAVSASLDLGKEGPLVHIGACFASLLGQGGPDNYRLRWRWLRYFNNDRDRRDLITCGSSSGVCAAFRSPVGGVLFALEEVATWWRSALLWRTFFSTAVVVVILRAFIEYCKSGNCGLFGRGGLIMFDVSGVSVSYHVVDIIPVVVIGIIGGLLGSLYNHVLHKILRLYNLINEKGKLHKVLLALSVSLFTSICMYGLPFLAKCKPCDPSLPGSCPGTGGTGNFKQFNCPDGYYNDLATLLLTTNDDAVRNIFSINTPGEFQVMSLIIYFVLYCILGLITFGIAVPSGLFLPIILMGSAYGRLLAIAMGSYTKIDPGLYAVLGAASLMAGSMRMTVSLCVIFLELTNNLLLLPITMLVLLIAKSVGDCFNLSIYEIILELKGLPFLDANPEPWMRNITAGELADVKPPVVTLCGVEKVGRIVEALKNTTYNGFPVVDEGVVPPVGLPVGATELHGLVLRTHLLLVLKKKWFLHERRRTEEWEVREKFTWIDLAERGGKIEDVLVTKDEMEMYVDLHPLTNTTPYTVVESLSVAKAMVLFRQVGLRHMLIVPKYQAAGVSPVVGILTRQDLRAHNILSVFPHLEKSKSGKKGN
SEQ ID NO:6(来自普通烟草的CLC-Nt2的蛋白质序列，由SEQ ID NO:2转译)
MEEPTRLVEEATINNMDRQQNEEERDPESNSLHQPLLKRNRTLSSSPFALVGAKVSHIESLDYEINENDLFKHDWRRRSRVQVLQYVFLKWTLAFLVGLLTGVTASLINLAIENIAGYKLRAVVNYIEDRRYLVGFAYFAGANFVLTLIAALLCVCFAPTAAGPGIPEIKAYLNGVDTPNMYGATTLFVKIIGSIAAVSASLDLGKEGPLVHIGACFASLLGQGGPDNYRLKWRWLRYFNNDRDRRDLITCGSSSGVCAAFRSPVGGVLFALEEVATWWRSALLWRTFFSTAVVVVILRAFIEYCKSGYCGLFGRGGLIMFDVSGVSVSYHVVDIIPVVVIGIIGGLLGSLYNCVLHKVLRLYNLINEKGKLHKVLLALSVSLFTSICMYGLPFLAKCKPCDSSLQGSCPGTGGTGNFKQFNCPDGYYNDLATLLLTTNDDAVRNIFSINTPGEFHVTSLIIYFVLYCILGLITFGIAVPSGLFLPIILMGSAYGRLLAIAMGSYTKIDPGLYAVLGAASLMAGSMRMTVSLCVIFLELTNNLLLLPITMLVLLIAKSVGDCFNLSIYEIILELKGLPFLDANPEPWMRNITAGELADVKPPVVTLCGVEKVGRIVEVLKNTTYNGFPVVDEGVVPPVGLPVGATELHGLVLRTHLLLVLKKKWFLNERRRTEEWEVREKFTWIDLAERGGKIEDVVVTKDEMEMYVDLHPLTNTTPYTVVESLSVAKAMVLFRQVGLRHMLIVPKYQAAGVSPVVGILTRQDLRAHNILSVFPHLEKSKSGKKGN
SEQ ID NO:7(来自普通烟草的NtCLCe的蛋白质序列；序列源于祖先美花烟草；一个起始密码子，由SEQ ID NO:3转译)
MCDSSKVDSDSGIQIGSLLEEVIPQGNNTAIISACFVGLFTGISVVLFNAAVHEIRDLCWDGIPYRAASEEPIGVHWQRVILVPACGGLVVSFLNAFRATLEVSTEGSWTSSVKSVLEPVLKTMAACVTLGTGNSLGPEGPSVEIGTSVAKGVGALLDKGGRRKLSLKAAGSAAGIASGFNAAVGGCFFAVESVLWPSPAESSLSLTNTTSMVILSAVIASVVSEIGLGSEPAFAVPGYDFRTPTELPLYLLLGIFCGLVSVALSSCTSFMLQIVENIQTTSGMPKAAFPVLGGLLVGLVALAYPEILYQGFENVNILLESRPLVKGLSADLLLQLVAVKIVTTSLCRASGLVGGYYAPSLFIGAATGTAYGKIVSYIISHADPIFHLSILEVASPQAYGLVGMAATLAGVCQVPLTAVLLLFELTQDYRIVLPLLGAVGLSSWVTSGQTRKSVVKDREKLKDARAHMMQRQGTSFSNISSLTYSSGSPSQKESNLCKLESSLCLYESDDEENDLARTILVSQAMRTRYVTVLMSTLLMETISLMLAEKQSCAIIVDENNFLIGLLTLGDIQNYSKLPRTEGNFQEELVVAGVCSSKGNKCRVSCTVTPNTDLLSALTLMEKHDLSQLPVILGDVEDEGIHPVGILDRECINVACRALATREQLC
SEQ ID NO:8(用于沉默CLC-Nt2的RNAi序列)
gtcatcatcaggtgtgtgtgctgctttccgttctccagtaggtggtgtcctatttgctttagaggaagtggcaacatggtggagaagtgcactcctctggagaactttcttcagcacggcagttgtggtggtgatactgagggccttcattgaatactgcaaatctggcaactgtggactttttggaagaggagggcttatcatgtttgatgtgagtggtgtcagtgttagctaccatgttgtggacatcatccctgttgtagtgattggaatcataggcggacttttgggaagcctctacaatcatgtcctccacaaaattctgaggctctacaatctgatcaacgagaagggaaaactacataaggttcttctcgctctgagtgtctcccttttcacctccatttg
SEQ ID NO:SEQ ID NO:9(用于沉默CLCe的RNAi序列)
gaaatcctttaccagggttttgagaatgttaatattctgctagaatctcgcccactagtgaaaggcctctccgctgatctgttgctccagcttgtagctgtcaaaatagtaacaacttcattatgccgagcctctggattggttggaggctactatgcgccatctctattcatcggtgctgctactggaactgcatatgggaaaattgttagctacattatctctcatgctgatccaatctttcatctttccatcttggaagttgcatccccacaagcttat
SEQ ID NO:10(来自普通烟草的NtCLCe的DNA序列；序列源于祖先美花烟草；两个起始密码子)
atgattagcggccaaaacactgtgctgcacaatcctcctaattcgctcttcaattccttatctcctcgccatatctgtatatctttctgtaacgacaaagctttaaaaaagtcagtcacgcactccgcccctcggtttgctcgtctgttaaacaatgaatcacggaagttgttgggtcgtcatccaaattgctggccttgggctcgacgaccatctcttcctccgggacgttcctctgacggaaacattgaaaaagaacaagatatgtgcgacagcagcaaagtcgatagtgatagtggcatccagataggatctctgctcgaggaagttatcccacaaggcaataataccgctataatctcggcttgctttgttggcctcttcaccggtatcagtgtcgtgcttttcaacgctgcggtacgtgcgctataggtctttcatttctcttttcatgtactattcctccttacttacttggcctcagtcaatcagccccctgcctactttaaattattgtacattttatcagaggagtgtcctatacatcaaattcacataacttagtaaaatatgctgatattctgaattttaaacttaccagcttagaacatccaggttagttcagaaacagataatctaaattggtctcatttataagtcattttgttattcaagacatacaatttggctcttgataaaagattatgcagcgcccgatgattacctaatatttatcagcaacccatgtaatttaacaatattgtcaccatataaaagaga actgaagagaatgttcaatttgtggtcatataacggatatctcccttggttaggttcatgaaatacgtgatctttgttgggatggaattccatatcgagctgcctcagaggagcccattggagtacattggcaacgtgtaatcttagtaccagcttgtggcggtttggtagtcagctttttgaatgccttccgagccactctggaggtttcaactgaaggaagttggacatcatctgttaaatctgtattggaaccagttttgaagacaatggccgcttgtgtcacattaggaactgggaattccttaggaccagaaggccctagtgttgaaattggcacatctgttgccaagggagttggagctctgcttgataaaggtggtcgtagaaagctgtcactcaaggctgctggatcagctgctggaatcgcttctggtttgttccccatattattcttggttctgaaccatacatggtacattttccttataattacatgtagcctgttgtatgctttcctctttcccgggaagcctttttgtaaatacaagtgtgtttgcactcaaaccaataaactgtaaaaaaggtgaactccttaagcaagcaaaagcattagaaatgtaaactagacatatttctcagattgagagtctgagagattagaacacgagtgtttccattagagagagaaaagagacttctagatatttctattatctctgtaagagtgaatccgttcctatacaaaaaataggccttcattaaatacaagcttgggctgggtactactgggccaaagtaaaaaataaaaagaatcacccactatcaaatgggcctagtctaacaacccccttcaagctggagggtgacacaacccctagcttgcgaatatgaaaatgatgagcaggcccaagtaacactttggtaagaacatcaaccacttgagaagcactggagttgtgaaatagactgatcaggccattcccaagcttgccacaaacaaaatgacagtccagcttaatgtgtttagtgcgttcatggaaaacttggttttttgcaatgtggacttcctgattatcacaaaataaaggaacaggtaaagaaggagaaactccaatatcagacaataatttggtgagccaagacacctctgcaacagccttactcatggacctatactcagcttcaattgatgatagtgagacaacaggttgcttctttgatttccagctcaccaagctgccccccaagaaaaatacaaaaaccagtgacagacctgcggctgtctgggcaagaagcccaatcactgcacaataaagctgcaaagacaagtctggagagttattgcggaagattccaaagtcaaaagtgcccttgaggtatcttagcaagtgcagggcagcctgcatgttaggaacacagggagactgcataaactgactcagatgctgaacaacaaaactaaggtcaggccttgtgcgtatcaaaaagtttagcttgtgcattagactcctgtactcttcaggcctgggcaaaggagtgccaatcttagcttttaacttcacattcaattcaagggggcaagtgacagaagagcaattcgaggaatgaaaatcagccagcaaatcatgaatgaactttttctgatgaagaagaaccccagaatcagtgtataaaacctcaatgctaaggaagtaattaagagagcccatgtccttaatcttgaactggtcactgagaaaggacttcaaagcagccaattcagctagatcacacctagtcaatatgatatcattcacatagacaaccaagatgaccaaggaatccctagaacccttggtaaaaatagagaaatcattcaaggaacgagagaagccattagagcacaaggcttgagataatttagcatactattgtcttgaagccagtcttaaaccataaagagacttctggagtttgcatactaaaggagcagaagaagagtgaggaacagttaggcccggtggcagcttcatgaatacctcctcatcaaggtccccatgtaagaagacattattcacatctagttgaaagaggggccagtgttgtttaacagctacaacaataagagttttgacaatagacatattgaccacaggagaaaaagtttcattaaagtcaataccctcaacttgagtgacctagctttatatctctcaatactttcattagccctatatttaaccttgtatacccacttacaactagtaggtttcttgccaggaggcaattcaacaatgtcccaagttctgttggcatccaaggcctcaaattcacatctcatggctgcctgccattcaggaacagctgcaacctgagagtaagaataaggctcaggaacatgaagttgactaagagaaggagcattagaaatagatctggagggaggaggagaagaagtggaggtgcagacataactcttgagatagttggttggattgtgtggcacggaagatcttctcaaagcaggaggaggtacaagagagttagaataatgagaaggagaagagatggaagtgggaacagagaagattgagaagcagtagaaggagaaagtgaaggagatgaaggagaggaagaagacggaaaggaacattcatcaaaacaagcagaaaagggaaaggggaagacttgaggtactacatgagaggattgaaagaaaggaaaaatggtgttcataaaaaatgacatcttttgatacaaaacaggtgttattctgaagattaaggcgcttgtagccctttttggcaaaagggtagccaatgaaaacacaaggaagggacctaggatgaaatttgttttgtgaggggtggtgacagttgagtaacagaggcacccaaaagctctaaggtggtgataagtagggtggaagaatgaagcaattcatagggacttttgtgattaagaagaggaaaaggaaatctgttaattaaatatgtggcagttaaaaagcagtcaccccaaaatttaagtggtagatgagactgaaacataagtgacctagcagtctctagtaaatttctgtgttctctttctacaataccattttattggggggtgtgaggacaggaggtttggtgtactatccctttttctgaaaagaaaaggcaaccagaagaactagatcccagttccaaagcattatcactcctaacagtttgaactttagattggaattgggtttcaaccatagcaatgaaaaccttgagcaaatcaaaggcattgcggcacccattaaatgtgtccaagtagccctagagtagtcatctacaatggttaaaaaatacctagaaccattataggtaggagtagaatagggtcaccaagtatttatgtgtattagctgaaaaggctgggtggagtgaatagaactatcagggaaggacaacctggtctgcctcgctaaaggacaaaccggactagtgaatgaccgtttggaagacagtttgcaattaagaccagaaatgcatttcattttatagaagggaatatggccaagtttgtaatgccaaacaacatcatctttattcacattatgcaaagcagtactagtatttacaattggagtatcatcaggtacagaaataggagcagaaactgaattaagcaaacaagaaataaggaaattagaaagaggtaaaggagatgatgttggaggcctggcattctgaaatagtttgtagagtccattgtccaatctaccaagaaccactggcttcctcactgaagggccctgtagggtacaagtagccttggtaaattgtacaatatcatcatcatgggaaagtaatttgtacacaaagatgagattatattgaaaactaggaatatagagcacattataaagaatcaagtcagggaacaaggctaaggaaccaatattagtgaccttaaccttatacccattaggaagggagacaaggtatggtacaggaagtgtttgaacattaaaaaaacaaatgtttaagggaggtcatgtggtcagatgcccagggtctattactcaaactacactatctatcatagtcagcataaatgcaccataagacaacccttgtgaggtaataactcaccagcaaagttggtagaagcaagatagttggttgaagaagtagatgatgctgatgaagacagttgagattgttgaagtaacattagctgagaatattggttcttggtaagaccaggaactggataggactgttcaggagcagaggtaccttcaggaccagctgacattgcagaaccaccagaggtatccacctcagcatgggcaacagaccttctgggaggaagagatctatttgacttgaaatttggaggaaagccattgagcttatagcacttatcaatgctatgtccgggtttcttacaatagtagacatgtgaagctcaaaagatcccttagaggtagtaccggacctttgaggttcaaaatttattttaggagagggaggaggcctggatacaccaacactgaaagaagcagaatttgaggcatattgagttctagcaaaaatttgtctttgcttctcatcagatagcaaaatcccatatacattaccaatggaaggtaagggcttcatcatgatgatgttgcttcttgtttggacataagtatcattcagtcccataaagaactggtagaccttttgttccctgtcttcagcagatttacccccacaagtacacattcaaactctcccggcagacaaagatgcaatatcatcccatagtcgtttaattttgttgaaatatgatgctatgtccatggacccttgggaaatatgagccagttccttctttagctcaaagatcctagtacctctcttctaactcagtccaaatattcttagcaaactcagagtattcaacactcttggatatttccttgtacatagagttagtcaaccaagagaccacaaggtcattgcaacgttaccactgtctggctagaggagaaccttcaggaggtctgtgagaagtaccattaatgaaatctagcttgttacgaatagacaaggcaactaggacattacgtctccaattgccataacagcttccatcaaaaggaccggaaactaaggaagttcccagcacgtctgatggatggacatataaggggcgacagggatgggtataatcatcttcatggaaaattaggcgtaagggagtagaagaagtcgcatcagcactggtgttattatcatttgccatttttttcaacagattgtcaatcaaccaacacaatacagatacacatatatagattgtgagaaagcacgagagaaaaatctatattattgatattctatttaattataatacaatgagccctatttatacaatacatatcatactcctattctatgtgggactaggactaattcatattatgtacataactatctaacactccccctcaagccggtgcatacaaatcatatgtaccgaacttgttacatatgtaactaatacaaggaccagtaaggaacttggtgaaaatatctgcaaactgatcatttgacttcacaaactttgtagcaatatctcatgagagtatcttttctctgacgaaatgacaattaatctcaatgtgtttagttctctcatgaaacaccggatttgatgctatatgaatggcagcttggttatcacacatcagttccatcttgctgacctcaccaaatttcaactaattaagtaaatgtttgatccaaactagctcacaagttgtcacagccattgctcgatattctgcttctgcactagaccgagcaaccacattttgtttcttgctcttccaagacacctaattacctcctactaaaacacaatatccagacgtagaacatctgtcaaaaggtgatcctgcctagccagcatttgagtacccaacaatttgctcatggcctcgatcttcaaacaataatctgttacctggagctgattttatatatcgaagaatgcagacaactgcatcccaatgactatcacaaggagaatccaagaactgacttaccacactcactggaaaggaaatatcaggtctaatcactgtgaggtaatttaatttaccaaccagccgcctatatctagcaggatcgctaagcggctccccctgtcctggtagaagtttagaattccgatccataggagtgtcaataggtctacaacgtgtcattcctgtctcctcaagaatgtctaaggcatacttcctttgtgagataacaatacatgtgctagactaagcgacctcaatacctagaaaatactttaatctgcccagatccttagtctgaaagtgctgaaagagatgttgtttcaacttagtaataccatcttgatcattgccggtaataacaatattatcaacataaaccaccagataaatactaagatttgaagaagaatgccgataaaacacagagtgatcagcttcactacgagtcatgccgaactcttgaataactgtgctgaacttaccaaaccaggctcgaggagactgttttagaccatagagggaccgacgcaaccgacatacaaggccactagactccccctgagcaacaaaaccaggtggttgctccatataaacttcacctcaaggtcaccacgaagaaaagcattcttaatgtccaactgatagagaggccaatggagaacaacaaccatggatagaaaaaggcggactgatgctattttagccacaggagagaaagtatcactgtaatcaagcccaaatatctgagtataccctttggcaacaagacgagccttaagtcgatcaacctggccatctggaccaactttgactgcatacacccaacgacaaccaacaataaatttacccgaaggaagaggaacaaactcccaagtaccactcgtatgtaaagcagacatctcgtcaatcatagcctgtcaccaccctagatgagacagtgcttcacctggatggaaatagaggacaaagatgatacaaatgcacaatagggtgatgacagacgatggtaacttaaaccgacataatggggattagcatttagtgtagaccgttcacctttccggagtgcaatcaattgactaagaggagacaagtccgcagtattagcaggatcaggtgcaggacgtgaatcagctgggcctgatgctgggcgcggacgacgatgataagttaggagtggtagagctgtagaaggttgaactggactaggcagtggaactgaagctatatgtggtggaactggagctataggtggtggagctggagctgtaggtgaagatgaatgggagatagtgactgaatctccaaaagatggaactggtagcacctcagatatatctaagtgattacctggactggtgaagtatgattgggtttcaaagaaggtaacatcagcagacataaggtaccacctgaggtcaggagaatagcatcgatatcccttttgtgttctcgagtaacccaaaaatacgcacttaagagcacgaggagctaatttatcttttcttggagtaaggttatgaacaaaacacgtgctcccaaaggcacggggtggaagagagaacaaaggtaagtggggaaacaagacagagaatggaacttgattctggatagctgaagatggcatacgattaataagatagcaagatgtaagaactgcatccccccaaaaacgcaacggaacgtgagattgtatgagtaaggtacgagcagtttcaataagatgtctattctttctttcagctacccgattttgttgggatgtgtatggacaagatgttttatgaataatcccatgagagttcataaactgttgaaatgggaaagacaaatactctaaggcattatcactacgaaatatgcggatagaaaccccaaattgattttgaatttcagcgtggaaggtctggaaagtagaaaacaactcagatcgattttttatcaaaaatatccaagtgcacctgtaataatcatcaatgaaactgacaaagtagcggaatcccaaggtagaactgacctgactaggaccccaaacatctgaatggactaaagtaaaaggtgactgactctgctcgattatcaagacggcgagggaaatgggagcacgtatgcttaccgagctgacatgactcacactctagagtggacaagtgagataaaccagataccattttttgaagttttgacaaactgggatgtcccaaccgtttatgtaatagatctggtgaatcagtaacaggacaagttgttgaagaaagacaagatgtaagtccatgtgattttgcaagaataaggtagtaaaatccatttaattcacgcccggtaccaatgatccgccctgtactgcgttcctgtataaaaacaaggtcatcaagaaataaaacagagcatttaagtgatttggctaagcgactaacggctatgagattaaaaagactaacgagaacataaagaactgaatctaaaggtaaggaaggaagtggacttacttggcttattccagttgccatggtttgagactcgttatccattgtgactgttgggagtgattgagaatatgaaatagtaatgaaaagagatttgttaccaaaaatatgatcagatgcacctgaatcaatgacccaagactcagaggttgaagattgggagacacaagtcacactactatctgtttgagcaacggaagctatccctgaagatgtttgtttacatgttttgaactgaaggaactcaatataatccggtagagaaaccatccaactcttcgtagtattggattccattttgctacaaccaatttctcaaattcttgattacaacttgtgtggttaaccttggaatgccaaatcagaacaccccttttttttttttggaaaacattgttcactcgctggaaaataaaaaaggttgccggaatttgatgaaacttgaatagaccgactcggaataatgtcctaagaaggctgtccaaaaggagttttgtcagaaactgaccagaaggaggtccacgcaccggcgcgtggacagatctcgccgaaaaaaaaaatcactttggttggcgcgtgatggcgcgtgggtggggtttttccggtcgggttttgtggggtttgctcccccggagatggagaacactgtggtggtgttggtttatgcacaacactggtaaaaagtggttttgatgcgaacagctactcaggtcaccaaaaaattgcacggtgacgactgatttcttcccggatgtcgttggaatgacgcacaacgataattatctcaccaatgctctgataccatgtgagaaagtacgggagaaaaatctatattattgatattctatttaattataatacaatgagccctatttataagactaggattaattcatattatgtacataactatctaacatagatcaaataggcatgcaattcacaataatggtgaataaaatgatacgaagttacccagctcttttcgcgatcgaaaaggagaaaatagccttcaatcacaaacgagaaagaagaatctccggcttgacagtagacgacttcgaaaccctagctcgagatgaaaaccacaaaatccccaaatcacattaccaaccaaacaatttgagatcacaaatgttgaatatgtgagaatccgactaagaaatcaacaaaaaatcaatagaaatggttgaagaataccgacttgaaccctaaatgagtcagacatcacctagaatgaaatacaccttcgaaattgacgaaaacaggaccggttgaaagcggagaacgtgccatagaaggatctacgctctgataccatgtaaacttgacatacttctcagattgagagtctgagagattagaaaacgagtgtttccattagaaagagagaaaagagacttctagatatttcgattatctgtgtaaaaatgaatccgttcctatacaaaaattaggccttcattaaatacaagattcggccgggtattactggcccaaagtaaaatataaaaagaatcacccactatcaaatgggcctagtctaacaagaaaaccaacaaatagtccccccccccccccccaaaagataccactgaaatgacaccgggtgcccaaaaataaagcagcttacttcttgactttgagaggaactgcaatccttatcggtttgagaggaactgcaatcagctataagtagcttattaatttccagtgcctgcattctgccaagtactatgatatatttctgaagctttgtttccccagttcctttttcagacgtttgctgtcaataaagttgagccagccaacttggctcccacaagctactaattttgtccaagcttactctatgggagaagttaaatttcccaaattccttgagcggaaaatgaaaaatggactcaaagtgtcatattatgcaactatctaaagaaaaatactcaattgaagtttagataagaaaagtgaatgtatattgatgtagtctccgttaggtgagaagcgtatcacttacccagcaacatatggacctaacattttactagtgaagttttcacattgtatcaaaagctcaacaaacggaaaggtgactaatcctaaaatgttatttcacatatatgggcacacggtttgtcaaccttctcatacgtgcattatttgttctctatctttctatttcatccgatataaccaatcgttattgtaaattctataatgcctgtggttacttttgtctttagtgacaaatgacatttaggataaccatgtagttattgacttatttcacttgaggtctcttccaattatgtagtagtagagtgttgagatatggatatgttaccttctaaaaaaaagagtgtagagatgcggatagtttgctagctggcttttgtctcccttcaagttgaattagcaaaagcttgtctcataagttggatagctagacaagaaaaactccaaattactttatgtagagtattcttaagcttgagtcgcgagttggaaactggaattatgtaaaaaaacctggaattatttggttgagcctgctttttagttttgtcaatatttccagtatctaacccaacatgtttagagtgattcccggagagcctcagtacaaggcatttgcagagtctttatgagagtccaggaaggggcacacattctgtagaggtatagtcttgtccttattttcagggttgaactagttctttagaagttacctaggcttcctaatttccaaatttctgccaggtccttttttggtgaagtacttgaagtttaataaatcaaattttaatttctaacatatcctgagaaatttattcacaaattcaactggtgacttctgatgcagaaacataagcaactgcttatgggttcatatgttcctgcaattttattgttgacatggattggcttcatatggttttgttcctgcaattttatcgctgacactaatcctttcatatggttttatgtggagtgttaaatagaggttaagagacaagaagaggctgaaaaaggtgggcagttcatttgttagtagactactctatttactaagagatatgatgtcccatacattactcgaattggctccgaatccagattccacttctttgccgagtttccttattgtacatagttcgactcgtcaagggaaattcacttcctttgactgaataatgctagtttgagtagtaccttacattaaatggaccatttagttctatctacttgatagaatagactggtcatcaactagttgcaaatacaatgacaactttgccatgtttgcagagtcacctgatgaagaagtacctcaattagtagaacatttcttgaatgttctacagtattctctatgcctacatgaccacatcacttttccttttgcgttgtgagaacttgaacttggtgagcgggggttccccaggaatggcatcttgatggcagatgaccattctgtccttgtcttagctaatgcttcttgcattgcctcactagatttattatacctttaaaaaatgtttgccattgttctgccataatagaaggatgtacccagctggtgcttcaaaactaatgaaatgctttacaattgtcgagtcctaaaggatgatttgtggaatcagatctcaaacaattctttttgaggaagaaaaataccaaaggttttttctgtttgttggaagattaaaaatcctttaaatggtaaagatttatgaacttaattcagcgtttttgtggccattgctggaaaagagaaaaaacaatggcacttcttcgagtttgcttatccaaaaaaaagaagaagagaatgtcacgtaatgcaatttcatcttaggaaactttgcaggagaaaagcaagagtgataaaacagaactatttgttttttttaacaagttgttgtgacctatttcttgtcattcttatttgctaataagctaatgtactatagttcctgtactatggtttgttttgacttaatacggggatgttcaatgagcattttcttgttttttctgctttcagcatctgctgccttacaggaattcattttctggaaatttacttcttgttctgctaacattttcctgttatatcttgtcagtcattttctctccatggttatactgtttgtgtcactttaaactctccttgttttctactttaaaggatttaatgctgctgtcgggggctgtttctttgctgtggaatctgtgttatggccatcacctgcagagtcctccttgtccttaacaaatacgacttcaatggttattctcagtgctgttatagcttctgtagtctcagaaattggtcttggctctgaacctgcatttgcggtcccaggatatgattttcgtacacctactggtaattttggacttctttctcgagtttgattcttaaatacaattgtacccgtcacttacagcaacaactacatttcaacagctagttggggttggctacacagatcatcactatccatttcaattcatttagtcccatttctttcgaatattgagtactttgggattctataatatcaaggttctttatattttctactttgacgtacaaatctctaaatagattaaagaagactcctagagacactggcctaatgcaaatgtaccaccatgaataaactttaatctgaaatagctggtatcttatataaggacccttagctttaattgtgttctatattgatcttttgggacaacttccttccaatattatgtcttacttatacagttatacttatccttaagccttactctttagagtggttatccctaattcaagcttttgttggcaccatagctagtttggttctaagtaaaaagttactctttagagtggtaactttttgtcaattttcttagtgaaaatataacctctgtgacaaatctaccaagtataaatccaatttggttctatgtcatccttgtagtttatccaagtcaatgctccatcactcttacaaaggttcatcgtatgactaatcttttttggagaaaggtaacagtttgtattgataataagatcagcgccaggttggtcattagtgctaatagctgtacgtacaactccaaaagagcaaaagacaagcacctgatgtaaggtaaattacaagctgcctataaaatctatcaggtgtcctatctcactaaacatttcttgtttacaccaaaaaaataaaacaaggaaagacaatccatcttaatcttctgaatggagtttctttttccttcaaaacatctggagttccttccgttccatgcaatccaccatatacaagctgggatgattttccatttgtctttatccatttcttctaccaattcccttccaattgattagaagttccaatgtggttctagatatgacccaattaactcccaacagataaaagaagatgtgccacggatttgtagtgattctgcaatgtaggaacaagtgagcattactttctacttcctgtccacaaagaaaacatcttgagcaaatctggaaacctcttctttgtaagttatcatgtgttaaacatgcctttttcaccaccaaccagacaaaacatgatactttgggaggagttttaaccctccaaatgtgtttccaaggccacacctcagttgttgaaacattaggatgtagagtccagtatgctcttttactgaaaatgcaccttttctattcagcttttaaactactttatctatggtctgtgatgtacccttgaaaggttcaagagtttggaggaagatagaaactctgtttatctcccaatcatccaaagatcttctaaagttccagctccatccttgtgagctccagactgacttaccaatgcttggctttgaagacttagagagaataagtcaggaaaatatctttcaaccttccttgccctatccggtgatcttcccaaaaagatgtctgcaacccattgccaatattgatcttgatattgctactgaaagatttcttttggtggcaggattactctcattaacaatgtacttgacaatctccatacatactaatgtctctttaccctcttgccattaaggttgtaaagagacttgtcaaattaagaaaaggtttcctatggaactgtttcaaggaaggaacctcctttcctttggtcaagtggagttaagtcatataatctaggaagtggaggcttgggtatgaaatagctgcaaatacagaaaaggagcatcttatttaaatgatcacggaaatgtgcccaaaactttaaatatctgcacagcatatggttgtagcaaaatttgaatcttcctgtcaatggtgctcatgtccagtgaatacccctgatggtgaaagtgtcctgaagggaagcaggaacttattggaagaattggcatctaacactcagcttttcggtgggtcatagcccattgaaaattgagtgcccagatttatatagttttgctctaaactgacgatgcagttgcacaacatacgacaaactaaggtgggacatcatcttcttcggaaggaattttgaggattaagagatagagtggttgattcagttgcaaatgaagcttcaagggttcaatatcatccaggagacaccggattctgatagataaaacaacagaaagatgagcactactttgttaggcttgttacaagttgctatcgtctttcttatctcggtacacaatttagatttgggaacttagttggaaaagcagagtggttgtttttgtgaatagcatcagacaaagcttctgagctggtacgacagaaaactcaacagggagaatagaagactgtggttcacaatttctgcatgcatcttgtaggttatttggtgggtaaattatttaatgttttgaagggaaggtagaacatgttcataggcttagattcaaatgtttgtatttttttggctctttggtgagagatgctgaacgtaaatgacataggcagctgactataatttctcagctccttgctttttaaattgacaggcactgatatgtacatgtgaacatccaacacttttgtggtgccgttccgatgaataaagaacattaatcacttactgatcaggagtaatagtttaggagttctagaatttttgtacataaaatgaaccaaaaagaagatcggaatgagaacatgtttctttttttgttttttctttttcgtgaaaacttcaataacacttctgatagaatagctaggtccatttgaattcctttggagacccttacacaaccaatgaatgacaagtatagcatttctaactccctcccacacgtataacccagattttagggtttagatgtggatctgatttgaccttattgcctttttttgtttttgttctttttgaagtagagagtgaggaggctcaacaattaattcggctcaacgggctaatgattggacttacatgctacgacaatgttaggagagagagagagagagagaagcccagagcagttacatgagttaagaaagagaagtccaaagcgatagaatatgaagagagaaagcggttgtgctaacaggctccctgaagtttggctctgagcatccaactcaaaaccttaaggcaatgagtagagtagcccaggaccatttaaattgctgttgaaaaccttacacaaccaataagggaacaagtgtaacattctcttacaaccctaccgtcttataagtcagtgctctaatttagcataaaatcaaagtgaggcgatctacaatgaaatgaagtaaataactgataaatacaaagaatgttaattctccaatatagcctgaatgttcccagaacaaaataaactagtctcaggatttatcattaacatgatgttcctcttattttgagtgattaggaaggttaatcaaggtataaattctttctaatttgtatcgtctagaattatttatctaacaaattttcagattaccggttcaaaagaggaatatattttgcatacaacgttaccataccttacaaaagggagatgaacatttttttattttattattgtcctttttttcaattagggattatgcagtcttcctccacgtgatattactcttagaatcacgtttttgtcattgctattacttaatgtggtaagtacaaatgtgttttgaactctttttggtatgtaatattgagttaatttttggtttccatttcagagctgccgctttatcttctgctgggcatcttttgtggcttagtttcagtggcattatcaagttgtacatcatttatgctgcaaatagtggaaaatattcaaacgaccagcggcatgccaaaagcagcttttcctgtcctgggtggtcttctggttgggctggtagctttagcatatcctgaaatcctttaccagggttttgagaatgttaatattttgctagaatctcgcccactagtgaaaggcctctccgctgatctgttgctccagcttgtagctgtcaaaatagtaacaacttcattatgtcgagcctctggattggttggaggctactatgcaccatctctattcatcggtgctgctactggaactgcatatgggaaaattgttagctacattatctctcatgctgatccaatctttcatctttccatcttggaagttgcatccccacaagcatatggcctggtatgaatttgtcttttgttagaagtagcattacatatctggataagtgagttttttattattgaaaagtaataacaggagagcaagagaatatagcacccaaatctacttctttcctctcttctattcttctgaaattcaaggtcctttaactcctccacggcctgtctagttattgatcctgtagacttaattcacataggtttaggacattcaagtttatccaaacttcgtgaaaaggtttctaatttttttacattacagtatgagtcgtgtctacttgagaaacatatcactccatgtttctatagagtctgttttctcctcagtttattttgatatatggggtcctattaagacagttcaaccttggattttcattatttttgttgtttcattgataattattcaagatgtacttggattttcttaacaagagatagttctcagttgttttttgtgttcctaagtttttgtgctgcaatacaaaattagtttgatgtctctatttgcatttttcccaatgataatgccttagaatattttcttctcggtttcagtagcttatgatttctttagaaactctctatcagaaatctcaactgagatagatgagaggaagaataagcatatcattgagacggctcgtacccttctcattcagtcccctgtcaagcttagtttcttgggcgatgcagtttcacgtcctttgattagattaattggatgcctcatctgctatccaaaatcagattcaactttcgatattgtttcctcgcttacctttatactctctttccctcgagtctttgggagcacatgttttgttcaataacatagctcctggaaagtgaccagcgcaaccgacaagcaaggccttcttaatatagaaggagggcatatgctattctagccacgagggagaaagtaatattgtaatcaaacccaaatatctgagtataacctttggcaatggcgatcaatttgattatatggaccaactttgcctacatatacccaccgatagatttacggggaggtagagaaataagctcccaagtaccactaatatgtaaagcagacatctctttgatcatagcctgtccttgtggacatagggatagaaattgaggactaagatgacacaaaagcataatgctgtgatgataaacgatgataactcaaatcaatatgatggggatgggaattaagagtggattgaatatctttgcggaatgtgattggtagactaggaggagacaagtccgcaataggtaaaagatccagtacatggaatgaatcttctggacatgatgttggactgacgtcaatgataagtcaagagtggtggagttgcagaacatggaactggagctgtaggtgacataatcgaagttgtagggggtggagctatagaggaaggtgaaggagagatagtgactgaatctccaaaatatgaaaccggtaatacctcaaaaaatgtctaagagatcatttggacctatgaagtatggttgcgttttaaagaaggtaacatcagcagacataaggtaccgcggaaagtcaggtgaataacattgatatccttgttgcgtcctcgagtaacttagaaatacatatttgagagcacggggagctaacttatcttttctggagtaaggttataaaaaaacacatgctcccatagacacgaggtggaagagagaaaggtgagtggggaaacaagacagagtatgaaacttgattcttgatagttgaagatggcatacaattaataagacaataggatgtgagaactgtatccccacgtaaacacaacagaacatgagattgtacgagttgggtatgagcagtctcaatgagatacctattcttcctttcagctatcccattttattgagatgtgtatggacaaaatatttgatgtatgatcctatgagagttcatgaactgctgaaatggagaagacaaatactctggggcattatcactatgaaatgtgcggttagaaaccccaaattgattttggatttcagagtgaaaggtctgaaaaatagagaccaactcagattgatttttcatgagaaatatccaagtggacttggaataatcatcaatgaaactgacaaagtagcagaattccaaggtagaactaactcgacaaggacctcaaacatctgaatggactaaagtgaaaggtgactctattcgattatcaagacaccgaggaaaatgagagcgagtatgccttctgagcggatatgactgacgctctagagtggacaagtgagacaaaccaggtaccattttctgaagttctgataaattgggatgtcctaaccgtttatgtaataaatctggtggatcagtaaaaggacaagctgtaaggggacaaaaataccaaatatttccagaagatggcaaactacaacagaagaagcaactacattaacaggctcaggatatgtgatgaaatgaggacaaagagttgatcaagaaggagattctggaattctaccagaacttatatagtgaaaatgaaccgtggaggcccagtgcaaattttgaaggcatctcctcactaagcatagaagagaagaactagttggaagctccatttgaagaaatagaggtgcttgaagctttgaaatcatgtgcccctgataaagcaccaggtccagacggcttcaccatggctttctttcagaaaaattgggatactcttaaaatggacatcatggccgcacttaatcactttcaccagagctgtcacatggttagggcttgcaatgccaccttcatcgccttaattccaaagaaaaagggtgctatggagctcagagactacagatctattgacaaactagtctcgggggaacaaaatgctttcatcaagaacaggcacatcactgatgcttccttgattgccagtgaagtgctggattggagaatgaaaagtggaaaaccaggcgtgttgtgcaaactggacattgaaaaggcttttgatcaattaagatggtcttacctcatgagtatcttgaggcagatggctttggggagaaatggataagatggataaactattgcatttcaactgtcaagaactctgttttggtgaatagtggcccgaccggttttttctcctgccaaaagggcctaaggcaggggatctcctctcccctttcctattcattttggcgatggaaggactcactaaaatgttggagaaggctaagcaactacaatggatacaaggctttcaggtgggaaggaatcctgccagctcagttacagtatcccatctactctttgcggatgatactcttattttttgtggtactgagagatcacaagcacgaaatctcaacctgacgctgatgatcttcgaggcactatcaggactccacaacaatatgataaagagcatcatataccctgtgaatgcagtccccaacatacaggagctagcagacatcctatgctgcaaaacagatactttcccaacatatcttggacttcccttgggagctaaattcaaatcaaaagaagtttggaatggagtcctagagaagtttgaaaagaggcttgcgacttggcgaatgcaatacctctccatcggtggcaagttaactttaatcaatagtgtactggacagtcttcctacataccacatgtctttgttcccaattccaatctcagtcctaaagcagatggacaaactcagaaggaagttcttacgggaaggatgcagcaaaacacacaaatttccactagtgaaatgactcaaggtaactcaaccaaaattcaaaggaggcttgagcatcagggatctacaagcacacaacaaagctatgctcttaaaatggctctggagatatggacaggaggaatctaggctatggaaggacatcatagttgctaaatatggagcacacaatcactggtgttccaagaaaacaaacactccttatggagttggtctgtggaagaacatcagcaaccactgggatgaattcttccaaaatgtaactttcaaagttgggaatggaactcgtattaagttttggaaggatagatggctcggaaatacacctttgaaagacatgtttcccggtatgtatcagattgccttgaccaaagactccactgttgctcaaaatagagacaatggcacttggtgcccattttcagaagaaatttgcaggattgggaggtcaacagcctactcacaatgttaagctccctagaaggtcataatatcgaagatcaacagcctgacaaacttatttggggaaattctgagagaggcaagtacacagtcaaagaatgatacattcacctctgtgaccagaatccaataatagataactagccatggaaacacatctggagaactgaagtgcctaccaaggtgacttgcttcacatggttgactctaaatggggcatgtctcactcaagacaacttaatcaagaggaatatcatactagttaatagatgctacatgtgccaacaacagtcagaaagtgtaaaccacctattcctccactgctcagttgcaaaagacatttggaacttcttctacactacctttggtctgaaatgggttatgccacaatcaacaaagcaagcttttgaaagttggtatttttggagagttgacaaatccatcaaaaaaatctggaaaacggtgccggctgcatttttttggtgtatttggaaagaaaggaaccgaagatgttttgatgacatattaactccactctactccctcaaggctgcgtgtttagttaacttatttagttttgtggattttattagctccctgatagtagcataggcttttgtaaatggagctaattatcctatctcttttgtactctttgcatcttcttgatgccttttaatgaatctaatttacttcataaaaaataaaaggacaagttgttgaaggaggaaaagatgtgagtccatgtgatttagcaaggataaggtactaaagtccatttgattcacgcccggtaccaatgatccatcccgcattgcattcctgtattaaaacagagtcatcaagaaataaaatagagcaaataagtgattggccaaacgactagtggatatgagattaaaaggactatcgggaacataaagaactgaattcaaaggtaaggaaggaagtggactagcttaacctattccagttgccatggtttgagaatagttggccattgtgactgttggaagtgattgagagtaagaaatagtagtgaaaagagatttgttaccagaaatataatcagatgcaactgaatcaataacctaagagtcggaaaaagaaacacaagtcatgttattacctgtttgaacaatagaagttatctccgaagaggattatttacatgttttgtactgatggaactcaatataagccgataaagaaaccatccggatattcaaagtattggatcaacagcttataagccaaaagcatccgatacgagtgccattataatggatcaagagagatcaaacaacaaatcaccaaatatcataaacaaccaagaatctcgctggaatgtgaacaaagattgaaaaacaacaatgtagctcgccaaaaatgtgcaaagtgatcgaaaaatattgaatcgtgagtggagagaaataggagcttcaatcgacccacacagtaccaaaaaatccaaaaacggttgtcggagctcaagaaagttgtcaaaaagtatattgtatgcttcgaaagtagccgaaaaaggttggaagtgggatgtgtcaactccgaattatgatacgagcaccacagaagatcaatttgtgtcaaaactaccgaaaaaaatacttcacaccccgacgcgtggagtactcgctcgttggaacccttgctgccaacgtcgcatgtaggatcagttttcgaagaatcttattggggtttggtcgccggacgatgtcggatcttgtggtgccgttggaattcgcacaaccctgaaggaaaagaaggttacacaaatcagatctgaaagtcaccgaaaagacacatggcgattgacttttttgtctcagatgtttctcaccgtcgctctgataccagttgttgggctcaactcgtttgaagatactcttaacatagtgtgatattgtcccttttggaatgtgagtcatcttagctcggtaagcatactcgctcttccaactagcccgaagatacttttaacagagtgtaatattatctgctttgagccaagctggcgcggttttcatcaaaagacctcatactattaaaagatccatacaccttatatgtaggcttctaagttgctcggacacgggtgcgagtacccgacacaggtgcaaatctagaggtcagatcctttaaaatgtaaattctaagatttggggatacgaatcctagtacggatacgggtgcgaggatccgattaaaaataattcaaaaaaataagaaaataaaaaagtctctaaattatgtgaaattttgtggaataactacgtatagcttgtaaagtgtggatttattttttattctcaagttgtagataagtaaatgattgatttcctagataaggtatgttattttcttcaaatttaccctagtttggttcgaatttcgggaaattgtatcttgtctcgaatttttccttctgtcctgattaaactactcaaaatcgtctgaccagatccggtacggatcccatacccacatccacactagtgtcgtgtggacaagggtgcggcacctaaacttccgtgtaggagcaatttaggtaggctcctaatcttttcagctattaatgtgggacttttacgcacctctatcaaattccccaataaactaagtttcacgtggtccatcatcgcaatccacgggtctcttcctctagttaagtcccacatggcccattaccatgatccacgggtcaattttcgtgattcatcgtgtgccacccacatcgttagtatttatggtaactaaagtacgcaactagcttttgcttgtgagcgtgtctccaagctcgtaaaggtaagaaaaccgagccgcatattccatcactctatcatcaccatactcgtcccgcgaaacttgtaagataaaggtggctggttggtcagttgaactacctcagagtgacttggtatagtatttcctttcttgtgaatatttaactcaattatggactctctgtgtgatagtcattgagagccattttctatatagccggtgcacacaaatcatatgtaccaagcttgttatatatgtaactaatacgaggaccagtgaaggactcggtgaaaatatctgcaatctggtcattcgacatacaaggccaatagactccccagcaataaaatcagggggttgctgataaatagaattggccgaaatgttgccagaaaaatttgaaaatagtgagactaagccgaattctacactacaaaataggttttaaaacacaaccagaaaacaaaaacttttttggaaattactgttcacatcgaaaaaataaaagttgtcagaatttgatgtaatttatatggataggctcgtaatcactggacgagtaagttgtcctgaagaagttttgtcaaaaggtggccggaatggctcacacatgccggaaaacttattgtagctcgccggaaccctagttctggcggtgcgtagaggcgtgtgactttctgccagactgattgactgtggtttgtcgcctgacttttcctaacaagatggtagtattggttttcgcacaacaattaccgatgaggagataacgcaaatcaatcttgagtcgtcaatcggaaagacgcacggtggctgactttctatttagatgggactggaatttctggagtttaatcgcacaagcgttttggatctgatggtaatactggtatgcacagtaccactgtagcagtgatgaaccctcaaaataagacaaagttgccagaaaattgcacggcgatgagatctttcttccggatgtcaccggaatgacgcacaacgataatttctcactgaagctctgacaccatgtgagaatacacgggagaaaaatctatttttattaacaatgatacaatgagccctatatataatacatattctactctactacatatgggaatagggcatattttactcctactacatatgagactaggactatttacacataactatctaacaagggctatatctcagatttatgagaatatctacccaacgacccagagagacgagcctaatcattttgcagtggcacagactataacaacaaaaaacctactcataatggttaaaccaactgattaagatgcttacaggactatcttgagaaatgtacatattatatagatgcttgagttgcgtcccaatcctaaatagaagcttttattcgtaagcaagaagggaagcagctttacttgagccaatagctttcaaggtgcatgttgtcacaccaaggacatccagaatttgattttatagtgggaatatcgtttaaagataaaaaagatagcgtgcagaagattgcatacattagagatgcaaaatacggaatacccatactcccagataatgcagtatgccttttgcatgacctactggttgaatggaagcacctggtgaatttactaggtgtgttagtgatttctgctgcttccttcccctttctaaactgcatactatctaaaatgttaggggggcagaagcccagtcaatctgactaggtgatgttagtggtttccgcttcttcctcccacttctaaatgcgtactttctcaaatttaggagcatagaaacttaagcagctgcctacctgaggagttgcatgggaacataagagaatagactttacctgtcatattttccataccttagttaattacagtgttatcctgataatgatctgttttctggatctaggctgaatcgagattcaatcgcttttggttgaaaggatgctgctacagatccttagtttacatcattttggttcttattctataagtacttcccctatcaactacttccttcttttttcttaggttatttgcctctttaggttgtttggaaggaaaggaacagtagatgttttgatggaatagcaactccaaaccacttccttaaggctaatatcctgattggccaagtttctccaaagtccaaaacactttttttttccttcaaaaaagtacctttttttttcaaagttgaggtgtttggccaagcttttggaaggaaaaaaagtgtttttgagtagaagcagatgctcttgagaagcagaagaagtagcttcttcccggaagcacttttgagaaaaataaatttagaaacactttttaaaagcttggccaaacactaattgctgcttaaaagtattttcagatttattagacaaacacaaactgcttctcaccaaaaatacttttttgaaaagtacttttcaaacaaagcacttttcaaaataagttttttagaagcttggctaaacaggctataaatgtcttttatttttacagctggagtaccctaacacctgtaaattcccctatacatttttttcgactttggtagctcattaaccctagtataggactctttgttttggagctagcaaactcttttgttttcctatttttgcatcttcttggtgccatttataatatctcttcaccaaaaaaaaaaagttcccaaactatgactaccttgagttggtcaaagcataaccaaagcatgggcacaccagtgtttgcgtgaattttatggatgttccttacctttatccttctgtgcttatgtagcatctgtcttggtcaatcttttctgaagtctatattgtatttctgtgttgcaacatgagtttactgttaatcttactgtttgacctcaattttgggttctttttgattttggaagacatcgtttaacaggttggcatggctgctactcttgctggtgtctgtcaggtgcctctcactgcggttttgcttctctttgaactgacacaggattatcggatagttctgcccctcttgggagctgtggggttgtcttcttgggttacatctggacaaacaaggaaaagtgtagtgaaggatagagaaaaactaaaagatgcaagagcccacatgatgcagcgacaaggaacttctttctccaacatttctagtttaacttattcttcaggttcaccttcacagaaagagagtaacctctgcaaacttgagagttccctctgtctttatgaatctgatgatgaagaaaatgatttggcaaggacaattctagtttcacaggcaatgagaacacgatatgtgacagttctaatgagcaccttgctaatggagaccatatccctcatgctagctgagaagcaatcttgtgcaataatagttgatgaaaataattttctcattggtctgctgacacttggtgatatccagaattacagcaagttgccaagaacagagggcaatttccaggaggtagcttcttggtacatttcaatattcttaactgatgaaaaaataagggaaattgatctagcatgaaatgaagctaattataagttttacacagtagaactggtaaaacagggttggctggatatttctttgttgaatttttaggattatatatattgttttagttttgtaggttgttttctgatgtgctttttgactcggcagaatcttaagatgaaatggaaggttgtatcatcaaatgttaaataagggaatatgtgactttcaaagttaagcacggagtattttggagtcaatagttacttcctgaatcttttaggatggaggagacagtttctataggaataggaaaaggggacctgatttcattatttgtgtgtatatacatttgttatctgaattcgcattactttctaacaaccaacaaaaggaaagtggacattcaatttgagccggagggagaaaatttaactagaaaatgacctggccgtgaaataaaattattgatccgtcctttaactagttttcatggattgcctccttgcggatgatttttccaaccggtagaactactgttagtcgtccaaattctgaccccctactatgaataaaaatgtattagtaagtttagtgggtaatctccttgagaaataaaggaacaggagaaatattttattgatatatgctaagtgttttacaatagccctatttatatacaatgtttacataaacctaaagccttctatataaatgtgggacactatacatgaactaactctaacactatccctcaagctagtgcatataaattatatatatgcttgttacatatataattaatttctctactttttggtatacttcttgtatacgggagttatctcccttttgattaatacaatttaccttatcaaaaaaaaattaatacgaggaccagtgagggacttggtgaaaatatctgcaagttgatcatttgacttctcaaactttgtaacaatatctcctgagaatcttctctctcgtgaagtgacagtcaatctcagtgtgtttggtcctctcatggaacactggatttgatgcaatatgaaggacaacttgattatcacacacaagttccatctgactgattgctccaaattttaattatttgagcaattgtttgatccaaactagctcacatggtgcaagagtcatgactcgatattcggcttctgcgctagatcgagcaactacattctgtttcttgcttttccgagagacaaattacctcctattaaaacacaatatccagatacgtaacgtctatcagaaggtgaccctgcccaattagcatctgtgcgtccaacaatatgctcatggcatcgatcttcgaatattagtcatttgtctggagctgattttatataacgaacaatgcgaacaactgcatcccaatgactatcgcaaggaaattccataaactgacttacaacactcacaggaaataaaatatcaggtctagtaattatgaggtaattcaattttccaaccaggcgcctatattttgcaggattgctaagaggctcccccctatcctggcagaagcttagcattcggattcataagagtatcaatagttctgcagcccattattcatgtctcctcaagaatgtctaaagcatacttcctttgcgaaataacaacctgaactagaccgagcgacctcaatacctacaaagtacttcaatctgctaaggtcgttagtctggaagtgttgaaagtgatgttgtttcaaattagtaataccatcctgatcattgcgagtaataacaatatcatcaacataaaccaccagataaatacagagattaggagcagaatgccgataaaatacagagtgatcagcttcactattagtcatgccaaattcccgaataattgtcctgaacttacgaaactaggctcgacgagattgttttaaaccatagagacttgcataagtgacatacaatacctctagactccccttgagcaacaaaaccaagtggttgctccatattaactttatcctcaagatcaccatggagaaaggcattctttatgtccaactgataaagaggccaatgatgaacaatagccatggacaggaaaaggcgaacagatacgactttagccacgggagaaaagtgtcattattatcaagcccaaatagctgagtatatccttttgcaatcagacgagccttgagccaatcaacctggccatccaggtagactttgactgcataaacccaacgacaaccaacagtagacttacttgaaggaagagaacaaactcccatgtaccactcactcacatgtaaagcaaacatctcgtcaatcatagcctgtcgccatcctggatgagatagtgcctcacctgtaaacttaggaatggaaacagtggacaaagatgatacaaaatcataatagggtgatgagatgcggtgataacttaaaccaacataatggggactaggattaagtttggatcatacaccctttcgaagtgcaatcagtggactaggaggagccaagtccgcactagacgtggatgacaatgataagtcaagagtggtggcctcgtggttggagatgtaggatgagcaactgtagactcctcagaagtcggtataggtaggagtacctgtgatgttgatgtggatttaagaggaggaacaatagattcctcacaagtagatacaggtaagacctcagatatatcaagatgattagatgaagtaaagtaaggttgagactcaaaaaatgtgacatcgactgacataagatatctacgaagatcaggtgagtagcagcgataccccttttgaacccgagaatagccaagaaagacacacctgagaacacaaggagctattttatctttttcaggagctaagttatgaacaaatgtactccttaaaacactaggaggaaagagtataaagatgacctagggaacaatactgagtgtggaaactgattctagatggaagatgaaggcatccgattaattaagtaacaggttgtaagaactgcatcgtcccaaaaacgttgtggaacataggactgaatgagaagtgtgcgagcagttttaatgagatacctattctttctctctactaccctataatgttgaggagtatacagacataggataatattttgagaagtcataaactattgaaactaagagaatacatattttaaggcattatcactacgaaaagcgaataaaaacaccaagcggagttttaatttcagcataaaaactctagaatattgaaaacaactcaaaacgatctttcatttggaaaatccaaatacatcttgagtaatcattaatgaaactaacaaaatccaaatcttaaggttgtgactctactaagaccccatatatcataatgaactaaagacaaaacagactctacacgactcttagcacgacgtgaaaatgtagctcgaatatatttcccaagttgacacgaatcacaatctaatgtggacaaaccagacaccatcttctgaagcttggataaactcggatgtcctaaacgtttgtgaattaggtctagaggatctgtagttggacatgttgtagagggattgagtgagttaagatagtcaaggtcttgtgattcacgccatgtgccaatcgtctgtaccgtactgcggtcctgcatagtaaaagaatcatcaataaaatatatatcacaatggaattcacgagtcaaatgactaacagatgcgagattaaaggacaaccggggacataaaaaatagaatctaaagtgacagaggacatgtgattagcttgtccaactccttttgcttttgtttagacttcatttgctaaagtatcattgggaagagattgtgaataaacaattatttgacaaaagtgacatattaccactggggtatcaagttgcttagtcatactaagaatgtttgggagagggtggtggaagtgagggtaaggaggacagtgtctctatccgagaaccagttcggattcatgcatgatcgttcaactgcggaagctatccgtcttattaggaggctggtggaacagtacaaggataggaagaaggatttgcacatgatgtttacctagagtaagcgtatgacaaggtccctaaggaggttccttggagatgtcagaaggttaaaggtgttccggtagcatatactagggtgatgaaggacatgtatgatggagctaagactcgggttaggacaatggaaagagactctaagcattgtttggttgttatggggttacagtaaggatctacgctcaaaccgttcttatttgccttggcgatggacgcattaacgtaccatattcagggagatgtgccatggtgtatgttattcgcggatgatatagttctgattgatgagacgcgaggcggtgttaacgagaggttgggggtttggagacagacccttgaatttaaaggtttcaagttgagcaggactaagacagaatacttggaatgtaagttcagcgacgtgacggaggaagctgacatggacgcgaggcttgattcataagtcatccccaagagaggaagtttcaagtatcttgagtcagttatacagggagaagatggggagattgacaaggatgtcacgcaccgtattaagggcggggtggatgaaatggaggttagcattcggtatcttttgtcacaagaatgtgccaccaaaacttaaaggtaagttctatagagcggtggttagaccaaccatgttgtatggggcagagtgttggccagtcaagaattctcatatctagaagatgaaagtagcagaaatgagaatgttgagacggatatgcgggcatactacgttggaagattaagaatgaaaatatttgggtgaaggtgggcgtggccccatggaagttgtgcccaccattaaagactgctatctgaaaactaattctttgggcccaaacattctggcccaaagtacctcgtgaataataatattgagctcatgtctgacatgttggaagaggagttactagcaaacacttatacacctatgttggtaacacaattgaagaactacgaaaaacactcttctgcaaaggaaaatgagaagaagaagaagaagaagacgaagaagaaggatgatgcaatgatcattgaagaaaaaggagagcaggaggacccatctaaacttacaaagtctagaggaagaggaggacccagagtttgatgcttccctctgggtacaccaaaacatcgtcaaacttaggcaaggagtttggggtaaacattcaggggtgtgagaaggaagctttggagcttttcgtaaaattacaactagaggcataaaaaaaaaaaaggcaatccaggcatggaggtgacaaccttcgaaaagaaagggattcaaagaactgaaagggctggatttttggagtaacttcaagagtaatagaacaagaagtagggggttgcattattatcaaagatcaatgaagattaacattgaagaagtgggaaatccaaaaagactccaccgagaaggatgatgcaatgatcattgaagaaaaaggagagcatgagaaaaaacccgtagaaattgacagcactcacacacaataagacgagataataaagtagtgagttggccaattgaagaagctttacctcttaacttacaaagtctagaggaagaggaggacccagagtttgatgcttccctctgggtacaccaaaacatcgtcaaacttaggcaaggagtttggggtaaactttcaggggtgtgagaaggatgttttggagcttttcataaaattataacaagaggcatgggaaaaaaaaggaaatccaggcatgcaggtgacaaaaccttccaaaagaaagggactggaagaactgaaagggctggatttttggcgtaacttcaagagtaataggacaagaagtacgggattgcattattatcaaagatcaatgaagattaacattgtatcatggaatgtcagggggttaaatcgacatagaaaaagaatgttgattaggagtttaattcataggtggaaagcagatgttttctgtttccaagattcaaaattaaaaggggacattagggagtttataagagaactatgggcaaataggtggtttaaatatgcacagttggaggctagtgggcctagagggggtattattgtcttatgggatagtaaaattggggagggggagatcagcagcctgagctcctattctgttacttgtaaatttataggtaaaactcaggagtatacttggaatttatccactgtatacgctccaaatgatagggaggaaaggaaagaagtatggtgggaattagcaggtgccaggggaatttttatggaccttgggtaatttctggggatttcaatactgtgaggtacccaccagagaaaaagaattacagcaaaatcactagagcaataaatgaattctcataatttattgaagatatggaactggtggatctacaacttgcaggaggaagttacacttggaggacaggagatagacatgtgataacagctagactggataggttcttggtttttatggattggaatgagagcatcagaaacaccaagcaatcagttctccattgaattacctctgaccattcccctgtgatgcttcaatgtggtaaccggtaccctgtcaaatcctattacaagtttgagaattggtggctggaaacagagggcttcaaagaaaggattaaagtctggtggagctcttttgcttgtgaaggaagacgtgactttattctggctttcaaacttaaagcatcgaaggaaaaaattgaagaaatggagtaaatctattcaaggaaacttggagatgcagaaattgagtattcttagtcaacttgcagaactagaagagacacatgatcaaaggagccttactgaagaagaaatacacactaaatatgcagtctatggagtttggggagattgcaaaacatgaggaggtggcttggagacaaagatctagggctctttggttgaaagaagggacaaaaacatcaattttttcctcaaaattgcaagtgcacataggaaatacaataacatagaccaactgttacttgaaggaaaatttgtggcgaatccaacatacataacaaataatattggtacattttatcaaaaactatatataaagattgctagaggacaatcttatgttgcaaagtcttttcgaagcttaggaaatttgggatagtgtcaggcatgtgaaagggataaagcacctggacctgagaactgggaggtgataaacacggatatgatagctgcagttctttgttcatggaatgtttgaggaaagctttaatgttacctttgtggtattgattcctaagaagatggaagctaaggaatagaaggactttaggcctattatgataggcaatgtgtacaagatcttgatagaaagacttaagaaattggtgaacaagttggtgaagggtcaacggatgacttttattaaaggtagacagataatggatgttgttctaattgccaaatgaatgtgtagatgcaagaacaaaggcgagaaacctacaatactatgcaaactagatattgagaaggcatatgaccatctaaattggaactttctattggaatcgctgatgaggatgggctttggtgtaagatgggtcagctggatcaaattctgcatcagcacaatgaaattctcaattttgataaatgtttcaccagtaggtttcttcccttctcagagggatttgagacagggtgatccactatctccttttattattcattagtgctatgggaggcttaaatgatatgttaaagactactcaagataacaactgcatacggggttttaaggtgaagtccagggcagacagtactattgagatttttcatcttcgatatgcagatgacgcacttatgttctgtgaggttgacaatgaacaattgaaagtgctgaaggtgatcttcattctgtttgaagccacatctgtattacaaattaactggaatgaaagctttatctatctagttaatgaggtaactaagatccactttttggttggaatcctagaaggtaaaattggggaattgcctacagttatttggggatgccatgggggccaagagcaattttaaggggatttggactagggtcgtagagatatgtgaaaaaattttaacaaactggaagagttagtatttatccttaagggacaaactaatactaatcaattctatacttgatgattttcctacttacatgatgttcctcttctcaatccatgtgaatgttgtgaagagaatatatacccttagaaggaacttcctatggggaggaaactatgacaaggaaagatctatttggtcaaatggaagtctctcacagtcagcaagaagtaagagtgttttggaatcaagaattggagaattcagaaccaaagtttgatgatgaagtggctatggagatttactacagaagaacattgtttgtggaaagaggtgatcatggagaagtatggcatagaagataaacggataacaaagtctgtaaatagatcttatggagttagtcgatggaaatccatcagggacctatagcttcagctcttgaataagtccaaattctgaataggaaatggattgaaaatatctttttggaaggataattggctaaccaaggaactttgaaacaactctttcttgacatttacattccaaatcaacagcataaagcaataatagtagaattatgggctaatcaaggttggaatctcacatacagaagactatcaaaagacccggagattggcaggtcaacagagttcaaaggcactttggaacaatttaaagaggtctatacttctatagactatttgacttggcaagggaagtttattgttaattcagcctataaggaattcaacttctcagctaactggattggttgttggccatagaagttgatttggaaagttaaaattccttatagagttgcttgtttctcttggcttttggctaaagaggcagttctgacgcatgataatctaaccaagagagattaccatttatgttcaagatgttatttatgtgaagagcaggcagagacaaccaatccacttttttttgcattgtaagttcactgcagttatggaggattttcattagtttaaagggtatcatgtgggctatgcgtagaagtatacctgaagttctagcatactggaaaaaagaaagaaatctttccaattataaaaagagatggaggattatcctagcttgcatctggtggaccatttgggaagaaagaaatcaaagatgcttcaaagataaatcagtcatattcagataattaaaatgaagtggctagtcttgttttatttttggtgttaagtgttagatagttatgtattatgtataagttgtctagtcccacattggaacgggagtaatatgtactatgtagagtatagctataaataggacttcttgtactttattgtagagaatatattaataatatatttttcccgtgttgtctcacatggtatcagagaaaccgtgagatatcagtcgttgtgaaaaataccagcggcttcgggaagaaaaaaatcaatcaactgctaggtatattagtcttcggcgaccgatccattaaatttctctggcaaagaaccactcatgggccctcacgcgcccaccgaaagaaatatttccggcgaggttccaatttcatgcgcccgcgcgtgaggcagtttccggtcaaattttgacaaaggtcctttttgacagtttgttcaccctgtaattcccagtctatccatcattttttttatttcgatcacttcgcaatttctcgggcagctacagtgatttttccggcagaagcggtgtttcctttgcctgcttcagcgagatacagttgattatttctattatttgtttctagacctctctccaatccaacgatgtctttggaatttgatgtatttggttctgaaaacacgagttctagaaagtcaagcttcatgattactttagagccattaatggggagttcaaactatttagcttgggtttcctctgttgaattgtggtgtaaaggtcaaggtgttcgagatcacttaatcaaaaaggctagtgagggctgtgaaaaggtcaatttaagcagtttatgacgtctgtataccactcagcagaataggatagcaaagaaagaatatgcacatcattgagactgctcgcacacttctcattgagtctcacgttctgctacattttctgagcgatgcagttctaacggcttgttatttgattaatcggatgcctttatcttccatccagaatcagattctgcagttagtattgttttctcagtcacccttatacttttttcgtcctcgtgcttttgggagcatgtgtttgttcataacttagctcccgaaaaaaataagttagctcctcgtgctctcaagtgtgtcttccttggatattcccgagtttaaaagtgatattgttgctactcacctgatcgtaggtaccttatgtcagttgatgttgcattttttgagtctagaccttactttacctcttctgaccaccttgatatatatatgaggtcttacctataccgactcttgaggggtttactatagctcctcctctacatactgagccacagaaatcttactcatacctaccattggggaatctagtgttgctcctcctagatccccagctacaggaacacttttaacttatcgtcgtcgtccgcgcccagcatcatgtccagctgattcacgttctgcacctgctcctactgcggactagtctcatcctaatctaccaattgcacttcggaaaggtatatagtccacacttaatcctaatccatattatgtcggtttgagttatcatcgtgtcatcacctcattatgcttttataacttctttgtccactgtttcaattcataagtttacaggtgaagcactgtcacatccaggatggcaacatgctatgattgacgagatgtctgctttacatacgagtagtacttgtgaacttgttcctcttccttcaggcaaatctactgttggttatcgttgggtttatgccgtcaaagttggtccagatgaccagattgccaaagggtatagtcaaatatttggggcttggttacagtgatattttctctcccgtggctaaaataccatcagttcatctctttatatccatggttgttgttcgtcattggcatctctatcagtttgacattaagaatgtttttcttcacagtgagattgaggatgaagtttatatgaattaaccacctaattttgttgcttagggggagtctagtggctttgtatgttggttgcctcagacgctctatggtctaaagtaatctcctcgagccttgtttagtaagttgagcacagttattcgggaatttggccaactcgtagtgaagcttatcactttgtgctttattggcattttacttcaaatctctgtatttatttggtggtttatgttgacgatattgttattaccggcaatgaacaggatggtattactgagttgaagcaacatctctttcagcacttttagactaaggatctgagtagattgaagtattttttaggtattgtgattgctcagtctagcttaggttttgttatttcacattggaagtagaaaaacttcaatcatttttctttatttgaaaggaagaaaaaaaaggtaatatctagacctaaatattaatctgaagacaagtgaggcttgctcagttggtaaaagcacctccacctacgatcgttaggtcctgggttcgagtcaccatggaggggaagtgtggaaacactatagatcctcctaatttgggagggggaaaaaaatattaatctgaattgacatgaatctcaatgacaatgaccaacgatttcctgcaattcttttcagtatggaatgaataaaaaatcaagctacaagtctctattaaacgaaatgcactaacagggatcactctcaagaaaggaagtggttttggttgttgttattccaggttggataaatcactttctttataaatatcataaaagacaagggctttcttgcttcagcacatgtgggaaatgccggggggcttggctggtaccaagctcgagcggtctttctatctttttggattgcatgcccaaggcaatgctttttgtagattgggatggattgatcttcgcagaagtatgctttagacattcttgaggagacaggaatgacggattgtagacccattgacacacctatggatccaaatgccacacttctaccaggatagggggagcctcttagtgatcctgcaagatataggcggctggttggcaagttgaattacctcacagtaactagaccttatatatcctttcctgtgagtgttgtaagtcagtttatggactctccttgtgatagtcattgggatgtggttttccgaattcttcgatataaaatcagctccaagcaaagaactgttgttcgaggatcgaggcccatgagcagatgttgattgggcacgatcaccttctaatagacattctatatctggatattgtatgttaataggagttaatttggtgtcttggaagatcaagacgtaaaatgtagttgatcggtctagtgcggaagcaaataatcgagcaattgttatggtaacacgtgagctagtttggatcaaacaactgctcaaagaattgaaatttggagaaattgatggaaccagtgtgtaataatcaagcagctcttcatattgcgtcaaatccggtgttccatgacagaattaaacacattgagattgactctcactttgccggagaaaagatactctcaggagataccgttacaaagattgtgaagtcgaatgatcagcttagagatatttttaccaagtcccttgctggtcctcgtattagttatatttgtagcaaactcggtatatatgatttatatgcaccaacttaagggagagtgtgagatagttatgtacaacaaaatacccggtataatcccacaagtggggtatggagggtagtgtatacgtagagcttacccttaccctgtgaaggtagagaagctgtttccaaataccctcggctccagtacaaatgaaaaggagcagtagcaacaagcagtaacaacaatgatatagtaaaataactgaagaaagaaataacatgtagacatataactccactaacaaacatgcaaggttaatactattgccacgagaatggcaaaggaatgttagatagttatgtattatatgtatattaatagtctagtctcacgttggaataggagtaatatgtactatgtagagtatagctataactaggacttcttgtaatatattgcatagagatatcaataatatatttttcctgtgctttctcacgtaaaggaatgtaatgtacttagaagatcatgaatctatctttgatgttttagacacctcgtgagaacacaaaggtttaggaactttattgtgttctttgtaattatgggtgactgccaatatgttaccttttcataaaaatgattatttggccattggattagtttcaacagcctctctgcccctccgggtaggggtaaggtctgcgtacatattaccctctccagaccccacttgtgggattatactgggttgttgttgttgttgttgtggattagtttcaacaattttgatagttcttttatttgaatcaaactactcattcacatggattttgtatcgtatcattgagttaaaaaaattggttttgctaatttatcctcatgtataacaactacctatttttcaatatattggattcaggagcttgtagtagctggagtttgctcttcaaagggcaataagtgccgggtatcatgcacagtgactccaaatacagatctcctttctgctctaactcttatggagaaacatgatctaagtcagctacctgttatactaggggacgtggaggatgaaggcatccatcctgtgggcattttggacagagaatgcatcaatgtagcttgcaggtttttgacattcaacttttacttcaaagatataatgctttctggaaccattgatgataaaatatgcaagaaacttgtgcagaagtcgcactttactatcgattaccagataaagttacttatcaagaagtcaaatatattgaacatatttctctaaaacactttgactggactgtaagcagaaacttactaaagtaggtcgtaagaaatggtttgatagggaaatcaccatctacacttaaaagagttgtgtgaatttgaattcttaaagcatgtgaaagttataaaaacttgttattatctaagcatctgaagcattttggccatccaaaggatcaaaaataggaaataatttcatttgtacaatgaactccctgcacaaattctcacactaggtgtattctctattcatcactagcactacatgtgtcactacgaatcatatacaataaatctttgtaacataaaagacgacacataatatggaagtaagccgagtatacaagggaagtttcatcattacggtgagctttttataagataatcaagttttactggaaaagggcaaaaactctcccgtatagaagtataccaaaaagtagaataccttacaaaaatatgattttctatgaacaacaccctatcttctatacttgtagggatctcatcggggcaccaaaaagagataaagggataagaggcttttcctcaaatgtacaaaatccttctctattccttcaaaagctctcctatttctctctctgcacactgtccacataagttcaatggagcaacatccacgccctgtgtcttcttttccgtcttctataggtccagctgaacatggcttctttgactgagtgtggcatcaacgttgaagaccaaaccatcccagtacttccaaccacaaacgagacactatatgacaatttagaagaagatgattcacatcttctcccgaacatttacacataaaacaccagctgatacatgtaatcttcctcttcctcaaattatcagccgtcaggatcacccgtctcgtagctaactaggtgaagaagcacacctttctcgaaaacctcaggatccatacagagagatatggaaaagctgattcctccatgcccagaagcttctcataataagacttaacaaagaaacaccactacttccccccccccccaaaaaaaaaaaatctccatacatcgactttcatgtgtaattcttgttcgtgaaacgacccaatcaacctttggcacaaatctcccagtcttgcgagttcctcctaaacttcaaatcacaatgaacttctccaccttgtagcctccgtgtcccttggactggcaactcctttggcatgaaactttgtacatattaggagatgtgatactcaaagtgttgttcctgcaccaattgtacccccaaaaaacttaccatgctcccatcacctaacattgaatgatacgttccaaaatcttcgcactccttcaagaaacttttccgtaggccccacccataagggagtgtgattttttttgctctccatcccctctccaagaatccattccctaaaccactgcaggacactttaacaatcactatgtcactttttctactagttctacattgagtgatatcttgatgtcattgaaatgcctctggaaaatcttcttctcatctaaaagaacacttgtttgccttttgaatccccctctaacattttctatgtttcattcatctttggtggaacagagcattagcaactagagaacagctttgctag
SEQ ID NO:11(来自普通烟草的NtCLCe的DNA序列；序列源于祖先绒毛状烟草；两个起始密码子)
