JP6225108B2 - ニコチアナ・タバカムからのトレオニン合成酵素ならびにその方法および使用 - Google Patents

ニコチアナ・タバカムからのトレオニン合成酵素ならびにその方法および使用 Download PDF

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Description

本発明は、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)からのトレオニン合成酵素遺伝子ならびにそのバリアント、ホモログおよび断片を開示する。特に、植物、例えばタバコ植物において遊離メチオニンレベルを増加させるための、この遺伝子の発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性の改変が開示される。タバコ中のメチオナールレベルを上昇させることによって、タバコの望ましい味と香りを作り出すために本発明を用いることができる。
タバコにおいてフレーバーの増加、例えば香りを作り出す物質の増加によって、タバコを吸うときの望ましい味を作り出すことができる。このようなフレーバーは、例えば、メイラード反応したアミノ酸から得ることができる。メチオナール、すなわち(3-(メチルチオ)プロパナール)は、”ベイクドポテト”の香りに関与するフレーバー化合物である。メチオナールの生成は、熱によって誘導されることができるが、ここでメチオナールはメチオニンおよびメチオニン誘導体から生じる。メチオニンのストレッカー分解は、メイラード反応において中間体であるα-ジカルボニル化合物との相互作用を含み、メチオナールの生成をもたらす。
植物において遊離メチオニン量を増加させるための種々の方法が開発されてきた。例えば、外因性アミノ酸を植物に添加することができる。しかしながら、外因的に添加されるアミノ酸の使用によって、製造コストの著しい増加ばかりでなく、安全性への懸念および規制事項が生じる。
メチオニンおよびトレオニンの生合成は、共に、アスパラギン酸経路と関連している。植物において、これらの生合成経路は、O-ホスホホモセリン(OPH)の段階で分岐している。酵素シスタチオニンγ合成酵素(CGS)とトレオニン合成酵素(TS)は、共通の基質であるO-ホスホホモセリンに対して競合する。遊離メチオニンレベルは、アスパラギン酸生合成経路に関与する酵素の過剰発現または発現の抑制によって増加する可能性がある。
1つの可能なアプローチは、シスタチオニンγ合成酵素の過剰発現である。もう1つのアプローチは、トレオニン合成酵素の発現の低下である。しかしながら、今日まで、トレオニン合成酵素遺伝子の改変に関する努力は、すべて、植物全体が悪影響を受ける表現型しかもたらさなかった。Bartlem et al. (2000) Plant Physiol., 2000, 123:101-110)は、アラビドプシス(Arabidopsis)植物のトレオニン合成酵素遺伝子における変異を記載している。トレオニン合成酵素をコードする遺伝子内の単一塩基対変異を含む開示された変異体は、メチオニンの過剰蓄積とトレオニンレベルの著しい低下を示した。しかしながら、開示されたアラビドプシスの変異体は、野生型と比較して低成長であるという欠点を有していた。この成長の阻害は、トレオニンまたはイソロイシンを添加したときにのみ救済することができる。
Zeh et al. (2001) Plant Physiol., 2001, 127:792-802 は、構成的カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを用いるアンチセンストランスジェニックアプローチによって作成されたトランスジェニックジャガイモ植物を開示している。開示されたトランスジェニックジャガイモ植物は、高レベルのメチオニンを示したが、一方で、これもまた野生型植物と比較して低成長であるという欠点を有していた。
Avraham et al. (2005) Transgenic Research, 2005, 14: 299-311 は、アンチセンストランスジェニックアプローチによって作成されたトランスジェニックアラビドプシス植物を開示している。開示されたトランスジェニック植物は、レベルが増加したメチオニンを示したが、かなりの成長遅延、ロゼット葉サイズの低下およびクロロティックリーフを含む異常性が強い表現型という欠点を有していた。
農学的に望ましい特定の特性(例えば植物の生長速度および全サイズ)を維持し、何ら外因性成分の添加を必要としないで、遊離メチオニンレベルを増加させる植物、例えばタバコ植物が求められている。この必要性を満足させることが本発明の目的である。
本発明は、少なくとも一部分において、植物または植物細胞(例えばタバコ植物または植物細胞)におけるトレオニン合成酵素の発現または活性の低下(例えば抑制)が、対照植物または植物細胞と比較して、植物細胞または植物の1以上の部分におけるメチオニン濃度の増加をもたらすという発見に基づく。驚くべきことに、対照植物と比較して、この遺伝子改変植物は、その全体の視覚的外観に何ら変化を示さない。トランスジェニックアラビドプシス植物またはジャガイモ植物において観察される種々の不利な表現型を考慮すれば、この発見は予期せぬものである。植物は、タバコを含む種々の製品の商業生産に利用されるため、視覚的外観の改変がその産業に許容されないと考えられるか、または容認できない収穫量の低下をもたらす恐れがある場合に、この発見は好都合に活用することができる。外因性アミノ酸の添加もまた必要としない。さらに、対照植物から製造されるタバコと比較して、このタバコの加熱によって放出されるエアゾールは、増加したメチオナールレベルを含む。タバコをすうとき、煙またはエアゾール中のメチオナールの増加によって、望ましいフレーバー、香りまたはフレーバーおよび香りの両方が生じる。
添付の特許請求の範囲において、本発明の側面および実施形態を説明する。
一側面において、トレオニン合成酵素をコードし、かつ配列番号1、配列番号2もしくは配列番号3に少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
他の側面において、トレオニン合成酵素をコードし、かつ配列番号4または配列番号5に少なくとも87%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
他の側面において、トレオニン合成酵素をコードし、配列番号20に少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
他の側面において、本発明のポリヌクレオチドのいずれか1つによってコードされる単離されたポリペプチドが提供される。
他の側面において、配列番号6、配列番号7または配列番号8に少なくとも95%の配列同一性を有する単離されたポリペプチドが提供される。
他の側面において、配列番号21に少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する単離されたポリペプチドが提供される。
他の側面において、本発明のポリヌクレオチドのいずれか1つ(例えば1以上、2以上、3以上または4以上)を含む構築物、ベクターまたは発現ベクターが提供される。
他の側面において、少なくとも1つの(例えば1以上の、2以上の、3以上のもしくは4以上の)ポリヌクレオチドまたは少なくとも1つの(例えば1以上の、2以上の、3以上のもしくは4以上の)ポリペプチドを含む変異植物細胞、天然に存在しない植物細胞またはトランスジェニック植物細胞が提供される。他の側面において、本発明に記載の植物細胞を含む変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物が提供される。適切には、1以上のトレオニン合成酵素コード配列の発現またはそれによってコードされるトレオニン合成酵素タンパク質の活性が低下し、タバコ植物の一部分が、トレオニン合成酵素の発現または活性が低下していない対照タバコ植物と比較して少なくとも5%のメチオニン含量の増加を有し、煙またはエアゾール中のメチオナール濃度が、対照タバコ植物からの煙またはエアゾールと比較して少なくとも5%増加している。
さらなる側面は、タバコ植物の少なくとも一部におけるメチオニンの濃度を増加させる方法であって、(i)タバコ植物において1以上のトレオニン合成酵素(例えば、2以上、3以上または4以上)の発現または活性を低下させる段階であって、好ましくは、トレオニン合成酵素が本明細書に記載のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含む前記段階；(ii)段階(i)で得られた変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物の少なくとも一部におけるメチオニンの濃度を測定する段階；および(iii)対照植物と比較してその中のメチオニンの濃度が増加している変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物を同定する段階を含む前記方法に関する。好ましくは、一定期間後、例えば畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物の全体の視覚的外観は対照タバコ植物と実質的に同じである。
一実施形態において、外因性栄養素、例えばアミノ酸、例えば、トレオニンおよび／またはイソロイシンの添加を必要としない。
他の側面において、前記方法によって得られたか、または得ることができる変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物もしくはトランスジェニックタバコ植物または前記植物から誘導されたか（前記植物由来）、もしくは誘導されることができる（前記植物由来として得ることが可能な）タバコ植物材料が提供される。
他の側面において、1以上のトレオニン合成酵素コード配列(例えば、2以上、3以上または4以上)の発現またはそれによってコードされるトレオニン合成酵素タンパク質の活性が低下し、タバコ植物の一部分が、トレオニン合成酵素の発現または活性が低下していない対照タバコ植物と比較して少なくとも5%のメチオニン含量の増加を有するか、または対照タバコ植物からの煙またはエアゾールと比較して煙またはエアゾール中のメチオナール濃度が少なくとも5%増加している変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物もまた提供される。
適切には、前記植物の全体の外観は、一定期間後、例えば限定するものではないが畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物と実質的に同じであるか、または視覚的に区別がつかない。好ましくは、(i)変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物の幹の高さは、一定期間後、例えば限定するものではないが畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照タバコ植物の幹の高さと実質的に同じであるか；(ii)変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物のクロロフィル含量は、一定期間後、例えば限定するものではないが畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照タバコ植物のクロロフィル含量と実質的に同じであるか；あるいは(i)および(ii)の両方である。
適切には、植物の一部分(例えば葉)のトレオニン濃度は、対照植物と比較して増加しており；好ましくは、(a)植物の一部分(例えば葉)のメチオニン濃度は少なくとも約0.03mg/gであるか；(b)葉のトレオニン濃度は少なくとも約0.5mg/gであるか；(c)加熱による煙またはエアゾールのメチオナール濃度は少なくとも約2000μg/gであるか;または(a)、(b)および(c)のうちの2以上の組み合わせである。
本明細書に記載の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物からの細胞または組織を含むバイオマス、種子または葉もまた提供される。本明細書に記載の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の一部分、そのバイオマス、またはその葉、またはそれらの組み合わせを含むタバコ製品もまた提供される。
他の側面において、メチオナールを製造する方法であって、(a)変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物もしくはトランスジェニックタバコ植物の一部分;バイオマス、種子もしくは葉;または本明細書に記載のタバコ製品を提供する段階;および(b)それらに熱を加える段階を含む前記方法が提供される。
他の側面において、加熱によるエアゾール中に増加したレベルのメチオナールを放出するタバコ材料を同定する方法であって、(a)タバコ材料の試料を調製する段階；(b)試料の分子量プロフィールを測定する段階；および(c)1以上の質量電荷比で分子量プロフィールを比較する段階であって、対照植物と比較しての質量電荷比の特定の増加が、エアゾール中のメチオナールレベルが増加することを示唆する前記段階を含む前記方法が提供される。
本開示の他の側面において、本方法によって同定されるか、または同定することができるタバコ材料もまた提供される。
本発明のさらなる側面を以下に述べる。
1以上の調節配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含むキメラ遺伝子。
少なくとも15〜30ヌクレオチド、30〜50ヌクレオチド、50〜100ヌクレオチド、100〜150ヌクレオチド、150〜200ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜500ヌクレオチド、500〜600ヌクレオチドまたは600〜700ヌクレオチドを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるNtTSポリヌクレオチド構築物。
本発明に記載の植物材料、バイオマス、種子または葉を組み込むかまたは用いる消費財。
本発明に記載の、(例えば1以上の、2以上の、3以上または4以上の)単離されたポリヌクレオチド、キメラ遺伝子、ポリヌクレオチド構築物、二本鎖RNA、コンジュゲートまたは発現ベクターなどを含む細胞株。
細胞において、NtTS DNAの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性を調節する方法であって、本発明に記載の(例えば1以上の、2以上の、3以上または4以上の)キメラ遺伝子、ポリヌクレオチド構築物、二本鎖RNA、コンジュゲートまたは発現ベクターを投与することを含む前記方法。
NtTSポリヌクレオチドを検出するか、単離するか、増幅するか、または解析する方法であって、ポリヌクレオチドを含む試料を提供する段階および、本発明に記載の単離されたヌクレオチド配列からの少なくとも10連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる段階を含む前記方法。
植物の少なくとも一部分において、対照植物と比較して、メチオニン含量を少なくとも5%低下させるための、NtTS DNAの発現およびそれによってコードされるタンパク質の活性またはそれによってコードされるタンパク質の活性を調節する薬剤の使用。
薬剤が、NtTS DNA、キメラNtTS遺伝子、NtTSポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物、アンチセンスRNA、二本鎖RNA、cDNA、NtTSポリヌクレオチドとそれに共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチドもしくは非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲート、リボザイム、突然変異原、ジンクフィンガー、小分子またはメガヌクレアーゼであるか、またはそれ由来である、本発明に記載の方法または使用。
他の実施形態において、ポリヌクレオチド断片(単数または複数)は、アンチセンス核酸、リボザイム、スプライソソーム媒介トランススプライシングを行うRNA、干渉RNA(RNAi)、ガイドRNAまたは他の非翻訳RNAなどをコードする。他の実施形態において、ポリヌクレオチド断片(単数または複数)はRNAiをコードする。
他の側面において、タバコ製品を製造する方法であって、(a)変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物から種子を得る段階；(b)種子をまき、植物に成長させる段階；(c)植物を収穫する段階；および(d)採取した植物からタバコ製品を製造する段階を含む前記方法が提供される。
前述の側面のそれぞれの実施形態として前記の実施形態が開示される。
メタノールで抽出し、WatersXBridge Shield RP18カラムで分離した後の、VC-4、TN90-4、NtTS1-3、NtTS2-3、NtTS3-2の乾燥葉のLC-MSプロフィールを示す図である。VC-4はベクターのみの対照植物であり、TN90は、バックグラウンドを提供する未修飾タバコ植物であり、NtTS1-3、NtTS2-3およびNtTS3-2は、RNAiサイレンシングされたトレオニン合成酵素遺伝子を有するニコチアナ・タバカム植物である。矢印は約5、9 17および19分におけるピークを示す。
定義
本願の範囲内で用いられる技術用語および表現には、一般に、植物および分子生物学の関連技術において一般に用いられている意味と同じ意味がそれらに付与されるものとする。以下の用語の定義のすべては、本願の全内容に適用される。”含んでいる(complising)”なる用語は、他の要素または段階を排除せず、不定冠詞”ある(a)”または”ある(an)”は、複数であることを排除しない。個々の段階は、特許請求の範囲に記載のいくつかの特徴の機能を満たすことができる。所定の数値または数値範囲との関係において、用語”約”、”本質的に”および”おおよそ”は、所定の数値または範囲の20%以内、10%以内、または5%、4%、3%、2%もしくは1%以内である数値または範囲のことを言う。
用語”単離された”は、その天然の環境から取り出された任意の実体のことを言うが、この用語は精製度のことを意味するものではない。
”ベクター”は、核酸、核酸構築物および核酸コンジュゲートなどの輸送を可能にするための核酸成分の組み合わせを含む核酸ビヒクルのことを言う。適切なベクターは、染色体外複製が可能なエピゾーム、例えば環状二本鎖DNAプラスミド;線状化二本鎖DNAプラスミド;および任意の起源の他のベクターを含む。
”発現ベクター”は、核酸、核酸構築物および核酸コンジュゲートなどの発現を可能にするためのDNA成分の組み合わせを含む核酸ビヒクルである。適切な発現ベクターは、染色体外複製が可能なエピゾーム、例えば環状二本鎖DNAプラスミド;線状化二本鎖DNAプラスミド;および任意の起源の他の機能的に同等な発現ベクターを含む。発現ベクターは、少なくとも、下記で定義する、核酸、核酸構築物または核酸コンジュゲートの上流に位置し、それに作動可能に連結されたプロモーターを含む。
用語”構築物”とは、1以上のポリヌクレオチドを含む二本鎖組換えDNA断片のことを言う。構築物は、相補的”センス鎖またはコード鎖”と塩基対を形成する”鋳型鎖”を含む。所定の構築物は、ベクター内、例えば発現ベクター内に位置するプロモーターの配向に対して2つの可能な配向、同じ(もしくはセンス)配向または逆(もしくはアンチセンス)配向のいずれかでベクターに挿入されることができる。
”プロモーター”とは、一般的に二本鎖DNA断片の上流に位置し、それに作動可能に連結された核酸エレメント/配列のことを言う。プロモーターは、天然の目的遺伝子に隣接する領域に完全に由来することもできるし、異なる天然プロモーターまたは合成DNAセグメント由来の異なるエレメントで構成されることもできる。
用語”相同性、同一性または類似性”は、配列のアラインメントによって比較された、2つのポリペプチド間または2つの核酸分子間の配列類似度を指す。比較される2つの別々の核酸配列間の相同性は、相当する位置における同一のまたはマッチングするヌクレオチド数の関数である。同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって計算できる。あるいはまた、2つの核酸配列の同一性パーセントは、コンピュータプログラム、例えばClustalW、BLAST、FASTAまたはSmith-Watermanを用い、配列情報を比較することによって決定することもできる。
用語”植物”とは、その生活環または発生の任意の段階における任意の植物およびその子孫のことを言う。一実施形態において、植物は、ニコチアナ(Nicotiana)属に属する植物であるタバコ植物である。タバコ植物の好ましい種、栽培品種、雑種および変種は本明細書に記載されている。
”植物細胞”とは、植物の構造的および生理学的単位のことを言う。該植物細胞は、細胞壁のないプロトプラスト、単離された単一細胞または培養された細胞の形態であることもできるし、限定するものではないが、植物組織、植物器官または全植物などの高度に組織化された単位の一部であることもできる。
用語”植物材料”とは、バイオマス、葉、葉身、中骨、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、挿し木、分泌物、抽出物、細胞もしくは組織培養物または植物の任意の他の部分もしくは産物を含む、植物から入手される任意の固体、液体もしくは気体組成物またはそれらの組み合わせのことを言う。一実施形態において、植物材料は、バイオマス、種子または葉を含むかまたはそれからなる。他の実施形態において、植物材料は、葉を含むかまたはそれからなる。
用語”変種”は、同じ種の他の植物とを隔てる共通の特性を有する植物の集団のことを言う。1以上の特有の形質を有すると同時に、変種はさらに、その変種内の個体間の大変小さな全般的な変異を特徴とする。変種は、多くの場合市販されている。
本明細書において、用語”系統”または”育種系統”とは、植物育種を通じて用いられる一群の植物を意味する。系統は、他の形質に関して個体間で何らかの変異を示す場合があるが、対象とする1以上の形質に関して個体間でほとんど変異を示さないため、変種とは区別できる。
本明細書において、用語”低下する”または”低下した”は、ある量またはある活性、例えば限定するものではないが、ポリペプチド活性、転写活性、および／またはタンパク質発現の約10%〜約99%、約10%〜約95%以下、約10%〜約90%以下の低下または少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは少なくとも100%以上の低下のことを言う。
本明細書において、用語”抑制する”または”抑制した”は、ある量またはある活性、例えば限定するものではないが、ポリペプチド活性、転写活性および／もしくはタンパク質発現の約98%〜約100%の低下または少なくとも98%、少なくとも99%の低下、特に100%の低下のことを言う。
本明細書において、用語”増加する”または”増加した”は、ある量またはある活性、例えば限定するものではないがポリペプチド活性、転写活性および／もしくはタンパク質発現の約10%〜約99%の増加または少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の増加または少なくとも100%、200%、300%、400%もしくは500%以上の増加のことを言う。
対照植物または対照植物細胞という文脈において、用語”対照”は、トレオニン合成酵素の発現または活性が改変されていない(例えば増加または低下されていない)植物または植物細胞を意味し、従って、対照は、トレオニン合成酵素の発現または活性が改変された植物との比較を提供することができる。対照植物は空ベクターを含むことができる。対照植物は野生型植物に一致することができる。
発明の詳細な説明
一側面において、配列表に示したポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載の配列のいずれかに少なくとも60%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。適切には、単離されたポリヌクレオチドは、それに少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。
一実施形態において、トレオニン合成酵素をコードし、かつ配列番号1、配列番号2および／または配列番号3に少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。適切には、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2または配列番号3に少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。配列番号1は、N.タバカム(N. tabacum)からのトレオニン合成酵素のDNA配列である。配列番号2は、N.タバカム(Hicks Broad Leaf種)からの単離されたRNAからの逆転写酵素(RT)-PCRによって増幅され、配列決定されたトレオニン合成酵素のDNA配列である。RT-PCR分析によって示されたように、この配列は、N.タバカムの2つの祖先の1つであるニコチアナ・シルベストリス(Nicotiana sylvestris)に存在する。配列番号3は、N.タバカム(Hicks Broad Leaf種)から単離されたRNAからのRT-PCRによって増幅されたトレオニン合成酵素のDNA配列である。
他の実施形態において、トレオニン合成酵素をコードし、かつ配列番号4または配列番号5に少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。配列番号4は、配列番号3のゲノムDNA配列に一致する。配列番号1と比較して、ATG開始コドンからの位置234に137bpのイントロンが位置している。配列番号5は、N.トメントシホルミス(N. tomentosiformis)からのトレオニン合成酵素のゲノムDNA配列に一致する。
他の実施形態において、トレオニン合成酵素をコードし、かつ少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%または90の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。適切には、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号20に少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。配列番号20はN.タバカムからのトレオニン合成酵素のDNA配列であり、配列番号1に85%の配列同一性を有し、配列番号2に86%の配列同一性を有し、配列番号3に86%の配列同一性を有する。
用語”NtTSポリヌクレオチド”は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号20に実質的相同性(すなわち配列類似性)または実質的同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、ニコチアナ・タバカムからのトレオニン合成酵素をコードするポリヌクレオチド；配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4配列番号5または配列番号20の断片を含むNtTSポリヌクレオチドの断片；および配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号20の対応する断片に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%または99%または100%の配列同一性を有する、それに実質的相同性(すなわち配列類似性)または実質的同一性を有する配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号20の断片に関する。例示的な断片は、配列番号9〜19に示されている。本明細書に記載されるように、バリアントは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号20の配列に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%または99%の配列同一性を有することができる。また、NtTSポリヌクレオチドは、トレオニン合成酵素として機能するポリペプチドをコードする、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号20に十分なまたは実質的な程度の同一性または類似性を含む配列を含む。一実施形態において、用語”NtTSポリヌクレオチド”は、本明細書において配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号20と呼ぶポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるヌクレオチドのポリマーのことを言う。
用語”ポリヌクレオチド”は、未改変または改変デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)であることができるヌクレオチドのポリマーのことを言う。従って、ポリヌクレオチドは、限定するものではないが、ゲノムDNA、相補的DNA(cDNA)、mRNAもしくはアンチセンスRNAまたはそれらの断片(単数または複数)であることができる。さらに、ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるDNA、DNAおよびRNAを含むハイブリッド分子または一本鎖領域と二本鎖領域を混合して有するハイブリッド分子もしくはそれらの断片(単数または複数)であることができる。
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、一般にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、例えばホスホルアミダート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートまたはO-メチルホスホロアミダイト結合を含む代わりの主鎖；ならびにペプチドポリヌクレオチド主鎖および結合を有するポリヌクレオチドアナログが含まれる。他のアナログポリヌクレオチドは、陽性主鎖;非イオン性主鎖および非リボース主鎖を有するものを含む。リボース-リン酸骨格の改変は、種々の理由によって、例えば、生理学的環境におけるこのような分子の安定性および半減期を増すために、あるいはバイオチップ上のプローブとして行うことができる。天然に存在するポリヌクレオチドとアナログの混合物を作成することができる。あるいはまた、種々のポリヌクレオチドアナログの混合物ならびに天然に存在するポリヌクレオチドとアナログの混合物を作成することができる。
種々のポリヌクレオチドアナログ、例えば、ホスホルアミダート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、O-メチルホスホロアミダイト結合を含むアナログならびにペプチドポリヌクレオチド主鎖および結合を含むアナログが既知である。他のアナログポリヌクレオチドは、陽性主鎖、非イオン性主鎖および非リボース主鎖を有するものを含む。1以上の炭素環式糖を含むポリヌクレオチドもまた含まれる。
他のアナログは、ペプチドポリヌクレオチドアナログであるペプチドポリヌクレオチド(PNA)を含む。これらの主鎖は、天然に存在するポリヌクレオチドの高度に荷電したホスホジエステル主鎖とは対照的に、中性条件下では実質的に非イオン性である。これによって利点をもたらすことができる。第1に、PNA主鎖は、改善されたハイブリダイゼーションキネティクスを示すことができる。PNAは、ミスマッチ塩基対に対する完全にマッチした塩基対に関して融解温度(Tm)においてより大きな変化を示す。DNAとRNAは、一般的には、内部ミスマッチ1つに対してTmの2〜4℃の低下を示す。非イオン性PNA主鎖に関しては、この低下は7〜9℃に近い。同様に、それらの非イオン性の性質のため、これらの主鎖に結合した塩基のハイブリダイゼーションは、塩濃度に比較的非感受性である。さらに、PNAは、細胞酵素によって分解されないか、またはより低い程度でしか分解されず、従ってより安定であることができる。
開示されたポリヌクレオチドおよびそれらの断片の組み合わせの使用には、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブまたは核酸増幅アッセイにおけるプライマーとしての断片の使用がある。このような断片は、一般に、少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20またはそれ以上のDNA配列の連続ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、DNA断片は、少なくとも約10、15、20、30、40、50または60またはそれ以上のDNA配列の連続ヌクレオチドを含む。従って、一側面において、プローブおよび／またはプライマーの使用を含むNtTSポリヌクレオチドを検出する方法もまた提供される。例示的なプライマーを配列番号10〜14に示す。場合により、前記プライマーはプローブとして使用することができる。例示的なプライマーまたはプローブは、配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号20の間で相同な領域にハイブリダイズすることができる。例示的なプライマーまたはプローブは、配列番号1、2および3のヌクレオチド1〜46；配列番号20のヌクレオチド1〜52；配列番号1のヌクレオチド99〜141；配列番号2および配列番号3のヌクレオチド102〜144；配列番号20のヌクレオチド102〜153；配列番号1、2および3のヌクレオチド1325〜1362または配列番号20のヌクレオチド1334〜1371にハイブリダイズすることができる。
ハイブリダイゼーション条件の選択に影響をおよぼす基本的パラメータおよび適切な条件を工夫するための手引きは、Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)に記載されている。遺伝コードの知識を本明細書に記載のアミノ酸配列と組み合わせて用い、縮重オリゴヌクレオチドのセットを作成することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、それによってDNA断片が単離され増幅されるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)におけるプライマーとして有用である。特定の実施形態において、遺伝子ライブラリーのためのプローブとして縮重プライマーを用いることができる。このようなライブラリーは、限定するものではないが、cDNAライブラリー、ゲノムライブラリーを含み、電子化したEST(発現配列タグ)またはDNAライブラリーさえも含む。次いで、この方法によって同定された相同配列は、本明細書において同定されたNtTS配列のホモログを同定するためのプローブとして用いられる。
本明細書に記載のNtTSポリヌクレオチドに、低ストリンジェントな条件下で、一般的には中程度のストリンジェントな条件下で、通常は高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド(例えばプライマーまたはプローブ)の潜在的使用もまた存在する。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響をおよぼす基本的パラメータおよび適切な条件を工夫するための手引きは、Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)に記載されており、当業者は、例えば、ポリヌクレオチドの長さまたは塩基組成に基づいて、容易に決定することができる。
中程度のストリンジェントな条件を達成するための1つの方法は、5xクエン酸緩衝液(Standard Sodium Citrate)、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム、1.0mMエチレンジアミン四酢酸(pH8.0)を含有する予洗液、約50%ホルムアミド、6xクエン酸緩衝液のハイブリダイゼーション緩衝液を用い、ハイブリダイゼーション温度は約55℃(または他の同様なハイブリダイゼーション溶液、例えば約50%ホルムアミドを含有する溶液、約42℃のハイブリダイゼーション温度)、洗浄条件は、約60℃で0.5xクエン酸緩衝液、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを用いることを含む。一般に、高ストリンジェントな条件は、上記と同じハイブリダイゼーション条件で、おおよそ68℃で0.2xクエン酸緩衝液、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを用いて洗浄することと定義される。ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄用緩衝液において、クエン酸緩衝液(1xクエン酸緩衝液は0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸ナトリウムである)の代わりにSSPE(1x SSPEは0.15M塩化ナトリウム、10mMリン酸ナトリウムおよび1.25mMエチレンジアミン四酢酸(pH7.4)である)を用いることができる；ハイブリダイゼーション完了後、洗浄は15分間行われる。当業者に公知のように、さらに下記に記載されるように(例えばSambrookら(前出)を参照のこと)、ハイブリダイゼーション反応および二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって、所望のストリンジェンシーの程度を達成するために、必要に応じて洗浄温度および洗浄塩濃度を調整することができることが理解されるべきである。未知の配列の標的ポリヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる場合、ハイブリッド長さは、ハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さと仮定される。既知の配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズされる場合、ポリヌクレオチドの配列をアラインメントし、最適の配列相補性の領域(単数または複数)を同定することによってハイブリッド長さを決定することができる。長さ50塩基対未満と予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、そのハイブリッドの融解温度(Tm)よりも5〜10℃低くする必要がある。Tmは、下記方程式に従って決定される。長さ18塩基対未満のハイブリッドに関しては、Tm(℃)=2(A+T塩基数)+4(G+C塩基数)である。長さ18塩基対以上のハイブリッドに関しては、Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N)である(式中、Nはハイブリッドの塩基数であり、[Na+]は、ハイブリダイゼーション緩衝液(1xクエン酸緩衝液に関して[Na+]=0.165M)のナトリウムイオン濃度である)。一般的には、このようなハイブリダイズするポリヌクレオチドのそれぞれは、それがハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さの少なくとも25%(一般に少なくとも50%、60%、または70%であり、通常は少なくとも80%である)の長さを有し、それがハイブリダイズするポリヌクレオチドに少なくとも60%(例えば、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%)の配列同一性を有する。
当業者には当然のことながら、線状DNAは2つの可能な配向を有する。5'から3'の方向および3'から5'の方向である。例えば、同じポリヌクレオチド分子/鎖内で参照配列が5’から3’の方向に配置され、第2配列が5’から3’の方向に配置される場合、参照配列と第2配列は同じ方向に配向しているか、または同じ配向を有する。一般的には、所定のプロモーターの制御下にあるプロモーター配列および目的遺伝子は、同じ配向で配置される。しかしながら、同じポリヌクレオチド分子/鎖内で、参照配列が5’から3’の方向に配置され、第2配列が3'から5'の方向に配置される場合、参照配列と第2配列はアンチセンス方向に配向しているか、またはアンチセンス配向を有する。参照配列(5'から3'の方向)と参照配列(5'から3'に配置される参照配列)の逆相補配列が同じポリヌクレオチド分子/鎖内に配置される場合、互いにアンチセンス配向を有する2つの配列は、同じ配向であるか、あるいは同じ配向を有すると記載されることができる。本明細書に記載の配列は、5’から3’の方向に示されている。
本明細書で提供される組換え構築物は、NtTSタンパク質発現レベルを調節するために、植物または植物細胞を形質転換するのに用いることができる。組換えポリヌクレオチド構築物は、植物または細胞内でNtTSポリペプチドを発現するのに適した調節領域に作動可能に連結された本明細書に記載のNtTSポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。従って、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のNtTSポリペプチドをコードするコード配列を含むことができる。
組換えポリヌクレオチドによってコードされるNtTSポリペプチドは、天然NtTSポリペプチドであることもできるし、その細胞に対して異種であることもできる。場合によっては、組換え構築物は、調節領域に作動可能に連結されたNtTS調節ポリペプチドの発現を低下させるかまたは抑制するポリヌクレオチドを含む。適切な調節領域の例は本明細書に記載されている。
組換えポリヌクレオチド構築物、例えば本明細書に記載の組換えポリヌクレオチド構築物を含むベクターもまた提供される。適切なベクターバックボーンは、例えば、当該技術分野でルーチンに用いられるベクターバックボーン、例えばプラスミド、ウイルス、人工染色体、BAC、YACまたはPACを含む。適切な発現ベクターは、限定するものではないが、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルスおよびレトロウイルス由来のプラスミドベクターおよびウイルスベクターを含む。多数のベクターおよび発現系が市販されている。
また、ベクターは、例えば、複製起点、足場付着領域(SAR)またはマーカーを含むこともできる。マーカー遺伝子は植物細胞に選択表現型を付与することができる。例えば、マーカーは、殺生物剤耐性、例えば抗生物質(例えば、カナマイシン、G418、ブレオマイシンもしくはハイグロマイシン)または除草剤(例えば、グリホサート、クロルスルフロンもしくはホスフィノスリシン)への耐性を付与することができる。さらに、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作または検出(例えば精製または位置決め)を容易にするように設計されたタグ配列を含むことができる。タグ配列、例えばルシフェラーゼ、β-グルクロニダーゼ(GUS)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、ポリヒスチジン、c-mycまたは赤血球凝集素配列は、一般的には、コードされるポリペプチドとの融合体として発現される。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含むポリペプチド内の任意の位置に挿入されることができる。
植物または植物細胞は、安定的に形質転換されるようにそのゲノムに組み込まれた組換えポリヌクレオチドを有することによって形質転換されることができる。安定的に形質転換された細胞は、一般的には、各細胞分裂に際して導入されたポリヌクレオチドを保持する。また、植物または植物細胞は、組換えポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれないで一過性に形質転換されることができる。一過性に形質転換された細胞は、一般的には、各細胞分裂に際して、導入された組換えポリヌクレオチドの全部または一部を失うため、十分な細胞分裂回数後には、導入された組換えポリヌクレオチドは娘細胞において検出することができない。
植物細胞を形質転換するために、粒子銃、遺伝子銃技術、アグロバクテリウムによる形質転換、ウイルスベクターを用いた形質転換およびエレクトロポレーションを含む多くの方法が当該技術分野で利用でき、それらはすべて本明細書に組み込まれる。植物染色体への異種DNAの組み込みのためのアグロバクテリウム(Agrobacterium)系は、植物遺伝子工学のために、大規模に研究され、改変され、活用されている。センス配向またはアンチセンス配向で、調節配列に作動可能に連結された、目的精製タバコタンパク質に対応するDNA配列を含むネイキッド(naked)組換えDNA分子は、慣用法によって、適切なT-DNA配列に結合される。これらは、ポリエチレングリコール技術またはエレクトロポレーション技術(これらはいずれも標準技術である)によってタバコプロトプラストに導入される。あるいはまた、目的精製タバコタンパク質をコードする組換え核酸分子を含むこのようなベクターは、生きたアグロバクテリウム細胞に導入され、次いでそれはその植物細胞に該核酸を導入する。T-DNAベクター配列を伴わないネイキッドDNAによる形質転換は、エレクトロポレーションによって、タバコプロトプラストとDNA含有リポソームとの融合によって達成されることができる。T-DNAベクター配列を伴わないネイキッドDNAはまた、不活性高速マイクロプロジェクタイルによってタバコ細胞を形質転換するために用いることもできる。
形質転換のためのレシピエント組織として細胞または培養組織が用いられる場合、必要に応じて、当業者に公知の技術によって、形質転換培養物から植物が再生されることができる。
組換え構築物に含まれる調節領域の選択は、限定するものではないが、効率、選択可能性、誘導能、所望の発現レベルおよび細胞または組織選択的発現を含むいくつかの要素に左右される。コード配列に対して調節領域を適切に選択し、配置することによってコード配列の発現を調節することは、当業者にはルーチン化した事柄である。ポリヌクレオチドの転写も同様にして調節することができる。一部の適切な調節領域は、特定の細胞型において、転写のみを、または主に転写を開始する。植物ゲノムDNAにおける調節領域を同定し特徴付ける方法は当該技術分野で公知である。
適切なプロモーターは、種々の組織もしくは細胞型(例えば、根特異的プロモーター、苗条特異的プロモーター、木部特異的プロモーター)において存在するか、または種々の発生段階において存在するか、または種々の環境条件に応じて存在する組織特異的因子によって認識される組織特異的プロモーターを含む。適切なプロモーターは、特定の誘導因子を必要としないで大部分の細胞型において活性化されることができる構成的プロモーターを含む。NtTS RNAiポリペプチド産生を調節するための適切なプロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス35S(CaMV/35S)、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos、ユビキチンまたはファゼオリンプロモーターを含む。当業者は、組換えプロモーターの複数の変異を作成することができる。
組織特異的プロモーターは、栄養組織または生殖組織などにおいて植物の発生の特定の時期に特定の細胞または組織にのみ活性な転写調節エレメントである。組織特異的発現は、例えば、特定の組織におけるポリヌクレオチドの発現が好ましい場合に好都合であることができる。発生制御下での組織特異的プロモーターの例は、特定の組織、例えば栄養組織(例えば根もしくは葉)、または生殖組織、例えば果実、胚珠、種子、花粉、雌蕊、花もしくは任意の胚組織のみにおいて(または主としてそれのみにおいて)転写を開始することができるプロモーターを含む。生殖組織特異的プロモーターは、例えば、葯特異的、胚珠特異的、胚特異的、胚乳特異的、珠皮特異的、種子および種皮特異的、花粉特異的、花弁特異的、萼片特異的またはそれらの組み合わせであることができる。
適切な葉特異的プロモーターは、C4植物(トウモロコシ)からのピルビン酸正リン酸ジキナーゼ(PPDK)プロモーター、トウモロコシからのcab-m1Ca+2プロモーター、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)myb関連遺伝子プロモーター(Atmyb5)、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ(RBCS)プロモーター(例えば、トマトRBCS1、RBCS2およびRBCS3A遺伝子は葉および光照射下種苗において発現され、RBCS1およびRBCS2は発育中のトマト果実において発現され、あるいはリブロースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターは、葉身および葉鞘における葉肉細胞にほぼ限定的に高レベルで発現される)を含む。
適切な老化特異的プロモーターは、果実成熟、葉の老化および離脱に際して活性なトマトプロモーター、システインプロテアーゼをコードする遺伝子のトウモロコシプロモーターを含む。適切な葯特異的プロモーターを用いることができる。当業者に公知の適切な根優先的プロモーターを選択することができる。適切な種子選択的プロモーターは、種子特異的プロモーター(種子貯蔵タンパク質のプロモーターなどの、種子形成中に活性なプロモーター)および種子発芽プロモーター(種子発芽中に活性なプロモーター)の両方を含む。このような種子優先的プロモーターは、限定するものではないが、Cim1(サイトカイニン誘導性メッセージ);cZ19B1(トウモロコシ19kDaゼイン)；milps(ミオイノシトール-1-リン酸シンターゼ);mZE40-2(別名Zm-40);nuclc;およびcelA(セルロースシンターゼ)を含む。γ-ゼインは胚乳特異的プロモーターである。Glob-1は胚特異的プロモーターである。双子葉植物に関しては、種子特異的プロモーターは、限定するものではないが、マメβ-ファセオリン、ナピン、β-コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどを含む。単子葉植物に関しては、種子特異的プロモーターは、限定するものではないが、トウモロコシ15kDaゼインプロモーター、22kDaゼインプロモーター、27kDaゼインプロモーター、g-ゼインプロモーター、27kDa γ-ゼインプロモーター(例えばgzw64Aプロモーター、Genbankアクセッション番号S78780参照)、waxyプロモーター、shrunken 1プロモーター、shrunken 2プロモーター、グロブリン1プロモーター(Genbankアクセッション番号L22344参照)、Itp2プロモーター、cim1プロモーター、トウモロコシend1およびend2プロモーター、nuc1プロモーター、Zm40プロモーター、eep1およびeep2;lec1、チオレドキシンHプロモーター;mlip15プロモーター、PCNA2プロモーター;ならびにshrunken-2プロモーターを含む。
誘導性プロモーターの例は、病原菌攻撃、嫌気性条件、高温、光、干ばつ、冷温または高塩濃度に感受性のあるプロモーターを含む。病原体誘導性プロモーターは、病原体による感染後に誘導される病因関連タンパク質(PRタンパク質)に由来するもの(例えば、PRタンパク質、SARタンパク質、β-1,3-グルカナーゼ、キチナーゼ)を含む。
植物プロモーターに加えて、他の適切なプロモーターは、細菌起源、例えばオクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーターおよびTiプラスミド由来の他のプロモーター由来であることもできるし、ウイルスプロモーター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sおよび19S RNAプロモーター、タバコモザイクウイルスの構成的プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)19Sおよび35Sプロモーターまたはゴマノハグサモザイクウイルス35Sプロモーター)由来であることもできる。
用語”NtTSポリペプチド”は、ニコチアナ・タバカムからのトレオニン合成酵素をコードするポリペプチドのことを言い、配列番号1、配列番号2または配列番号3に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%、99%もしくは100%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるポリペプチドあるいは、配列番号4、配列番号5または配列番号20に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%,87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%、99%もしくは100%の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号20のNtTSポリヌクレオチド断片；ならびに配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号20の対応する断片に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%、99%もしくは100%の配列同一性を有する配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号20の断片を含む。例示的な断片を配列番号9〜19に示す。また、NtTSポリペプチドは、トレオニン合成酵素として機能する配列番号6、配列番号7または配列番号8に十分なまたは実質的な程度の同一性または類似性を含む配列を含み、配列番号6、配列番号7、配列番号8または配列番号21に少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む。配列番号6は配列番号1の翻訳配列である。配列番号7は配列番号2の翻訳配列である。配列番号8は配列番号3の翻訳配列である。配列番号21は配列番号20の翻訳配列であり、配列番号7、配列番号8または配列番号9に89%の配列同一性を有する。
一実施形態において、NtTSポリペプチドの断片はトレオニン合成酵素の活性を保持する。また、NtTSポリペプチドは、任意のタイプの改変(例えば、アミノ酸の挿入、欠失または置換;グリコシル化状態の変化;リフォールディングもしくは異性化、三次元構造または自己会合状態に影響を及ぼす変化)を導入することによって作成されるバリアントおよび変異体を含むが、それらは、なおトレオニン合成酵素として機能する限り、故意に操作されることも、天然から単離されることもできる。NtTSポリペプチドは、線状形であることもできるし、公知の方法を用いて環化することもできる。用語”NtTSポリペプチド”は、配列番号6、配列番号7、配列番号8または配列番号21に示した配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるポリペプチドを指すことができる。
他の側面において、配列表に示したポリペプチドのいずれかを含む本明細書に記載の配列のいずれかに少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる単離されたポリペプチドが提供される。適切には、単離されたポリペプチドは、それに少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。
NtTSポリペプチドは、任意のタイプの改変(例えば、アミノ酸の挿入、欠失または置換;グリコシル化状態の変化;リフォールディングもしくは異性化、三次元構造または自己会合状態に影響を及ぼす変化)を含むが、それらは故意に操作されることも、天然から単離されることもできる。該バリアントは、サイレント変異を生じ機能的に同等なタンパク質をもたらす改変を有することができる。その物質の二次結合活性が保持されている限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および/または両親媒性における類似性に基づいて人工的なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正に荷電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み、非荷電極性頭部基を有し類似した親水性値を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンを含む。例えば以下の表に従って保存的置換を行うことができる。第2列における同じブロックのアミノ酸、好ましくは第3列における同じラインにおけるアミノ酸を、互いに置換することができる。
Figure 0006225108
NtTSポリペプチドは、成熟タンパク質または未成熟タンパク質または未成熟タンパク質由来のタンパク質であることができる。NtTSポリペプチドは線状形であることもできるし、公知の方法を用いて環化することもできる。NtTSポリペプチドは、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30または少なくとも40連続アミノ酸を含む。
一実施形態において、トレオニン合成酵素をコードする配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるポリヌクレオチドのいずれか1つによってコードされ、配列番号1、配列番号2または配列番号3に少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の配列同一性を有するか、あるいは配列番号4、配列番号5または配列番号20に少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは100%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるポリヌクレオチドのいずれか1つによる単離されたポリペプチドが提供される。
他の実施形態において、トレオニン合成酵素をコードし、配列番号6、配列番号7、配列番号8または配列番号21に示された配列に少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる単離されたポリペプチドが提供される。
他の実施形態において、トレオニン合成酵素をコードし、配列番号6、配列番号7、配列番号8または配列番号21に示した配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる単離されたポリペプチドが提供される。
ポリペプチド配列の断片、適切にはトレオニン合成酵素活性を保持する断片もまた本明細書に開示される。
変異NtTSポリペプチドを含む変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物を作成するために、変異ポリペプチドバリアントを用いることができる。適切には、変異NtTSポリペプチドはトレオニン合成酵素活性を保持する。
ポリペプチドを発現するのに適切な培養条件下で形質転換細胞または組換え宿主細胞を培養することによってポリペプチドを製造することができる。次いで、公知の精製プロセスを用いて、このような培養物から、その結果発現されたポリペプチドを精製することができる。ポリペプチドの精製は、このポリペプチドに結合する薬剤を含有するアフィニティカラム；このようなアフィニティ樹脂に関する1以上のカラム段階；疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む1以上の段階；またはイムノアフィニティクロマトグラフィーを含むことができる。あるいはまた、ポリペプチドは、精製が容易な形態で発現されることができる。例えば、ポリペプチドは融合ポリペプチド、例えばマルトース結合ポリペプチド(MBP)、グルタチオン-5-トランスフェラーゼ(GST)またはチオレドキシン(TRX)の融合ポリペプチドとして発現されることができる。融合ポリペプチドの発現および精製のためのキットは市販されている。ポリペプチドは、エピトープでタグをつけ、続いて、このようなエピトープに対する特異的抗体を用いて精製されることができる。ポリペプチドをさらに精製するために、1以上の液体クロマトグラフィー段階、例えば逆相高速液体クロマトグラフィーを用いることができる。実質的に均一な組換えポリペプチドを提供するために、種々の組み合わせでの前述の精製段階の一部または全部を用いることができる。従って、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチドを実質的に含まないことができ、本明細書においては、”実質的に精製されたポリペプチド”と定義される。このような精製されたポリペプチドは、NtTSポリペプチド、断片、バリアントなどを含む。ポリペプチドおよび断片の発現、単離および精製は、本明細書に記載の方法を含むがこれに限定されない任意の適切な技術によって達成されることができる。
発現されたポリペプチドをアフィニティ精製するために、アフィニティカラム、例えばポリペプチドに対して作成されたモノクローナル抗体を用いることもできる。これらのポリペプチドは、慣用法を用いて、例えばアフィニティカラムから高塩溶出緩衝液に溶出し、次いで、使用のために低塩緩衝液に透析するか、または使用するアフィニティマトリックスに応じてpHを変えるかもしくは他の成分に交換するか、または天然に存在する親和性部分の基質を用いて競合的に溶出することができる。
ポリペプチドは、従来の既知の化学合成によっても製造することができる。ポリペプチドまたはその断片を合成手段によって構築する方法は当業者に公知である。合成的に構築されたポリペプチド配列は、天然ポリペプチドと一次構造、二次構造もしくは三次構造特性またはコンホメーション特性を共有することによって、生物活性を含む生物学的特性をそれらと共有することができる。
本明細書において、用語'天然に存在しない'は、天然では生じない、または天然には存在しない実体(例えば、ポリヌクレオチド、遺伝的変異、ポリペプチド、植物、植物細胞および植物材料)を説明する。このような天然に存在しない実体または人工の実体は、本明細書に記載の方法または当該技術分野で公知の方法によって製造され、合成され、開始され、改変され、介在され、または操作されることができる。従って、例として、旧来の植物育種技術(例えば戻し交雑)または遺伝子操作技術(例えばアンチセンスRNA、干渉RNA、メガヌクレアーゼ)などを用いて天然に存在しない植物、天然に存在しない植物細胞または天然に存在しない植物材料を作成することができる。さらなる例として、得られた植物、植物細胞もしくは植物材料またはそれらの子孫が、天然では生じない、または天然には存在しない遺伝子構成(例えばゲノム、染色体またはそれらのセグメント)を含むように、第1植物もしくは植物細胞から第2植物もしくは植物細胞(それ自体が天然に存在するすることができる)に1以上の遺伝子突然変異(例えば1以上の多型)を遺伝子移入または導入することによって、天然に存在しない植物、天然に存在しない植物細胞または天然に存在しない植物材料を作成することができる。得られた植物、植物細胞または植物材料は、従って、人工の、または天然に存在しないものである。従って、たとえ得られた遺伝子配列が、第1植物または植物細胞とは異なる遺伝的背景を含む第2植物または植物細胞に天然に存在する場合であっても、天然に存在する第1植物または植物細胞における遺伝子配列を改変することによって、人工の、または天然に存在しない植物または植物細胞を作成することができる。遺伝的背景における違いは、表現型の違いまたは当該技術分野で公知の分子生物学技術、例えば核酸配列決定、遺伝子マーカー(例えば、マイクロサテライトRNAマーカー)の存否によって検出することができる。
他の実施形態において、NtTSポリペプチドに免疫反応性である抗体が本明細書で提供される。本明細書に記載したNtTSポリペプチド、断片、バリアント、融合ポリペプチドは、それらに免疫反応性である抗体を作成するために、”免疫原”として用いることができる。このような抗体は、抗体の抗原結合部位を介してNtTSポリペプチドに特異的に結合することができる。特異的に結合する抗体は、NtTSファミリーポリペプチド、ホモログおよびバリアントを特異的に認識し、それに結合するが、他の分子にはそうではない抗体である。一実施形態において、抗体は、本明細書に記載のNtTSアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的であるが、他のポリペプチドには交差反応しない。
より具体的には、ポリペプチド、断片、バリアント、融合ポリペプチドなどは、抗体の形成を誘導する抗原決定基またはエピトープを含む。これらの抗原決定基またはエピトープは、線状抗原決定基またはエピトープあるいは立体構造(不連続)抗原決定基またはエピトープのいずれかであることができる。線状エピトープは、ポリペプチドのアミノ酸の部分の1つで構成されるが、立体構造または不連続エピトープは、ポリペプチドフォールディングによって近接近に導かれたポリペプチド鎖の異なる領域からのアミノ酸部分で構成される。エピトープは、当該技術分野で公知の方法のいずれかによって同定することができる。さらに、ポリペプチドからのエピトープは、アッセイにおける研究試薬として用いることもできるし、培養ハイブリドーマからのポリクローナル血清または上清などの物質から特異的な結合性抗体を精製するために用いることもできる。このようなエピトープまたはそのバリアントは、固相合成、ポリペプチドの化学切断または酵素切断などの当該技術分野で公知の技術を用いて製造することもできるし、組換えDNA技術を用いて製造することもできる。
ポリペプチドに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、共に、慣用法によって製造することができる。ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた本明細書において考えられる。このようなハイブリドーマは、慣用法によって作成し、同定することができる。抗体の産生のために、NtTSポリペプチド、断片、バリアントまたはそれらの変異体を用いる注射によって種々の宿主動物を免疫することができる。このような宿主動物は、いくつか例をあげれば、限定するものではないが、ウサギ、マウスおよびラットを含むことができる。免疫応答を増強させるために、種々のアジュバントを用いることができる。宿主種に応じて、このようなアジュバントは、限定するものではないが、フロイントアジュバント(完全および不完全)、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性剤、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばBCG(カルメット・ゲラン菌(bacille Calmette-Guerin))およびコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)を含む。モノクローナル抗体は、慣用法によって回収することができる。このようなモノクローナル抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであることができる。
抗体は、in vitroまたはin vivoのいずれかで、ポリペプチドまたは断片の存在を検出するためのアッセイにも用いることができる。抗体は、イムノアフィニティクロマトグラフィーによるポリペプチドまたは断片の精製に用いることもできる。
トレオニン合成酵素の発現または活性を低下させることができる組成物は、限定するものではないが、1以上の内因性トレオニン合成酵素遺伝子(単数または複数)の転写に干渉することができる配列特異的ポリヌクレオチド;トレオニン合成酵素RNA転写物の翻訳に干渉することができる配列特異的ポリヌクレオチド(例えば、二本鎖RNA、マイクロRNA、siRNA、リボザイム);トレオニン合成酵素タンパク質の安定性に干渉することができる配列特異的ポリペプチド；基質または制御タンパク質に対するトレオニン合成酵素タンパク質の酵素活性またはトレオニン合成酵素タンパク質の結合活性に干渉することができる配列特異的ポリヌクレオチド；トレオニン合成酵素タンパク質に特異性を示す抗体；トレオニン合成酵素タンパク質の安定性またはトレオニン合成酵素タンパク質の酵素活性またはトレオニン合成酵素タンパク質の結合活性に干渉することができる小分子化合物；トレオニン合成酵素ポリヌクレオチドに結合するジンクフィンガータンパク質；およびトレオニン合成酵素ポリヌクレオチドに対する活性を有するメガヌクレアーゼを含む。
アンチセンス技術は、NtTSポリペプチドの発現を調節する(例えば低下させるかまたは抑制する)ために用いることができる公知の方法の1つである。抑制されるNtTS遺伝子のポリヌクレオチドがクローニングされ、RNAのアンチセンス鎖が転写されるように調節領域および転写終結配列に作動可能に連結される。次いで、この組換え構築物を植物に形質転換し、RNAのアンチセンス鎖を産生させる。このポリヌクレオチドは、抑制される遺伝子の全配列である必要はないが、一般的には、抑制される遺伝子のセンス鎖の少なくとも一部に実質的に相補的である(それがコード領域にあるか、非コード領域にあるかにかかわらず)。
ポリヌクレオチドは、mRNAの発現に影響を及ぼすリボザイムまたは触媒性RNAに転写されることができる。リボザイムは、事実上任意の標的RNAに特異的に対合し、特定の位置でホスホジエステル主鎖を切断し、それによって標的RNAを機能的に不活化するように設計されることができる。異種ポリヌクレオチドは、特定のmRNA転写物を切断するように設計された、従ってポリペプチドの発現を抑制するように設計されたリボザイムをコードすることができる。ハンマーヘッド型リボザイムは特定のmRNAを破壊するのに有用であるが、部位特異的認識配列でmRNAを切断する種々のリボザイムもまた使用することができる。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的mRNAと相補的塩基対を形成する隣接領域によって指定される位置でmRNAを切断する。唯一の必要条件は、標的RNAが5'-UG-3'ヌクレオチド配列を含むことである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および産生は当該技術分野で公知である。in vivoでの切断効率を上げるために、安定なRNA、例えば転移RNA(tRNA)にハンマーヘッド型リボザイム配列を組み込むことができる。
一実施形態において、トレオニン合成酵素RNA転写物(単数または複数)の翻訳に干渉することができる配列特異的ポリヌクレオチドはRNAiである。RNA干渉(”RNAi”)またはRNAサイレンシングは、特定のmRNAが酵素分解の標的となることができる進化的に保存されたプロセスである。RNAi経路を開始するためには、二本鎖RNA(二本鎖RNA)が導入されるか、または細胞によって産生されなければならない(例えば、二本鎖RNAウイルスまたはNtTS RNAiポリヌクレオチド)。二本鎖RNAは、二本鎖RNA特異的エンドヌクレアーゼ(”Dicer”)であるRNアーゼIIIによって長さ21〜23bpの複数のsiRNA二本鎖(”siRNA”)に変換されることができる。続いて、ATP依存プロセスによってsiRNAの巻き戻しを促進するRNA誘導サイレンシング複合体(”RISC”)によってsiRNAを認識することができる。siRNAの巻き戻されたアンチセンス鎖は、siRNAアンチセンス鎖に相補的な配列を含む標的mRNA(例えば、NtTS RNAバリアント)に活性化RISCを導く。標的mRNAとアンチセンス鎖ははαへリックスを形成することができ、αへリックスの主溝は活性化RISCによって認識されることができる。標的mRNAは、センス鎖の5’末端の結合部位によって指定される単一部位で活性化RISCによって切断されることができる。活性化RISCは、他の切断事象を触媒するために再使用されることができる。
NtTS RNAi発現ベクターは、NtTS mRNA、NtTSプレmRNAまたはNtTS RNAバリアントの発現レベルを低下させることによってRNA干渉活性を示すNtTS RNAiポリヌクレオチドをコードするNtTS RNAi構築物を含むことができる。この発現ベクターは、本明細書でさらに詳細に説明されるように、上流に位置し、NtTS RNAi構築物に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。NtTS RNAi発現ベクターは、適切な最小限のコアプロモーター、対象とするNtTS RNAi構築物、上流(5')調節領域、下流(3')調節領域(転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む)ならびに当業者に公知の他の配列、例えば種々の選択マーカーを含むことができる。
NtTSポリヌクレオチドは、二本鎖構造(すなわちアンチセンス鎖および相補的センス鎖を含む二本鎖RNA分子)、二本鎖ヘアピン様構造(”dsRNAi”)または一本鎖構造(すなわち、アンチセンス鎖そのものを含むssRNA分子)などを含む種々の形態で製造することができる。該構造は、自己相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を含むことができる。NtTS dsRNAiは、二本鎖NtTS siRNAに酵素的に変換されることができる。NtTS siRNA二本鎖の鎖の1つは、標的NtTS mRNAおよび関連NtTS RNAバリアント内の相補配列にアニーリングすることができる。siRNA/mRNA二本鎖は、配列依存的に複数の部位でNtTS RNAを切断することができるRISCによって認識され、標的NtTS mRNAおよび関連NtTS RNAバリアントの分解がもたらされる。
二本鎖RNA分子は、ステムループ構造の単一オリゴヌクレオチドからアセンブルされたsiRNA分子であって、siRNA分子の自己相補的センス領域とアンチセンス領域がポリヌクレオチドベースまたは非ポリヌクレオチドベースリンカー(単数または複数)によって連結された前記siRNA分子ばかりでなく、自己相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、2以上のループ構造および1つのステムを有する環状一本鎖RNAであって、in vivoまたはin vitroのいずれかでプロセシングされて、RNAiを媒介することができる活性siRNA分子を生じることができる前記環状RNAを含むことができる。
本明細書において、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)分子の使用もまた考えられる。この分子は、逆相補鎖(センス)配列に加えて、一般的にはスペーサーまたはループ配列によって隔てられた、特定のアンチセンス配列を含む。スペーサーまたはループの切断によって一本鎖RNA分子およびその逆相補鎖が生じ、それらがアニーリングして二本鎖RNA分子を形成する(場合により、一方または両方の鎖の3'末端または5’末端から1、2、3以上のヌクレオチドの添加または除去をもたらす追加の処理段階を含む)。スペーサーは、スペーサーの切断(および、場合により、一方または両方の鎖の3'末端または5’末端から1、2、3、4以上のヌクレオチドの添加または除去をもたらす追加の処理段階)の前に、アンチセンス配列とセンス配列がアニーリングして、二本鎖構造(またはステム)を形成することを可能にする十分な長さのものであることができる。スペーサー配列は、一般的には、二本鎖ポリヌクレオチドにアニーリングさせたときにshRNAを形成する2つの相補的ヌクレオチド配列領域間に位置する類縁性のないヌクレオチド配列である。スペーサー配列は、一般に、約3〜約100ヌクレオチドを含む。
NtTSヘアピン二本鎖を作成するために、適切な配列組成、ループサイズおよびステム長さを選択することによって、任意の目的NtTS RNAポリヌクレオチドを作成することができる。ヘアピン二本鎖のステム長さの設計の適切な範囲は、少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20ヌクレオチド、例えば約14〜30ヌクレオチド、約30〜50ヌクレオチド、約50〜100ヌクレオチド、約100〜150ヌクレオチド、約150〜200ヌクレオチド、約200〜300ヌクレオチド、約300〜400ヌクレオチド、約400〜500ヌクレオチド、約500〜600ヌクレオチドおよび約600〜700ヌクレオチドのステム長さを含む。ヘアピン二本鎖のループ長さの設計の適切な範囲は、ヘア二本鎖のステム長さがかなりの長さである場合、約4〜25ヌクレオチド、約25〜50ヌクレオチド以上のループ長さを含む。特定の実施形態において、二本鎖RNA(dsRNA)または一本鎖RNA(ssRNA)分子は約15〜約40ヌクレオチド長である。他の実施形態において、dsRNAまたはssRNA分子のsiRNA分子は約15〜約35ヌクレオチド長である。他の実施形態において、siRNA分子は約17〜約30ヌクレオチド長のdsRNAまたはssRNA分子である。他の実施形態において、siRNA分子は約19〜約25ヌクレオチド長のdsRNAまたはssRNA分子である。他の実施形態において、siRNA分子は、約21〜約23ヌクレオチド長のdsRNAまたはssRNA分子である。特定の実施形態において、21ヌクレオチドよりも長い二本鎖領域を有するヘアピン構造は、ループ配列および長さにかかわらず、有効なsiRNA指向性サイレンシングを促進することができる。
標的mRNA配列は、一般的には、約14〜約50ヌクレオチド長である。従って、標的mRNAは、好ましくは、標的配列のための以下の基準の1以上を満たす約14〜約50ヌクレオチド長の領域をスキャンすることができる：約2:1〜約1:2のA+T/G+C比；標的配列の5’末端におけるAAジヌクレオチドまたはCAジヌクレオチド；標的mRNAに特有な少なくとも10連続ヌクレオチド配列(すなわち、該配列は、同じ植物からの他のmRNA配列に存在しない)；および、3を超える連続グアニン(G)ヌクレオチドまたは3を超える連続シトシン(C)ヌクレオチドの”並び(run)”がないこと。これらの基準は、当該技術分野で公知の種々の技術を用いて評価することができる。例えばBLASTなどのコンピュータプログラムは、選択された標的配列が標的mRNAに特有であるかどうかを決定するために、公に入手可能なデータベースを検索するのに用いることができる。あるいはまた、市販されているコンピュータソフトウェア(例えば、市販のOligoEngine、Target FinderおよびsiRNA Design Tool)を用いて標的配列(および設計されたsiRNA配列)を選択することができる。
一実施形態において、上記基準の1以上を満たす約14〜約30ヌクレオチド長の標的mRNA配列が選択される。他の実施形態において、上記基準の1以上を満たす約16〜約30ヌクレオチド長の標的配列が選択される。他の実施形態において、上記基準の1以上を満たす約19〜約30ヌクレオチド長の標的配列が選択される。他の実施形態において、上記基準の1以上を満たす約19〜約25ヌクレオチド長の標的配列が選択される。
例示的な実施形態において、発現を調節するために用いられる分子は、本明細書に記載のNtTSポリヌクレオチド配列のいずれか1つに記載の少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30以上の連続ヌクレオチドに相補的な特異的配列(例えばアンチセンス配列)、例えば配列番号1〜5または20を含む。
さらなる例示的な実施形態において、発現の調節に用いられる分子は、配列番号1、2および3のヌクレオチド1〜46;配列番号20のヌクレオチド1〜52;配列番号1のヌクレオチド99〜141;配列番号2および配列番号3のヌクレオチド102〜144;配列番号20のヌクレオチド102〜153;配列番号1、2および3のヌクレオチド1325〜136；または配列番号20のヌクレオチド1334〜1371の少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30以上の連続ヌクレオチドに相補的な配列(例えばアンチセンス配列)を含む。
さらなる例示的な実施形態において、発現の調節に用いられる分子は、配列番号1、配列番号2もしくは配列番号3のヌクレオチド454〜805または配列番号20のヌクレオチド463〜814の少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30以上の連続ヌクレオチドに相補的な配列(例えばアンチセンス配列)を含む。
siRNA分子に含まれる特定のアンチセンス配列は、標的配列の相補鎖と同一であるか、または実質的に同一であることができる。一実施形態において、siRNA分子に含まれる特定のアンチセンス配列は、標的mRNA配列の相補鎖と少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一である。配列同一性を決定する方法は当該技術分野で公知であり、例えば、University of Wisconsin Computer Group(GCG)ソフトウェアのBLASTNプログラムか、またはNCBIウェブサイトで提供されているものを用いて決定することができる。
siRNA分子の特定のアンチセンス配列は、標的mRNAの配列からの1、2、3、または4以上のヌクレオチドにおいて異なる(例えば、トランジションまたはトランスバージョンを含むヌクレオチド置換によって)ことによって変異性を示すことができる。二本鎖RNA分子のアンチセンス鎖にこのようなヌクレオチド置換が存在する場合、一般的には置換ヌクレオチドが水素結合による塩基対形成を形成する、センス鎖における相補的ヌクレオチドは、相応じて置換されることもできるし、置換されないこともできる。センス配列に1以上のヌクレオチド置換が存在するが、アンチセンス鎖には存在しない二本鎖RNA分子もまた考えられる。前述のように、siRNA分子のアンチセンス配列が、siRNAのヌクレオチド配列と標的ヌクレオチド配列との間に1以上のミスマッチを含む場合、該ミスマッチは、アンチセンス配列の3'末端、5'末端または中央部分において見出すことができる。
他の実施形態において、siRNA分子は、ストリンジェントな条件下で、天然に存在する標的遺伝子または標的mRNAの一部分に選択的にハイブリダイズすることができる特定のアンチセンス配列を含む。当業者に公知のように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの変化は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄段階に用いる溶液の時間、温度または濃度を変えることによって達成することができる。適切な条件は、一部分において、用いられる特定のヌクレオチド配列、例えば標的mRNAまたは遺伝子の配列にも左右される場合がある。
二本鎖RNAによるサイレンシングを植物に誘導する方法の1つは、ヘアピンRNAを生じる遺伝子構築物での形質転換である(Smith et al. (2000) Nature, 407, 319-320 参照)。このような構築物は、適切なスペーサーによって隔てられた標的遺伝子配列の逆位領域を含む。スペーサー断片としての機能性植物イントロン領域の挿入は、イントロンが挿入されたヘアピンRNAの生成によって、遺伝子サイレンシング誘導の効率をさらに増加させる(Wesley et al. (2001) Plant J., 27, 581-590)。適切には、ステム長さは、約50ヌクレオチド〜長さ約1キロベースである。イントロンが挿入されたヘアピンRNAの作成方法は、当該技術分野で公知である(例えば、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617 参照)。
二本鎖または二本鎖構造、例えば二本鎖RNAまたはshRNAを有するRNAi分子は、平滑末端を有することもできるし、3'または5'オーバーハングを有することもできる。本明細書において、”オーバーハング”とは、1つのRNA鎖の3'末端が他の鎖の5'末端を超えて伸びる場合(3'オーバーハング)、またはその逆の場合(5'オーバーハング)の、二本鎖構造から突出する不対ヌクレオチド(単数または複数)のことを言う。オーバーハングを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの改変バージョンであることができる。一実施形態において、RNAi分子の少なくとも1つの鎖は、約1〜約6ヌクレオチド長の3'オーバーハングを有する。他の実施形態において、3'オーバーハングは、約1〜約5ヌクレオチド、約1〜約3ヌクレオチドおよび約2〜約4ヌクレオチド長である。
RNAi分子が分子の一端に3'オーバーハングを含む場合、他の末端は平滑末端であることもできるし、オーバーハング(5'または3')を有することもできる。RNAi分子が、分子の両末端にオーバーハングを含む場合、そのオーバーハングの長さは同一であることも異なることもできる。一実施形態において、RNAi分子は、分子の両末端に約1〜約3ヌクレオチドの3'オーバーハングを含む。他の実施形態において、RNAi分子は、分子の両末端に2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有する二本鎖RNAである。さらに他の実施形態において、RNAiのオーバーハングを含むヌクレオチドはTTジヌクレオチドまたはUUジヌクレオチドである。
標的mRNA配列に対する、1以上のオーバーハングを含むRNAi分子のパーセンテージ同一性を決定する場合、オーバーハング(単数または複数)を考慮に入れることもできるし、入れないこともできる。例えば、3'オーバーハングからのヌクレオチドおよび二本鎖の5'または3'末端からの2ヌクレオチドまでは、siRNA分子の活性を著しく失なわずに改変されることができる。
RNAi分子は1以上の5'または3'キャップ構造を含むことができる。RNAi分子は、RNAi分子のセンス鎖、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の3'末端またはセンス鎖、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の5’末端にキャップ構造を含むことができる。あるいはまた、RNAi分子は、RNAi分子の3'末端および5’末端の両方にキャップ構造を含むことができる。用語”キャップ構造”とは、分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内への送達または局在化を容易にすることもできる、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれた化学修飾のことを言う。
RNAi分子に適用可能なもう1つの改変は、RNAi分子の活性、細胞分布、細胞取り込み、バイオアベイラビリティーまたは安定性を高める1以上の部分またはコンジュゲートのRNAi分子への化学結合である。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で確立された方法によって合成または改変されることができる。化学改変は、限定するものではないが、2'改変、非天然塩基の導入、リガンドへの共有結合および、リン酸結合のチオリン酸結合への置換を含むことができる。この実施形態において、二本鎖構造の完全性は、少なくとも1つの化学結合、一般的には2つの化学結合によって強化される。化学結合は、種々の公知の技術のいずれか、例えば共役結合、イオン結合または水素結合の導入；疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用またはまたはスタッキング相互作用；金属イオン配位によって、あるいはプリンアナログの使用によって化学結合を達成することができる。
さらに他の実施形態において、2つの一本鎖の1つまたは両方のヌクレオチドは、細胞酵素、例えば限定するものではないが特定のヌクレアーゼの活性化を低下させるかまたは抑制するために改変されることができる。細胞酵素の活性化を低下させるかまたは抑制する技術は、当該技術分野で公知であり、限定するものではないが、2'-アミノ改変、2'-フルオロ改変、2'-アルキル改変、非荷電主鎖改変、モルホリノ改変、2'-O-メチル改変およびホスホルアミダートを含む。従って、二本鎖RNA上のヌクレオチドの少なくとも1つの2'-ヒドロキシル基は化学基によって置換される。また、少なくとも1つのヌクレオチドは、固定された(locked)ヌクレオチドを形成するように改変されることができる。このような固定されたヌクレオチドは、リボースの2'酸素とリボースの4'炭素とを連結するメチレンまたはエチレン架橋を含む。固定されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドへの導入は、相補配列の親和性を改善し、融解温度を数℃上昇させる。
例えば、その細胞吸収を高めるために、RNAi分子にリガンドを結合させることができる。特定の実施形態において、細胞膜への直接浸透を容易にするために、分子に疎水性リガンドが結合される。これらのアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への浸透を容易にするために用いられている。特定の例において、オリゴヌクレオチドへのカチオンリガンドの結合は、多くの場合、ヌクレアーゼへの耐性改善がもたらされる。カチオンリガンドの代表例は、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドを通じてカチオンリガンドが分散される場合に、mRNAへのその高い結合親和性を保持することができる。
本明細書に記載の分子およびヌクレオチドは、固相合成に関する公知の技術を用いて製造することができる。当該技術分野で公知のこのような合成のための任意の他の手段は、これに加えて、あるいはこれに代えて用いることができる。
種々の実施形態は、1以上のNtTSポリヌクレオチドを含む1以上のNtTSポリヌクレオチドまたはNtTS RNAi構築物を含むNtTS発現ベクターに関する。
種々の実施形態は、1以上のNtTSポリヌクレオチドまたは1以上のNtTS RNAi構築物を含む発現ベクターに関する。
種々の実施形態は、自己アニーリングしてヘアピン構造を形成することができる1以上のNtTS RNAiポリヌクレオチドをコードする1以上のNtTSポリヌクレオチドまたは1以上のNtTS RNAi構築物であって、(a)1以上のNtTSポリヌクレオチド;(b)ヘアピン構造のループを形成するスペーサーエレメントをコードする第2配列；ならびに、(c)第1配列と同じ配向で配置される、第1配列の逆相補配列を含む第3配列であって、第2配列が第1配列と第3配列の間に位置し、第2配列が第1配列および第3配列に作動可能に連結されている前記第3配列；を含む前記構築物を含む発現ベクターに関する。
開示された配列は、ヘアピン構造を形成しない種々のNtTSポリヌクレオチドを構築するために用いることができる。例えば、NtTS二本鎖RNAは、1)第1プロモーターに作動可能に連結するによってNtTS DNAの第1鎖を転写し、(2)第2プロモーターに作動可能に連結するによってNtTS DNA断片の第1鎖の逆相補配列を転写する、ことによって作成されることができる。NtTSポリヌクレオチドの各鎖は、同じ発現ベクターから転写されることもできるし、異なる発現ベクターから転写されることもできる。RNA干渉活性を有するNtTS二本鎖RNAは、NtTS RNAレベルを低下させるために、siRNAに酵素的に変換されることができる。
従って、種々の実施形態は、自己アニーリングすることができるNtTS RNAiポリヌクレオチドをコードするNtTSポリヌクレオチドまたはNtTS RNAi構築物であって、(a)本明細書に記載のNtTSポリヌクレオチドの1以上；および(b)第1配列と同じ配向で配置される第1配列の相補的(例えば逆相補的)配列を含む第2配列；を含む前記構築物を含むNtTS発現ベクターに関する。
NtTS遺伝子発現の共抑制を促進することによって、NtTSの内因性発現レベルを低下させる種々の組成物および方法が提供される。共抑制の現象は、植物細胞宿主への導入遺伝子の複数コピーの導入の結果として生じる。複数コピーの導入遺伝子の組み込みによって、導入遺伝子および標的内在性遺伝子の発現低下をもたらすことができる。共抑制の程度は、導入遺伝子と標的内在性遺伝子間の配列同一性に左右される。内在性遺伝子および導入遺伝子の両方のサイレンシングは、転写を妨げる、サイレンシングされた遺伝子座(すなわち、内因性プロモーターおよび内因性目的遺伝子)の十分なメチル化によって起こすことができる。あるいはまた、場合によっては、内在性遺伝子および導入遺伝子の共抑制は、転写物は生じることができるが、分解速度の増加が転写物の蓄積を妨げる転写後遺伝子サイレンシング(”PTGS”)によって起こすことができる。RNAはこれらのプロセスにおける重要な開始剤および標的の両方であると考えられ、少なくとも一部分において同じ分子機構で、多分、RNAにガイドされるmRNAの分解によって媒介されることができるという点で、PTGSによる共抑制の機構は、RNA干渉に類似すると考えられる。
NtTS核酸の共抑制は、目的植物のゲノムに、導入遺伝子として、NtTS核酸またはその断片の複数コピーを組み込むことによって達成することができる。宿主植物は、NtTS核酸またはその断片に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターによって形質転換されることができる。種々の実施形態は、NtTSポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むNtTSの内在性遺伝子の共抑制を促進する発現ベクターに関する。
種々の実施形態は、(タバコ)植物ゲノムにNtTSポリヌクレオチドの複数コピーを組み込むことによって、NtTS DNAの発現レベルを調節する(例えば、低下させるかまたは抑制する)方法であって、NtTSポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターによって植物細胞宿主を形質転換することを含む前記方法に関する。
NtTS mRNAの翻訳を低下させるかまたは抑制することによって、NtTSの内在性遺伝子発現レベルを低下させる種々の組成物および方法が提供される。宿主(タバコ)植物細胞は、NtTS mRNAの一部分に相補的な配列を有するRNAポリヌクレオチドの発現を可能にするプロモーターに対してアンチセンス配向で配置されるNtTSポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターによって形質転換されることができる。
NtTS mRNAの翻訳を低下させるかまたは抑制する種々の発現ベクターは、NtTSポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターであって、配列がプロモーターに対してアンチセンス配向で配置される前記プロモーターを含むことができる。アンチセンスNtTS RNAポリヌクレオチドの長さは変えることができ、約15〜20ヌクレオチド、約20〜30ヌクレオチド、約30〜50ヌクレオチド、約50〜75ヌクレオチド、約75〜100ヌクレオチド、約100〜150ヌクレオチド、約150〜200ヌクレオチドおよび約200〜300ヌクレオチドであることができる。
変異NtTSポリヌクレオチドおよびポリペプチドを得る方法もまた提供される。植物細胞または植物材料を含む任意の目的植物は、部位特異的変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、化学的に誘導された変異誘発、照射誘起変異誘発、修飾塩基を用いる変異誘発、ギャップ付き二本鎖DNAを用いる変異誘発、二本鎖切断変異誘発、修復欠損宿主株を用いる変異誘発、遺伝子の全合成による変異誘発DNAシャフリングおよび他の等価な方法を含む変異誘発を誘導することが知られている種々の方法によって遺伝子改変されることができる。
あるいはまた、自己切断および複製が可能な、多くの小さな環状RNA由来のリボザイムを植物に導入することによって、NtTS遺伝子を不活化の標的とすることができる。これらのRNAは、単独で(ウイロイドRNA)、あるいはヘルパーウイルスの存在下で(サテライトRNA)複製することができる。適切なRNAの例は、アボカドサンブロッチウイロイド由来のRNAならびにタバコリングスポットウイルス、ルセルントランシエントストリークウイルス、ベルベットタバコモトルウイルス、ソラナムノジフロラムモトルウイルスおよびスブテラネアンクロバーモトルウイルス由来のサテライトRNAを含む。種々の標的RNA特異的リボザイムが当業者に公知である。
いくつかの実施形態において、非トランスジェニック手段、例えばNtTS遺伝子に1以上の変異を起こさせることによって、NtTSポリペプチドの発現が低下する。遺伝子配列にランダムに変異を導入する方法は、化学的変異誘発、EMS変異誘発および放射線変異誘発を含むことができる。細胞に1以上の標的変異を導入する方法は、限定するものではないが、ゲノムエディティング技術、特にジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異誘発、tilling法(ゲノムに誘導した局所的損傷部位のターゲティング)、相同組換え、オリゴヌクレオチド指定変異誘発およびメガヌクレアーゼ媒介変異誘発を含む。
限定するものではない変異のいくつかの例には、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、挿入およびミスセンス変異、一塩基多型(SNP)ならびに単純反復配列がある。変異後、未成熟終止コドンまたは他の非機能性NtTS遺伝子を生じる欠失を同定するためにスクリーニングを行うことができる。変異体のスクリーニングは、配列決定によって行うか、あるいはNtTS遺伝子またはタンパク質に特異的な1以上のプローブまたはプライマーの使用によって行うことができる。NtTS遺伝子発現の低下、NtTS mRNAの安定性の低下またはNtTSタンパク質の安定性の低下をもたらしうるNtTSポリヌクレオチドにおける特定の変異もまた起こすことができる。本明細書においては、このような植物を変異植物と呼ぶ。
変異植物は、NtTSポリペプチドレベルの低下をもたらす1以上の変異の任意の組み合わせを有することができる。例えば、変異植物は、単一のNtTS遺伝子において単一の変異を有することもできるし、単一のNtTS遺伝子において複数の変異を有することもできる。従って、NtTSの変異ポリペプチドバリアントを含む変異植物が開示される。
一実施形態において、植物からの種子を変異させ、次いで第一世代変異植物に成長させる。次いで、この第一世代植物を自家受粉させ、第一世代植物からの種子を第二世代植物に成長させ、次いでこれをそのNtTS遺伝子座における変異に関してスクリーニングする。変異させた植物材料を変異に関してスクリーニングすることもできるが、第二世代植物をスクリーニングする利点は、すべての体細胞変異が生殖系列変異に対応していることである。種子、花粉、植物組織または植物細胞を含むがこれに限定されない種々の植物材料を、NtTS変異植物を作成するために変異させることができることは、当業者には明らかであろう。しかしながら、変異に関して植物核酸をスクリーニングする場合、変異させた植物材料のタイプは影響を及ぼすことができる。例えば、変異させてない植物の受粉の前に花粉を変異誘発に供した場合、その受粉から得られた種子は第一世代植物に成長する。第一世代植物のすべての細胞は、花粉で生じた変異を含む。従って、第二世代まで待つ代わりに、これらの第一世代植物を、次に、NtTS変異に関してスクリーニングすることができる。
変異を引き起こすために、化学的変異誘発剤または放射線を含む、点突然変異、短い欠失、挿入、トランスバージョン、および／または遷移を引き起こす突然変異原を用いることができる。突然変異原は、限定するものではないが、メタンスルホン酸エチル(EMS)、メタンスルホン酸メチル(MMS)、N-エチル-N-ニトロソウレア(ENU)、トリエチルメラミン(TEM)、N-メチル-N-ニトロソウレア(MNU)、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、N-メチル-N'-ニトロ-ニトロソグアニジン(MNNG)、ニトロソグアニジン、2-アミノプリン、7,12ジメチル-ベンゾ(a)アントラセン(DMBA)、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホルアミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン(ジエポキシオクタン(DEO)、ジエポキシブタン(BEB)など)、2-メトキシ-6-クロロ-9[3-(エチル-2-クロロ-エチル)アミノプロピルアミノ]アクリジン二塩酸塩(ICR-170)およびホルムアルデヒドを含む。突然変異原によって直接に引き起こされたものではないNtTS遺伝子座における自然変異もまた、それらが所望の表現型をもたらすものである限り、考えられる。適切な変異誘発剤は、例えば電離放射線、例えばX線、ガンマ線、高速中性子照射およびUV放射線もまた含む。NtTS変異スクリーニング用の植物核酸を調製するために、当業者に公知の、任意の植物核酸調製方法を用いることができる。NtTS変異スクリーニング用の植物核酸を調製するために、当業者に公知の、任意の植物核酸調製方法を用いることができる。
個々の植物、植物細胞または植物材料から調製された核酸は、場合により、変異させた植物組織、細胞または材料由来の植物集団のNtTS遺伝子における変異のスクリーニングをはかどらせるためにプールすることができる。植物、植物細胞または植物材料の1以上のその後の世代をスクリーニングすることができる。場合によりプールした群のサイズは、用いられるスクリーニング方法の感度に左右される。
場合により核酸試料をプールした後、それらをNtTSポリヌクレオチド特異的増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に供することができる。場合によりプールした核酸試料中のNtTS配列を増幅するために、NtTS遺伝子またはNtTS遺伝子に直接隣接した配列に特異的なプライマーまたはプローブをいずれか1つ以上用いることができる。有用な変異が最も起こりそうなNtTS遺伝子座の領域を増幅するために、好ましくは1以上のプライマーが設計される。最も好ましくは、プライマーは、NtTSポリヌクレオチドの領域内の変異を検出するために設計される。さらに、点突然変異のスクリーニングを容易にするために、既知の多型性部位を避けるプライマー(単数または複数)が好ましい。増幅産物の検出を容易にするために、任意の従来の標識法を用いて、1以上のプライマーまたはプローブを標識することができる。プライマー(単数または複数)またはプローブは、当業者に公知の方法を用いて、本明細書に記載のNtTS配列に基づいて設計することができる。多型は、当該技術分野で公知の手段で同定することができる。
他の側面において、変異植物の製造方法が提供される。本方法は、機能性NtTSポリペプチドをコードする遺伝子を含む植物の少なくとも1つの細胞を提供することを含む。次いで、NtTS遺伝子の活性を調節するのに有効な条件下でこの植物の少なくとも1つの細胞が処理される。次いで、少なくとも1つの変異植物細胞を変異植物に増殖させ、ここで変異植物は、対照植物と比較して調節されたレベルのNtTSポリペプチドを有する。変異植物を製造する本方法の一実施形態において、処理段階は、上記のように、少なくとも1つの変異植物細胞を生じるのに有効な条件下で、少なくとも1つの細胞を化学的変異誘発剤にかけることを含む。本方法の他の実施形態において、処理段階は、少なくとも1つの変異植物細胞を生じるのに有効な条件下で、少なくとも1つの細胞を放射線源にかけることを含む。用語”変異植物”は、適切には遺伝子工学または遺伝子改変以外の手段で、対照植物と比較して遺伝子型が改変されている変異植物を含む。
特定の実施形態において、変異植物、変異植物細胞または変異植物材料は、他の植物、植物細胞または植物材料に天然に存在する1以上の変異を含み、所望の形質を付与することができる。この変異は、他の植物、植物細胞または植物材料(例えば、変異が誘導された植物とは遺伝的背景が異なる植物、植物細胞または植物材料)に組み込まれ(例えば遺伝子移入され)、それに形質を付与することができる。従って、例として、第1植物に天然に存在する変異は、第2植物、例えば第1植物とは遺伝的背景が異なる第2植物に導入されることができる。従って、当業者は、所望の形質を付与するNtTS遺伝子の1以上の変異対立遺伝子をそのゲノム中に天然に含む植物を調べ同定することができる。天然に存在する変異対立遺伝子(単数または複数)は、NtTS遺伝子中に1以上の変異を有する系統、変種または雑種を製造するための育種、戻し交雑および遺伝子移入を含む種々の方法によって第2植物に導入することができる。変異植物のプールの中から所望の形質を示す植物をスクリーニングすることができる。適切には、本明細書に記載のNtTSヌクレオチド配列の知識を用いて選択が行われる。その結果として、対照と比較してレベルが増加した遊離メチオニンを示す遺伝形質をスクリーニングすることが可能である。このようなスクリーニングアプローチは、本明細書に記載の従来の核酸増幅および／またはハイブリダイゼーション技術の適用を含むことができる。従って、さらなる側面において、変異植物を同定する方法であって、(a)植物からNtTSポリヌクレオチドを含む試料を提供する段階；および(b)NtTSポリヌクレオチドの核酸配列を決定する段階であって、対照植物のNtTSポリヌクレオチドと前記NtTSポリヌクレオチドの配列の違いが、前記植物がNtTS変異植物であることを示す前記段階を含む前記方法に関する。他の側面において、対照植物と比較してレベルが増加した遊離メチオニンを蓄積する変異植物を同定する方法であって、(a)スクリーニングされる植物からの試料を提供する段階；(b)前記試料がNtTSポリヌクレオチド中に1以上の変異を含むかどうかを決定する段階；および(c)前記植物のメチオニン含量を決定する段階；を含む前記方法において、前記試料が、対照植物と比較して、コードされるタンパク質の発現または活性を調節するNtTSポリヌクレオチドにおける1以上の変異を含み、植物の一部分が対照植物と比較して少なくとも5%のメチオニン含量の増加を有し、トレオニン合成酵素の発現または活性が低下していないかどうかが、レベルが増加した遊離メチオニンを蓄積する天然に存在する変異植物であることを示す前記方法が提供される。他の側面において、対照植物と比較してレベルが増加した遊離メチオニンを蓄積する変異植物を製造する方法であって、(a)第1植物からの試料を調製する段階；(b)前記試料が、その中にレベルが増加した遊離メチオニンの蓄積をもたらす、NtTSポリヌクレオチドにおける1以上の変異を含むかどうかを決定する段階；および(c)第2植物に1以上の変異を導入する段階；を含む前記方法が提供される。変異(単数または複数)は、当該技術分野で公知の種々の方法、例えば遺伝子工学、遺伝子操作、遺伝子移入、植物育種、戻し交雑などによって第2植物に導入されることができる。一実施形態において、第1植物は天然に存在する植物である。一実施形態において、第2植物は第1植物とは異なる遺伝的背景を有する。他の側面において、対照植物と比較してレベルが増加した遊離メチオニンを蓄積する変異植物を製造する方法であって、(a)第1植物から試料を提供する段階；(b)前記試料が、その中に、レベルが増加した遊離メチオニンの蓄積をもたらすNtTSポリヌクレオチドにおける1以上の変異を含むかどうかを決定する段階；および(c)第1植物からの1以上の変異を第2植物に遺伝子移入する段階；を含む前記方法が提供される。一実施形態において、遺伝子移入する段階は、場合により戻し交雑などを含む植物育種を含む。一実施形態において、第1植物は天然に存在する植物である。一実施形態において、第2植物は第1植物とは異なる遺伝的背景を有する。一実施形態において、第1植物は栽培品種または優良栽培品種ではない。一実施形態において、第2植物は栽培品種または優良栽培品種である。さらなる側面は、本明細書に記載の方法によって得られるか、または得ることができる変異植物(栽培品種または優良栽培品種変異植物を含む)に関する。特定の実施形態において、変異植物は、植物の特定の領域にのみ局在化した、例えばNtTSポリヌクレオチドの配列内の1以上の変異を有することができる。この実施形態によれば、変異植物の残りのゲノム配列は、変異誘発前の植物と同じかまたは実質的に同じである。
特定の実施形態において、変異植物は、その植物の2以上の領域に、例えばNtTSポリヌクレオチドの配列およびゲノムの1以上のさらなる領域に局在化した1以上の変異を有することができる。この実施形態によれば、変異植物の残りのゲノム配列は、変異誘発前の植物と同じではないか、または実質的に同じではない。特定の実施形態において、変異植物は、NtTSポリヌクレオチドの1以上、2以上、3以上、4以上または5以上のエクソンにおいて1以上の変異を有さないことができ；NtTSポリヌクレオチドの1以上、2以上、3以上、4以上または5以上のイントロンにおいて1以上の変異を有さないことができ、NtTSポリヌクレオチドのプロモーターにおいて1以上の変異を有さないことができ；NtTSポリヌクレオチドの3'非翻訳領域において1以上の変異を有さないことができ；NtTSポリヌクレオチドの5'非翻訳領域において1以上の変異を有さないことができ；NtTSポリヌクレオチドのコード領域において1以上の変異を有さないことができ；NtTSポリヌクレオチドの非コード領域において1以上の変異を有さないことができ；あるいはそれらの部分の2以上、3以上、4以上または5以上の任意の組み合わせを有さないことができる。
一実施形態において、発現を調節するために、配列番号1、2および3のヌクレオチド1〜46の少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30以上の連続ヌクレオチドである配列(例えば相補配列)；配列番号20のヌクレオチド1〜52；配列番号1のヌクレオチド99〜141;配列番号2および配列番号3のヌクレオチド102〜144;配列番号20のヌクレオチド102〜153;配列番号1、2および3のヌクレオチド1325〜1362;または配列番号20のヌクレオチド1334〜1371が用いられる。
他の実施形態において、発現を調節するために、配列番号1、配列番号2または配列番号3のヌクレオチド454〜805の少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30以上の連続ヌクレオチドである配列(例えば相補配列)あるいは配列番号20のヌクレオチド463〜814が用いられる。さらなる側面において、NtTSをコードする遺伝子における変異を含む植物、植物細胞または植物材料を同定する方法であって、(a)植物、植物細胞または植物材料を変異誘発にかけ；(b)前記植物、植物細胞もしくは植物材料またはそれらの子孫から核酸試料を入手し；(c)NtTSまたはそのバリアントもしくは断片をコードする遺伝子の核酸配列を決定し、ここで前記配列における違いがその中の1以上の変異を示すことを含む前記方法が提供される。
トレオニン合成酵素の発現または活性を調節するために、ジンクフィンガータンパク質を用いることができる。種々の実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異誘発によって、NtTSポリヌクレオチドのコード配列の一部またはすべてを含むゲノムDNA配列が改変される。ジンクフィンガータンパク質結合の特異部位に関してゲノムDNA配列が調べられる。あるいはまた、ゲノムDNA配列は、ジンクフィンガータンパク質結合の2つの特異部位であって、逆鎖上で近接して、例えば、1、2、3、4、5、6塩基対またはそれ以上離れて存在する前記2つの特異部位に関して調べられる。それによって、NtTSポリヌクレオチドに結合するジンクフィンガータンパク質が提供される。
NtTS遺伝子における選択された標的部位を認識するために、ジンクフィンガータンパク質が操作されることができる。ジンクフィンガータンパク質は、選択法、例えば限定するものではないが、ファージディスプレイ選択、細菌2ハイブリッド選択または細菌1ハイブリッド選択と結びつけた短縮化、伸張または部位特異的変異誘発プロセスによって、天然のジンクフィンガーDNA結合ドメインおよび非天然ジンクフィンガーDNA結合ドメイン由来のモチーフの任意の組み合わせを含むことができる。用語”非天然ジンクフィンガーDNA結合ドメイン”とは、標的DNA中の3塩基対配列に結合し、改変されるDNAを含む細胞または生物体内に存在しないジンクフィンガーDNA結合ドメインのことを言う。標的遺伝子に特有な特定のヌクレオチド配列に結合するジンクフィンガータンパク質の設計の方法は当該技術分野で公知である。
NtTSポリヌクレオチドに結合するジンクフィンガータンパク質をコードする第1ポリヌクレオチドと、非特異的エンドヌクレアーゼをコードする第2ポリヌクレオチド、例えば限定するものではないが、IIS型エンドヌクレアーゼをコードする第2ポリヌクレオチドとの融合体を製造することによってジンクフィンガーヌクレアーゼを構築することができる。ジンクフィンガータンパク質と該ヌクレアーゼとの融合タンパク質は、2つの塩基対からなるスペーサーを含むこともできるし、あるいはまた該スペーサーは、3、4、5、6、7以上の塩基対からなることもできる。種々の実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、NtTSポリヌクレオチドのゲノムDNA配列の調節領域、コード領域または非コード領域に二本鎖切断を導入し、NtTSポリヌクレオチドの発現レベルの低下またはそれによってコードされるタンパク質の活性の低下をもたらす。ジンクフィンガーヌクレアーゼによる切断は、しばしば、非相同末端結合によるDNA修復に続く切断部位におけるDNAの欠失をもたらす。
他の実施形態において、ジンクフィンガータンパク質は、NtTSポリヌクレオチドの調節配列に結合するように選択されることができる。より具体的には、調節配列は、転写開始点、開始コドン、エクソンの領域、エクソン-イントロンの境界、ターミネーターまたは終止コドンを含むことができる。従って、本開示は、NtTS遺伝子の近くまたはNtTS遺伝子内のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異誘発によって製造された変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物または植物細胞および、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異誘発によるこのような植物または植物細胞の製造方法を提供する。ジンクフィンガータンパク質およびジンクフィンガーヌクレアーゼの植物への送達方法は、メガヌクレアーゼ送達のための下記の方法と同様である。
他の側面において、本開示はさらに、メガヌクレアーゼ、例えばI-CreIを用いて、変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物または他の遺伝子改変植物を製造する方法を提供する。NtTS遺伝子の破壊を可能にするために、植物のゲノムDNAの単一部位または比較的少ない部位で二本鎖切断を特異的に引き起こすために、天然に存在するメガヌクレアーゼだけでなく、組換えメガヌクレアーゼもまた使用することができる。メガヌクレアーゼは、改変されたDNA認識特性を有する操作されたメガヌクレアーゼであることができる。メガヌクレアーゼタンパク質は、当該技術分野で公知の種々の異なる機構によって植物細胞に送達することができる。
本開示は、植物細胞または植物においてNtTSポリヌクレオチドを不活化するためのメガヌクレアーゼの使用を含む。特に、本開示は、メガヌクレアーゼを用いて植物におけるNtTSポリヌクレオチドを不活化する方法であって、(a)NtTSポリヌクレオチドを含む植物細胞を提供し；(b)前記植物細胞内にメガヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼをコードする構築物を導入し；(c)メガヌクレアーゼにNtTSポリヌクレオチドを実質的に不活化させること；を含む前記方法を提供する。
NtTSポリヌクレオチドのコード領域内のメガヌクレアーゼ認識部位を切断するためにメガヌクレアーゼを用いることができる。このような切断は、非相同末端結合による変異DNA修復に続いて、しばしば、メガヌクレアーゼ認識部位におけるDNAの欠失をもたらす。遺伝子コード配列におけるこのような変異は、一般的には、遺伝子を不活化するのに十分である。植物細胞を改変するこの方法は、第1に、適切な形質転換方法を用いて植物細胞にメガヌクレアーゼ発現カセットを送達することを含む。効率を最大にするために、メガヌクレアーゼ発現カセットに選択マーカーを連結させ、形質転換に成功した細胞を選択剤の存在下で選択することが望ましい。このアプローチは、メガヌクレアーゼ発現カセットのゲノムへの組み込みをもたらす。しかしながら、この植物が規制当局の認可を必要とすると思われる場合は、このアプローチは望ましくない。このような場合には、メガヌクレアーゼ発現カセット(および連結された選択マーカー遺伝子)は、従来の育種技術を用いて、その後の植物の世代において離脱させることができる。あるいはまた、植物細胞は、初めに、選択マーカーを欠くメガヌクレアーゼ発現カセットで形質転換することができ、選択剤を欠く培地で増殖させることができる。このような条件下では、処理される細胞の分画は、メガヌクレアーゼ発現カセットを必要とし、ゲノムにメガヌクレアーゼ発現カセットが組み込まれることなしに、操作されたメガヌクレアーゼを一過性に発現する。このような条件は形質転換効率を考慮に入れてないので、この後者の形質転換過程は、所望のゲノム改変を得るために、多数の処理細胞をスクリーニングすることを必要とする。上記のアプローチはまた、ジンクフィンガータンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて植物細胞を改変するのにも用いることができる。
メガヌクレアーゼ発現カセットの送達に続いて、最初に、用いられた特定の形質転換過程に典型的な条件下で植物細胞が増殖される。これは、しばしば暗所で、26℃以下の温度の培地で形質転換細胞を増殖させることを意味することができる。植物細胞を形質転換プロセスから回復させるために、ある期間、好ましくは1〜4日間、このような標準条件を用いることができる。この最初の回復期間に続く任意の時点で、増殖温度を上げて、操作されたメガヌクレアーゼの活性を刺激し、メガヌクレアーゼ認識部位を切断し、変異させることができる。
特定の用途に関して、植物のゲノムからNtTSポリヌクレオチドを正確に除去することが望ましい場合がある。このような用途には、そのそれぞれが対象とする欠失のいずれかの側でメガヌクレアーゼ認識部位を切断する一対の操作されたメガヌクレアーゼを用いることが可能である。
本開示に記載の遺伝子改変に使用するのに適した植物は、以下の科の1つからの種を含む単子葉植物および双子葉植物の植物および植物細胞系を含む：キツネノマゴ科(Acanthaceae)、ネギ科(Alliaceae)、ユリズイセン科(Alstroemeriaceae)、ヒガンバナ科(Amaryllidaceae)、キョウチクトウ科(Apocynaceae)、ヤシ科(Arecaceae)、キク科(Asteraceae)、メギ科(Berberidaceae)、ベニノキ科(Bixaceae)、アブラナ科(Brassicaceae)、パイナップル科(Bromeliaceae)、アサ科(Cannabaceae)、ナデシコ科(Caryophyllaceae)、イヌガヤ科(Cephalotaxaceae)、アカザ科(Chenopodiaceae)、イヌサフラン科(Colchicaceae)、ウリ科(Cucurbitaceae)、ヤマノイモ科(Dioscoreaceae)、マオウ科(Ephedraceae)、コカノキ科(Erythroxylaceae)、トウダイグサ科(Euphorbiaceae)、マメ科(Fabaceae)、シソ科(Lamiaceae)、アマ科(Linaceae)、ヒカゲノカズラ科(Lycopodiaceae)、アオイ科(Malvaceae)、メランチウム科(Melanthiaceae)、バショウ科(Musaceae)、フトモモ科(Myrtaceae)、ヌマミズキ科(Nyssaceae)、ケシ科(Papaveraceae)、マツ科(Pinaceae)、オオバコ科(Plantaginaceae)、イネ科(Poaceae)、バラ科(Rosaceae)、アカネ科(Rubiaceae)、ヤナギ科(Salicaceae)、ムクロジ科(Sapindaceae)、ナス科(Solanaceae)、イチイ科(Taxaceae)、ツバキ科(Theaceae)またはブドウ科(Vitaceae)。
適切な種は、アベルモスクス属(Abelmoschus)、アビエス属(Abies)、アセル属(Acer)、アグロスチス属(Agrostis)、アリウム属(Allium)、アルストロメリア属(Alstroemeria)、アナナス属(Ananas)、アンドログラフィス属(Andrographis)、アンドロポゴン属(Andropogon)、アルテミシア属(Artemisia)、アルンド属(Arundo)、アトローパ属(Atropa)、ベルベリス属(Berberis)、ベタ属(Beta)、ビクサ属(Bixa)、ブラシカ属(Brassica)、カレンデュラ属(Calendula)、カメリア属(Camellia)、カンプトテカ属(Camptotheca)、カンナビス属(Cannabis)、カプシクム属(Capsicum)、カルタムス属(Carthamus)、カタランサス属(Catharanthus)、ケファロタクスス属(Cephalotaxus)、クリサンセマム属(Chrysanthemum)、シンコナ属(Cinchona)、キトルルス属(Citrullus)、コフィア属(Coffea)、コルチカム属(Colchicum)、コリウス属(Coleus)、ククミス属(Cucumis)、ククルビタ属(Cucurbita)、キノドン属(Cynodon)、ダツラ属(Datura)、ダイアンサス属(Dianthus)、ジギタリス属(digitalis)、ディオスコレア属(Dioscorea)、エラエイス属(Elaeis)、エフェドラ属(Ephedra)、エリアンサス属(Erianthus)、エリスロキシルム属(Erythroxylum)、ユーカリプタス属(Eucalyptus)、フェスツカ属(Festuca)、フラガリア属(Fragaria)、ガランツス属(Galanthus)、グリシン属(Glycine)、ゴシピウム属(Gossypium)、ヘリアンサス属(Helianthus)、ヘベア属(Hevea)、ホルデウム属(Hordeum)、ヒヨスチアムス属(Hyoscyamus)、ジャトロファ属(Jatropha)、ラクツカ属(Lactuca)、リナム属(Linum)、ロリウム属(Lolium)、ルピナス属(Lupinus)、リコペルシコン属(Lycopersicon)、リコポディウム属(Lycopodium)、マニホット属(Manihot)、メディカゴ属(Medicago)、メンタ属(Mentha)、ミスカンツス属(Miscanthus)、ムサ属(Musa)、ニコチアナ属(Nicotiana)、オリザ属(Oryza)、パニクム属(Panicum)、パパベル属(Papaver)、パルテニウム属(Parthenium)、ペンニセツム属(Pennisetum)、ペチュニア属(Petunia)、ファラリス属(Phalaris)、フレウム属(Phleum)、ピヌス属(Pinus)、ポア属(Poa)、ポインセチア属(Poinsettia)、ポプルス属(Populus)、ラウオルフィア属(Rauwolfia)、リシヌス属(Ricinus)、ロサ属(Rosa)、サッカルム属(Saccharum)、サリクス属(Salix)、サンギナリア属(Sanguinaria)、スコポリア属(Scopolia)、セカレ属(Secale)、ソラナム属(Solanum)、ソルガム属(Sorghum)、スパルティナ属(Spartina)、スピナキア属(Spinacea)、タナセタム属(Tanacetum)、タクサス属(Taxus)、テオブロマ属(Theobroma)、トリチコセカレ属(Triticosecale)、トリチクム属(Triticum)、ウニオラ属(Uniola)、ベラトルム属(Veratrum)、ビンカ属(Vinca)、ヴィティス属(Vitis)およびゼア属(Zea)のメンバーを含むことができる。
適切な種は、パニクム種(Panicum spp.)、ソルガム種(Sorghum spp.)、ミスカンサス種(Miscanthus spp.)、サッカルム種(Saccharum spp.)、エリアンサス種(Erianthus spp.)、ポプルス種(Populus spp.)、アンドロポゴン・ゲラルディイ(Andropogon gerardii)(ビッグブルーステム)、ペンニセツム・プルプレウム(Pennisetum purpureum)(力芝)、ファラリス・アルンディナケア(Phalaris arundinacea)(クサヨシ)、キノドン・ダクティロン(Cynodon dactylon)(バミューダグラス)、フェスツカ・アルンディナケア(Festuca arundinacea)(鬼牛の毛草)、スパルティナ・ペクティナタ(Spartina pectinata)(プレーリーコード草)、メディカゴ・サティウァ(Medicago sativa)(アルファルファ)、アルンド・ドナックス(Arundo donax)(ジャイアントリード)、セカレ・ケレアレ(Secale cereale)(ライ麦)、サリクス種(Salix spp.)(ヤナギ)、ユーカリプタス種(Eucalyptus spp.)(ユーカリノキ)、トリチコセカレ(Triticosecale)(トリチクム(triticum)--小麦xライ麦)、タケ、ヘリアンサス・アンヌス(Helianthus annuus)(ヒマワリ)、カルタムス・ティンクトリウス(Carthamus tinctorius)(ベニバナ)、ジャトロファ・クルカス(Jatropha curcas)(ジャトロファ)、リキヌス・コムムニス(Ricinus communis)(ヒマシ)、エラエイス・ギネエンシス(Elaeis guineensis)(ヤシ)、リヌム・ウシタティッシムム(Linum usitatissimum)亜麻仁油(アマ)、ブラッシカ・ユンケア(Brassica juncea)、ベタ・ブルガリス(Beta vulgaris)(テンサイ)、マニホット・エスクレンタ(Manihot esculenta)(キャッサバ)、リコペルシコン・エクスレンタム(Lycopersicon esculentum)(トマト)、ラクツカ・サティバ(Lactuca sativa)(レタス)、ムサ・パラディシアカ(Musa paradisiaca)(バナナ)、ソラナム・ツベロスム(Solanum tuberosum)(ジャガイモ)、ブラシカ・オレラシア(Brassica oleracea)(ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ)、カメリア・シネンシス(Camellia sinensis)(チャノキ)、フラガリア・アナナッサ(Fragaria ananassa)(イチゴ)、テオブロマ・カカオ(Theobroma cacao)(カカオノキ)、コフィア・アラビカ(Coffea arabica)(コーヒーノキ)、ヴィティス・ヴィニフェラ(Vitis vinifera)(ブドウ)、アナナス・コモサス(Ananas comosus)(パイナップル)、カプシクム・アンヌウム(Capsicum annum)(唐辛子およびシシトウ)、アリウム・セパ(Allium cepa)(タマネギ)、ククミス・メロ(Cucumis melo)(メロン)、ククミス・サティウス(Cucumis sativus)(キュウリ)、ククルビタ・マクシマ(Cucurbita maxima)(スカッシュ)、ククルビタ・モスカータ(Cucurbita moschata)(スカッシュ)、スピナキア・オレラケア(Spinacea oleracea)(ホウレンソウ)、シトルルス・ラナタス(Citrullus lanatus)(スイカ)、アベルモスクス・エスクレンツス(Abelmoschus esculentus)(オクラ)、Solanum melongena(ソラナム・メロンゲーナ)(ナス)、ロサ種(Rosa spp.)(バラ)、ディアンツス・カリオフィルス(Dianthus caryophyllus)(カーネーション)、ペチュニア種(Petunia spp.)(ペチュニア)、ポインセチア・プルケリマ(Poinsettia pulcherrima)(ポインセチア)、ルピナス・アルブス(Lupinus albus)(ルピナス)、ウニオラ・パニクラータ(Uniola paniculata)(オートムギ)、ベントグラス(アグロスチス種(Agrostis spp.))、ポプルス・トレムロイデス(Populus tremuloides)(アスペン)、ピヌス種(Pinus spp.)(マツ)、アビエス種(Abies spp.)(モミ)、アセル種(Acer spp.)(カエデ)、ホルデウム・ウルガレ(Hordeum vulgare)(大麦)、ポア・プラテンシス(Poa pratensis)(ケンタッキーブルーグラス)、ロリウム種(Lolium spp.)(ライグラス)およびフレウム・プラテンセ(Phleum pratense)(オオアワガエリ)、パニクム・ウィルガツム(Panicum virgatum)(スイッチグラス)、ソルガム・ビカラー(Sorghum bicolor)(ソルガム、スーダングラス)、ミスカンサス・ギガンテウス(Miscanthus giganteus)(ミスカンサス)、サッカルム種(Saccharum sp.)(エネルギーケイン)、ポプルス・バルサミフェラ(Populus balsamifera)(ポプラ)、ゼア・マイス(Zea mays)(コーン)、グリシン・マックス(Glycine max)(ダイズ)、ブラッシカ・ナプス(Brassica napus)(カノーラ)、トリチクム・アエスチウム(Triticum aestivum)(小麦)、ゴシピウム・ヒルスツム(Gossypium hirsutum)(綿)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)(米)、ヘリアンサス・アンヌス(Helianthus annuus)(ヒマワリ)、メディカゴ・サティウァ(Medicago sativa)(アルファルファ)、ベタ・ブルガリス(Beta vulgaris)(テンサイ)またはペンニセツム・グラウクム(Pennisetum glaucum)(トウジンビエ)を含むことができる。
種々の実施形態は、NtTS遺伝子の発現レベルを低下させるように改変した変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物に関し、それによって、対照植物と比較して目的植物組織内のNtTSの発現レベルが低下した植物、例えばタバコ植物が製造される。開示された組成物および方法は、N.ルスチカ(N. rustica)およびN.タバカムを含むニコチアナ属の任意の種(例えばLA B21、LN KY171、TI 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1、およびPetico)に用いることができる。他の種は、N.アカウリス(N. acaulis)、N.アクミナタ(N. acuminata)、N.アクミナタ・変種マルチフロラ(N. acuminata var. multiflora)、N.アフリカナ(N. africana)、N.アラタ(N. alata)、N.アムプレキシカウリス(N. amplexicaulis)、N.アレントシ(N. arentsii)、N.アテヌアタ(N. attenuata)、N.ベナビデシ(N. benavidesii)、N.ベンサミアナ(N. benthamiana)、N.ビゲロビ(N. bigelovii)、N.ボナリエンシス(N. bonariensis)、N.カビコラ(N. cavicola)、N.クレベランジ(N. clevelandii)、N.コルジフォリア(N. cordifolia)、N.コリンボサ(N. corymbosa)、N.デブネイ(N. debneyi)、N.エクセルシオル(N. excelsior)、N.フォルゲチア(N. forgetiana)、N.フラグランス(N. fragrans)、N.グラウカ(N. glauca)、N.グルチノサ(N. glutinosa)、N.グッドスピーディ(N. goodspeedii)、N.ゴセイ(N. gossei)、N.ハイブリッド(N. hybrid)、N.イングルバ(N. ingulba)、N.カワカミ(N. kawakamii)、N.ナイチアナ(N. knightiana)、N.ラングスドルフィ(N. langsdorffii)、N.リネアリス(N. linearis)、N.ロンギフロラ(N. longiflora)、N.マリチマ(N. maritima)、N.メガロシホン(N. megalosiphon)、N.ミエルシ(N. miersii)、N.ノクチフロラ(N. noctiflora)、N.ヌジカウリス(N. nudicaulis)、N.オブツシフォリア(N. obtusifolia)、N.オシデンタリス(N. occidentalis)、N.オシデンタリス・亜種ヘスペリス(N. occidentalis subsp. hesperis)、N.オトホラ(N. otophora)、N.パニクラータ(N. paniculata)、N.パウシフロラ(N. pauciflora)、N.ペツニオイデス(N. petunioides)、N.プルムバギニフォリア(N. plumbaginifolia)、N.クアドリバルビス(N. quadrivalvis)、N.ライモンジ(N. raimondii)、N.レパンダ(N. repanda)、N.ロスラタ(N. rosulata)、N.ロスラタ・亜種イングルバ(N. rosulata subsp. ingulba)、N.ロツンジホリア(N. rotundifolia)、N.セトケリ(N. setchellii)、N.シムランス(N. simulans)、N.ソラニフォリア(N. solanifolia)、N.スペガジニ(N. spegazzinii)、N.ストクトニ(N. stocktonii)、N.スアベオレンス(N. suaveolens)、N.シルベストリス(N. sylvestris)、N.チルシフロラ(N. thyrsiflora)、N.トメントサ(N. tomentosa)、N.トメントシホルミス(N. tomentosiformis)、N.トリゴノフィラ(N. trigonophylla)、N.アンブラチカ(N. umbratica)、N.アンドゥラタ(N. undulata)、N.ベルチナ(N. velutina)、N.ウィガンジオイデス(N. wigandioides)およびN. xサンデラエ(N. x sanderae)を含む。
従って、トランスジェニック植物、天然に存在しない植物または変異植物は、1以上の導入遺伝子、1以上の遺伝子突然変異またはそれらの組み合わせを含むタバコ変種または優良タバコ栽培品種であることができる。遺伝的変異(単数または複数)(例えば1以上の多型)は、個々のタバコ変種またはタバコ栽培品種(例えば優良タバコ栽培品種)に天然に存在しない変異であることもできるし、その変異が、個々のタバコ変種またはタバコ栽培品種(例えば、優良タバコ栽培品種)には天然に存在しない限りは、天然に存在する遺伝的変異(単数または複数)であることもできる。特に有用なニコチアナ・タバカム変種は、バーレータイプ、ダークタイプ、鉄管乾燥タイプおよびオリエンタルタイプのタバコを含む。限定するものではない変種または栽培品種の例は、BD 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CD 263、DF911、DT 538 LC Galpaoタバコ、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、Hybrid 403LC、Hybrid 404LC、Hybrid 501 LC、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、Narrow Leaf Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD 7302 LC、PD 7309 LC、PD 7312 LC、'Perique'タバコ、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR (Tom Rosson) Madole、VA 309、VA359、AA 37-1、B 13P、Xanthi (Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC number 2 Hybrid 49、バーレー 21、KY 8959、KY 9、MD 609、PG 01、PG 04、PO1、PO2、PO3、RG 11、RG 8、VA 509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、Kutsage E1、LA BU 21、NC 2326、NC 297、PVH 2110、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、TI-1070、TW136、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havanaである。上記の低変換体亜変種もまた、たとえそれらが本明細書に具体的に記載されていなくても、考えることができる。
また、実施形態は、トレオニン合成酵素の発現または活性を低下させるように改変された変異植物、天然に存在しない植物、雑種植物またはトランスジェニック植物を製造するための組成物および方法であって、対照と比較して、植物の1以上の部分(例えば葉)における遊離メチオニン濃度の増加をもたらす前記組成物および方法に関する。好都合には、得られる変異植物、天然に存在しない植物、雑種植物またはトランスジェニック植物の全体の外観は、対照植物と同様であるか、または実質的に同じである。種々の表現型特性、例えば成熟度、植物あたりの葉の数、幹の高さ、葉の着生角度、葉のサイズ(幅および長さ)、節間距離ならびに葉身中肋比を畑観察によって評価することができる。
一側面は、本開示の変異植物、天然に存在しない植物、雑種植物、トランスジェニック植物の種子である。好ましくは、種子はタバコ種子である。本開示のさらなる側面は、本開示の変異植物、天然に存在しない植物、雑種植物、トランスジェニック植物の花粉または胚珠である。さらに、雄性不稔を付与する核酸をさらに含む、本明細書に記載の変異植物、天然に存在しない植物、雑種植物、トランスジェニック植物が提供される。
本開示はまた、変異植物、天然に存在しない植物、雑種植物もしくはトランスジェニック植物またはその一部分の再生可能な細胞の組織培養物であって、その親のすべての形態学的および生理学的特性を発現することができる植物を再生する前記培養物を提供する。本開示の再生可能な細胞は、限定するものではないが、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、根、根冠、葯、花およびその部分、胚珠、苗条、茎、幹、髄ならびにさく（capsule,鞘）またはそれらに由来するカルスもしくはプロトプラストからの細胞を含む。
一実施形態において、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の幹の高さは、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物と実質的に同じである。例えば、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の幹の高さは、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物の幹の高さよりも低くない。他の実施形態において、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の幹の高さは、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物よりも約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%もしくは1%低いかまたは高い。他の実施形態において、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物のクロロフィル含量は、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物と実質的に同じである。例えば、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物のクロロフィル含量は、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物のクロロフィル含量よりも低くない。他の実施形態において、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物のクロロフィル含量は、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物よりも約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%もしくは1%高いかまたは低い。他の実施形態において、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の幹の高さは、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物と実質的に同じであり、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物のクロロフィル含量は、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物と実質的に同じである。例えば、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の幹の高さは、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物の幹の高さよりも低くなく、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物のクロロフィル含量は、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物のクロロフィル含量よりも低くない。他の実施形態において、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の幹の高さは、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物よりも約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%もしくは1%高いかまたは低く、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物のクロロフィル含量は、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物よりも約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%もしくは1%高いかまたは低い。他の実施形態において、以下の特性：変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の成熟度、植物あたりの葉の数、幹の高さ、葉の着生角度、葉のサイズ(幅および長さ)、節間距離、葉身中肋比および葉の色、のいずれか1つ以上が畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物と実質的に同じである。
他の側面において、植物の少なくとも一部(例えば葉)において遊離メチオニンの濃度を増加させる方法であって、(i)植物においてトレオニン合成酵素の発現または活性を低下させる段階であって、好ましくは、トレオニン合成酵素が本明細書に記載のポリヌクレオチド配列または本明細書に記載のポリペプチド配列を含む前記段階；(ii)段階(i)で得られた変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の少なくとも一部(例えば葉)におけるメチオニンの濃度を測定する段階；および(iii)対照植物と比較してその中の遊離メチオニンの濃度が増加している変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物を同定する段階を含む前記方法が提供される。適切には、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、前記変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の全体の外観は対照植物と実質的に同じである。適切には、遊離トレオニン濃度は、植物の一部分、例えば葉において対照植物と比較して増加される。
対照植物と比較してのトレオニン合成酵素の発現の低下は、約5%〜約100%、約5%〜約99%以下、約5%〜約95%以下、約5%〜約90%以下であることもできるし、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%の低下であることもできる。該低下は転写活性および／またはタンパク質発現の低下を含む。一実施形態において、トレオニン合成酵素の発現の低下は、発現の部分的低下であり、これは転写活性および／またはタンパク質発現の低下を含む。一実施形態において、発現の部分的低下は、変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物または植物細胞に残存レベルのトレオニン合成酵素を維持させる。
対照植物と比較してのトレオニン合成酵素の活性の低下は、約5%〜約100%、約5%〜約99%以下、約5%〜約95%以下、約5%〜約90%以下であることもできるし、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%以上の低下であることもできる。一実施形態において、トレオニン合成酵素の活性の低下は活性の部分的低下である。一実施形態において、活性の部分的低下は、変異植物、天然に存在しない植物もしくはトランスジェニック植物または植物細胞に残存レベルのトレオニン合成酵素を維持させる。
対照植物と比較しての遊離トレオニン濃度の増加は、約5%〜約100%の増加であることもできるし、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%までの増加であることもできる。
特定の実施形態において、配列番号1または配列番号2または配列番号3または配列番号20の発現あるいはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下される(例えば、サイレンシングされるかまたは抑制される)。特定の実施形態において、配列番号1および配列番号2または配列番号3または配列番号20の発現あるいはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下される(例えば、サイレンシングされるかまたは抑制される)。特定の実施形態において、配列番号1または配列番号2および配列番号3または配列番号20の発現あるいはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下される(例えば、サイレンシングされるかまたは抑制される)。特定の実施形態において、配列番号1または配列番号2または配列番号3および配列番号20の発現あるいはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下される(例えば、サイレンシングされるかまたは抑制される)。特定の実施形態において、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号20の発現あるいはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下される(例えば、サイレンシングされるかまたは抑制される)。特定の実施形態において、配列番号2、配列番号3および配列番号20の発現あるいはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下される(例えば、サイレンシングされるかまたは抑制される)。特定の実施形態において、配列番号2、配列番号3および配列番号20の発現あるいはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下される(例えば、サイレンシングされるかまたは抑制される)。特定の実施形態において、配列番号1、配列番号3および配列番号20の発現あるいはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下される(例えば、サイレンシングされるかまたは抑制される)。特定の実施形態において、配列番号1、配列番号2および配列番号20の発現あるいはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下される(例えば、サイレンシングされるかまたは抑制される)。特定の実施形態において、配列番号1、配列番号2および配列番号3の発現あるいはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下される(例えば、サイレンシングされるかまたは抑制される)。特定の実施形態において、配列番号1、配列番号2または配列番号3のそれぞれの発現あるいはそれによってコードされるタンパク質のそれぞれの活性が、個々にまたは組み合わせで、配列番号20の発現よりもかなりな程度低下される。一実施形態において、許容される視覚的外観の植物を得るために、外因性成分、例えばアミノ酸、例えば、トレオニンおよび／またはイソロイシンの添加を必要としない。
一目的は、対照植物と比較して、遊離メチオニンのレベルの増加を示すと同時に同じ視覚的外観および1以上の作物学特性を実質的に維持する変異植物、トランスジェニック植物または天然に存在しない植物を提供することである。従って、対照タバコ細胞または対照植物と比較して遊離メチオニンのレベルが増加し、トレオニン合成酵素の活性または発現が低下した変異植物、トランスジェニック植物もしくは天然に存在しない植物または遺伝子改変細胞が本明細書に記載される。変異植物、トランスジェニック植物もしくは天然に存在しない植物または細胞が、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列、好ましくは、トレオニン合成酵素をコードする配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなり、配列番号1、配列番号2および／または配列番号3に少なくとも87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、99%および100%の配列同一性を有する1以上のポリヌクレオチドによってコードされるか、あるいはトレオニン合成酵素をコードする配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなり、配列番号4、配列番号5、配列番号6または配列番号20に少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または100%の配列同一性を有する1以上のポリヌクレオチドによってコードされる1以上のポリペプチドの発現を低下させることによって、トレオニン合成酵素の合成を低下させるように改変された。
さらなる側面は、トレオニン合成酵素の発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下し、植物の一部分(例えば葉)が、トレオニン合成酵素の発現または活性が低下していない対照植物と比較して少なくとも5%のメチオニン含量の増加を有する変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物に関する。好ましくは、タバコ製品の煙またはエアゾール中のメチオナール濃度は、対照植物からのタバコ製品の煙またはエアゾールと比較して少なくとも5%増加している。
対照植物と比較してのメチオニン含量の増加は、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または約100%以上であることができる。
タバコ製品から生じる煙またはエアゾール中のメチオナール濃度の増加は、対照植物と比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または約100%以上であることができる。
適切には、前記植物の視覚的外観または1以上の作物学特性は、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物と実質的に同じであり、好ましくは、ここで、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の幹の高さは、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物の幹の高さと実質的に同じであり、かつ／または、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物のクロロフィル含量は、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物のクロロフィル含量と実質的に同じである。
適切には、植物の一部分(例えば葉)における遊離メチオニン濃度は対照植物と比較して増加している。
適切には、(i)植物の一部分(例えば葉)における遊離メチオニン濃度は少なくとも約0.026mg/gであり、適切には少なくとも約0.027mg/gであり、適切には少なくとも約0.028mg/gであり、適切には少なくとも約0.029mg/gであり、適切には少なくとも約0.03mg/gであり、適切には少なくとも約0.031mg/gであり、適切には少なくとも約0.032mg/gであり、適切には少なくとも約0.032mg/gであり、適切には少なくとも約0.033mg/gであり、適切には少なくとも約0.034mg/gであり;
(ii)植物の一部分(例えば葉)における遊離トレオニン濃度は、少なくとも約0.5mg/gであり、適切には少なくとも約0.52mg/gであり、適切には少なくとも約0.54mg/gであり、適切には少なくとも約0.56mg/gであり、適切には少なくとも約0.58mg/gであり、適切には少なくとも約0.6mg/gであり;(iii)植物の一部分(例えば葉)の加熱によるエアゾール中のメチオナール濃度は、少なくとも約2000μg/gであり、適切には少なくとも約2100μg/gであり、適切には少なくとも約2200μg/gであり、適切には少なくとも約2500μg/gであり、適切には少なくとも約2750μg/gであり、適切には少なくとも約3000μg/gであり、適切には少なくとも約3250μg/gであり、適切には少なくとも約3500μg/gであり、適切には少なくとも約3750μg/gであり、適切には少なくとも約3800μg/g以上である。
適切には、(i)植物(例えば葉)の一部分における遊離メチオニン濃度は少なくとも約0.03mg/gであり；(ii)植物(例えば葉)の一部分における遊離トレオニン濃度は約0.5mg/g〜0.65mg/gであり；(iii)植物の一部分(例えば葉)の加熱によるエアゾール中のメチオナール濃度は少なくとも約2200μg/gである。
適切には、(i)植物(例えば葉)の一部分における遊離メチオニン濃度は少なくとも約0.03mg/gであり;(ii)植物(例えば葉)の一部分における遊離トレオニン濃度は約0.5mg/g〜0.65mg/gであり；(iii)植物の一部分(例えば葉)の加熱によるエアゾール中のメチオナール濃度は約2200μg/g〜約4000μg/gであり、適切には約2200μg/g〜約3850μg/gである。
該エアゾールを放出させるために、該植物を100℃以上、例えば少なくとも125℃、少なくとも150℃、少なくとも175℃または少なくとも200℃に加熱することができる。
さらなる側面において、トレオニン合成酵素の発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下し(i)植物の一部分(例えば葉)における遊離メチオニン濃度が約0.03mg/gであり;(ii)植物の一部分(例えば葉)における遊離トレオニン濃度が0.5〜約0.7mg/gであり；(iii)植物の一部分(例えば葉)の加熱によるエアゾール中のメチオナール濃度が少なくとも約2000μg/gであり、適切には、前記植物の視覚的外観または1以上の作物学特性が、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物と実質的に同じであり、好ましくは、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の幹の高さが、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物の幹の高さと実質的に同じであり、かつ／または、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物のクロロフィル含量が、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物のクロロフィル含量と実質的に同じである変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物が提供される。
本開示によれば、有用な系統、変種および雑種をつくるための植物育種プログラムに、改変トレオニン合成酵素対立遺伝子を含む植物を用いることができる。改変対立遺伝子は変異対立遺伝子であることができる。特に、改変トレオニン合成酵素対立遺伝子は、前述の商業的に重要な変種に遺伝子移入される。従って、本明細書に記載の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物を、異なる遺伝的同一性を含む植物と交雑することを含む植物の育種方法が提供される。本方法は、さらに、子孫植物と他の植物とを交雑させ、場合により、望ましい遺伝形質または遺伝的背景を有する子孫が得られるまで交雑を繰り返すことを含むことができる。このような育種方法によって提供される目的の1つは、他の変種、育種系統、雑種または栽培品種、特に商業的利益のあるものに望ましい遺伝形質を導入することである。他の目的は、単一の植物変種、系統、雑種または栽培品種における異なる遺伝子の遺伝子改変のスタッキングを容易にすることである。種内交配ばかりでなく種間交配もまた考えられる。このような交雑に起因する子孫植物は、育種系統とも呼ばれ、本開示の天然に存在しない植物の例である。
一実施形態において、天然に存在しない植物を製造する方法であって、(a)変異植物またはトランスジェニック植物と第2植物とを交雑させて子孫のタバコ種子を得；(b)植物成長条件下で子孫のタバコ種子を成長させて天然に存在しない植物を得ることを含む前記方法が提供される。本方法は、さらに、(c)天然に存在しない植物の前世代と、それ自身または他の植物とを交雑させて子孫のタバコ種子を得；(d)植物成長条件下で段階(c)の子孫のタバコ種子を成長させて追加の天然に存在しない植物を得；(e)(c)および(d)の交雑および成長段階を複数回繰り返して天然に存在しない植物のさらなる世代を作ることを含むことができる。本方法は、場合により、段階(a)の前に、特性決定され、変異植物またはトランスジェニック植物とは同一ではない遺伝的同一性を含む親植物を提供する段階を含むことができる。いくつかの実施形態において、育種プログラムに応じて、天然に存在しない植物の世代をつくるために、0〜2回、0〜3回、0〜4回、0〜5回、0〜6回、0〜7回、0〜8回、0〜9回または0〜10回交雑および成長段階が繰り返される。親の1つの遺伝的同一性に近い遺伝的同一性を有する次世代における子孫植物を得るために、子孫が、その親の1つとその親に遺伝的に類似した他の植物と交配される戻し交雑は、このような方法の一例である。植物育種、特にタバコ植物育種の技術は公知であり、本開示の方法に用いることができる。本開示はさらに、これらの方法によって製造される天然に存在しない植物を提供する。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、バリアントトレオニン合成酵素遺伝子の育種およびスクリーニングから得られた系統は、標準的な畑手順を用いて畑で評価される。元の未変異親を含む対照遺伝子型も含まれ、記載事項はランダム化完全ブロックデザイン(randomized complete block design)または他の適切な畑設計で計画される。タバコについては、標準的作物学技法(standard agronomic practice)が用いられる。例えば、タバコは採取され、計量され、乾燥(curing)中および乾燥後に化学試験または他の通常の試験のためにサンプリングされる。選択された系統の親系統への類似性を確認するために、データの統計解析を行う。場合により、染色体相補対と染色体の対合関係を確認するために、選択された植物の細胞遺伝学解析が行われる。
本明細書に記載の、トレオニン合成酵素遺伝子の改変または変異対立遺伝子の他のタバコへの導入または育種のためのマーカー支援選択(MAS)育種プログラムに、DNAフィンガープリンティング、一塩基多型、マイクロサテライトマーカーまたは類似の技術を用いることができる。例えば、ブリーダーは、農学的に望ましい遺伝子型を有する変異対立遺伝子を含む遺伝子型の雑種形成から分離集団を作り出すことができる。本明細書に記載の技術の1つを用いて、トレオニン合成酵素ゲノム配列またはその断片から開発されたマーカーを用いてF2または戻し交雑世代の植物をスクリーニングすることができる。変異対立遺伝子を有することが明らかにされた植物は、スクリーニングされる第2集団を作り出すために、戻し交雑されるか、または自家受粉されることができる。予想される遺伝パターンまたは用いられるMAS技術に応じて、所望の個々の植物の同定の助けとするために、戻し交雑の各サイクルの前に、選択された植物を自家受粉することが必要な場合がある。反復親の所望の表現型が回復されるまで、戻し交雑または他の育種手順を繰り返すことができる。
本開示に従って、育種プログラムにおいて、交雑の成功によって、受精能力のあるF1植物が得られる。選択されたF1植物は、親の1つと交配されることができ、この第1戻し交雑世代植物は、自家受粉されて集団を生じ、これは再度、バリアントトレオニン合成酵素遺伝子発現に関してスクリーニングされる(例えば、トレオニン合成酵素遺伝子のヌルバージョン)。最終スクリーニングによって、受精能力があり、反復親とかなり類似している植物が提出されるまで、戻し交雑、自家受粉およびスクリーニングのプロセスが、例えば少なくとも4回繰り返される。必要に応じて、この植物は自家受粉され、続いて、その植物がバリアントトレオニン合成酵素遺伝子発現を示すことを確認するために、その子孫を再度スクリーニングする。いくつかの実施形態において、F2世代における植物集団は、バリアントトレオニン合成酵素遺伝子発現に関してスクリーニングされる。例えば、標準法、例えば、本明細書に記載のトレオニン合成酵素のヌクレオチド配列情報に基づくプライマーを用いるPCR法を用いる標準法に従って、トレオニン合成酵素遺伝子の非存在によってトレオニン合成酵素を発現することができない植物が同定される。
第1変種の雌性親植物(すなわち種子親)の自家受粉を妨げ、第2変種の雄性親植物からの花粉を雌性親植物に受精させ、雌性植物にF1雑種種子を形成させることによって雑種変種を製造することができる。花の発達の初期において花を除雄することによって、雌性植物の自家受粉を防ぐことができる。あるいはまた、雄性不稔形を用いることによって、雌性親植物における花粉形成を防ぐことができる。例えば、細胞質雄性不稔(CMS)または、導入遺伝子が小胞子形成および／もしくは花粉形成を抑制するトランスジェニック雄性不稔または自家不和合性によって雄性不稔が生じる。CMSを含む雌性親植物が特に有用である。雌性親植物がCMSである実施形態において、雄性の受精能力のある植物から花粉が採取され、CMS雌性親植物の柱頭に人の手によって付けられ、得られたF1種子が採取される。
本明細書に記載の変種および系統は、単交雑一代雑種を形成させるために使用することができる。このような実施形態において、雄性親植物から雌性親植物への天然の異花受粉を容易にするために、親変種植物は、実質的に均一な自生集団として栽培することができる。慣用法によって、雌性親植物に形成されたF1種子が選択的に採取される。あるいはまた、2つの親植物変種をばらで栽培し、雌性親に形成された一代雑種種子と、自家受粉の結果として雄性親に形成された種子との混合物を採取することもできる。あるいはまた、雌性親として単交雑一代雑種が用いられ、異なる雄性親と交配される三系交雑を行うこともできる。他の選択肢として、2つの異なる単交雑のF1子孫をそれらで交配させた複交雑雑種を作ることができる。
所望の形質または表現型を有する集団のメンバーに関して、変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の集団をスクリーニングまたは選択することができる。例えば、所望の発現レベルのNtTSポリペプチドまたはポリヌクレオチドを有する植物に関して、単一形質転換事象の子孫の集団をスクリーニングすることができる。発現レベルを同定するために、物理的および生化学的方法を用いることができる。これらには、ポリヌクレオチドの検出のためのサザン分析またはPCR増幅；RNA転写物を検出するためのノーザンブロット、S1 RNアーゼプロテクション法、プライマー伸長法またはRT-PCR増幅；ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ；ならびに、ポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈降および酵素免疫測定法が含まれる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの存在または発現を検出するために、in situハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などの他の技術もまた使用することができる。
1以上の組換えポリヌクレオチド、例えば1以上の単離されたNtTSポリヌクレオチド、1以上のポリヌクレオチド構築物、1以上の二本鎖RNA、1以上のコンジュゲートまたは1以上のベクター/発現ベクターを含む変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物細胞および植物が本明細書に記載される。
いくつかの実施形態において、NtTSポリヌクレオチドの発現が低下した植物は、遊離メチオニン濃度、特に葉における遊離メチオニン濃度の増加を有することができる。NtTSポリヌクレオチドの発現が低下していない対応する対照植物における遊離メチオニン濃度と比較して、遊離メチオニン濃度は少なくとも約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%以上増加することができる。
いくつかの実施形態において、NtTSポリヌクレオチドの発現が低下した植物は、遊離トレオニン濃度、特に葉における遊離トレオニン濃度の低下を有することができる。NtTSポリヌクレオチドの発現が低下していない対応する対照植物における遊離トレオニン濃度と比較して、遊離トレオニン濃度は、少なくとも約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%以上減少していることができる。一実施形態において、NtTSポリヌクレオチドの発現が低下していない対応する対照植物における遊離トレオニン濃度と比較して、遊離トレオニン濃度は、少なくとも約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%または80%以上減少していることができる。
NtTSの発現は、例えば、RT-PCR、ノーザンブロット、RNアーゼプロテクション法、プライマー伸長法、ウェスタンブロット、タンパク質ゲル電気泳動、免疫沈降、酵素免疫測定法、チップアッセイおよび質量分析法を含む方法を用いて評価することができる。ポリペプチドが組織選択的プロモーターまたは広域発現プロモーターの制御下に発現される場合、発現は植物全体で評価されることもできるし、選択された組織で評価されることもできることに留意すべきである。同様に、ポリペプチドが特定の期間、例えば発達または誘導における特定の期間に発現される場合、発現は、所望の期間に選択的に評価されることができる。
限定するものではないが、本明細書に記載の植物は、トレオニン合成酵素の発現または活性が調節される前または後に、他の目的のために改変されることができる。本開示の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物において、以下の追加の遺伝子改変の1以上が存在することができる。一実施形態において、改変(単数または複数)のない対照植物またはその部分よりも、重金属含量の低い植物または植物の部分(例えば葉)を得るために、重金属の取り込みまたは重金属の輸送に関与する1以上の遺伝子が改変される。限定するものではない例は、重金属の輸送に関与する重金属排出輸送体(CDF)ファミリー、Zrt-、Irt様タンパク質(ZIP)ファミリー、カチオン交換体(CAX)ファミリー、銅トランスポーター(COPT)ファミリー、重金属P型ATPアーゼ(HMA、WO2009074325の記載による)ファミリー、自然耐性関連マクロファージタンパク質(NRAMP)のホモログのファミリーおよびATP結合カセット(ABC)トランスポーターファミリーに属する遺伝子を含む。本明細書において、用語重金属は遷移金属を含む。他の実施形態において、加熱されたとき、対照植物またはその部分よりも低いレベルの少なくとも1つのタバコ特異的ニトロソアミン(例えば、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン、N-ニトロソノルニコチン、N-ニトロソアナタビンおよびN-ニトロソアナバシン)を生じる植物または植物の部分(例えば葉)を得るために、窒素代謝中間体の変換に関与する1以上の遺伝子が改変される。改変されることができる遺伝子の限定するものではない例は、ニコチンのノルニコチンへの変換に関与し、WO2006091194、WO2008070274、WO2009064771およびPCT/US2011/021088に記載されている、ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子、例えばCYP82E4、CYP82E5およびCYP82E10を含む。
他の改変の例は、除草剤耐性を含む。例えば、グリホサートは、多くの広域スペクトル除草剤の活性成分である。aroA遺伝子(サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella thyphimurium)およびE.コリ(E. coli)からのグリホサートEPSP合成酵素)を導入することによって、グリホサート抵抗性トランスジェニック植物が開発された。アラビドプシスからの変異ALS(アセト乳酸合成酵素)遺伝子を形質転換することによって、スルホニル尿素抵抗性植物が作られた。アトラジン抵抗性トランスジェニック植物を作るために、変異体アマランサス・ヒブリダス(Amaranthus hybridus)からの光化学系IIのOBタンパク質が植物に導入され；細菌クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)からのbxn遺伝子を組み込むことによって、ブロモキシニル抵抗性トランスジェニック植物が作られた。他の例示的な改変は、昆虫に抵抗性を示す植物をもたらす。バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)(Bt)毒素は、ブロッコリーにおいて最近明らかにされたBt抵抗性害虫の出現を遅らせる効果的な方法を提供することができる。組み入れたcry1Acおよびcry1C Bt遺伝子は、いずれか1つのタンパク質に抵抗性を示すコナガの広がりを食い止め、抵抗性昆虫の発生を顕著に遅らせた。他の例示的な改変は、病原体(例えばウイルス、細菌、真菌)によって引き起こされる疾患に耐性を示す植物をもたらす。Xa21遺伝子(白葉枯病に対する耐性)を発現する植物と、Bt融合遺伝子およびキチナーゼ遺伝子の両方(サンカメイガに対する抵抗性およびシースに対する抵抗性)を発現する植物が操作された。他の例示的な改変は、改変された生殖能力、例えば雄性不稔をもたらす。他の例示的な改変は、非生物的ストレス(例えば渇水、温度、塩分)に耐性のある植物をもたらす。耐性のあるトランスジェニック植物は、アラビドプシスからのアシルグリセロールリン酸酵素を導入することによって作られた。マンニトールおよびソルビトールの合成に関与するマンニトール脱水素酵素およびソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子は渇水耐性を改善する。他の例示的な改変は、ヒトでの使用に好ましい免疫原性を有するタンパク質を産生する植物をもたらす。例えば、そのN-グリカンにおいて、α-1,3-結合型フコース残基、β-1,2-結合型キシロース残基またはその両方を実質的に欠くタンパク質を産生することができる植物を使用することができる。他の例示的な改変は、タンパク質およびオイルの貯蔵が改善された植物、光合成効率が増強された植物、長期の保存期限を有する植物、炭水化物含量が改善された植物および真菌に耐性を示す植物ならびにアルカロイドの生合成に関与する酵素をコードする植物をもたらすことができる。S-アデノシル-L-メチオニン(SAM)および／またはシスタチオニンγ合成酵素(CGS)の発現が調節されたトランスジェニック植物もまた考えられる。
1以上のこのような形質は、他のタバコ栽培品種から本開示の変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物に遺伝子移入されることもできるし、またはそれに直接に形質転換されることもできる。本開示の変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物への形質(単数または複数)の遺伝子移入は、当該技術分野で公知の植物育種の任意の方法、例えば、系統育種、戻し交雑、倍加半数体育種などによって達成されることができる(Wernsman, E. A, and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 pp. 参照)。前述の分子生物学ベースの技術、特にRFLPおよびマイクロサテライトマーカーは、反復親と最も高い程度の遺伝的同一性を有する子孫を同定する戻し交雑において用いることができる。これによって、反復親と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも99%遺伝的同一性を有し、より好ましくは、反復親と遺伝的に同一であり、ドナー親から遺伝子移入された形質(単数または複数)をさらに含む変種の産生を速めることが可能になる。遺伝的同一性のこのような決定は、当該技術分野で公知の分子マーカーに基づくことができる。
導入される核酸(単数または複数)のための純粋な育種子孫を得るために、最後の戻し交雑世代を自殖することができる。得られた植物は、一般に、導入された形質(単数または複数)(例えば、1以上の単一遺伝子形質)に加えて、本開示の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の本質的にすべての形態学的および生理学的特性を有する。適切な試験プロトコルを決定するためには、正確な戻し交雑プロトコルは、改変される形質に左右される。導入される形質が優位な対立遺伝子である場合は、戻し交雑方法は簡単であるが、劣性対立遺伝子もまた導入することができる。この場合は、所望の形質の導入に成功したかどうかを決定するために、子孫の検査を取り入れることが必要である場合がある。
種々の実施形態は、NtTSポリヌクレオチドの発現レベルが低下し、その中の、特に限定するものではないが葉の中の遊離メチオニン濃度が増加した変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物ばかりでなく、バイオマスもまた提供する。
このような植物、特にタバコ植物の一部、より具体的には、タバコ植物の葉身および中骨は、エアゾール形成材料、エアゾール形成装置、喫煙物品、喫煙用物品、無煙製品およびタバコ製品を含むがこれに限定されない種々の消費財の製造に組み込まれることもできるし、使用されることもできる。エアゾール形成材料、特にニコチンエアゾール形成材料の例は、限定するものではないが、タバコ組成物、タバコ、タバコ抽出物、刻みタバコ、カットフィラー、乾燥タバコ、膨張タバコ、破砕タバコ、再構成タバコおよびパイプタバコを含む。喫煙物品および喫煙用物品は、ニコチンエアゾール形成装置を含むエアゾール形成装置のタイプである。喫煙物品または喫煙用物品の例は、限定するものではないが、紙巻きタバコ、シガリロおよび葉巻を含む。無煙製品の例は、噛みタバコおよびかぎタバコを含む。特定のエアゾール形成装置において、タバコ組成物または他のエアゾール形成材料は、燃焼よりはむしろ、エアゾールを形成させる1以上の電熱線によって加熱される。他のタイプの加熱エアゾール形成装置において、物理的にエアゾール形成材料を分けるために、熱源内、熱源の周り、熱源に隣接して、または熱源の下流に位置する燃焼性燃料体からの熱を伝えることによってエアゾールが形成される。無煙タバコ製品および種々のタバコ含有エアゾール形成材料は、任意の形式で、他の成分、例えば薄片、フィルム、錠剤、フォームまたはビーズに沈着された、混合された、囲まれた、または他の風に混合された、乾燥粒子、破片、顆粒、粉末またはスラリーを含む任意の形態のタバコを含むことができる。本明細書において、用語‘煙’は、喫煙物品、例えば紙巻きタバコ(例えばたばこの煙)によって生じるか、またはエアゾール形成材料を燃焼させることによって生じるエアゾールのタイプを説明するために用いられる。
一実施形態において、本明細書に記載の変異体、トランスジェニックおよび天然に存在しないタバコ植物からの乾燥葉または乾燥植物部分を含む乾燥植物材料もまた提供される。緑色タバコ葉を乾燥させるプロセスは、当業者には公知であり、限定するものではないが、空気乾燥、火力乾燥、鉄管乾燥および天日乾燥を含む。緑色タバコ葉を乾燥するプロセスは、採取したタバコのタイプに左右される。例えば、Virginia flue(bright)タバコは一般的には鉄管乾燥され、バーレーおよび特定のダーク株は通例空気乾燥され、パイプタバコ、噛みタバコおよびかぎタバコは通例火力乾燥される。
他の実施形態において、本明細書に記載の変異タバコ植物、トランスジェニックタバコ植物または天然に存在しないタバコ植物の葉から製造される葉、好ましくは乾燥葉を含むニコチンエアゾール形成材料またはタバコ含有エアゾール形成材料を含むタバコ製品が開示される。本明細書に記載のタバコ製品は、未改変タバコ植物を含むタバコ植物の1以上の他の変種からのタバコをさらに含むことができるブレンドタバコ製品であることができる。
本開示のエアゾール形成材料またはタバコ組成物における遊離メチオニンのパーセンテージは、非変異植物、天然に存在しない植物または非トランスジェニックカウンターパート植物由来のエアゾール形成材料またはタバコ組成物と比較して、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、t、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%および100%以上の値である。
変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物は、他の用途、例えば農業における用途を有することができる。例えば、本明細書に記載の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物は、動物飼料およびヒト食品を製造するために用いることができる。
本開示はまた、種子を製造する方法であって、本明細書に記載の変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物を栽培し、栽培した植物から種子を採取することを含む前記方法を提供する。本明細書に記載の植物からの種子は、コンディショニングし、当該技術分野で公知の手段によって包装材料に入れて製品を作ることができる。紙および布などの包装材料は当該分野で公知である。種子の包装は、その中の種子の性質を説明するラベル、例えば、包装材料に固定したタグもしくはラベル、包装材料上に印刷したラベルまたは、包装内に挿入したラベルを有することができる。
さらなる側面は、メチオナールを製造する方法であって、(a)変異植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物の一部分;バイオマス、種子または葉;または本明細書に記載のエアゾール形成材料を提供する段階；および(b)それらに熱を加える段階を含む前記方法に関する。
同定、選択または育種のために植物を遺伝子型決定するための組成物、方法およびキットが本開示に含まれ、ポリヌクレオチド試料中のNtTSポリヌクレオチドの存在を検出する手段を含むことができる。従って、NtTSポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に増幅するための1以上のプライマーを含み、場合により1以上のプローブを含み、場合により増幅または検出を行うための1以上の試薬を含む組成物が開示される。従って、NtTSポリヌクレオチドに対応する約10以上の連続ポリヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが開示される。前記プライマーまたはプローブは、NtTSポリヌクレオチドにハイブリダイズする(例えば特異的にハイブリダイズする)約15、20、25、30、40、45または50以上の連続ポリヌクレオチドを含むか、またはそれらからなることができる。いくつかの実施形態において、プライマーまたはプローブは、遺伝子同定の配列依存的方法(例えば、サザンハイブリダイゼーション)または単離(例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのin situハイブリダイゼーション)または遺伝子検出(例えば、核酸増幅または検出における1以上の増幅として)に用いることができる約10〜50連続ヌクレオチド、約10〜40連続ヌクレオチド、約10〜30連続ヌクレオチドまたは約15〜30連続ヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。1以上の特異的プライマーまたはプローブは、NtTSポリヌクレオチドの一部または全部を増幅または検出するために設計または使用することができる。具体例として、DNAまたはRNAなどのNtTS核酸をコードする核酸フラグメントを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおいて2つのプライマーを用いることができる。また、NtTS核酸配列由来の1つのプライマーと、NtTS核酸配列の上流または下流の配列、例えばNtTSプロモーター配列、mRNA前駆体の3'末端またはベクター由来の配列にハイブリダイズするもう1つのプライマーとを用いるポリメラーゼ連鎖反応を行うこともできる。ポリヌクレオチドのin vitro増幅に有用な加熱および等温技術の例は当該分野で公知である。試料は、本明細書に記載の植物、植物細胞もしくは植物材料または該植物、植物細胞もしくは植物材料から製造されたか、もしくはそれら由来のタバコ製品であるか、またはそれら由来であることができる。
従って、他の側面において、試料中のNtTSポリヌクレオチドを検出する方法であって、(a)ポリヌクレオチドを含むか、またはそれを含むことが疑われる試料を提供する段階；(b)NtTSポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に検出するための1以上のプライマーまたは1以上のプローブと前記試料を接触させる段階；および(c)増幅産物の存在を検出する段階であって、ここで増幅産物の存在が、試料中のNtTSポリヌクレオチドの存在を示す前記段階もまた提供される。他の側面において、NtTSポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に検出するための1以上のプライマーまたはプローブの使用もまた提供される。NtTSポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に検出するための1以上のプライマーまたはプローブを含む、NtTSポリヌクレオチドの少なくとも一部を検出するためのキットもまた提供される。該キットは、ポリヌクレオチドの増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のための試薬を含むこともできるし、核酸プローブハイブリダイゼーション検出技術、例えばサザンブロット、ノーザンブロット、in situハイブリダイゼーションまたはマイクロアレイのための試薬を含むこともできる。該キットは、抗体結合検出技術、例えばウェスタンブロット、ELISA、SELDI質量分析法またはテストストリップのための試薬を含むことができる。該キットは、DNA配列決定のための試薬を含むことができる。該キットは、メチオニン、トレオニンおよび／またはメチオナール含量を測定するための試薬および／または使用説明書を含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、開示された方法の1以上のための使用説明書を含むことができる。開示されたキットは、遺伝的同一性の決定、系統発生の研究、遺伝子型決定、ハプロタイプ解析、系統解析または植物育種、特に共優性スコアリングを有する植物育種に有用であることができる。
本開示はまた、NtTSポリヌクレオチドを含む植物、植物細胞または植物材料の遺伝子型決定の方法を提供する。遺伝子型決定は、染色体対のホモログを識別する手段を提供し、植物集団における分離個体を識別するために用いることができる。分子マーカー法は、系統学的研究、作物の変種間の遺伝的関係の特徴付け、交雑種または体細胞雑種の同定、単一遺伝子形質に影響を及ぼす染色体部分の限定、マップベースクローニングおよび量的遺伝研究に用いることができる。特定の遺伝子型決定方法には、増幅断片長多型(AFLP)を含む任意の数の分子マーカー解析技術を用いることができる。AFLPは、ヌクレオチド配列変異性によって引き起こされる増幅断片間の対立遺伝子の相違の結果である。従って、本開示はさらに、NtTS遺伝子または核酸の分離ばかりでなく、AFLP解析のような技術を用いるこれらの遺伝子または核酸に遺伝的に連結した染色体配列を追跡する手段を提供する。
トレオニン合成酵素サイレンシングによって得られた植物において産生されるメチオニンと乾燥タバコにおいて見出された化学化合物との相関を、質量分析法を用い、乾燥葉においてモニターした。植物抽出物の質量分析法プロフィールは、植物におけるトレオニン合成酵素のサイレンシングが、植物における変化を増強させることを示している。なぜなら、対照植物からの抽出物と比較して、トレオニン合成酵素がサイレンシングされた系統において、4つのピークが改変されたプロフィールを示したからである(図1参照)。3つのピークは存在量が増加し、1つのピークは存在量が減少している。プロフィールにおけるこれらの変化は、エアゾール中のメチオナールレベルが増加する見込みのある植物を同定するために用いることができる。従って、他の側面において、加熱によるエアゾール中に増加したレベルのメチオナールを放出するタバコ材料を同定する方法であって、(a)タバコ材料の試料を調製する段階；(b)試料の分子量プロフィールを測定する段階；および(c)1以上の質量電荷比における分子量プロフィールと対照植物のそれとを比較する段階であって、対照植物と比較しての質量電荷比の特定の変化が、エアゾール中のメチオナールレベルが増加することを示唆する前記段階を含む前記方法が提供される。適切には、分子量は、質量分析法、好ましくは液体クロマトグラフィー-質量分析法(LC-MS)、ガスクロマトグラフィー-質量分析法(GC-MS)によって測定される。他の側面において、本方法によって同定されるか、または同定可能なタバコ材料が提供される。
以下の実施例において本開示をさらに説明するが、これらは本発明をさらに詳細に説明するために提供される。これらの実施例は、本発明を実施するために現在考えられる好ましい方法を述べたものであって、本発明を限定するものではない。
タバコトレオニン合成酵素の同定
Tobacco Genome Initiativeにおいて見出されるタバコEST配列を用いてタバコトレオニン合成酵素遺伝子が同定される。タバコトレオニン合成酵素に近接する他のタバコESTコンティグ(NCBI_45312-v2pep-fl)をNCBI EST配列からアセンブルする。このコード配列は、タバコトレオニン合成酵素と正確に同じ長さ(1569bp)を有する。DNAマイクロアレイエクソンAffymetrixチップ(NtPMIa1g193542e1からの配列プローブ)を用いるデータは、タバコトレオニン合成酵素が、N.タバカムの根、トリコーム、緑葉および老化葉において等しく発現されていることを示す。鉄管乾燥(K326、K399)タバコとバーレー(TN90、Bu64)タバコの間で、遺伝子発現レベルの大きな変化は見られなかった。さらに、寒冷ストレスおよびカドミウムストレスは、タバコトレオニン合成酵素の発現レベルに影響を及ぼさない。このことは、このトレオニン合成酵素がタバコ葉において構成的に発現されていることを強く示唆する。
シスタチオニンγ合成酵素(CGS)の過剰発現
文献の記載に従い、古典的なリーフディスク法を用いて、アグロバクテリウム・ツメファキエンス(Agrobacterium tumefasciens)によって、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの転写調節下、アラビドプシス・タリアナCGS(MT01、TAIR Accession AT3901120)がバーレータバコTN90に導入される。カナマイシン抗生物質選択遺伝子もまた挿入される。
タバコ植物におけるトレオニン合成酵素発現のサイレンシング
RNAiアプローチを用い、タバコにおけるNtTSをサイレンシングするために、配列番号1のDNA断片を用いてプライマーを作成する。用いるプライマーは5'-ctgaaatcgacagcgatgata-3'(配列番号9)および5'-caaccaatagctaacggagctt-3'(配列番号10)である。対応するRNAi配列は、逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によってcDNAから増幅し、次いで、製造業者(Invitrogen社)の指示に厳密に従って、エントリーベクターによってGatewayベクターpB7GWIWG2(II)に挿入される。このベクターは、植物のすべての組織における導入遺伝子の構成発現のためのプロモーター(カリフラワーモザイクウイルスCaMV 35Sプロモーター)および寒天平板上でのカナマイシン抗生物質選択(100mg/ml)のためのカナマイシン遺伝子を含む。次いで、古典的リーフディスク法を用いて、アグロバクテリウム・ツメファキエンスによって、バーレータバコTN90のゲノムにこの構築物を挿入する。カルスから、個々の系統が再生され、カナマイシンに対して選択される。RNAiサイレンシングに関して、(i)ゲノムDNAに対して35Sプロモーター内の1つのプライマー(5’-gagcatcgtggaaaaagaagac-3')およびサイレンシングに用いる断片内の1つのプライマー(5’-aagctccgttagctattggttg-3')を用いるRT-PCRによってT0系統をモニターし、種子を作らせ、次いで(ii)サイレンシングに用いる挿入物に隣接する特異的プライマー(5'-ttgattcacgtgtcggtaagac-3')を用いるRT-PCRによってモニターして種子を作らせる。T1種子を採取し、カナマイシン含有寒天上で再栽培し、T0小植物と全く同様にモニターする。ゲノムgDNAに対するPCRは、NtTS DNA断片がゲノムに挿入され、タバコトレオニン合成酵素を効果的にサイレンシングすることを示す。
トレオニン合成酵素がサイレンシングされたタバコ植物の栽培
カナマイシン抵抗性植物は、畑(ケンタッキー州、米国)における栽培の前に、フローティングトレイにおいて栽培される。サイレンシングされたトレオニン合成酵素系統の20本の植物(NtTS-RNAi系統;実施例2)、シスタチオニンγ合成酵素系統(実施例3)、ベクター対照(VC、pB7GWIWG2(II))およびTN90 USバックグラウンドタバコを、20本の植物を4連で栽培する。畑移植3ヶ月後(摘心36日後)、各連の20本の中から10本の同一の植物において幹中央部における1つの葉の試料を採取する。この葉(”緑葉”)を直ちにドライアイス中に保存し、凍結乾燥する。最良の2つの系統からの10本の植物を選択し、次いで、バーレーの農業規範に従って乾燥する。乾燥後、幹中央部の3枚の葉の試料を採取する。サイレンシングされたトレオニン合成酵素系統におけるサイレンシング効果をモニターし、シスタチオニンγ合成酵素系統と比較するために、3つの系統からの”緑葉”をすりつぶし、遊離アミノ酸解析に供する。
メチオナール分析
前述の系統を用い、LC-MSを用いて、トレオニン合成酵素のサイレンシングによって得られた緑葉において産生されるメチオニンと、乾燥タバコにおいて見出される化学化合物との相関を乾燥葉においてモニターする。メタノールで抽出を行う。用いる装置は、MSに連結されたWaters Acquity UPLCシステムである。カラムはWatersXBridge Shield RP18であり、移動層Aとして水:アセトニトリル(95:5v/v)を用い、移動層Bとしてメタノールを用いる。このLC-MSプロフィールは、緑葉におけるトレオニン合成酵素のサイレンシングが、乾燥葉における化学的シグナルを増強させることを示す。実際、対照と比較して、トレオニン合成酵素がサイレンシングされた系統において、4つのピークが改変されたプロフィールを示した(図1参照)。3つのピークは明確に存在量が増加し、1つは減少する。緑葉に蓄積するメチオニンは、乾燥葉において、分解硫黄産物またはメチオニン誘導体のいずれかに変換されることをこのことは示している。
メチオニンはメチオナールの可能な前駆体であるため、乾燥タバコ(TN90、VC、NtTS-1、NtTS-1およびNtTS-3、選択された登録された複製系統)を加熱して形成させ、コールドトラップに捕集したエアゾール中のメチオナール含量を分析した。用いる発煙プラットフォームは、2秒間12回の吹かし(Puff)のレジメンを含むMacor型熱源(54W)を備える喫煙シミュレーターである。発煙の前に、タバコの乾燥した葉身を刻み、20%グリセリンを含侵させた。含侵乾燥タバコ(100mg、3回のフル反復試験)を加熱することによって生成したエアゾールを、Air Liquidによって開発された極低温システムを用いて濃縮し、ジクロロメタンに溶解した(2回、5mL)。誘導体化した後、GC-MSによって、エアゾール溶液中のメチオナールレベルを測定した。Single Ion Monitoring(SIM)モードで、最も豊富なシグナルを生成するイオンを用いて定量的データを得た。
トレオニン合成酵素のサイレンシングによって得られた、緑葉において産生されるメチオニンと、乾燥タバコにおいて見られる化学化合物との相関を、前述の複製系統を用い、LC-MSを用いて、乾燥葉において、モニターした。メタノールで抽出を行った。用いる装置は、MSに連結されたWaters Acquity UPLCシステムである。カラムはWatersXBridge Shield RP18であり、移動層Aとして水:アセトニトリル(95:5v/v)を用い、移動層Bとしてメタノールを用いた。結果を表1に示す。
表1に示すように、NtTS-RNAi植物は、対照植物との視覚的違いを何ら示さなかった。例えば、トレオニン合成酵素がサイレンシングされたタバコ植物の草高およびクロロフィル含量は対照植物とほぼ同一であった。トレオニン合成酵素がサイレンシングされたタバコ植物の緑葉における遊離メチオニン濃度は、対照植物よりも高かった。トレオニン合成酵素がサイレンシングされたタバコ植物におけるエアゾール中のメチオナール濃度は対照植物よりも高かった。トレオニン合成酵素がサイレンシングされたタバコ植物における緑葉のトレオニン含量は、対照植物と比較して20%を超える低下を示した。
NtTS-RNAiタバコ系統におけるトレオニン合成酵素発現解析
開始コドンから終止コドンまでの1587塩基のコンセンサス配列に関して、配列番号1、2、3および20をアラインメントした。配列番号1、2および3間では相同であり、配列番号20とは異なる断片領域は、配列番号1、2および3のヌクレオチド1〜46と配列番号20のヌクレオチド1〜52；配列番号1のヌクレオチド99〜141；配列番号2および配列番号3のヌクレオチド102〜144と配列番号20のヌクレオチド102〜153；ならびに配列番号1、2および3のヌクレオチド1325〜1362と配列番号20のヌクレオチド1334〜1371である。これらの配列は、配列番号1、2、3に特異的なプライマーを設計するために用いられる。配列番号20に特異的な1組のプライマーもまた設計される。
配列番号1のヌクレオチド454〜805；配列番号2のヌクレオチド454〜805；配列番号3のヌクレオチド456〜805；および配列番号20のヌクレオチド463〜814に対応する領域を用いてNtTS-RNAi系統が作成される。RNAiサイレンシングのための導入遺伝子(単数または複数)を陽性発現する(gDNAにおける35Sプロモーターの存在に関してPCRで試験した)3つの独立したNtTS-RNAi系統(NtTS1、NtTS2およびNtTS3)からの3つの個々の植物を、配列番号1、2および3に特異的なプライマーならびに配列番号20に特異的なプライマーを用いて半定量的RT-PCRに供する。ハウスキーピング遺伝子の発現の対照としてチューブリンを用いる。配列番号1、2、3および20に関連する転写物の発現の対照として3つのバーレーTN90植物を用いる。
半定量的RT-PCRにおいて、配列番号1、2および3に特異的なプライマーまたは配列番号3のみに特異的なプライマーまたは配列番号1および2のみに特異的なプライマーを用いることによって、対照と比較して、3つの独立したNtTS-RNAi系統のそれぞれにおいて、トレオニン合成酵素発現の部分的サイレンシングが起きたことが示される。配列番号20に特異的なプライマーを用いることによって、NtTS-RNAi植物における部分的サイレンシングが起き、サイレンシングのレベルが、配列番号1〜3で達成されたレベルよりも低いことが示される。配列番号3に関して、配列番号20よりもサイレンシングがより有効であることが観察されたが、これらの配列間の%配列同一性は同一である。
本明細書に引用または記載された刊行物は、いずれも、本願の出願日前に開示された関連情報を提供するものである。本明細書に記載の何物も、本発明者が、このような開示に先行することの資格を与えられないことの承認として解釈してはならない。上記明細書に記載のすべての刊行物は参照により本願に組み込まれる。本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく、本開示の種々の改変および変更をなしうることは、当業者に明らかであろう。特定の好ましい実施形態と関連して本発明を説明してきたが、特許請求される本発明が、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されなければならない。実際、細胞生物学、分子生物学および植物生物学または関連分野における当業者には明らかな、本発明を実施するために記載された方法の種々の改変は、以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。
表１
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〔配列〕
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Claims (16)

  1. タバコ植物の少なくとも一部分において遊離メチオニン濃度を増加させる方法であって、
    (a)タバコ植物においてトレオニン合成酵素の発現または活性を低下させる段階であって、タバコ植物が、
    (i)トレオニン合成酵素をコードし、かつ配列番号1、配列番号2もしくは配列番号3に少なくとも90%の配列同一性を有するか、または配列番号4もしくは配列番号5に少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるポリヌクレオチド；
    (ii)(i)に記載の前記ポリヌクレオチドのいずれか1つによってコードされるポリペプチド;または
    (iii)配列番号6、配列番号7もしくは配列番号8に少なくとも95%の配列同一性を有し、かつトレオニン合成酵素活性を有するポリペプチド；
    を含む前記段階；
    (b)段階(a)で得られた変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物の少なくとも一部分において遊離メチオニン濃度を測定する段階；および
    (c)変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物を同定する段階であって、前記植物中の遊離メチオニン濃度が、トレオニン合成酵素の発現または活性が低下していない対照植物と比較して増加しており、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、前記変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物の視覚的外観が対照植物と実質的に同じである前記段階
    を含む前記方法。
  2. 請求項1に記載の方法によって得られたか、または得ることができる、変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物、またはトランスジェニックタバコ植物または前記タバコ植物から誘導されたか、誘導されることができる、タバコ植物材料。
  3. 変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物であって、
    (i)トレオニン合成酵素をコードし、かつ配列番号1、配列番号2もしくは配列番号3に少なくとも90%の配列同一性を有するか、または配列番号4もしくは配列番号5に少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるポリヌクレオチド；
    (ii)(i)に記載の前記ポリヌクレオチドのいずれか1つによってコードされるポリペプチド;
    (iii)配列番号6、配列番号7もしくは配列番号8に少なくとも95%の配列同一性を有し、かつトレオニン合成酵素活性を有するポリペプチド；または
    (iv)(i)に記載の前記ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクター
    を含み、
    トレオニン合成酵素の発現または活性が低下していない対照タバコ植物と比較して、トレオニン合成酵素の発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下し、植物の一部分が少なくともメチオニン含量の5%の増加を有し、エアゾール中のメチオナール濃度が、対照植物からのエアゾールと比較して少なくとも5%増加している変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物。
  4. 畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、前記植物の視覚的外観が対照植物と実質的に同じである、請求項3に記載の変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物。
  5. 変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物の幹の高さが、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に対照植物の幹の高さと実質的に同じであり、かつ／または変異タバコ植物、天然に存在しない植物またはトランスジェニック植物のクロロフィル含量が、畑移植3ヶ月後または摘心36日後に、対照植物のクロロフィル含量と実質的に同じである、請求項3又は4に記載の変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物。
  6. 植物の一部分において遊離トレオニン濃度が対照植物と比較して増加している、請求項3、4又は5に記載の変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物。
  7. (i)葉において遊離メチオニン濃度が少なくとも約0.03mg/gであり、(ii)葉において遊離トレオニン濃度が少なくとも約0.5mg/gであり、および(iii)加熱によるエアゾール中のメチオナール濃度が少なくとも約2000μg/gである、請求項6に記載の変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物。
  8. 請求項5〜7のいずれか1つに記載のタバコ植物からの細胞または組織を含む種子。
  9. 請求項5〜7のいずれか1つに記載のタバコ植物からの細胞または組織を含むバイオマスまたは葉を含む植物材料。
  10. 請求項5〜7のいずれか1つに記載のタバコ植物の一部分または請求項9に記載の植物材料を含むタバコ製品。
  11. メチオナールを製造する方法であって、
    (a)請求項5〜7のいずれか1つに記載の変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物もしくはトランスジェニックタバコ植物の一部分、請求項9に記載の植物材料または請求項10に記載のタバコ製品を提供する段階；および
    (b)それらに熱を加える段階
    を含む前記方法。
  12. 試料中のトレオニン合成酵素をコードし、かつ配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号20に少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを検出する方法であって、
    (a)前記ポリヌクレオチドを含むか、またはそれを含むことが疑われる試料を提供する段階；
    (b)前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に検出するための1以上のプライマーまたは1以上のプローブと前記試料を接触させる段階；および
    (c)増幅産物の存在を検出する段階であって、ここで増幅産物の存在が、その試料中の前記ポリヌクレオチドの存在を示す前記段階
    を含む前記方法。
  13. メチオニン濃度が、対照植物と比較して増加している、変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物において使用する為の、トレオニン合成酵素をコードし、かつ配列番号1、配列番号2もしくは配列番号3に少なくとも90%の配列同一性を有するか、または配列番号4もしくは配列番号5に少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる単離されたポリヌクレオチド。
  14. メチオニン濃度が、対照植物と比較して増加している、変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物において使用する為の、請求項13に記載のポリヌクレオチドのいずれか1つによってコードされる単離されたポリペプチド。
  15. メチオニン濃度が、対照植物と比較して増加している、変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物において使用する為の、配列番号6、配列番号7または配列番号8に少なくとも95%の配列同一性を有し、かつトレオニン合成酵素活性を有する、単離されたポリペプチド。
  16. メチオニン濃度が、対照植物と比較して増加している、変異タバコ植物、天然に存在しないタバコ植物またはトランスジェニックタバコ植物において使用する為の、請求項13に記載のポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクター。
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