atgattagcggccaaaacaccgtgctgcaccatcctcctaattcgctcttcaattccttatctcctcgccatatctgtgtatctttctgtaacgacaaagctttaaaaaagtcagtcacgcactccgcccctcggtttgctcgtctgttaaacaatgaatcacgaaagttgttgggtcgtcatccaaattgctggccttgggctcgacgaccatctcttcctccgggacgttcctgtgacggaaacattgaaaaagaacaagatatgtgcgacagcagcaaagacgatagtgatagtgatagtggtatccagataggatctctgctcgaggaagttatcccacaaggcaataataccgctataatctcggcttgctttgttggcctcttcaccggtatcagtgtcgtgcttttcaacgctgcggtaagtgcgctataggtctttcatttctcttttcatctactattctcccttacttacttggcctcagtcaatcagccccctgcctactttaaattattgtacaatttatcagaggagtatcctatacatcaaattcacataacttagtaaaatatgctgacattctgaattttaaccttaccagcttagaacatccaggctagttcagaaacagataatctaaattggcctcatttataagtcattttgttaatcaagacatacaatttggctcttgataaaagattatgcagcgcccgatgataacctaatatttatcagcaacccatatgtcactttcttttgtttaaatgctctcccatgtaatttaacaatattgtcaccatacaaaagagaactgaagtgaatgttccatttgtggtcatataacggatatctcccttggttaggttcatgaaatacgtgatctttgttgggatggaattccatatcgagctgcctcagaggagcccattggagtacattggcaacgtgtaatcttagtaccagcttgtggcggtttggtagtcagctttttgaatgccttccgagccactctggaggtttcaactgaagaaagttggacatcatctgttaaatctgtgttggggccagttttgaagacaatggccgcttgtgtcacattaggaactgggaattccttaggaccagaaggccctagtgttgaaattggtacatctgttgccaagggagttggagctctgcttgataaaggtggtcgtagaaagctgtcactcaaggctgctggatcagctgctggaatcgcttctggtttgttccccatattattcttggttctgaaccatacatggtacattttccttataattacatgtagcctgttgtatgctttcctctttcctgggaagcctttctgtaaatgcaaatgtgtttgcactcaaaccaataaactgtaaaaacagtgaaccccttgagcaagcaaaagcactagaaaaccaacaaatagatcccccccccaagataccagtgaaatgacaccgggtgacccaaaaataaagcagcttacatcttgactttgagaggaactgcaatcagctataagtaggttattaatttccagtgcctgcattctgcccaagtactatgatatatttctgaagctttgtttccccagttcctttttcagacgtttgctgtcaataaagttgagccagccaacttggttcccacaagctactaattttgtccaagcttactctatgggagaagttaaatttcccaaattccttgagcagaaaatgaaaaatgaactcaaagtgtcatattaggcaactatctaaagaaaaatacttaattgaagtttagataagaaaagtgaatatatattgatgtagtctccgttaggtgagaagcgcatcacttacccagcaacatatggacctaaaatttactagtgaacttttcacattgtatcaaaagctcaacaaacagaaagatgactagtcctaaaatgttatttcacatcaaccttatcatacgtgcattatttgttctctatatttctatttcatccgatataaccaatcgtcattgtaaattctataatgcctgtggttacttttgtctttagtgacaaatgacatttaggctaaccatgtagttattgactgatttcgcttgacgtctcttccaattatgtagtagtagagtgttgagatatggatatgttaccttctaaaaaaaaagagtgttgagatgcggatggtttgctagctggcttttgtctcccttcaagttgaattagcaaaagcaatgtctcataagttggatagctagacaagaaaaactccaaattactttatgtagagtattcttaagcttgagtcgcgagttggaaattggaattatgtaaaaaaacctggaattatttggttgagcctgctttttatttttgtcaatatttccagtatctaacccaacatgtttagagcaattcccagagagcctcaatacgaggcatttgcagagtctttatgagagtccaggaaggggcacacactgtagaggtatagtgttgtccttatttttttttttttgataaggtaagattttattaaaaggtaccaagatggtgcaaaattacaaacatccaaactaatacaacaaagcaactacattcctcctagctcctctagaaaattcatatattgttccatatttttcattacatgtcttttacaccagaaatacaagtttaataagcatctgtttttaatcctggatacatgctgcctttccccttcaaagcaaatcctgtttctttccaaccatattgtccagaacacacatagaggaattgttcttcatactatctgttgactctttgccactttttgttgttgccatgtctccaacaaactttacactggcaggcattgcccacttgacatcatatatatttaggaagagctaccaacactgctttgccactttgaaatggatgattagatggttgactgtttctgcctcttcttcacacatgtaacaccggttacatagagcaaaacctctcttctgcaagttctcctgagttagaaaagcttcctttgctccaatccaaccaaaacgggctactttaataagtgcttttgacttccatattgctttccatggccaatttgactgataaagcccttgtagtttttgtaacaagctataacaactgctgactgtgaaaataccatcattacttgctgcccagattaatgagtctctcctgttttcctccaatctaacattattcaataactgcatcaattgggaaaattcatcaacttcccagtcattgaggcccctcttgaagattagctgccagccggtgcttgaatagaagtctaacactcttccatttttgttaatagagcagctatatagaccaggaaactttgatctaagacttccattttccaaccacatatcagaccaaaacagggtattattaccatttccaagtttcagtttcacaaactgactatatttattccaaagattactaattgtgctccaaactcccccttttgaagaagattgaattgaacgaggagcccacatgtccttcataccatacttggcatctatcacctttttccataatctattcccatcataattatatctccatagccatttaaataaaagacttttgttatgcatctttagattcctcactcctaatccccctctttctttttttttcatcacctcttgccatttgaccaagtgaaatttcttgttatcattattaccttcccacaaaaatttattcctcatagtattcaattttttctccactgatgttggcattttaacgagagatattagataagtaggtataccatccatcacactattgaccagtgtaagcctaccaccaagagataaatattgtcttttccatgacaccagtttactgctacatctatccaagaccccctgccacatctttgcatcattcttttttgctccaagtggtaggcccagataggtggatggtagctgctccactttacaacccaaaacatctgccagatcatcaatacaatgctcggcattaatactaaacacattactctttgccaagttcactttcaatcccgagacagcttcaaaagctagtagtactcctatgaggtgtaagagttgctctttttcagcttcacataatatcaatgtatcatcagcatagagtatgtgtgagaaatacagttcttccccctctctttttctaattttcaatcctctaatccaccctaacttttctgcttttaaaagcattctgctaaagatttccatcaccaacaaaaataaatagggggatattggatccccctgtcttaaccccctctgagaattaaagtatctatgtggactcccattaattaaaactgagaagctaattgaggatatgcagaattttatccacccaatccatctttccccaaaattcgtatgtttcatcagatttaacagacatgaccaatttacatgatcataagccttttccacgtcaagtttgcaggccacccctttaatcttcctcttgaatagatattcaagacactcattagctaccatagcagcatcaataaattgccttcctcttacaaaggcattctgattatctaatatcaattttcctatcaccatctttaatctttcagctatcgactttgcaattattttatagacactgcccaacaagctgataggtctaaaatctttcacttccgctgccccctttttcttaggaataagagcaatgaaaattgagtttaggctcttagtcttgtccttattttcagggttgaactagttctttagaagtttcctaggcttcctaatttccaaagttctgccaggtccttttctagtgaagtacttgaagtttaataaatcaaattttaatttctaacatatcccgagaaattcattcacaaattcaactggtgacttctgatgcagaaacataagcaactgcttatgggttcatatgttcctgcaattttattgttgacatggattggcttcatatggttttgttcctgcaattttatcgctgacactaatcctttcatatggttttatgtggggtggtaaatagaggttaagagacaagaagaggctggaaaaggtgggcagttcatttgttagtagactactctatttactaagagatatgatgtcccatacattactcgaattggctccaaatacagattccacttctttgtcgagtttccttattgtacagagttcgactcgtcaagggaaattcacttcctttgactgaataatgctagtttgagtagtaccttaaattaaatggaccatttaattctatctacttgatagaatagactggtcatcaactagttgcaaatataatgacaactccgccatgtttgcagagtcacctgatgaagaagtacctcaattagtagaccatttcttgaatgttctacagtattctctatgcctacatgaccacatcacttttccttttgcgttgtgagaacttgaacttggtgagcgggggttccccaggaatggcatcttggtggcagatgaccattctgtccttatcttagctaatgcttcttggattgcctcactagatttattatacctttaataaatgtttgccattgttctgccataatagagggatgtacctagctggtgcttcacatcacatagtccaaaactaatgaaatgctttacaattgtcgagtactaaaggatgatttgtggaatcagatctcaaacaatttattttgaggaagaaaaataccaaaggttttttctgtttgttggaagattaaaaatcctttaaaaggtaaagatttatgaacttaattcagcatttttgtggccattgctgaaaaagagaaaacaatggcacttattcgagtttgcttatccaaaaaaaaagaagaagagaatgtcacgtaatgcaatttcatcttaggaaactttgcaggagaaaagcaagagtgataaaacagaactatttgtttttttgataagttgttgtgacctatttctttgtcattcttatttgctaataagctaatgtaccctgtactatggttgttttgacttaatccggggatgttcagtgagcattttcttgttttttctgctgtcagcatctgctgccttacaggaattcattttctggaaatttacttcttgttctgctaacattttcctgttatatcttgtcagtcattttctctccatggttatactgtttgtgtcactttgaaactctccttgttttctactttaaaggatttaatgctgctgtcgggggctgtttctttgctgtggaatctgtgttatggccatcacctgcagagtcctccttgtacttgacaaatacgacttcaatggttattctcagtgctgttatagcttctgtagtctcagaaattggtcttggctctgaacctgcatttgcagttccaggatatgatttccgtacacctactggtaattttggacttctttctcgagtttgattcttaaatacaattgtacccgtcacttacagcaacaacaactacatttcaacagctagttggggttggctacacagatcatcactatccatttcaatttctttagtcccatttctttcgaatattcagtactttgggattctctattatcagaggttctctttattttctactttgacgtacaaatctctaaatagattaaagaagactcctagagacactggcctaatgcaaatgtaccaccatgaataaaccttaatctgaaatagctggtatcgtatataagaacctttagctttaattgtgttctatattgatcttttgggacaacttccgtccaataatattatgtcttacttatacagttatacttatccttaaactttactctttagagtggttatccgtagttcaagcttttgttggcaccatagctagtttggttcttagtaaaaagttactctttagagtggtaactttttgtcaattttcttagtgaaaatataacctctgtgacaaatctaccaagtataaatccaatatggttctgtgtcatacttgtagtttatccaagtctatgctccatcactcttacaaaggctcatcgtatgactaattttttttgagaaaggtaacagtttgtattgataataagatcagcgccaggttagtcattagtgctaatagctgtatgtacaactccaaaagagcaaaagacaagcacctggtgtaacgtaaattacaagctgcctataaaatctatcaggtctcctacctcactaaacatttcttgtttacaccaaaaaaataaaacaaggaaagacaatccatcttaatcttctgaatggagtttcttttgccttcaaacatctcgagttcctttcgttccatgcaatccaccatatacaagctgggatgcttttccatttgtctttatccattttttctaccaattcccttccaattgactagaagttccaatgtggttctagatatgacccaattaactcccaacatataaaagaacatgttccacggatttgtagtgattctgcaatgtaggaacaagtgagcattactttctacttcctgtccacaaagaaaacatcttgagcaaatctggaaacctcttctttgtaagttatcatgtgttaaacatgcttttttaccactaaccagacaaaacatgatactttgggaggagttttaaccctccaaatgtgtttccaaggccacacctcagtcattgaaacattatgatttagagtccagtatgcatcttttactgaaaatgcacctttgctattcagcttccaaactattttatctatggtcttgttagtttacagctatgtatatagtgtagtcttgtcccacattggaataggagtagtatgtccttgtatagtatagctataaataaggacctcttgtattgtattgaacatccaatatcaataacatattttctcccgtgctttctcacatggtatcagagcaattgtgagagatttatcgctgcgcataaattccagcgactccgggaagagaaatcagtcaccggaagtctttttccgacgactctttcaaggttgtttgcgtttgctttataaatccaacactaccacaagagtaatcactgtccggcgaccaaaccccagtaaaaatctccggcagcagcctcctcacgccaccagaagctcacgcgccggcgcgtacgaccacttccgtccattttttgaaaaacttccttcagaacagttgggtcgcctggtaattcctatcctacccctactgttttcatttcattccgaccactttgagttttttccggctgctacagtactattccggcagctatagtactattccgacaactacagtaagattccggctgctacagtatttcattattctgtttttgtgtttccttactctgtttcagtggattacaattgattctttctcttatttggtaataatttgcaacaatgtctatgggatttgatgtttttgggtctagaaacatgagttctggaagctctagtgttattattacctcagaaccttaaatgggaggttcaaactacttagcttgggcttcatctgtcgagttgtggtgtagaggccaaggtgttcaagatcatctaatcaaaccgtctagcgaaggagatgaaaaggcaataacactttggacaaaaatcgatgctcagttatgtagcatcttgtggcgatctattgattccaagttgatgcccttgtttcgtccattcctgacatgttatttggtttgggcaaaggcacacaccttatacactaatgacatatctcgcttctatgatgtgatatcgcggatgacaaactgaaagaagcaagaattagatatgtctacttacttgggtcaagtacaagcaatcatgggggaatttgagaagttgatgccagtttctgctagtgttgaaaaacaacaagagcagcgacaaaagatgtttctcgctcttaccctcgctgaacttcctaatgatcttgattcagtacgcgaccatattttagctagtccgactgtcccgacagttgatgaattattctctcgattactccgccttgctgtagcaccaagtcacccagtgatctcatcacagatacttgattcctctgttcttgcatcccagacaatggatgttcgggcatctcaaactatggagcatagacgaggaggaggtcgttttggaagatctagacccaagtgttcttattgtcacaaacttggacacactcgtgaaatgtgttattccttacatggtcgtccacccaaaaatgcttacattgctcagaccgagactccaggtaaccagggattttctttatctaaagaagaatataatgaactccttcagtatcgaacaagtaagcagacatctccacaagtagcctcagttgcttagactgatacttcttttactggtaatttttttgcttgtgtttcccagtctagcactcttggcccatgggtcatggactcaggcgcttctgatcacatctctggtaatatatcacttttgttaaatattgtatattcatagtctcttcccattgttactttagccaatggatgtcaaattacggcaaaaggagttggacaagctaatcccttgtcttctatcaccctagattctgttctttatgtccctggctgtctttttcgtcttgcatctgttagtcgtttgactcgtgccctccattgtggtatatattttattgacgattcttttattatgcaggactgcagtacgggacagacaattggtggaggacgtgaatcagaaggcctttactaccttaactcacccagtccttccacaacatgtctggttacagatcctccagatctaatccacagacgtttaggacatccgagtttatccaaacttcagaagatggtgcctagtttatctagtttgtctacattagattgtgagtcgtgtcagcttgggaaacatacccgagcctccttttcgcgtagtgttgagagtcttgcatagtctgccttctccttagttcattctgatatatggggtcctagtagagtaagttcaaccttgggatttcgttattttgttagtttcattgatgattattcaagatgtacttggcttttcttaatgaaagaccgttctgagttattttctatattccagagtttctgtgctgaaatgaaaaaccaatttggtgtttctattcgcatttttcgcagtgataatgccttagaatatttatcttttcaatttcagcagtttatgacttctcaaggaattattcatcagacatcttgtccttatacccctcaacaaaatggggttgctgagagaaagaataggcaccttattgagattgctcgcacacttctaattgaatctcgtgttccgttgcgtttttggggcgatgcagtgctcacaacttgttatttgattaatcggatgccttcatctcccatcaaggatcagattccacattcagtattgtttccccagtcacccttatactctcttccaccccgtatttttggaagcacgtgttttgttcataacttagcccctgggaaagataagttagctcttcgtgctctcaagtgtgtcttccttggttattctcgtgttcagaagggatatcgttattattctccagatcttcgtaggtaccttatgtcagctgacgtcacattttttgagtctaaacctttctttacttttgctgaccaccatgatatatctgaggtcttacctataccgacctttgaggagtttactatagctcctcctccaccttcgaccacagaggtttcatccataccagccgttgaggagtctagtgttgttcctcgtagttccccagccacaggaacaccactcttgacttatcatcatcgttcgcgccctacatcgggcccaactggttctcgtcctgcacctgacccttctcctgctgcggaccctgctcctagtacactgattgcacttcggaaaggtatacgaaccatacttaaccctaatcctcattatgtcggtttgagttatcatcgtctgtcatttccccattatgcttttatatcttctttgaactcggtttccatccctaagtctacaggtgaaacgttgtctcacccaggatggcgacaggctatgagtgacgagatgtctgctttacatacaagtggtacttgggagcttgttcctcttccctcaggtaaatctactgttggttgtcgttgggtttatgcagtcaaagttggtcccgatggccagattgatcgacttaaggcccgtcttgttgccaaaggatatactcagatatttgggctcgattacagtgataccttctctcccgtggctaaagtggcttcagtccgtctttttctatccatggctgcggttcgtcattggcccctctatcagctgaacactaagaatgccttttttcacggtgatcttgaggatgaggtttatatagagcaaccacctggttttgttgctcaggagggggtctcgtggccttgtatgtcgcttgcgtcggtcactttatggtctaaagcagtctcctagagcctggtttggtaagttcagcacggttatccaggagtttggcatgactcgtagtgaagctgatcactctgtgttttatcggcaccctgttgacattccgatggatccgaattctaaacttatgccaggacagggggagccgcttagcgatcctgcaagctataggcggctggttggaaaattaaattatctcacagtgactagacccgatatttcttatcctgtaagtgttgtgagtcgatttatgaattctccctgtgatagtcattgggttgcagttgtccgcattattcggtatataaaatcggctccaggcaaagggttactgtttgaggatcaaggtcatgagcagatcgttggatactcagatgctgattgggcaggatcaccttctgatagacgttctacgtctggatgttgtgttttagtaggaggcaatttggtgtcttggaagagcaagaaacagaatgtagttgctcggtctagtgcagaagcagaatatcgagcaatggctatggcaacatatgagctagtctcgaccaaacaattgctcaaggagttgaaatttggtgaaatcaatcggatggaacttgtgtgcgataatcaagctgcccttcatattgcatcaaatccggtgttccatgagagaactaaacacattgagattgattgtcacttcgtcagagaaaagatactttcaggagagattgctacaaagtttgtgaggtcgaatgatcaacttgcagatattttcaccaagtctctcactggtcctcgtattggttatatatgtaacaagctcggtacatatgatttgtatgcaccggcttgagggggagtgttagtttacagctatgtatatagtgtagtcttgtctcacattggaataggagtagtatgtccttgtatagtatagctataaataagacagtactaacgtcccttttgccgggggttctgcatctttaaatagatgcacgtggttccatagcagaccgtgttgatcacagatcgtgctgcatcctcttcccagcggactcggtgagcccctcttgtattgtattgaacatccaatatcaataacatattttctctcgtgctttctcacaggtctgtgatgtacccttgaaaggttcaagagtttggaggaagatagaaactctgtttatctcccaatcatccaaagatcttctaaagttccagttccatccttgtgagctccagactgacttaccaatgcttggctttgaagacttagagagaataagtcaggaaaaatctttcaaccttccttgccctatccggtgatcttcccaaaaagatgtcttcaacccattgccaacattgatcctgatattgctactgaaagatttcttttggtggcaggattactctcattaacaatgtacttgacaatctccatacatacgaatgtctctttaccctcttgccattaaggttgtaaagagacttgtcaaattaagaagaggtttcctatggaactgtttcaaggaaggaacctcctttcctttggtcaagtggagttaagtcatataatctaggaagtggagacttgggtataaaatagctgcaactacagaaaaggagcatcttatttaaatgatcacgcaaatgtgcccaaaactttaaatatctgcggagcatatggttgtagcaaaatttgaatcttccggtcaatgttgctcatgtccagtgaatacccctgatggtgaaagtgtcctgaagggaagcaggaacttattggaggaattggcatttaacactcagcatttcgttaggtcatagcccgctgaaaattgagtgcccagatttatatagttttgctctaaactgacgatgcagttgcacaacatacgacaaactaaggtgggacatcttcttcggaaggaattttgaggattaagagatagagtggttgattcagttgcaaatgaagcttcaagggttcaatatcatccaggagacaccggattctgatagataaaacaacagaaagatgaacactactttgttaggcttgttacaagttgctatcgtctttcttatctcggcacacaatttagatttgggaacttatttggaaaatagagtggttgtttttgtgaatagcatcagacaaagcttctgagctggtacgacagaaaactcaacagggagaataaaagactgtggttcacgatttctgcatgcatcttgtaggttatttggtgggtaaaatatttaatgttttgaagggaaggtagaacatgttcataggcttagattcaaatgtttgtatttttttggctctttggtgagagatgctgaatgtaaatgacataggcagctgactataatttctcagctccttgctttttaaattggcaggcactgatatgtacatgtgaacatccaacacttttgtggtgccgttccgatgaataaagcacattaatcacttactgatcaggagtaatagtttaggagttctagaatttttgtacataaaatgaaccaaaaagaatatcggaatgagaacatgtttctttttttgtttcttctttttcgtacaaatttcaataacacttctgatagaatagctaggtccatttgaattcctttggagacccttacacaaccaatgaatggcaagtatagcattttctaacaccctcccacatgtataatccagtttttagggtttagatgtggatttgatttgaccttattgcctttttttgtttttgttctttttgaagtagagagtgaggaggctcacaacgacgggctacgtagagcgagattaattcggctcaacgggctaatgattggacttacatgctacaacaatgttaggagaaagagagagagagagagagaagcccagagcagttccacgagttaagaaagagaagtccaaagcgattgaatatgaagagagaaagcggttgtgctaacaggctccctcaagtttggctctgagcatccaactcaaaaccttaaggcaatgagtagagtagcccaggaccatttaaactcctgttgaaaaccttacacaaccaataagggaacaagtgtaacattctcttacaaccctaccgtcttataagtcagggctctaatttagcataaaatcaaagtgaggcgatctactatgaaatgaagaaaataactgataaatataaagaatgttaattctcccatatagcctgaatgttcccagaacaaaataaattagtctcatgatttatcattaacatgatgttcctcttattttgagtgattaggaaggttaatcaaggagtaaattctttctaatttgtatcgtctagaattatttgtctaacaaattttcagattaccggtgatcaaaagaggaaaatattttgcatacaacgttaccataccttacaaaagggcgatgaacatttttttattttattattgtcctttttttcaattaggggttatgcagtcttcctccacgtgatattactcttagaatcacgtttttgtcattgctattacttactgtggtaagtacaaatgtgttttgaactctttttggtatgtattattgagttaatttttcgtttccatttcagagctgccgctttatcttctgctgggcatcttttgtggcttagtttcagtggcattatcaagttgtacatcatttatgctgcaaatagtggaaaatattcaaatgaccagcggcatgccaaaagcagcttttcctgtcctgggcggtcttctggttgggctggtagctttagcatatcctgaaatcctttaccagggttttgagaatgttaatattctgctagaatctcgcccactagtgaaaggcctctccgctgatctgttgctccagcttgtagctgtcaaaatagtaacaacttcattatgccgagcctctggattggttggaggctactatgcgccatctctattcatcggtgctgctactggaactgcatatgggaaaattgttagctacattatctctcatgctgatccaatctttcatctttccatcttggaagttgcatccccacaagcttatggcctggtatgaatttgtcttttgttagaagtagcattacatatctggataagtgagttttttattattgaaaagtaataacaggagaacaagagaatatatcacccaaatctacttctttcctctcttctattcttctgaaattcaaggtcctttaactcctccacagtctgtctagttattgatcctgtagacttaattcacataggtttaggacattcgagtttatccaaacttcatgaaaaggtttctaatttttttacattacattatgagtcgtgtctacttgagaaacatatcactccatgtttctatagtctgttttctccttagtttattctgatatgtggggtcctattaagtcagttcaaccttgtattttcattatttttgcagtatcattgataattattcaagatgtacttggattttctttacaagagatagttctcagttgttttttgtgttcctaagtttttatgctgcaatacaaaattggtttgatgtctctatttgcatttttcccaatgataatgccttagaatattttcttttccgtttcagtagcttattatttctttaggaactctttatcagaaatctcaactgagatagatgagaggaagaataagcatatcattggtctcattcagtcccctgtcaagcttagtttcttgagcgatgcggtttcacgtccttttattagattaattggatgcctcatctgctatccaaaatcagttaactttcgatattgtttcctcgcttacctttatactctctttccctcgagtctttgggagcacatgttttgttcaataacatagctcctggaaagtgaccagcgcaaccgacaaacaaggccttcttaatgtagaaggtggacatatgctattctagccacgggaaagaaagtaatattgtaatcaaacccaaatatctgagtataacctttggcaatggcgatcaatttgattatatggaccaactttgcctgcatatacccaccgacaaccaataatagatttaccgggaggtagagaaacaagctcccaaataccactaatatgtaaagcagatatatctctgatcatagcttgtccttgtggacatagggatagaaattaaggacaaagatgacacaaaagcataatgcggtgatgataaacgatgataactcaaatcaatataatggggatggggattgagagtggatcgaatatctttgcggaatgcgattggtagactaggaggagagaagtctgtggacatgatgttggactgagatcaataataagtcaagaatggtggagctacagaacatggaactggagctgtaggtgacataatcggagctgtaggaggtggagctatagaggaaggtgaaggagagatagcgactgaatctccaaaagatgaaaccggtaatacctcaaaaaatgtctaagagatcatttggacctatgaagtatgattgcgtttttaaaaaggtaacatcataaggtcaggtgaataacattgatatccccgttgcatcctcgagtaacttagaaatatacatttgagagcacggagagctaacttatcttttctggagcaaggttgtaaacaaaacacgtgctcccaaagacacgaggtggaagagagaaaggtgagtggggaaacaagacagaggatgaaacttgactcttgatagttgaagatgacatacaattaataagacaataggatgtgagatccaatgacagttctcatgaactgctgaaatggagaagacaaatactctggggcgttatcactacgaaatgtgcagttagaaaccccaaattgattttggatttcagtgtggaaggtctaaaaaatagagaacaactcagattgatttttcatcaagaatatccaagtggacttggaataatcatcaatgaaactgacaaagtagcggaattccaaggtagaactaacccgacaaggaccccaaacatctgaatggactaaagtgaaaggtaactctacccgattatcaggatgtcgagggaaatgagagtgagtatgccttctgagcggatatgactcacgctctagagtggacaagtgagacaaacgaggtactattttctaaagttctgataaattgggatgtcctaactgtatatgtaataaatctggtggatcagtaaaaggacaagctgtagggggaaaaaaataccaaatatttccagaagatggcaaactacaacagaagatgcaactgcattaacatgctcaggataggtgatgaaatcattgaggacaaagagttgatcaagaaggagattctggaattttaccagaacttatatagtgaaaatgaaccctggaggcgcagtgcaaatttcgaagacatctcctcactaagcatagaagagaagaactggttggaagctccatttgtagaaatagaggtgcttgaagctttgaaatcatgtgccccttataaagcaccaggtccagaaggcttcactatggatttctttcagaaaaattgggatactcttaaaacagacatcatggctgcacttaatcattttcaccagagctgtcacatggttagggcttgcaatgccaccttcattgccctaattccaaagaaaaatggtgctatggagctcagagactacagacctattagcttgacaggtattgtatacaaattggtttcaaagattttagcagagaggctcaagaaggtaattgacaaactagtctcgggggaacaaaatgctttcatcaagaacaggcagatcactgatgcttccttgattgccaatgaagtgctggattggagaatgaaaagtggagaaccaggcgtgttgtgcaaactggacattaaaaaggcttttgatcaattaagctggtcttacctcatgagtatcttgaggcagatgggctttggggagaaatggagaagatggataaactattgcatttcaactgtcaagtactctgttttggtgaatagggacccaatcggttttttctccccccaaaagggcctaaggcagggggatcccctctcccccttcctattcattctggcgatggaaggactcactaaaatgttggagaaggctaagcaactgcaatggatacaaggctttcaggtgggaaggaatcctgccagctcagttacagtatctcatctactctttgcggatgatactcttattttctgtggtactgagagatcacaagcacgaaatctcaacctgacactgatgatcttcgaggcactatcaggactccacatcaatatgataaagagcatcatataccctgtgaatgcagtccccaacatacaagagctagcagacatcctatgccgcaaaacagacactttcccaaccacatatcttggacttcccttgggagctaaattcaaatcaaaagaagtttggaatggagtcctagagaagtttgaaaagaggcttgcgacttggcaaatgcaatacctccccatgggtggcaggttaactttaatcaatagtgtactggacagtcttcccacataccacatatctttgttcccaattccaatctcagtcctaaagcagatggacaaactcagaaggaagttcttatgggaaggatgcagcaaaacacacaaatttccactagtgaaatggctgaaggtaactcaaccaaaattcaaaggagtcttgggaatcagggatgctatgctcttaaaatggctctggagatatggacaggaggaatctaggctatggaaggacatcatatttgctaaatatggagcacacaaccactggtgttccaagaaaacaaactctccttatggagttggtctgtggaagaacatcagcaaccactgggatgaattcttccaaaatgtaactttcaaagttgggaatgtaactcgtataagttttggaaggatagatggcttggaaatacacctttgaaagacatgtttcccagtatgtatcagattgccgtgaccaaagactccactgttgctcataatagaaacaatgacacttggtacccacttttcagaagaaatttgcaggattgggaggtcaacaacctactcacaatgttaagctccctagaatgtcataacattgaagatcaacaacctgacaaacttatttgggaaaattctaagagaggcaagtacacagtcaaagaatgatacattcacctctgtgaccagaatccaatatataactggccatggaaacatatctggagaactaaagtgcctaccaagatgacttgcttcacatgattgtctctaaatggggcctgtctcactcaagacaacttaatcaagaggaacatcatataagttaatagatgctacatgtgccaacaacagtcagaaagtgtaaagcacttattccttcactgctcagttgcaaaagaaatttggaacttcttctacactacctttggtctaaaatgggttatgccacaatcaactaagcaagcttttgaaagttggtatttttggagagttgataaatccattagaaaaatctggaaaatggtgtcggccgcaagtttttggtgtatttggaaagaaaggaactgaagatgttttgatggcatatcaactccactcaaggctgcgtgtttagttaacttattttgctggaactatctcacccctgttaatagtgctgatacttctgtggatttcattagccccctgatagtagcataggcttttgtaaatggagctaattatcctttctcttttgtactctttgcatcttcttgatgccttttaatgaatctaatttacttcatcaaaaagaaaatgacaagttgttgaaggaggaaaagatgtgagtccatgtgatttagcaaggataaggtactaaagtccatttgattcacgtccggtaccaatgatccgtctcgtgctgcattcctgtattaaaacagagtcatcaagaaataaaatagagcaaataagtgattggccaagcgactagtggatatgagattaaaaggactatggggaacataaaaaactgaattcaaaggtaaggaaggaagtggactagcttaacctattctagttgccatggtttgagaatcgttggccattgtgactattggaagtgattgagagtaagaaatagtagtgaaaggagatttgttacccgaaatataattagatgcacctgaatcaatgacccaaaagtcggaagaagaggaaacacaagtcacgctattacctgtttgaacaatagagattagtttggatcaaatagttgtatagagaactgaaatttggagaaatcaatcatatagaacttgtatgtgattattgttgccctttatattgcgtcaaatcctaaaacacattgagattaactgccacttatcacagaaaagatattctctagagacattgttacaatttcatgaagtcaagtaattagcttgaacatatcttcagcaagtccctcgtcagtcctcatattagttacatttgtaacaatgtcggtacataagacttataagcaccagtttgaggaggagtggtagagagttgatgtacatagttaaagtagatatacttacacttagtgttatgtaaagagtggatataaaaagggatcagcataagacaattgtcttcgcgcgtcttaacatttttttcctgtctttatttctctcatggtatcagataacctatctctatcttggtttacccaatggttggcccccatattgtattagccatgctccagttgactaggcttggacgggcagaggtgttaaattatcccatattggttgaaagaatgagctattgtctccttatatggtcttagacaattctccaactcatgagatattttgttttggctgagttagccctaaggtttattttttgtcatattctttaaccttatggcaatgcttgtacacggaaaaaccggagtgcaagacttaaattaggagaaggaaactattgaaggtgaggaacttaaagggttgtgagaatacacgggagaaaaaaatcttaatactatctagtggccttgtatatcaaatgatcagcttgcaaatattttcaccaagtccctcactggtcctcgtattagttacatatgtaacaagttcggtatatatgatttgtatgcaccggcttgaggttatgcatattctattcctcctactatatatgtgactaggaaatattttactcctactgcatatgggactaggactatttacacataactatctaacattcccctcaagccagtgcacacaagtcatatgtaccgagcttgttacatatgtaactaatacgaggaccagtgagggatttagtaaaaatatctgcaagctggtcattcgacatacaaggccactagactccccccgagcaacaaaaccaggtggttgctgataaacagaaactggccgaaaagttgccggaaaaatttgaaaatagtgagactaagccgaattctacactacaaaataggttctaaaacaccaccagaaaacaaaaacttttctagaaattactcttcacaccggaaaaaataaaagttgtcagaatttgatgtaatttatatagataggttcggaatcactggaggagtaagttgtcccgaagaagttttgtcaaaaagtggccggaatggctcacatgcgccggaaaacttactgtagctcgcaggaaccctagttctggcggtgcgtggaggcgcgtgacttaagattaagatgcttacaggactatcttgagaaatatacatattatatagacgcttgagttgcttcccaatcctaaatagaagcttttattcgtaggcaagaagggaagcagctttacttgagccaatagctttcaaggtgcacgttgtcacaccaaggacatccagaatttgattttatagggggtgtgagaaagcacgggagaaaatatgttattgatatttggataataaatacaatacaagaggtccctatttatagctatacactacaaggagatattactcctcttccaatgtgggacaagaatacactatacatatctgtaaactaacactccccctcaagtcggtgcatacacatcatatgtaccgatcttgttacacatgtagctaatacgagaaccaataagagacttagtgaaaatatctgctagttgatcattcgactttacaaactttgtaacaatatctcctgaaagtattttttctctgacaaagtgacagtcgatctcaatgtgtttagtcctctcatggaacaccggatttgacacaatatgaagagtagcttggttatcacacattagttccatcttgctgatttctccgaattttaactccttgagcaactgcttgacccaaaataactcacacgtcgtcatagccatggcccgatattcggcttcggcgctagatcgagcaactacattctgtttcttgctcttccacgagaccaaattacctcctactagaacacaatatccagacatagaacgtctatcaaaaggtgatcttgcccaatcagcatctgtgtacccaacaatctgctcgtggccttgatcctcgaatagtaatcctttgcccggagctgactttatataccgaagaatgcgaacaactgcatcccagtgactatcacagggagaatccataaactgacttacaacactcaccggaaaagaaatgtcaggtctagtcactgtgaggtaattcaatttgccaaccaacctcctatatctcgtagggtctctaagaggctccccctgtccaggcagaagcttagcattcagatccataggagagtcaataggtctgcaacccatcattccagtctcctcaagaatgtctaagacatacttccgctgtgaaataacaatacctgagctagactgagcgacctcaatacctaaaaaatacttcaatctgcccagatccttagtctggaagtgctgaaagagatgttgcttcagattagtaataccatcctgatcattgccagtaataacaatatcatcaacataaatcactagataaatacacagattaggagcagaatgccgataaaacacagagtgatcagcctcactacgagtcataccgaactcctgaataattgtgctgaacttaccaaaccaagctcgaggggactgtttcaaaccatatagtgacctgcgcaatctgcacacacaaccattaaactcccctaagcaacaaaaccaggtggttgctccatataaacttcttcctcaagatcactgtggagaaaagcattcttaatgtctaactgataaagaggccaatgacgtacaacagccatggacaaaaagagacgaacagatgctactttagccacgggagagaacatatcactataatcaagcccaaaaatctgagtatatccttttgcaacaagacgagccttaaaccgatcaacctggccatccggaccgactttgactgcataaacccaacgacaaccaacagtagacttacctgcaggaagaggaacaagctcccaagtgcaactcgcatgtaaagcagacatctcgtcaatcatagcatgtcgccatcctggatgagatagtgcctcacctgtagacttagggatagaaacagtggacaaagaagatataaaagcataatgaggtgacgacagacgatgataacttaaaccgacatagtggggattaggattaagtgtggatcatacacctttgcggagtgcaattggttgactaagaggagacaagtccgcagtaggtgcagaatctgatgcggggcgtgaatcacctgggcctgatgctggatatggacgacgatgataagtcaagagtggtggagctgccgaaggttgaactggattatgtggaggaactggagctataggtggtggagctacaactggagctgtaggtggtggaactagagtaactgaatctccaaaagatgaaactggtagtacctcagaaatatctaagtgatgacctgaacctgtgaagtatgattgggtttcaaagaaggtaacatcagcagacataaggtactgctggaggttaggagagtagcatcgataccccttttgtgttctcgagaaacctagaaatacgcacttaagagcacgaggagctaacttatccgttcctggaataaggttatgcacaaaacaagtgcttccaaagatacgaggtggaagagagaacaaaggtaagtggtaaaacatgacagagaatggaacttggttctggatagctgatgatgtcatacgattaataagatagcaagatgtaagaactgtatcccccaaaaacgcaacggagcatgagattgtatgagtagggtacgagcagtttcaataaaatgtctattctttctttcagctaccccattttgttgagatgtgtacagacaagatgtttgatgaataatcccatgagatttcataaactgctgaaatggggaagacaaatactctcgggcattatcactacgaaatgtgcgaatagaaaccccaaattgattttgaatttcagcgtggaaggtctggaaaatagaaaacagctcagatcgattttttatcaaaaatatccaagtgcacctggaataatcatcaatgaaactgacaaaatagcagaatcccaaggtggaactgacccgactaggaccccaaacatctgaatggactaaagtaaaaggtgactctgctcgattatcaagacgcctaaggaaatgggagcgagtatgcttaccgagctgacatgactcacactctagagctgacaagtgagataaaccagataccattttctgaagttttgacaaactgggatgtcccaaccgtttatgtaataaatctggtgaatcagtaacaggacatattgtagatggaagacaagatgcgagtccatgtatttagcaaggataaggtaataaagtccgtttgattcacgcccggtaccaatgatccgccccgtactgcgttcttgtataaaaacatggtcatcaagaaataaaataacgcatttaagtgatttggctaagcgactaacaactatgagattaaaaggactattgcgaacataaaggactgaatctaaaggtaaggaagaaagtgggcttgcttgacctattgcagttgccatggtttgagacccattggctattgtgacttttggaaaagattgagaatacgaaatagtagtgaaaagagatttgttaccagaaatatgatctgatgcacctgaatcaatgacccaagactcagaggatgaagattgggaaaaacaagtcacgctattacctgtttgaacaacagaagctatctcagaagatgtctgcttacatgctttgtactaaaggaactcaatataatctgctaaagaaaccatccgactattcaaagcatcggttcccatgtcgctacaatttgtagtagtagggttaacttgaaatagtggaaataagtaactccggtgagaaaactgaagaaatagcttgaaaacactgtttacaacagtaaaaacagaacactgttctgcgccggaatctactgtagctgacggaaaaactcaaagtagtcggaatgaaacgaaaaacagtaggggtaggatcggaattaccaggcgacccaactattctgaaggaagtttttcaaaaaatggccggaagtggtcgtacgtgtcggcgcgtgagctcacgcgcgtgagcttctggtggcgcgtggaggcgcgtgaggaggctgctgccggagattttcactggggtttggtcgccggacagtgactactcttgtggtagtgttggattttgcacaacactgacggagataaagcagacgcaaacagccttgaaaaagtcgccggaaaagacttccggtgactgatttctcttcctggaatcgctggaatttatgcacagcgataaatctctcacaattgctctgataccatgtgagaaagcatgggagaaaatatgttattgatatttggataataaatacaatacaagaggtccctatttatagctatacactacaaggagatattacttctcttccaatgtgggacaaaaatacactatacatatctgtaaactaacaaggggaatatcgtttaaagataaaaaagatagcgtgcagaagattgcatacattagagatgcaaaatacagaatacccatactcccagataatgcagtatgccttttgcatgacccactggttgaatggaagcacctggtcaatttactaggtgtgttagtgatttttgctgcttccttcccctttctaaactacatactatctaaaatgttagggggacagaagcccagtcaatctgactaggtgatgttagtggtttccgcttctttctcccacttctaaatgcgtactttctcaaatttaggagcatagaaacttaagcagctgcctacctgaggaggtgcatgggaacataagagaatagactttacctgtcatattttccataccttagttaattacagtgttatcctgataatgatctgttttctgtatctaggctgaatcgagattcaatcgcttttggctgaaaggatgctgctacagatccttagtttacatcattgtggttcttattctataagtacttcccctatcaactacttccttcttttttcttaggttatttgcctcttaggttgtttgcaaggaaaggaacaatagatgttttgatggaatagcaactccaaaccacttccttaaggctaatatactgtttggccaagcttcttcaaagtccaaagcccttttttgtcttcaaaaaagtatctttttttcccaaagttgaggtgtttggccaaacttttggaaggaaaaaaaagtgcttttgagtaaagcagaagctcttgagaagtagaaaaagtagttttttcccggaagcatttttttgaaaagcacttttgagaaaaataaacttagaaacactttttaaaagtttggccaaacactaattgctgcttaaaagtgtttttcagatttattagccaaacacaaactgcttctcaccaaaagtacttttttgaaaaatacttttttgaaaagtgattttcaaacaaagcacttttcaaaataagtttattttagaagcttgtcaaccggctataaatgtcttttatttttacagctagagtaccctaacacctgtaaattcccctagacatttttttcgactttgttagctcattaaccctagtataggactctttgttttggagctagcaaactcttttgttttcctatttttgcatcttcttggtgccatttataatatctcttacttcaccaaaaaaaataagttcccaaaatatgactaccttgagttggccaaagcataaccaaagcttgggcacaccagtgtttgcgtgaattttatggatgttccttacctttatccttctgtgcttatgtagcatctgtcttggttaatcttttctgaagtctatagtgtatttctgtgttgcaacatgagtttactgtcaatcttactgtttgacctcaattttgggttctttttgattttgaaagacatcgtttaacaggttggcatggctgctactcttgctggtgtctgtcaggtgcctctcactgctgttttgcttctctttgaactgacacagaattatcggatagttctgcccctcttgggagctgtggggttgtcttcttgggttacatctggacaaacaaggaaaagtgtagtgaaggatagagaaagactaaaagatgcaagagcccacatgatgcagcgacaaggaacttctttctccaacatttctagtttaacttattcttcaggtgtgaaaccttcacagaaagagagtaacctatgcaaacttgagagttccctctgtctttatgaatctgatgatgaagaaaatgatttggcaaggacaattctagtttcacaggcaatgagaacacgatatgtgacagttctaatgagcaccttgctaacggagaccatatccctcatgctagctgagaagcaatcttgtgcaataatagttgatgaaaataattttctcattggtctgctgacacttagtgatatccagaattacagcaagttgccaagagcagagggcaatttccaggaggtagcttcttggtacatttcaatattcttaactgatgaaaaaataagggaaattgatctagcatgaaattaagctaattataagttttacactgtagaactggtaaaacagggttggctggatatttctttgttgaatttttaggattatatgtattgttttagttttgtaggttgttttctgatgtgctttttgacttggcagaatcttaagatgaaatggaaggtgtttaaccaaaaaatagaattttcagtcaaagcctatatttagaagaaaacgggttattgataaccaagttttactttacttccccaacaatctatttggtaaatagcaaaagtaatgcgtatgtgagaaagcacgggagaaaatatattattgatattagatattcaatataatacaagaggtcctacacatcatatagctatagtctacaaactacatattactctcattccaatgtgggactacacataactaacactccccctcaagccggtgcatacatatcatatgtaccgagcttgttacacatgtaactaatacgagaaccagtaagagacttagtgaaaatatctgctagttgatcatttgactttacaaactttgtaaaaatatctcctgaaagtattttttctctgacaaagtaacagtcgatctcaatgtgtttagtcctctcatggaatagcggatttgacgcaatatgaagagcagcttggttatcacacaccagttccatcttgctgatttctccaaactttaactccttgagcaactgcttgacccaaactaactctcacgttgccatagccattgcccgatattcgacgtcggcgccagatcgagcaactacattctgtttcttgctcttccacgagaccaaattacctcctactagaacacaatatccaggcgtagaacgtctatcaaaaggtgatcctgcccaatcagcatttgtgtacccaacaatttgctcgtggcctcgatcctcgagtagtaatcctttgcttggagatgactttatataccgaagaatgcgaacaactgcatcccagtgactatcacagggagaatccataaactgacttacaacactcaccggaaaagaaatgtcaggtctagtcactgtgaggtaattcaatttgccaaccaacctcctatatctcgtagggtctctaagaggctccccgtgtctaggcagaagcttagcattcggatccataagagagtcaataggtctgtaacccatcattccagtctcctcaaaaatgtctaaggcataattccgctgtgaaataacaatacctgagctagactgaggcactgagcaacctcaatacctagaaaatacttcaatctgcccagatccttagtctggaagtgctgaaagagatgttgcttcagattagtaatatcatcctgatcattgccagtaataacaatatcatcaacataaaccactagataaatacacagattaggagtaaagtgccgataaaacacagagagatcagcctcactacgagtcatggcgaactcctgaataattatgctgaacttaccaaaccaagctcgaggggactgtttcaaaccatataatgacctgcacaatctacacacacaaccattaaactccccctgagcaacaaaaccaggtggttactccatataaacttcttcctcaagatcaccgtggagaaaagcattcttaatgtctaactgataaagaggccaatgacgtacaacagccatggacaaaaagagacgaacaaatgctattttagccacgggagagaaagtatcactataatcaagcccaaaaatctgagtatatccttttgcaacaagacgagccttaagccgatcaacctggccatccgggccgactttgaccgcataaacctaatgacaaccaacattagacttacctgcaggaagaggaacaagctcccaagtgccactcgcatgtaaagcagacatctcgtcaatcatagcatgtcgccatcctggatgagatagtgcctcacctgtagacttagggatagaaacagtggacaaagaagatataaaagcataatgaggtgatgacacacgatgatgacttaaaccgacatagtggggattaggattacgtgtggatcgtacgcctttgcggagtgcaattggttgactaagaggagacaagatcgtagtaggtgcagaatctgatgcagggcgtgaatcacttgggcatgatgttggatgtggacgacgatgataagtcaagagtggtggagctgcagaaggttgaactggattatgtggaggaactggaggtggagctacaactggagctgtaggtggtggaactggagctataagtggtggagctacaactggagctggagatgtagaggaagatgaatgagagatagtgactgaatctccaaaaaataaaattggtagtacctcagaaatatctaagtgatgacatgaacctgtgaagtatgattgagtttcaaagaaggtaacatcagcggacataaggtaccgctgaaggtcaagagagtagcatcgataccccttttgtgttctcgagtaacctagaaatacgcacttaagagcacgaggagctaacttatctgttcctggagtaaggttatggacaaaacaagtgattccaaagatacagggtggaagagagaacaaaggtaagtggggaaacatgacaaagaatggaacttggttttggataactgaagatggcatacgattaataagatagcaagatataagaactgcatccccccaaaaacgaaacggagcatgagattgtatgagtagggtacgagcaatttcaataagatgtctattttttctttcagctaccccattttgttgagatgtgtacagacaagatgtttgatgaataatcccatgagatttcataaactgctgaaatggggaagacaaatactctcgggcattatcactaggaaatgtgcgaatagaaaccccaaattgattttgaatttttagcgtggaaggtctggaaaaatagaaaacaactcagatcgattttttatcaaaaatatccaagtgcaccttgaataatcatcaattattcaataaaactgacaaagtagcagaatcccaaggtggaactgacccgactaggaccccaaacatttgagaatggactaaagtaaaaggtgactctgcttgattatcaagacgccgagggaaatggaagcgagtatgcttatcgaactgacatgactcacactctagagctgacaagtgagataaaccagataccattttatgaagttttgacaaattgggatgtcccgaccgtttatgtaataaatttggtgtattagtaacaggacaagttgttgaaggaagacaagatgtgagtccgtgtgatttagcaaggataaggtaataaagtccgtttgattcacgtccggtaccaataattcgtcccgtactgcgttcctgtataaaaacatggtcatcaagaaataaaacaacgcatttaagtgatttggctaagcgactaatagttatgagattaaaaggactattgggaacataaatgactgaatataaaggtaaggaaggaagtgagcttgcttgacttattgttgttgccattgtttgagacctattggccattgtgactcttgaaagagattgaaaatacgaaatagtagtgaaaagagatttgttaccagaaatatgatctgatgcacctgaatcaatgacccaaaactcagatgatgaagattgggagaaacaagtcacgctattacctgtttaaacaacagaagctatcacagaagatgtctgcttacatgctttgtaccgaaggaactcaatataatctgctaaagaaaccatccgactattcaaagtatcggttcccatgtcgctacaatttgtagtaataggatggatagactcggaaaattgtaaagttatcggaatttgtcgtaaccaggatcgagcaagctgtcttgaagaaatggtttcaaaaaatgtccggaaaggtcacttttacgccggaaaaatataaaaatggtcgaaatttgatttgaattagatgggtaggctcggaattgtgaggagagcagactgtcctgaagaagcttaatgaaaaaatggccggaaagtggccggaaccctcgccgtaaaagttgttaccggcgcgtgaaggcgcgtggcattttttctgccagataaattttcaggggttggtcgtcggagggtgatcccttgtggtggtgttggtttttgcacaataccgacaggccttaggtcacccgaaaatttgcacgatgactaagttctttcttcccggttaacgctggaatgacgcacatcgatcttttctcactaatgctatgataccatgtgagaaagcacgggagaaaatatattattgatattagatactcaatataatacaagaggtcatatttatagctatagtctacaaagtacatattactctcattcaaatgtgggactacacataactaacaacgtaaattaacaaagagaaataaggaatgtaacaacagtcaatccctaaaatcaaggtagaaaactttgataaagcagagaattatagaatgtatttcagtagtacttggaacttgtccttacaaataaaattctttatccttatataggggcgtacaatcataacatttttcgcacttaattcgaattcattatgagcattaattgtattgattgcccgttatcatagataaccataactgacgtatttgtaactataaatgccttataacggctctgattccccttccttatttacttctggtttgtgtatctttccttctttttagcctttattcattcagttctcgcctcttctttgacaactgtcaagcccgatcctctgttctgtactgtctcgtgggtgtttcccccgtaccttccttatattcttaattctgttaattgagagtgtcacttgtcactatgccattgttccacgcgtcatgtttcatccacgtgtaatatcttttttccaccaatacagataatcccccactttctgaatattctcaactgaatattcgggtaagtttttatggcgggaattctttgccgtcgtttttcgagtatcatcgtgtcatcttcagaaccgatgtgacgtacgtcacgtctatttaatgcctatgccaggtggcttctatcgattggctctgcagttttttagcgctttttagggtttttcagcggctgcgtcagtcacgaagtgacggttccattatgacgcttcataatgactaactttaatgatggtcgtgtcttcttattaatacttcattcctttttgatctcttggagtcttccttcttcagtatccaccacattacttctttgtatttctgcatcttctctttgatattcctttggacaatcatgtcttcttctacaccagacccccgtaaggttgtgattgttgacgaacttgatctttctactgctcctactagaagtaggagaggtggtagacttcgtagtcttggttcactatctaatcgtggttcttcttcccagggtagtgctgctaagccatcttcttctagacctagggctcctttaacccctagatcttcttctaggaatagagatttaaatgatccagtgcgcgaacctacagttgcagagattgttcctcaagaattttcttttgtaactgaccgtgaaaccataaggaatcaaatttcttctatagcctccctcaataccgctaacctttatccaagtttaatcagtaatggtcttctctcccgggttcgaagagaatattactgaaaccagatttcccaattttagtccctggtgccaaccagagaattactccataccatgttggtttttcctttgtttacacctacccttttactttagggttcaaaccacctattgaaccagtaatcattgaattctgtcgttatttcaacgtgtgtcttggccagattgaccacatagtatggagggctgttcatgccttcgttatttatcagatttggtttccatgcctttcacttttcagcacttgcttcatctctactcccctaaattgtttcgtgaagtagtttttactctcgtggctagaagtaagagagtgttggttagccttgaagacgattgggaccgtggctggtacgctcgttttgttgctgctcccactagtgcattagtgggtgaagaaaatatgcctttcccggagaaatggaactttgcacgtaagctttcttctcctctttttttttgtcttaaaaaaactccatgtaatcatatacccacttcttcagcaactatggaagttttttatgcttgggtagaaaagatgttaactgctgcgcctatggagaaaagatcctggaaatacttttctcaaagatttggttggaaagtgaagacgcacggtactttttaccttcattgtttttccttttctcttccttgtttgttcaatgatttctcatccttccctttttttttactagggtttccgattcgtggtattagtcccgcgtctgttccatcaactaggctttccgtgattcttgttcaggaaagaattttaagtgcttcttcttcaaaaaggaaaactgacggagcccgtggctctgatgacgaagaagaaacagaggagggttctttggtgcgaaggtcacgcgtcaggagacgcgtggtttctgatgatgaaactactccttctcatgaccctctatctagttcaatcccttttagactcacggatgagctagagagtacccctttagtgatttcttatgatgatgctgttgatccccctccaagttctgttgatagattgtttgctcatggcttcgagggtgatgaagttttgggcctgtttctgaagaattgccccttgcttcccttccagtttcagttttcattaacccttccgtgtccttacctgatgatactcctgttgttattctcgtggctgcttctactccgtcatctattcccgtgactgcttctcatgcagaggccaaaccttctagcagcagaagggcaatgaaaagagttgttgttgaggttcctgaaggtgagaacttattaagaaaatccggtcaagccgacgtgtagttgaaacctatgctcggccccgtagagaagaagaagttagaaagccatagctcactcactttaatgaatgatatcgttcattcttccttgaaagtacaagcttaattatatttcctttcttttctctttcttattcataactcttcctccttttttgcagatcaacttgattggcacagagcttatgaaaagagtttctcaggcggaccggcaagttatagatttgcgcaccgaggctgataactggaaggaacaattcgaaggtcttcaattggaaaaagaggttccggcggaagagaagaatgctttggaacaacagatgagagtgattgcctctgaattagcagttgaaaaagcttcctcgagccaggttggaaaggataagtatatacttgaatcctcctttgctgaacaactttccaaggcaactgaagaaataaggagtttgaaggaactccttaatcaaaaagaggtttatgcgagagaattggttcaaacacttactcaagttcaggaagatctccgtgcctctacttataagattcagttcttggaaagttctctcgcttctttgaagacagcttacgatgcctctgaagcagaaaaagaagagctgagagctgagatttaccagtgggagaaggattatgagattctcgaggataatctatcgttggatgtaagttgggctttcttaaacactcgtctcgagactctagttgaagccaaccatgagggttttgaccttaatgctgagattgctaaggctaaagaagcaattgataaaactcagcaacgtcaaatcttttcctcacctgaagacgaaggtcccgaaggtgatggagattga
SEQ ID NO:12(来自普通烟草的NtCLCe的蛋白质序列；序列源于祖先美花烟草；两个起始密码子，由SEQ ID NO:10转译)
MISGQNTVLHNPPNSLFNSLSPRHICISFCNDKALKKSVTHSAPRFARLLNNESRKLLGRHPNCWPWARRPSLPPGRSSDGNIEKEQDMCDSSKVDSDSGIQIGSLLEEVIPQGNNTAIISACFVGLFTGISVVLFNAAVHEIRDLCWDGIPYRAASEEPIGVHWQRVILVPACGGLVVSFLNAFRATLEVSTEGSWTSSVKSVLEPVLKTMAACVTLGTGNSLGPEGPSVEIGTSVAKGVGALLDKGGRRKLSLKAAGSAAGIASGFNAAVGGCFFAVESVLWPSPAESSLSLTNTTSMVILSAVIASVVSEIGLGSEPAFAVPGYDFRTPTELPLYLLLGIFCGLVSVALSSCTSFMLQIVENIQTTSGMPKAAFPVLGGLLVGLVALAYPEILYQGFENVNILLESRPLVKGLSADLLLQLVAVKIVTTSLCRASGLVGGYYAPSLFIGAATGTAYGKIVSYIISHADPIFHLSILEVASPQAYGLVGMAATLAGVCQVPLTAVLLLFELTQDYRIVLPLLGAVGLSSWVTSGQTRKSVVKDREKLKDARAHMMQRQGTSFSNISSLTYSSGSPSQKESNLCKLESSLCLYESDDEENDLARTILVSQAMRTRYVTVLMSTLLMETISLMLAEKQSCAIIVDENNFLIGLLTLGDIQNYSKLPRTEGNFQEELVVAGVCSSKGNKCRVSCTVTPNTDLLSALTLMEKHDLSQLPVILGDVEDEGIHPVGILDRECINVACRALATREQLC
SEQ ID NO:13(来自普通烟草的NtCLCe的蛋白质序列；序列源于祖先绒毛状烟草；一个起始密码子，由SEQ ID NO:4转译)
MCDSSKDDSDSDSGIQIGSLLEEVIPQGNNTAIISACFVGLFTGISVVLFNAAVHEIRDLCWDGIPYRAASEEPIGVHWQRVILVPACGGLVVSFLNAFRATLEVSTEESWTSSVKSVLGPVLKTMAACVTLGTGNSLGPEGPSVEIGTSVAKGVGALLDKGGRRKLSLKAAGSAAGIASGFNAAVGGCFFAVESVLWPSPAESSLYLTNTTSMVILSAVIASVVSEIGLGSEPAFAVPGYDFRTPTELPLYLLLGIFCGLVSVALSSCTSFMLQIVENIQMTSGMPKAAFPVLGGLLVGLVALAYPEILYQGFENVNILLESRPLVKGLSADLLLQLVAVKIVTTSLCRASGLVGGYYAPSLFIGAATGTAYGKIVSYIISHADPIFHLSILEVASPQAYGLVGMAATLAGVCQVPLTAVLLLFELTQNYRIVLPLLGAVGLSSWVTSGQTRKSVVKDRERLKDARAHMMQRQGTSFSNISSLTYSSGVKPSQKESNLCKLESSLCLYESDDEENDLARTILVSQAMRTRYVTVLMSTLLTETISLMLAEKQSCAIIVDENNFLIGLLTLSDIQNYSKLPRAEGNFQEINLIGTELMKRVSQADRQVIDLRTEADNWKEQFEGLQLEKEVPAEEKNALEQQMRVIASELAVEKASSSQVGKDKYILESSFAEQLSKATEEIRSLKELLNQKEVYARELVQTLTQVQEDLRASTYKIQFLESSLASLKTAYDASEAEKEELRAEIYQWEKDYEILEDNLSLDVSWAFLNTRLETLVEANHEGFDLNAEIAKAKEAIDKTQQRQIFSSPEDEGPEGDGD
SEQ ID NO:14(来自普通烟草的NtCLCe的蛋白质序列；序列源于祖先绒毛状烟草；两个起始密码子，由SEQ ID NO:11转译)
MISGQNTVLHHPPNSLFNSLSPRHICVSFCNDKALKKSVTHSAPRFARLLNNESRKLLGRHPNCWPWARRPSLPPGRSCDGNIEKEQDMCDSSKDDSDSDSGIQIGSLLEEVIPQGNNTAIISACFVGLFTGISVVLFNAAVHEIRDLCWDGIPYRAASEEPIGVHWQRVILVPACGGLVVSFLNAFRATLEVSTEESWTSSVKSVLGPVLKTMAACVTLGTGNSLGPEGPSVEIGTSVAKGVGALLDKGGRRKLSLKAAGSAAGIASGFNAAVGGCFFAVESVLWPSPAESSLYLTNTTSMVILSAVIASVVSEIGLGSEPAFAVPGYDFRTPTELPLYLLLGIFCGLVSVALSSCTSFMLQIVENIQMTSGMPKAAFPVLGGLLVGLVALAYPEILYQGFENVNILLESRPLVKGLSADLLLQLVAVKIVTTSLCRASGLVGGYYAPSLFIGAATGTAYGKIVSYIISHADPIFHLSILEVASPQAYGLVGMAATLAGVCQVPLTAVLLLFELTQNYRIVLPLLGAVGLSSWVTSGQTRKSVVKDRERLKDARAHMMQRQGTSFSNISSLTYSSGVKPSQKESNLCKLESSLCLYESDDEENDLARTILVSQAMRTRYVTVLMSTLLTETISLMLAEKQSCAIIVDENNFLIGLLTLSDIQNYSKLPRAEGNFQEINLIGTELMKRVSQADRQVIDLRTEADNWKEQFEGLQLEKEVPAEEKNALEQQMRVIASELAVEKASSSQVGKDKYILESSFAEQLSKATEEIRSLKELLNQKEVYARELVQTLTQVQEDLRASTYKIQFLESSLASLKTAYDASEAEKEELRAEIYQWEKDYEILEDNLSLDVSWAFLNTRLETLVEANHEGFDLNAEIAKAKEAIDKTQQRQIFSSPEDEGPEGDGD
SEQ ID NO:13(来自普通烟草的NtCLCe的蛋白质序列；序列源于祖先绒毛状烟草；一个起始密码子，由SEQ ID NO:4转译)包括
P184S突变
MCDSSKDDSDSDSGIQIGSLLEEVIPQGNNTAIISACFVGLFTGISVVLFNAAVHEIRDLCWDGIPYRAASEEPIGVHWQRVILVSACGGLVVSFLNAFRATLEVSTEESWTSSVKSVLGPVLKTMAACVTLGTGNSLGPEGPSVEIGTSVAKGVGALLDKGGRRKLSLKAAGSAAGIASGFNAAVGGCFFAVESVLWPSPAESSLYLTNTTSMVILSAVIASVVSEIGLGSEPAFAVPGYDFRTPTELPLYLLLGIFCGLVSVALSSCTSFMLQIVENIQMTSGMPKAAFPVLGGLLVGLVALAYPEILYQGFENVNILLESRPLVKGLSADLLLQLVAVKIVTTSLCRASGLVGGYYAPSLFIGAATGTAYGKIVSYIISHADPIFHLSILEVASPQAYGLVGMAATLAGVCQVPLTAVLLLFELTQNYRIVLPLLGAVGLSSWVTSGQTRKSVVKDRERLKDARAHMMQRQGTSFSNISSLTYSSGVKPSQKESNLCKLESSLCLYESDDEENDLARTILVSQAMRTRYVTVLMSTLLTETISLMLAEKQSCAIIVDENNFLIGLLTLSDIQNYSKLPRAEGNFQEINLIGTELMKRVSQADRQVIDLRTEADNWKEQFEGLQLEKEVPAEEKNALEQQMRVIASELAVEKASSSQVGKDKYILESSFAEQLSKATEEIRSLKELLNQKEVYARELVQTLTQVQEDLRASTYKIQFLESSLASLKTAYDASEAEKEELRAEIYQWEKDYEILEDNLSLDVSWAFLNTRLETLVEANHEGFDLNAEIAKAKEAIDKTQQRQIFSSPEDEGPEGDGD
CLC-Nt2-s对应于SEQ ID NO.5中所示的多肽序列，所述SEQ ID NO.5由SEQ IDNO:1编码
CLC-Nt2-t对应于SEQ ID NO.6中所示的序列，所述SEQ ID NO.6由SEQ ID NO:2编码
NtCLCe-s对应于SEQ ID NO.7中所示的序列，所述SEQ ID NO.7由SEQ ID NO:3编码
NtCLCe-t对应于SEQ ID NO.13中所示的序列，所述SEQ ID NO.13由SEQ ID NO:4编码
表2
靶基因 正向引物(5'至3') 反向引物(5'至3')
CLCe-s TATCTCCTCGCCATATCTGTA GTGCAAACACACTTGTATTTAC
CLCe-t ACCATCTCTTCCTCCGGGA TATAGGATACTCCTCTGATAAAT
CLCe-t TTGTACAATTTATCAGAGGAGTA TTGGTTTGAGTGCAAACACA
CLCNt2-s ACTATATCGAGGATAGAAGGTA TATCTATTTATACATCTGGTTCG
CLCNt2-s CTTGTGATCCATCACTTCCC TATGACTATTTCTGTGCATCTTT
CLCNt2-s GCCTTGTGATTCATCACTTCAA TATGACTATTTCTGTGCATCTTA
CLCNt2-t GGTTCTTCTCGCTCTGAGC AACGTAAAATAACTTTGCCACG

Claims (26)

1.一种突变型、非天然存在的或转基因植物细胞，其包含：
(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性；
(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；
(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性；或
(iv)包含(i)中所示的经分离的多核苷酸的构建体、载体或表达载体，
其中与含有所述对照植物细胞的所述对照植物相比，所述多核苷酸或多肽的表达或活性被调节，其中含有所述对照植物细胞的所述对照植物相比，在含有所述突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的所述突变型、非天然存在的或转基因植物中的生物量水平被调节。
2.根据权利要求1所述的突变植物细胞，其中所述突变型、非天然存在的或转基因植物细胞包含一个或多个突变，与含有对照植物细胞的对照植物相比较，所述一个或多个突变增加含有突变型、非天然存在的或转基因植物细胞的突变型、非天然存在的或转基因植物中的硝酸盐水平。
3.根据权利要求1或2所述的突变植物细胞，其中所述突变包含在SEQ ID NO:13的位置P184处的删除、插入、取代或错义突变。
4.根据权利要求3所述的突变植物细胞，其中所述突变是取代突变。
5.根据权利要求4所述的突变植物细胞，其中所述突变是P184S，如SEQ ID NO:15中所示。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的突变型植物细胞，其中所述突变是杂合性的。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的突变型植物细胞，其中所述突变是纯合性的。。
8.一种突变型、非天然存在的或转基因植物或其组分或部分，其包括根据权利要求1至7中任一项所述的植物细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的突变型、非天然存在的或转基因植物、植物组分或植物细胞，其中硝酸盐含量经过另外调节。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的突变型、非天然存在的或转基因植物、植物组分或植物细胞，其中4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)含量经过另外调节。
11.根据权利要求9或10所述的突变型、非天然存在的或转基因植物、植物组分或植物细胞，其中所述突变进一步包括在SEQ ID NO:5的位置P163和/或SEQ ID NO:13的位置P143处的删除、插入、取代或错义突变。
12.根据权利要求11所述的突变型、非天然存在的或转基因植物、植物组分或植物细胞，其中所述在SEQ ID NO:5的位置G163处的突变是替代突变G163R和/或所述在SEQ IDNO:13的位置P143处的突变是替代突变P143L。
13.一种用于调节植物或其组分的至少生物量含量的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)调节下述的表达或活性：
(i)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性；
(ii)由(i)中所示的多核苷酸编码的多肽；或
(iii)包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的多肽，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性；或
并测量所述突变的生物产量；
(b)任选测量步骤(a)中获得的突变型、非天然存在的或转基因植物的至少一部分中的至少硝酸盐含量；和
(c)鉴定与对照植物相比较，其中至少所述生物量含量已改变的突变型、非天然存在的或转基因植物，在所述对照植物中，(a)中所示的所述多核苷酸或所述多肽的表达或活性未被调节。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述植物中的硝酸盐含量经过另外调节。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述植物中的4-(N-甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)含量被调节。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述植物中的尼古丁含量经过另外调节。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中至少N-硝基烟碱(NNN)含量与对照植物基本相同。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述植物的组分是叶，适当地，是烘烤的叶。
19.一种植物或其组分，所述植物或其组分通过根据权利要求13-18中任一项所述的方法获得或可获得。
20.植物材料，所述植物材料包括来自根据权利要求8或19中任一项所述的植物的生物量、种子、茎或叶。
21.一种烟草植物，其包括根据权利要求1所述的植物细胞、根据权利要求8或19中任一项所述的植物的至少一部分，根据权利要求20所述的植物材料，或根据权利要求20所述的经过适当处理的植物材料。
22.一种包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的分离多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQID NO:4或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少60％的序列同一性。
23.一种构建体、载体或表达载体，其包括根据权利要求22所述的多核苷酸。
24.一种分离的多肽，其由根据权利要求22所述的多核苷酸编码。
25.根据权利要求23所述的包含序列、由序列组成或基本上由序列组成的分离多核苷酸，所述序列编码CLC氯化物通道家族的成员，并且具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少60％的序列同一性。
26.一种植物或其中一部分，包括在CLC基因的适当纯合性突变，如SEQ ID No.15中所示。
CN201580033181.0A 2014-06-25 2015-06-24 通过氯化物通道的异位表达调节植物中的生物质 Pending CN107074919A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14173987 2014-06-25
EP14173987.0 2014-06-25
PCT/EP2015/064308 WO2015197727A2 (en) 2014-06-25 2015-06-24 Modulation of nitrate content in plants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107074919A true CN107074919A (zh) 2017-08-18

Family

ID=50980251

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580033181.0A Pending CN107074919A (zh) 2014-06-25 2015-06-24 通过氯化物通道的异位表达调节植物中的生物质

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20170145431A1 (zh)
EP (1) EP3160988A2 (zh)
JP (1) JP2017520249A (zh)
KR (1) KR20170020416A (zh)
CN (1) CN107074919A (zh)
AP (1) AP2016009665A0 (zh)
AR (1) AR101243A1 (zh)
BR (1) BR112016029591A2 (zh)
CA (1) CA2952534A1 (zh)
IL (1) IL249334A0 (zh)
MX (1) MX2016016875A (zh)
PH (1) PH12016502433A1 (zh)
RU (1) RU2017102191A (zh)
SG (1) SG11201610240UA (zh)
WO (1) WO2015197727A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113136389A (zh) * 2021-04-16 2021-07-20 河南农业大学 基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的基因工程应用
CN113271768A (zh) * 2018-12-30 2021-08-17 菲利普莫里斯生产公司 经由硝酸盐还原酶的突变来调节植物中的硝酸盐水平

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3775224A1 (en) 2018-03-28 2021-02-17 Philip Morris Products S.a.s. Modulating amino acid content in a plant
EP3772911A1 (en) 2018-03-28 2021-02-17 Philip Morris Products S.a.s. Modulating reducing sugar content in a plant
JP2022550383A (ja) 2019-10-01 2022-12-01 フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 植物における還元糖含有量の調節（ｉｎｖ）
KR20220071260A (ko) 2019-10-01 2022-05-31 필립모리스 프로덕츠 에스.에이. 식물 내 당 및 아미노산 (sultr3) 함량 조절
WO2023036691A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Philip Morris Products S.A. Modulating alkaloid profiles in nicotiana tabacum
WO2023117661A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Increasing anatabine in tobacco leaf by regulating methyl putrescine oxidase
WO2023117701A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Philip Morris Products S.A. Modulation of nicotine production by alteration of nicotinamidase expression or function in plants
WO2023127723A1 (ja) * 2021-12-27 2023-07-06 日本たばこ産業株式会社 タバコ植物
WO2024079137A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Philip Morris Products S.A. Increasing leaf biomass and nitrogen use efficiency by regulating ntp2

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101952444A (zh) * 2007-12-21 2011-01-19 巴斯夫植物科学有限公司 产量提高的植物(ko nue)
CN102648282A (zh) * 2009-09-25 2012-08-22 巴斯夫植物科学有限公司 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2829904B1 (fr) * 2001-09-21 2004-07-16 Genoplante Valor Obtention de plantes sous-accumulant le nitrate
KR20120126061A (ko) * 2009-10-22 2012-11-20 재단법인 작물유전체기능연구사업단 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법
WO2011088065A1 (en) * 2010-01-12 2011-07-21 Monsanto Technology Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
GB201204862D0 (en) * 2012-03-20 2012-05-02 Cambridge Advanced Tech Transgenic plants
US10563215B2 (en) * 2012-12-21 2020-02-18 Philip Morris Products S.A. Tobacco specific nitrosamine reduction in plants

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101952444A (zh) * 2007-12-21 2011-01-19 巴斯夫植物科学有限公司 产量提高的植物(ko nue)
CN102648282A (zh) * 2009-09-25 2012-08-22 巴斯夫植物科学有限公司 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: ""PREDICTED: chloride channel protein CLC-e-like [Solanum lycopersicum]"", 《GENBANK登录号：XP_004231107.1》 *
NCBI: "PREDICTED: chloride channel protein CLC-e-like [Solanum lycopersicum]", 《GENBANK登录号：XP_004231107.1》 *
史宏志等: "不同产地和品种白肋烟烟草特有亚硝胺与前体物关系 ", 《中国烟草学报》 *
李春俭主编: "《高级植物营养学》", 30 November 2008, 中国农业大学出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113271768A (zh) * 2018-12-30 2021-08-17 菲利普莫里斯生产公司 经由硝酸盐还原酶的突变来调节植物中的硝酸盐水平
CN113271768B (zh) * 2018-12-30 2024-02-06 菲利普莫里斯生产公司 经由硝酸盐还原酶的突变来调节植物中的硝酸盐水平
CN113136389A (zh) * 2021-04-16 2021-07-20 河南农业大学 基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的基因工程应用
CN113136389B (zh) * 2021-04-16 2023-02-14 河南农业大学 基因GhCLCg-1A和/或GhCLCg-1D的基因工程应用

Also Published As

Publication number Publication date
BR112016029591A2 (pt) 2017-10-24
WO2015197727A9 (en) 2016-05-12
EP3160988A2 (en) 2017-05-03
RU2017102191A (ru) 2018-07-25
AP2016009665A0 (en) 2016-12-31
KR20170020416A (ko) 2017-02-22
JP2017520249A (ja) 2017-07-27
IL249334A0 (en) 2017-02-28
WO2015197727A3 (en) 2016-03-10
US20170145431A1 (en) 2017-05-25
SG11201610240UA (en) 2017-01-27
MX2016016875A (es) 2017-05-01
RU2017102191A3 (zh) 2019-01-15
CA2952534A1 (en) 2015-12-30
WO2015197727A2 (en) 2015-12-30
AR101243A1 (es) 2016-12-07
PH12016502433A1 (en) 2017-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10415050B2 (en) Reduction of nicotine to nornicotine conversion in plants
US10563215B2 (en) Tobacco specific nitrosamine reduction in plants
CN103228671B (zh) 植物中的重金属减少
JP7129335B2 (ja) 圃場栽培植物体におけるカドミウム蓄積の低減
CN107074919A (zh) 通过氯化物通道的异位表达调节植物中的生物质
JP6225108B2 (ja) ニコチアナ・タバカムからのトレオニン合成酵素ならびにその方法および使用
RU2681497C2 (ru) Модулирование бета-дамасценона у растений
JP6810134B2 (ja) アスパラギン含有量を低減させた植物体
US11685929B2 (en) Plants with shortened time to flowering
EP3169149B1 (en) Tobacco protease genes
JP2018186820A (ja) ニコチアナ・タバカムからのイソプロピルリンゴ酸シンターゼならびにその方法および使用
EA041833B1 (ru) Уменьшение накопления кадмия в выращенных в поле растениях табака

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170818

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication