BR112014004641B1

BR112014004641B1 - Método para aumento da concentração de metionina livre em pelo menos uma parte de uma planta de tabaco e método para produção de metional

Info

Publication number: BR112014004641B1
Application number: BR112014004641-7A
Authority: BR
Inventors: Lucien Bovet; Nicolas Sierro
Original assignee: Philip Morris Products S.A
Priority date: 2011-09-02
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2022-08-09
Also published as: AU2012301350A1; IL231100A0; EP2565271A1; JP6225108B2; SG11201400216VA; JP2014533926A; UA116438C2; ES2685797T3; US20150106971A1; IL231100B; US10501732B2; RU2014112759A; KR102012531B1; EP2751273B1; KR20140057642A; AU2012301350B2; BR112014004641A2; RU2689719C2; EP2751273A1; PL2751273T3

Abstract

TREONINA SINTASE DE NICOTIANA TABACUM E MÉTODOS E USOS DA MESMA. A presente invenção refere-se a uma célula de planta mutante, que ocorre não naturalmente, ou transgênica, compreendendo: (i) um polinucleotídeo compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência que codifica uma treonina sintase, e tendo pelo menos 90% de identidade de sequência par a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3, ou pelo menos 87% de identidade de sequência para SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5; (ii) um polipeptídeo codificado por qualquer um de referidos polinucleotí deos colocados em (i); ou (iii) um polipeptídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, ou SEQ ID NO:8; ou (iv) um construto, vetor ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo conforme colocado em (i).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção revela o gene de treonina sintase de Nicotiana tabacum, e variantes, homólogos e fragmentos deste. Em particular, é descrita a modificação da expressão deste gene, ou a atividade da proteína codificada desse modo para aumentar os níveis de metionina livre em plantas - tais como plantas de tabaco. Isto pode ser usado para gerar sabores e aromas desejáveis em tabaco por elevação dos níveis de metional no mesmo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Um aumento nos aromas - tais como substâncias de pro dução de aroma - em tabaco, pode gerar um aroma desejável quando o tabaco é fumado. Tais aromas podem ser obtidos, por exemplo, de aminoácidos que são submetidos a reações de Maillard. Metional (3- (metiltio)propanal) é um composto de aroma responsável por uma aroma de "batata cozida". A produção de metional pode ser induzida termicamente onde metional se origina de metionina e derivados de metionina. A degradação de Strecker de metionina envolve interação com compostos de alfa-dicarbonil, que são intermediários nas reações de Maillard, e resultam na formação de metional. Vários métodos para aumentar a quantidade de metionina livre em plantas foram desenvolvidos, por exemplo, anino ácidos exógenos podem ser adicionados às plantas. Contudo, o uso de aminoácidos exogenamente adicionados resulta em um aumento significante no custo de produção, bem como problemas de segurança e regulatório.

[0003] A biossíntese de metionina e treonina são ambas ligadas à trajetória de aspartato. Nas plantas, suas trajetórias biosintéticas diver- gem no nível de O-fosfohomoserina (OPH). As enzimas cistationina gama-sintase (CGS) e treonina sintase (TS) competem para o substrato comum O-fosfohomoserina. Os níveis de metionina livre podem potencialmente serem aumentados por sobre expressão ou inibição da expressão de enzimas envolvidas na trajetória biosintética de aspartato.

[0004] Uma abordagem possível é sobre expressar cistationina gama-síntese. Outra abordagem é diminuir a expressão de treonina sintase. Contudo, até aqui todos tais esforços direcionados para alterar genes de treonina sintase resultaram em fenótipos que afetam adversamente a planta total.

[0005] Bartlem et al. (2000) Plant Physiol., 2000, 123:101-110) descrevem mutações no gene de treonina sintase de plantas de Arabi- dopsis. Os mutantes revelados que transportam uma mutação de par base simples dentro do gene que codifica treonina sintase exibiram uma sobre-acumulação de metionina e um nível marcadamente reduzido de treonina. Contudo, os mutantes revelados de Arabidopsis sofrem de crescimento reduzido comparados com aqueles do tipo selvagem. O crescimento estudado pode ser resgatado somente sob adição de treonina ou isoleucina.

[0006] Zeh et al. (2001) Plant Physiol., 2001 , 127:792-802 revela plantas de batata transgênicas preparadas por uma abordagem trans- gênica de antisentido usando o promotor 35S do vírus de mosaico da couve-flor constitutivo. Enquanto que as plantas de batata transgêni- cas reveladas exibem altos níveis de metionina, elas também sofrem de crescimento reduzido conforme comparadas com aquela das plantas tipo selvagem.

[0007] Avraham et al. (2005) Transgenic Research, 2005, 1 : 299 311 descrevem plantas de Arabidopsis transgênicas que são preparadas por uma abordagem transgênica de antisentido. Enquanto que, as plantas transgênicas reveladas exibem um nível aumentado de metio- nina, elas sofrem de fenótipos severamente anormais, incluindo retardamento de crescimento considerável, tamanho de folha de roseta reduzido e folhas cloróticas.

[0008] Existe uma necessidade de plantas - tais como plantas de tabaco - que combinem um nível aumentado de metionina livre, enquanto que mantêm certas propriedades agronomicamente desejáveis - tal como taxa de crescimento e tamanho total das plantas - e sem requerer a adição de quaisquer ingredientes exógenos. É um objetivo da presente invenção satisfazer esta necessidade.

ASPECTOS E CONCRETIZAÇÕES DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta que uma redução (por exemplo, inibição) na expressão ou atividade de treonina sintase em plantas ou células de planta - tais como plantas de tabaco ou células de planta - resulta em um aumento na concentração de metionina, em células de planta, ou uma ou mais partes de uma planta, conforme comparada a uma planta de controle ou célula de planta. Surpreendentemente, a planta geneticamente modificada não exibe qualquer mudança em sua aparência visual total conforme comparada a uma planta de controle. Esta descoberta é inesperada em vista dos vários fenótipos adversos observados plantas de Arabidposis transgênicas ou plantas de batata. A descoberta pode ser vantajosamente explorada porque as plantas são usadas para a produção comercial de vários produtos incluindo tabaco onde alterações na aparência visual, ou não seria aceitável para a indústria, ou poderia resultar em rendimentos de produção inaceitavelmente reduzidos. A adição de aminoácido exógeno não é também requerida. Além disso, o aerossol que é liberado após aquecimento do tabaco contém nível elevado de metional, conforme comparado ao tabaco preparado de uma planta de controle. O aumento no metional na fumaça ou aerossol produz um sabor desejável, aroma, ou ambos sabor e aroma quando o tabaco é usado.

[00010] Aspectos e concretizações da presente invenção são colo cados nas reivindicações acompanhantes.

[00011] Em um aspecto, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência que codifica uma treonina sintase, e tendo pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3.

[00012] Em outro aspecto, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência que codifica uma treonina sintase, e tendo pelo menos 87% de identidade de sequência para SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5.

[00013] Em um aspecto adicional, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência que codifica uma treonina sintase, e tendo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO:20.

[00014] Em outro aspecto, é provido um polipeptídeo isolado codificado por qualquer um dos polinucleotídeos da presente invenção.

[00015] Em outro aspecto, é provido um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, ou SEQ ID NO:8.

[00016] Em outro aspecto, é provido um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO:21.

[00017] Em outro aspecto, é provido um construto, vetor ou vetor de expressão compreendendo qualquer um (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais) dos polinucleotídeos da presente invenção.

[00018] Em outro aspecto, é provida uma célula de planta, que ocorre não naturalmente, mutante, ou uma célula de planta transgêni- ca, compreendendo pelo menos um (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais) dos polinucleotídeos, ou pelo menos um (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais) dos polipeptídeos. Em outro aspecto, é provida uma planta que ocorre não naturalmente, mutante, ou uma planta transgê- nica compreendendo a célula de planta, de acordo com a presente in-venção. Adequadamente, a expressão de uma ou mais sequências de codificação de treonina sintase, ou a atividade das proteínas de treoni- na sintase é, desse modo, reduzida, e uma parte da planta de tabaco tem um aumento no teor de metionina de pelo menos 5%, conforme comparado a uma planta de controle de tabaco em que a expressão ou a atividade de treonina sintase não foi reduzida, ou em que a concentração de metional na fumaça ou aerossol é aumentada por pelo menos 5%, conforme comparado à fumaça ou aerossol a partir da planta de controle de tabaco.

[00019] Um aspecto adicional se refere a um método para aumentar a concentração de metionina em pelo menos uma parte de uma planta de tabaco, compreendendo as etapas de: (i) redução da expressão ou atividade de um ou mais treonina sintases (por exemplo, dois ou mais, três ou mais ou quatro ou mais) na planta de tabaco, preferivelmente, em que a treonina sintase compreende a sequência de polinucleotídeo ou a sequência de polipeptídeo aqui descritas; (ii) medição da concentração de metionina em pelo menos uma parte da planta de tabaco que ocorre não naturalmente, mutante, ou planta de tabaco transgêni- ca obtida na etapa (i); e (iii) identificação de uma planta que ocorre não naturalmente, mutante, ou uma planta transgênica de tabaco em que a concentração de metionina nesta aumentou em comparação a uma planta de controle. Preferivelmente, a aparência visual total da planta que ocorre não naturalmente, mutante, ou planta transgênica de taba- co, é substancialmente similar à planta de controle de tabaco, após um período, tal como três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura.

[00020] Em uma concretização, a adição de nutrientes exógenos- tais como aminoácidos - por exemplo, treonina e/ou isoleucina - não é requerida.

[00021] Em outro aspecto, é provida uma planta de tabaco que ocorre não naturalmente, mutante, ou uma planta transgênica de tabaco, ou material de planta de tabaco derivado ou derivável desta, que é obtida ou alcançada por referido método.

[00022] Em outro aspecto, é também provida uma planta de tabaco que ocorre não naturalmente, mutante, ou uma planta transgênica de tabaco, em que a expressão de uma ou mais sequência de codificação de treonina sintase (por exemplo, duas ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais), ou a atividade da proteína de treonina sintase codificada, desse modo, é reduzida, e uma parte da planta de tabaco tem um aumento no teor de metionina de pelo menos 5%, conforme comparada a uma planta de controle de tabaco em que a expressão ou a atividade de treonina sintase não foi reduzida, ou em que a concentração de metional na fumaça ou aerossol é aumentada por pelo menos 5%, conforme comparada à fumaça ou aerossol a partir da planta de controle de tabaco.

[00023] Adequadamente, a aparência total de referida planta é substancialmente similar, ou visualmente indistinguível à planta de controle após um período, tal como, mas não limitado a, três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura. Preferivelmente, (i) a altura do caule da planta de tabaco que ocorre não naturalmente, mutante, ou plantas de tabaco transgênicas, é substancialmente a mesma como a altura do caule da plantas de controle de tabaco após um período, tal como, mas não limitado a, três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura; (ii) o teor de clorofila da planta de tabaco que ocorre não naturalmente, mutante, ou plantas de tabaco transgênicas é substancialmente o mesmo como o teor de clorofila da plantas de controle de tabaco após um período, tal como, mas não limitado a, três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura; ou ambos (i) e (ii).

[00024] Adequadamente, a concentração de treonina em uma parte da planta (por exemplo, as folhas) é aumentada conforme comparada á planta de controle; e, preferivelmente, em que (a) a concentração de metionina na parte da planta (por exemplo, as folhas) é pelo menos cerca de 0,03 mg/g; (b) a concentração de treonina nas folhas é pelo menos cerca de 0,5 mg/g; (c) a concentração de metional na fumaça ou aerossol sob aquecimento é pelo menos cerca de 2000 g; ou uma combinação de dois ou mais de (a), (b) e (c).

[00025] Biomassa, semente ou folhas compreendendo células ou tecido a partir da planta que ocorre não naturalmente, mutante, ou planta transgênica, aqui descritas são também providas. O produto de tabaco compreendendo uma parte da planta que ocorre não naturalmente, mutante, ou planta transgênica, sua biomassa, ou suas folhas, ou uma combinação destes, conforme aqui descritos, são também providos.

[00026] Em um aspecto adicional, é provido um método para produção de metional compreendendo as etapas de: (a) provisão de parte de uma planta de tabaco que ocorre não naturalmente, mutante, ou planta de tabaco transgênica; biomassa, semente ou folhas; ou o produto de tabaco aqui descrito; e (b) provisão de calor a estes. Em um aspecto adicional, é provido um método para identificação de material de tabaco que libera níveis elevados de metional em um aerossol sob aquecimento, compreendendo as etapas de: (a) preparação de uma amostra de material de tabaco; (b) determinação do perfil de massa molecular da amostra; e (c) comparação do perfil de massa molecular em uma ou mais de uma razão de massa:carga; em que o aumento nas razões específicas de massa:carga conforme comparado a uma planta de controle é indicativa que os níveis de metional no aerossol será elevado.

[00027] O material de tabaco identificado ou identificável por este método é também provido em um aspecto adicional da revelação.

[00028] Os aspectos adicionais da presente invenção são colocados abaixo.

[00029] Um gene quimérico compreendendo o polinucleotídeo ope- ravelmente ligado a uma ou mais sequências regulatórias.

[00030] Um construto de Polinucleotídeo de NtTS compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em pelo menos 15-30 nu- cleotídeos, 30-50 nucleotídeos, 50-100 nucleotídeos, 100-150 nucleo- tídeos, 150-200 nucleotídeos, 200-300 nucleotídeos, 300-400 nucleo- tídeos, 400-500 nucleotídeos, 500-600 nucleotídeos ou 600-700 nu- cleotídeos.

[00031] Um produto consumível incorporando ou utilizando material de planta, biomassa, semente ou folhas, de acordo com a presente invenção.

[00032] Uma linhagem de célula compreendendo o (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais) polinucleo- tídeo isolado, o gene quimérico, o construto de polinucleotídeo, o NA de trançado duplo, o conjugado ou o vetor de expressão, e similares, de acordo com a presente invenção.

[00033] Um método para modulação da expressão de NtTS DNA, ou a atividade da proteína desse modo codificada em uma célula, referido método compreendendo administrar o (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais) gene quimérico, o cons- truto de polinucleotídeo, o RNA de trançado duplo, o conjugado, ou o vetor de expressão, de acordo com a presente invenção. Um método para detecção, isolamento, amplificação ou análise de um Polinucleo- tídeo de NtTS, o método compreendendo a etapa de proporcionar uma amostra compreendendo um polinucleotídeo, e hibridização de referido polinucleotídeo a uma molécula de polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos a partir da sequência de nucleotídeo isolada, de acordo com a presente invenção.

[00034] O uso de agente que modula a expressão de NtTS DNA e a atividade da proteína codificada desse modo, ou a atividade da proteína, desse modo, codificada, para redução do teor de metionina em pelo menos uma parte de uma planta por pelo menos 5%, conforme comparado a uma planta de controle.

[00035] O método ou o uso, de acordo com a presente invenção, em que o agente é ou é derivado de DNA de NtTS, um gene de NtTS quimérico, um construto de polinucleotídeo compreendendo o polinu- cleotídeo de NtTS, um RNA de antisentido, um RNA de trançado duplo, um cDNA, um conjugado compreendendo Polinucleotídeo de NtTS e pelo menos uma porção de não nucleotídeo ou de não polinucleotí- deo covalentemente fixada a estes, a hibozima, um mutagênico, uma garra de zinco, uma molécula pequena ou a meganuclease. Em outra concretização, o(s) fragmento(s) de polinucleotídeo codifica(m) uma ácido nucleico de antisentido, uma ribozima, uma RNA que efetua trans-repartição mediada por espliceosome, um RNA de interferência (RNAi), um RNA de guia, ou outro RNA não transposto, e similares. Em outra concretização, o(s) fragmento(s) de polinucleotídeo codifi- ca(m) um RNAi.

[00036] Em um aspecto adicional, é provido um método de produ ção de um produto de tabaco compreendendo as etapas de: (a) obtenção da semente a partir da planta de tabaco que ocorre não natural- mente, mutante, ou planta de tabaco transgênica; (b) plantação e crescimento da semente em uma planta; (c) coleta da planta; e (d) preparação de um produto de tabaco a partir da planta colhida.

[00037] As concretizações acima mencionadas são reveladas como concretizações de cada um dos aspectos acima descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00038] A Figura 1 ilustra os perfis de LC-MS de folhas curadas de VC-4, TN90-4, NtTS1-3, NtTS2-3, NtTS3-2, após extração com metanol e separação em uma coluna WatersXBridge Shield RP18. VC-4 é uma planta de controle de apenas vetor; TN90 é uma planta de tabaco não modificada que proporciona o antecedente; NtTS1-3, NtTS2-3 e NtTS3-2 são plantas de Nicotiana tabacum que têm um gene de treo- nina sintase silenciado por RNAi. As setas indicam os picos a cerca de 5, 9 17 e 19 minutos.

DEFINIÇÕES

[00039] Os termos técnicos e expressões usados dentro do escopo deste pedido são geralmente para serem dados o significado comu- mente aplicado aos mesmos na técnica pertinente de planta e biologia molecular. Todas das seguintes definições de termo se aplicam ao conteúdo completo deste pedido. A palavra "compreendendo" não exclui outros elementos ou etapas, e o artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui uma pluralidade. Uma etapa única pode preencher as funções de várias características citadas nas reivindicações. Os termos "cerca de", "essencialmente" e "aproximadamente", no contexto de um dado valor numerado ou faixa, se referem a um valor ou faixa que está dentro de 20%, dentro de 10%, ou dentro de 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% do dado valor ou faixa.

[00040] O termo "isolado" se refere a qualquer totalidade que é tomada de seu ambiente natural, mas o termo não conota qualquer grau de purificação.

[00041] Um "vetor" se refere a um veículo de ácido nucleico que compreende uma combinação de componentes de ácido nucleico para capacitar o transporte de ácido nucleico, construtos de ácido nucleico, e conjugados de ácido nucleico, e similares. Vetores adequados incluem epissomas capazes de replicação extra-cromossomal, tais como plasmídeos de DNA de trançado duplo, circulares; plasmídeos de DNA de trançado duplo, linearizados; e outros vetores de qualquer origem.

[00042] Um "vetor de expressão" é um veículo de ácido nucleico que compreende uma combinação de componentes de DNA para capacitar a expressão de ácido nucleico, construtos de ácido nucleico, e conjugados de ácido nucleico, e similares. Vetores de expressão adequados incluem epissomas capazes de replicação extra-cromossomal, tais como, plasmídeos de DNA de trançado duplo, circulares; plasmí- deos de DNA de trançado duplo, linearizados; e outros vetores de expressão funcionalmente equivalentes de qualquer origem. Um vetor de expressão compreende pelo menos um promotor posicionado à montante, e operavelmente ligado a um ácido nucleico, construtos de ácido nucleico, ou conjugado de ácido nucleico, conforme definido abaixo.

[00043] O termo "construto" se refere a um fragmento de DNA re- combinante, de trançado duplo compreendendo um ou mais polinucle- otídeos. O construto compreende um "trançado padrão" de base emparelhada com um "trançado de sentido ou de codificação". Um dado construto pode ser inserido em um vetor em duas orientações possíveis, ou na mesma orientação (ou sentido), ou na orientação reversa (ou antessentido) com relação à orientação de um promotor posicionado dentro de um vetor - tal como um vetor de expressão.

[00044] Um “promotor" se refere a um elemento/sequência de ácido nucleico, tipicamente posicionado à montante e operavelmente ligado a um fragmento de DNA de trançado duplo. Os promotores podem ser derivados totalmente de regiões próximas a um gene nativo de inte- resse, ou podem ser compostos de elementos diferentes derivados de promotores nativos diferentes, ou segmentos de DNA sintéticos.

[00045] Os termos "homologia, identidade, ou similaridade", se referem ao grau de similaridade de sequência entre dois polipeptídeos, ou entre duas moléculas de ácido nucleico comparadas por alinhagem- mento de sequência. O grau de homologia entre duas sequências de ácido nucleico discretas sendo comparado é uma função do número de nucleotídeos idênticos, ou de equiparação, em posições comparáveis. A identidade por cento pode ser determinada por inspeção visual e cálculo matemático. Alternativamente, a identidade por cento de duas sequências de ácido nucleico pode ser determinada por comparação de informação de sequência usando um programa de computador, tal como - ClustalW, BLAST, FASTA ou Smith-Waterman.

[00046] O termo "planta" se refere a qualquer planta em qualquer estágio de seu ciclo de vida ou desenvolvimento, e suas progenias. Em uma concretização, a planta é uma planta de tabaco, que se refere a uma planta pertencente ao gênero Nicotiana. Espécies preferidas, cultivares, híbridos, e variedades de uma planta de tabaco, são aqui descritos.

[00047] Uma "célula de planta" se refere a uma unidade estrutural e fisiológica de uma planta. A célula de planta pode estar na forma de um protoplasto sem uma parede de célula, uma célula única isolada, ou uma célula cultivada, ou como uma parte de uma unidade organizada mais alta, tais como, mas não limitados a, tecido de planta, um órgão de planta, ou uma planta inteira. O termo "material de planta” de refere a qualquer composição sólida, líquida ou gasosa, ou uma combinação destas, obtidas de uma planta, incluindo biomassa, folhas, lâmina de folha, núcleo, caules, raízes, flores ou partes de flor, frutos, pólen, óvulos, zigotos, sementes, cortes, secreções, extratos, célula ou culturas de tecido, ou quaisquer outras partes ou produtos de uma planta. Em uma concretização, o material de planta compreende ou consiste de biomassa, semente ou folhas. Em outra concretização, o material de planta compreende ou consiste de folhas.

[00048] O termo "variedade" se refere a uma população de plantas que compartilham características constantes que as separam de outras plantas da mesma espécie. Enquanto que possuindo um ou mais traços distintos, uma variedade é adicionalmente caracterizada por uma variação total muito pequena entre indivíduos dentro de uma variedade. Uma variedade é frequentemente vendida comercialmente.

[00049] O termo "linhagem" ou "linhagem de linhagemgem", conforme aqui usado, denota um grupo de plantas que são usadas durante geração da planta. Uma linhagem é distinguível de uma variedade à medida que ela revela pouca variação entre indivíduos para um ou mais traços de interesse, embora possa existir alguma variação entre indivíduos para outros traços.

[00050] O termo "reduz" ou "reduzido", conforme aqui usado, se refere a uma redução de a partir de cerca de 10% a cerca de 99%, de cerca de 10% a cerca de 95% ou menos, de cerca de 10% a cerca de 90% ou menos, ou uma redução de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 100% ou mais, de uma quantidade ou uma atividade, tal como, mas não limitada a, atividade de polipeptídeo, atividade transcricional, e/ou expressão de proteína.

[00051] O termo "inibe" ou "inibido", conforme aqui usado , se refere a uma redução de a partir de cerca de 98% a cerca de 100%, ou uma redução de pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas particularmente de 100%, de uma quantidade ou uma atividade, tal como, mas não limitada a, atividade de polipeptídeo, atividade transcricional, e/ou ex- pressão de proteína.

[00052] O termo "aumento" ou "aumentado", conforme aqui usado, se refere a um aumento de a partir de cerca de 10% a cerca de 99%, ou um aumento de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 100%, 200%, 300%, 400% ou 500% ou mais, de uma quantidade ou uma atividade, tal como, mas não limitada a, atividade de polipeptídeo, atividade transcricional, e/ou expressão de proteína.

[00053] O termo "controle" no contexto de uma planta de controle, ou células de planta de controle, significa uma planta ou células de planta em que a expressão ou atividade de treonina sintase não tenha sido modificada (por exemplo, aumentada ou reduzida) e, desse modo, pode proporcionar uma comparação com uma planta em que a expressão ou atividade de treonina sintase tenha sido modificada. A planta de controle pode compreender um vetor vazio. A planta de controle pode corresponder a uma planta tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00054] Em um aspecto, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de polinucleotídeo, e tendo pelo menos 60% de identidade de sequência a qualquer das sequências aqui descritas, incluindo quaisquer dos polinucleotídeos mostrados na listagem de sequência. Adequadamente, os polinucleotídeos isolados compreendem, consistem ou consistem essencialmente, de uma sequência tendo pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência.

[00055] Em uma concretização, é provido um polinucleotídeo isola- do compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma treonina sintase, e tendo pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID No.1, SEQ ID No. 2, e/ou SEQ ID No. 3. Adequadamente, os polinucleotí- deos isolados compreendem, consistem ou consistem essencialmente de, uma sequência tendo pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, ou SEQ ID No. 3. SEQ ID NO: 1 é uma sequência de DNA de treonina sintase de N. tabacum. SEQ ID NO.2 é uma sequência de DNA de treonina sintase amplificada por transcriptase reversa (RT)-PCR de RNA isolado de N. tabacum (variedade Hicks Broad Leaf) e sequenciada. Esta sequência está presente em um dos dois ancestrais de N. tabacum, Nicotiana sylvestris, conforme demonstrado por análise de RT-PCR. SEQ ID NO:3 é uma sequência de DNA de treonina sintase amplificada por RT-PCR de RNA isolado de N. tabacum (variedade Hicks Broad Leaf).

[00056] Em outra concretização, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em, uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma treonina sintase, e tendo pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID No. 4 ou SEQ ID No. 5. SEQ ID NO:4 corresponde a sequência de DNA genômica de SEQ ID NO:3. Comparado a SEQ ID NO:1, o intron de 137 bp está localizado na posição 234 a partir códon de partida de ATG. SEQ ID NO:5 corresponde a sequência de DNA genômica de treonina sintase de W. tomentosiformis. Em outra concretização, é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em, uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma treonina sin- tase, e tendo pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou 90 de identidade de sequência para SEQ ID No.20. Adequadamente, os polinucleotídeos isolados compreendem, consistem, ou consistem essencialmente de uma sequência tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID No.20. SEQ ID NO: 20 é uma sequência de DNA de treonina sintase de N. tabacum, e tem 85% de identidade de sequência com SEQ ID No.1, 86% de identidade de sequência com SEQ ID No.2, e 86% de identidade de sequência com SEQ ID No.3.

[00057] O termo "polinucleotídeo de NtTS" se refere a polinucleotí- deos que codificam treonina sintase de Nicotiana tabacum compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em, polinucleotí- deos com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência), ou identidade substancial para SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:20; fragmentos dos polinucleotídeo de NtTS incluindo fragmentos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:20; e fragmentos de SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:20 com homologia substancial (is-to é, similaridade de sequência), ou identidade substancial que tem pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, ou 99% ou 100% de identidade de sequência aos fragmentos correspondentes de SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:20. Fragmentos exemplares são colocados em SEQ ID Nos 9 a 19. Conforme descrito acima, a variante pode ter pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:20. Os polinucleotídeos de NtTS também incluem sequências compreendendo um grau suficiente ou substancial de identidade ou similaridade para SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:20 para codificar um polipeptídeo que funciona como uma treonina sintase. Em uma concretização, o termo "polinu- cleotídeo de NtTS" se refere a polímeros de nucleotídeo que compreendem, consistem, ou consistem essencialmente de um polinucleotí- deo aqui designado como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, ou SEQ ID NO:20.

[00058] O termo "polinucleotídeo" se refere a um polímero de nu- cleotídeos, que pode ser ácido desoxiribonucleico não modificado ou modificado (DNA), ou ácido ribonucleico (RNA). Consequentemente, um polinucleotídeo pode ser, sem limitação, um DNA genômico, DNA complementar (cDNA), mRNA, ou RNA de antisentido, ou um fragmen- to(s) destes. Além disso, um polinucleotídeo pode ser DNA de trançado simples ou de trançado duplo, DNA que é uma mistura de regiões de trançado único e de trançado duplo, uma molécula híbrida compreendendo DNA e RNA, ou uma molécula híbrida com uma mistura de regiões de trançado único e de trançado duplo, ou um fragmento(s) destes.

[00059] Um polinucleotídeo, conforme aqui descrito, conterá geralmente ligações de fosfodiéster, embora, em alguns casos, análogos de polinucleotídeo são incluídos que podem ter suportes alternados, compreendendo, por exemplo, fosforamidato, fosforotioato, fosforoditi- oato, ou ligações de O-metilfoforoamidite; e suportes e ligações de peptídeo polinucleotídeo. Outros polinucleotídeos análogos incluem aqueles com suportes positivos; suportes não iônicos, e suportes de não ribose. Modificações do suporte de ribose-fosfato podem ser feitas por uma variedade de razões, por exemplo, para aumentar a estabilidade e meia-vida de tais moléculas em ambientes fisiológicos, ou co mo sondas em um biochip. Misturas de polinucleotídeos que ocorrem naturalmente e análogos podem ser feitas; alternativamente, misturas de análogos de polinucleotídeo diferentes, e misturas de polinucleotí- deos que ocorrem naturalmente e análogos, podem ser feitas.

[00060] Uma variedade de análogos de polinucleotídeo é conhecida, incluindo, por exemplo, fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, ligações de O-metilfoforoamidite e suportes e ligações de peptídeo po- linucleotídeo. Outros polinucleotídeos análogos incluem aqueles com suportes positivos, suportes não iônicos, e suportes de não ribose. Po- linucleotídeos contendo um ou mais açúcares carbocíclicos são também incluídos.

[00061] Outros análogos incluem peptídeo polinucleotídeos (PNA) que são análogos de peptídeo polinucleotídeos. Estes suportes são substancialmente não iônicos sob condições neutras, em contraste ao suporte de fosfodiéster altamente carregado de polinucleotídeos que ocorrem naturalmente. Isto pode resultar em vantagens. Primeiro, o suporte de PNA pode exibir cinéticas de hibridização aperfeiçoadas. Os PNAs têm mudanças maiores na temperatura de fusão (Tm) para pares bases desequiparados versus perfeitamente equiparados. O DNA e o RNA tipicamente exibem uma queda de 2-4°C em Tm para uma desequiparação interna. Com o suporte de PNA não iônico, a queda é mais próxima a 7-9°C. Similarmente, devido a sua natureza não iônica, a hibridização das bases fixadas a estes suportes é relativamente insensível a concentração de sal. Em adição, PNAs não podem ser degradados ou degradados a uma extensão menor por enzi- nas celulares, e, desse modo, podem ser mais estáveis.

[00062] Entre os usos dos polinucleotídeos revelados, e combinações de fragmentos destes, estão uso de fragmentos como sondas em ensaios de hibridização de ácido nucleico ou iniciadores em ensaios de amplificação de ácido nucleico. Tais fragmentos geralmente com- preendem pelo menos cerca de 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais nucleotídeos contíguos de uma sequência de DNA. Em outras concretizações, um fragmento de DNA compreende pelo menos cerca de 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou 60 ou mais nucleotídeos contíguos de uma sequência de DNA. Desse modo, em um aspecto, é também provido um método para detecção de polinucleotídeos de NtTS compreendendo o uso das sondas e/ou os iniciadores. Iniciadores exemplares são colocados em SEQ ID NOs: 10 a 14. Opcionalmente, referidos iniciadores podem ser usados como sondas. Iniciadores exemplares ou sondas podem hibridizarem a regiões que são homólogas entre SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, ou SEQ ID NO:20. Iniciadores exemplares ou sondas podem hibridizarem a nucleotídeos 1-46 de SEQ ID NOs: 1 , 2 e 3; a nucleotídeos 1-52 de SEQ ID NO:20; a nucleotídeos 99-141 de SEQ ID N0.1; a nucleotídeos 102-144 de SEQ ID NO. 2 e SEQ ID NO:3; a nucleotídeos 102-153 de SEQ ID NO:20; a nucleotídeos 3251362 de SEQ ID NOs: 1 , 2 e 3; ou a nucleotídeos 1334-1371 de SEQ ID NO:20.

[00063] Os parâmetros básicos que afetam a escolha de condições de hibridização e orientação para desenvolver condições adequadas são descritos por Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Usando o conhecimento do código genético em combinação com a sequência de aminoácido, conforme aqui descrito, conjuntos de oligonucleotídeos degenerados podem ser preparados. Tais oligonucleotídeos são úteis como iniciadores, por exemplo, em reações de cadeia de polimerase (PCR), pelo que fragmentos de DNA são isolados e amplificados. Em certas concretizações, iniciadores degenerados podem ser usados como sondas para bibliotecas genéticas. Tais bibliotecas incluiriam, mas não são limitadas a, bibliotecas de cDNA, bibliotecas genômicas, e ainda EST eletrônico (expressam etiqueta de sequência), ou bibliotecas de DNA. Sequências homólogas identificadas por este método, em seguida, seriam usadas como sondas para identificar homólogos das sequências de NtTS aqui identificadas.

[00064] Também de uso potencial são polinucleotídeos e oligonu- cleotídeos (por exemplo, iniciadores ou sondas) que hibridizam sob condições de estringência reduzidas, condições estringentes tipicamente moderadamente, e condições comumente altamente estringen- tes a um polinucleotídeo de NtTS, conforme aqui descrito. Os parâmetros básicos que afetam a escolha de condições de hibridização e orientação para desenvolver condições adequadas são colocadas por Sambrook er al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N Y.)., e podem ser prontamente determinadas por aqueles técnicos no assunto baseados em, por exemplo, o comprimento ou composição base do polinucleotídeo.

[00065] Um modo de alcançar condições moderadamente estrin- gentes envolve o uso de uma solução de pré-lavagem contendo 5x Citrato de Sódio Padrão, 0,5% de Dodecil sulfato de sódio, 1,0 mM

[00066] Ácido etilenodiaminatetraacético (pH 8,0), tampão de hibri- dização de cerca de 50% de formamida, 6x Citrato de Sódio Padrão, e uma temperatura de hibridização de cerca de 55°C (ou outras soluções de hibridização similares, tais como uma contendo cerca de 50% de formamida, com uma temperatura de hibridização de cerca de 42°C), e condições de lavagem de cerca de 60°C, em 0,5x de Citrato de Sódio Padrão, 0,1% de Dodecil sulfato de sódio. Geralmente, condições altamente estringentes são definidas como condições de hibri- dização conforme acima, mas com lavagem a aproximadamente 68°C, 0,2x de Citrato de Sódio Padrão, 0,1% de Dodecil sulfato de sódio. SSPE (1x SSPE é cloreto de sódio 0,15 N, 10 mM de fosfato de sódio, e 1,25 mM de ácido etilenodiaminatetraacético, pH 7,4) pode ser subs- tituído por Citrato de Sódio Padrão (1x de Citrato de Sódio Padrão é cloreto de sódio 0,15 M, e 15 mM de citrato de sódio) na hibridização e tampões de lavagem, lavagens são realizadas por 15 minutos após hibridização ser completa. Deve ser compreendido que a temperatura de lavagem e concentração de sal de lavagem podem ser ajustadas conforme necessário para alcançar um grau desejado de estringência por aplicação dos princípios básicos que guiam as reação de hibridiza- ção e estabilidade dúplex, conforme conhecido àqueles técnicos no assunto, e descrito adicionalmente abaixo (ver, por exemplo, Sambro- ok et al., supra). Quando da hibridização de um polinucleotídeo a um polinucleotídeo alvo de sequência desconhecida, o comprimento de híbrido é assumido ser aquele do polinucleotídeo de hibridização. Quando polinucleotídeos de sequência conhecida são hibridizados, o comprimento de híbrido pode ser determinado por alinhagemmento das sequências dos polinucleotídeos, e identificação da região ou regiões de complementaridade de sequência ótima. A temperatura de hibridização para híbridos antecipados para serem menos do que 50 pares base de comprimento deve ser 5 a 10°C menos do que a temperatura de fusão (Tm) do híbrido, onde Tm é determinada de acordo com as seguintes equações. Para híbridos menores do que 18 pares base de comprimento, Tm (°C)=2(número de A+T bases)+4(número de G+C bases). Para híbridos acima de 18 pares base de comprimento, Tm (°C)=81,5+16,6(log10 [Na+])+0,41(% G+C)-(600/N), onde N é o número de bases no híbrido, e [Na+] é a concentração de íons de sódio no tampão de hibridização ([Na+] para 1x de Citrato de Sódio Padrão = 0,165M). Tipicamente, cada tal polinucleotídeo de hibridização tem um comprimento que é pelo menos 25% (comumente pelo menos 50%, 60%, ou 70%, e, mais comumente, pelo menos 80%) do comprimento de um polinucleotídeo ao qual ele hibridiza, e tem pelo menos 60% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) com o polinucleotí- deo ao qual ele hibridiza.

[00067] Conforme será compreendido pelo técnico no assunto, um DNA linear tem duas orientações possíveis: a direção 5'-a-3' e a direção 3'-a-5'. Por exemplo, se uma sequência de referência é posicionada na direção 5'-a-3', e se uma segunda sequência é posicionada na direção 5'-a-3' dentro da mesma molécula/trançado de polinucleotídeo, então a sequência de referência e a segunda sequência são orientadas na mesma direção, ou têm a mesma orientação. Tipicamente, uma sequência promotora e um gene de interesse sob a regulação do dado promotor são posicionados na mesma orientação. Contudo, com relação a sequência de referência posicionada na direção 5'-a-3', se uma segunda sequência é posicionada na mesma direção 3'-a-5' dentro da mesma molécula/trançado de polinucleotídeo, então a sequência de referência e a segunda sequência são orientadas em direção de anti- sentido, ou tem uma orientação de antisentido. Duas sequências tendo orientações de antisentido com relação entre si podem ser alternativamente descritas como tendo a mesma orientação, se a sequência de referência (direção 5'-a-3') e a sequência complementar reversa da sequência de referência (sequência de referência posicionada na direção 5'-a-3'), são posicionadas dentro da mesma molécula/trançado de polinucleotídeo. As sequências aqui colocadas são mostradas na direção 5'-a-3'.

[00068] Os construtos recombinantes aqui providos podem ser usados para transformar plantas ou células de planta de modo a modular níveis de expressão de proteína de NtTS. Um construto de polinucleo- tídeo recombinante pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polinucleotídeo de NtTS, conforme aqui descrito, operavelmente ligado a uma região regulatória adequada para expressão do polipep- tídeo de NtTS na planta ou célula. Desse modo, um polinucleotídeo pode compreender uma sequência de codificação que codifica o poli- peptídeo de NtTS, conforme aqui descrito.

[00069] O polipeptídeo de NtTS codificado por um polinucleotídeo recombinante pode ser um polipeptídeo de NtTS nativo, ou pode ser heterólogo á célula. Em alguns casos, o construto recombinante contém um polinucleotídeo que reduz ou inibe expressão de um polipeptí- deo de modulação de NtTS, operavelmente ligado a uma região regu- latória. Exemplos de regiões regulatórias adequadas são aqui descritos.

[00070] Vetores contendo construto de polinucleotídeos recombi- nante, tais como aqueles aqui descritos, também são providos. Suportes de vetor adequados incluem, por exemplo, aqueles rotineiramente usados na técnica, tais como plasmídeos, vírus, cromossomos artificiais, BACs, YACs, ou PACs. Vetores de expressão adequados incluem, sem limitação, plasmídeos e vetores virais derivados de, por exemplo, bacteriófago, baculovírus, e retrovírus. Numerosos vetores e sistemas de expressão são comercialmente disponíveis.

[00071] Os vetores podem também incluir, por exemplo, origens de replicação, regiões de fixação de suporte (SARs) ou marcadores. Um gene marcador pode conferir um fenótipo selecionável em uma célula de planta. Por exemplo, um marcador pode conferir resistência à bio- cida, tal como resistência a um antibiótico (por exemplo, canamicina, G418, bleomicina, ou higromicina), ou a um herbicida (por exemplo, glifosato, clorsulfuron ou fosfinotricin). Em adição, um vetor de expressão pode incluir uma sequência de etiqueta designada para facilitar a manipulação ou detecção (por exemplo, purificação ou localização) do polipeptídeo expresso. Sequências de etiqueta, tais como sequências de luciferase, beta-glucuronidase (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), glutationa S-transferase (GST), polihistidina, c-myc ou hema- glutinina, tipicamente são expressas como uma fusão com o polipeptí- deo codificado. Tais etiquetas podem ser inseridas em qualquer lugar dentro do polipeptídeo, incluindo, ou no terminal carboxil, ou no terminal amino.

[00072] Uma planta ou célula de planta pode ser transformada por ter o polinucleotídeo recombinante integrado em seu genoma para se tornar estavelmente transformado. Células estavelmente transformadas tipicamente retêm o polinucleotídeo introduzido com cada divisão de célula. Uma planta ou célula de planta pode também ser transientemente transformada, tal que o polinucleotídeo recombinante não é integrado em seu genoma. As células transientemente transformadas tipicamente perdem toda ou alguma porção do polinucleotídeo recom- binante introduzido com cada divisão de célula, tal que o polinucleotí- deo recombinante introduzido não pode ser detectado nas células irmãs após um número suficiente de divisões de célula.

[00073] Um número de métodos está disponível na técnica para transformação de uma célula de planta que são todos aqui envolvidos, incluindo técnicas biolísticas, técnicas de canhão de gene, técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium, técnicas de transformação mediadas por vetor viral, e técnicas de eletroporação. O sistema de Agrobacterium para integração de DNA estranho em cromossomos de planta tem sido extensivamente estudado, modificado, e explorado pela engenharia genética de planta. Moléculas de DNA recombinante nu compreendendo sequências de DNA correspondentes a proteína de tabaco purificada objeto operavelmente ligada, na orientação de sentido e de antisentido, para sequências regulatórias são unidas a T- sequências de DNA apropriadas por métodos convencionais. Estas são introduzidas em protoplastos de tabaco por técnicas de polietileno glicol ou por técnicas de eletroporação, ambas das quais são padrão. Alternativamente, tais vetores, compreendendo moléculas de ácido nucleico recombinantes que codificam a proteína de tabaco purificada objeto, são introduzidos em células vivas de Agrobacterium, que, em seguida, transferem o ácido nucleico nas células de plantas. A transformação por DNA nu sem sequências de vetor acompanhantes de T- DNA pode ser acompanhada, via fusão de protoplastos de tabaco com lipossomas contendo DNA, ou via eletroporação. DNA nu não acompanhado por sequências de vetor de T-DNA pode também ser usado para transformar células de tabaco, via micro projéteis de alta velocidade, inertes.

[00074] Se uma célula ou tecido cultivado é usado como o tecido recipiente para transformação, as plantas podem ser regeneradas de culturas transformadas, se desejado, por técnicas conhecidas aqueles técnicos no assunto.

[00075] A escolha de regiões regulatórias a serem incluídas em um construto recombinante depende de vários fatores, incluindo, nas não limitados a, eficiência, seletividade, indutibilidade, nível de expressão desejado, e expressão preferencial de célula ou de tecido. É uma matéria de rotina para um técnico no assunto modular a expressão de uma sequência de codificação por seleção e posicionamento apropriadamente das regiões regulatórias relativas à sequência de codificação. A transcrição de um polinucleotídeo pode ser modulada em uma maneira similar. Algumas regiões regulatórias adequadas iniciam transcrição somente, ou predominantemente, em certos tipos de célula. Métodos para identificação e caracterização de regiões regulatórias em DNA genômico de planta, são conhecidos na técnica.

[00076] Promotores adequados incluem promotores específicos de tecido reconhecidos por fatores específicos de tecido presentes em tipos de célula ou tecidos diferentes (por exemplo, promotores específicos de raiz, promotores específicos de rebento, promotores específicos de xilema), ou presentes durante estágios de desenvolvimento diferentes, ou presentes na resposta a condições ambientais diferentes. Os promotores adequados incluem promotores constitutivos que podem ser ativados em muitos tipos de célula sem requerer indutores específicos. Exemplos de promotores adequados para controle de produção de polipeptídeo de NAi NtTS incluem o vírus de mosaico de couve-flor 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos ou promotores de ubiquitin ou phaseolin. Os técnicos no assunto são capazes de gerarem variações múltiplas de promotores recombinantes.

[00077] Promotores específicos de tecido são elementos de controle transcricional que são somente ativos em células ou tecidos particulares em tempos específicos durante desenvolvimento da planta, tais como tecidos vegetativos ou tecidos reprodutivos. Expressão específica de tecido pode ser vantajosa, por exemplo, quando a expressão de polinucleotídeos em certos tecidos é preferida. Exemplos de promotores específicos de tecido, sob controle de desenvolvimento, incluem promotores que podem iniciar transcrição somente (ou principalmente somente) em certos tecidos, tais como tecidos vegetativos, por exemplo, raízes ou folhas, ou tecidos reprodutivos, tais como fruto, óvulos, sementes, pólen, flores, ou qualquer tecido embrinco. Promotores es-pecíficos de tecido reprodutivos podem ser, por exemplo, específicos de antera, específicos de óvulo, específicos de embrião, específicos de endosperma, específicos de tegumento, específicos de semente e de camada de semente, específicos de pólen, específicos de pétala, específicos de sépala, ou combinações destes.

[00078] Promotores específicos de folha adequados incluem piruva- to, promotor de ortofosfato dikinase (PPDK) de planta C4 (milho), promotor de cab-m1Ca+2 de milho, o promotor de gene relacionado a Arabidopsis thaliana myb (Atmyb5), os promotores ribulose bifosfato carboxilase (RBCS) (por exemplo, os genes de tomate RBCS 1, RBCS2 e RBCS3A expressos em folhas e mudas de crescimento leve, RBCS1 e RBCS2 expressos no desenvolvimento de frutos de tomate, ou promotor de ribulose bisfosfato carboxilase expressos quase exclu-sivamente em células mesophyll em limbos e bainhas foliares em altos níveis).

[00079] Promotores específicos de senescência adequados incluem um promotor de tomate ativo durante maturação do fruto, senescência e abcisão de folhas, um promotor de milho de gene que codifica uma cisteína protease. Promotores específicos de antera adequados podem ser usados. Promotores preferidos de raiz adequados, conhecidos aos técnicos no assunto, podem ser selecionados. Promotores preferidos de semente adequados incluem ambos promotores específicos de semente (aqueles promotores ativos durante desenvolvimento de semente, tais como promotores de proteínas de armazenagem de semente) e promotores de germinação de semente (aqueles promotores ativos durante germinação de semente). Tais promotores preferi-dos de semente incluem, mas não são limitados a, Cim1 (mensagem induzida por citocinin); cZ19B1 (milho 19 kDa zein); milps (myo- inositol-1-fosfato sintase); mZE40-2, também conhecidos como Zm- 40; nuclc; e celA (celulose sintase). Gama-zein é um promotor específico de endosperma. Glob-1 é um promotor específico de embrião. Para dicotiledônias, promotores específicos de semente incluem, mas não são limitados a, feijão beta-phaseolin, napin, β-conglicinin, soja lectin, cruciferin, e similares. Para monocotiledôneas, promotores específicos de semente incluem, mas não são limitados a, um promotor de milho 15 kDa zein, um promotor 22 kDa zein, um promotor 27 kDa zein, um promotor g-zein, um promotor 27 kDa Y-zein (tal como promotor gzw64A, ver Número de Acesso no Banco de Gene S78780), um promotor ceroso, um promotor shrunken 1, um promotor shrunken 2, um promotor de globulin 1 (ver Número de Acesso no Banco de Gene L22344), um promotor Itp2, promotor cim1, promotores de milho endl e end2, promotor nud, promotor Zm40, eepl e eep2; led, promotor tiore- doxin H; promotor mlipl 5, promotor PCNA2; e o promotor shrunken-2.

[00080] Exemplos de promotores induzíveis incluem promotores responsivos à ataque de patogenia, condições anaeróbicas, temperatura elevada, luz, secura, temperatura fria, ou alta concentração de sal. Promotores induzíveis de patogenia incluem aqueles de proteínas relacionadas a patogenia (proteínas PR), que são induzidos em seguida por infecção por uma patogenia (por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1 ,3-glucanase, chitinase).

[00081] Em adição a promotores de planta, outros promotores adequados podem ser derivados de origem bacterial, por exemplo, o promotor octopina sintase, o promotor nopalina sintase, e outros promotores derivados de plasmídeos Ti), ou podem ser derivados de promotores virais (por exemplo, promotores 35S e 19S RNA de vírus de mosaico de couve-flor (CaMV), promotores constitutivos de vírus de mosaico de tabaco, promotores de vírus de mosaico de couve-flor (CaMV) 19S e 35S, ou promotor de vírus de mosaico da escrofulária 35S).

[00082] O termo "polipeptídeo de NtTS" se refere a um polipeptídeo que codifica treonina sintase de Nicotiana tabacum, e inclui polipeptí- deos compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácido codificada por um polinucleotídeo com pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO;3, ou um polinucleotídeo com pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%,87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, ou SEQ ID NO:20; fragmentos do polinucleotídeo de NtTS de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, ou SEQ ID NO:20; e frag- mentos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:20, que têm pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 25 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência aos fragmentos correspondentes de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, ou SEQ ID NO:20. Fragmentos exemplares são colocados em SEQ ID Nos 9 a 19. Os Polipeptídeos de NtTS também incluem sequências compreendendo um grau suficiente ou substancial de identidade u similaridade para SEQ ID NO:6, SEQ ID NO;7, ou SEQ ID NO:8, para funcionarem como uma treonina sintase, e incluem sequências com pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:21. SEQ ID NO. 6 é a sequência traduzida de SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO:7 é a sequência traduzida de SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO:8 é a sequência traduzida de SEQ ID NO. 3. SEQ ID NO:21 é a sequência traduzida de SEQ ID NO:20, e tem 89% de identidade de sequência para SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:9.

[00083] Em uma concretização, os fragmentos dos polipeptídeos de NtTS retêm atividade de treonina sintase.

[00084] Os polipeptídeos de NtTS também incluem variantes e mu- tantes produzidos por introdução de qualquer tipo de alterações (por exemplo, inserções, anulações, ou substituições de aminoácidos; mudanças nos estados de glicosilação; mudanças que afetam o redobra- mento ou isomerizações, estruturas tridimensionais, estados de auto associação), que podem ser deliberadamente projetadas ou isoladas naturalmente, provido que elas ainda funcionam como uma treonina sintase. Os polipeptídeos de NtTS podem ser em forma linear ou cicli- zada usando métodos conhecidos. O termo "Polipeptídeo de NtTS" pode se referir a um polipeptídeo compreendendo, consistindo ou con- sistindo essencialmente da sequência colocada em SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, ou SEQ ID NO:21

[00085] Em outro aspecto, é provido um polipeptídeo isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequência para qualquer da sequência, conforme aqui descrita, incluindo qualquer dos polipeptídeos mostrados na listagem de sequência. Adequadamente, os polipeptídeos isolados compreendem, consistem ou consistem essencialmente de uma sequência tendo pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência.

[00086] Os polipeptídeos de NtTS incluem variantes produzidas por introdução de qualquer tipo de alterações (por exemplo, inserções, anulações, ou substituições de aminoácidos; mudanças nos estados de glicosilação; mudanças que afetam o redobramento ou isomeriza- ções, estruturas tridimensionais, ou estados de auto associação), que podem ser deliberadamente projetadas ou isoladas naturalmente. A variante pode ter alterações que produzem uma mudança oculta, e resulta em uma proteína funcionalmente equivalente. Substituições de aminoácido deliberadas podem ser feitas na base de similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou a natureza anfipática dos resíduos, considerando-se que a atividade de ligação secundária da substância é retida. Por exemplo, aminoácidos negativamente carregados incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos positivamente carregados incluem lisina e arginina; e aminoácidos com grupos principais polares não carregados, tendo valores de hidrofilicidade similares, incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, e tirosina. Substituições conservativas podem ser feitas, por exemplo, de acordo com a Tabela abaixo. Os aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e, preferivelmente, na mesma linhagem na terceira coluna, podem ser substituídos entre si:

[00087] O polipeptídeo de NtTS pode ser uma proteína matura ou uma proteína imatura, uma proteína derivada de uma proteína imatura. Os polipeptídeos de NtTS podem ser na forma linear ou ciclizada usando métodos conhecidos. Os polipeptídeos de NtTS compreendem pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, ou pelo menos 40 aminoácidos contíguos.

[00088] Em uma concretização, é provido um polipeptídeo isolado codificado por qualquer um dos polinucleotídeos compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência que codifica uma treonina sintase, e tendo pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO. 1 , SEQ ID No. 2, ou SEQ ID No. 3, ou por qualquer dos polinucleotídeos compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO. 4, SEQ ID No. 5, ou SEQ ID NO:20.

[00089] Em outra concretização, é provido um polipeptídeo isolado que codifica uma treonina sintase e compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de polipeptídeo tendo pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência para a sequência colocada em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8, ou SEQ ID NO:21.

[00090] Em outra concretização, é provido um polipeptídeo isolado codificado que codificam uma treonina sintase, e compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente da sequência colocada em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8, ou SEQ ID NO:21.

[00091] Os fragmentos das sequências de polipeptídeo são também aqui revelados; adequadamente, tais fragmentos retêm atividade de treonina sintase.

[00092] Variantes de polipeptídeo mutante podem ser usadas para criar plantas mutantes, plantas que ocorrem não naturalmente, ou planta transgênicas compreendendo o polipeptídeo de NtTS mutante. Adequadamente, o polipeptídeo de NtTS mutante retém atividade de treonina sintase.

[00093] Um polipeptídeo pode ser preparado por cultura de células hospedeiras transformadas ou recombinantes sob condições de cultura adequadas para expressarem um polipeptídeo. O polipeptídeo expresso resultante pode, em seguida, ser purificado de tal cultura usando processos de purificação conhecidos. A purificação do polipeptídeo pode incluir uma coluna de atividade contendo agentes que se ligarão ao polipeptídeo; uma ou mais etapas de coluna sobre tais resinas de afinidade; uma ou mais etapas envolvendo cromatografia de interação hidrofóbica; ou cromatografia de imunoafinidade. Alternativamente, o polipeptídeo pode também ser expresso em uma forma que facilitará a purificação. Por exemplo, ele pode ser expresso como um polipeptídeo de fusão, tal como aquele de polipeptídeo de ligação de maltose (MBP), glutationa-5-transferase (GST), ou tioredoxin (TRX). Kits para expressão e purificação de polipeptídeos de fusão são comercialmente disponíveis. O polipeptídeo pode ser etiquetado com um epítope e, subsequentemente, purificado pelo uso de um anticorpo específico di- recionado a tal epítope. Uma ou mais etapas de cromatografia líquida - tais como cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa, podem ser empregadas para purificar adicionalmente o polipeptídeo. Algumas ou todas das etapas de purificação precedentes, em várias combinações, podem ser empregadas para proporcionar um polipeptí- deo recombinante substancialmente homogêneo. O polipeptídeo desse modo purificado pode ser substancialmente livre de outros polipep- tídeos, e é definido aqui como um "polipeptídeo substancialmente purificado"; tais polipeptídeos purificados incluem polipeptídeos de NtTS, fragmentos, variantes, e similares. Expressão, isolamento, e purificação dos polipeptídeos e fragmentos podem ser acompanhados por qualquer técnica adequada, incluindo, mas não limitada a, os métodos aqui descritos.

[00094] É também possível utilizar uma coluna de afinidade, tal como um anticorpo monoclonal gerado contra polipeptídeos, a polipeptí- deos expressos por purificação de afinidade. Estes polipeptídeos podem ser removidos de uma coluna de atividade usando técnicas convencionais, por exemplo, em um tampão de eluição de alto sal e, em seguida, dialisados em um tampão de sal inferior para uso, ou por mudança de pH, ou outros componentes dependendo da matriz de afinidade utilizada, ou serem competitivamente removidos usando o substrato que ocorre naturalmente da porção de afinidade.

[00095] Um polipeptídeo pode também ser produzido por síntese química convencional conhecida. Métodos para construção dos poli- peptídeos ou fragmentos destes por meios sintéticos são conhecidos àqueles técnicos no assunto. As sequências de polipeptídeo sinteticamente construídas, em virtude de compartilhamento estrutural primário, secundário ou terciário, ou características conformacionais com um polipeptídeo nativo, podem possuir propriedades biológicas em comum com estes, incluindo atividade biológica.

[00096] O termo 'ocorrendo não naturalmente', conforme aqui usado, descreve uma totalidade (por exemplo, um polinucleotídeo, uma mutação genética, um polipeptídeo, uma planta, uma célula de planta, e material de planta) que não é formada pela natureza, ou que não existe na natureza. Tais entidades que ocorrem não naturalmente, ou entidades artificiais, podem ser produzidas, sintetizadas, iniciadas, modificadas, intervistas, ou manipuladas, por métodos aqui descritos, ou que são conhecidos na técnica. Desse modo, por meio de exemplo, uma planta que ocorre não naturalmente, uma célula de planta que ocorre não naturalmente, ou material de planta que ocorre não naturalmente, podem ser produzidos usando técnicas de geração de planta tradicionais - tal como um retro cruzamento - ou por tecnologias de manipulação genética - tais como RNA de antisentido, RNA de interferência, meganuclease, e similares. Por meio de exemplo adicional, uma planta que ocorre não naturalmente, uma célula de planta que ocorre não naturalmente, ou material de planta que ocorre não naturalmente, podem ser produzidos por introgressão de, ou por transfe-rência de, uma ou mais mutações genéticas (por exemplo, um ou mais polimorfismos) de uma primeira planta, ou célula de planta, em uma segunda planta, ou célula de planta (que pode ser estar ocorrendo naturalmente), tal que a planta resultante, célula de planta, ou material de planta, ou a progenia destes, compreendem uma constituição genética (por exemplo, um genoma, um cromossomo, ou um segmento destes) que não é formado por natureza, ou que não existe na natureza. A planta resultante, célula de planta, ou material de planta, são, desse modo, artificiais, ou ocorrendo não naturalmente. Consequentemente, uma planta artificial, ou planta que ocorre não naturalmente, ou célula de planta, podem ser produzidas por modificação de uma sequência genética em uma primeira planta que ocorre naturalmente, ou célula de planta, mesmo se a sequência genética resultante ocorre em uma segunda planta, ou célula de planta, que compreendem um antecedente genético diferente a partir da primeira planta, ou célula de planta. Diferenças no antecedente genético podem ser detectadas por diferenças fenotípicas, ou por técnicas de biologia molecular conhecidas na técnica - tal sequenciamento de ácido nucleico, presença ou ausência de marcadores genéticos (por exemplo, marcadores de NA de microssatélite).

[00097] Em outra concretização, anticorpos que são imunorreativos com os polipeptídeos de NtTS são aqui providos. Os polipeptídeos de NtTS, fragmentos, variantes, polipeptídeos de fusão, e similares, conforme aqui colocados, podem ser empregados como "imunogenes" na produção de anticorpos imunorreativos com estes. Tais anticorpos podem especificamente se ligarem aos polipeptídeos de NtTS, via os locais de ligação de antígeno do anticorpos. Especificamente, anticorpos de ligação são aqueles que especificamente reconhecerão e se ligarão com polipeptídeos da família de NtTS, homólogos, e variantes, mas não com outras moléculas. Em uma concretização, os anticorpos são específicos para polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácido de NtTS, conforme aqui colocado, e não reagem por cruzamento com outros polipeptídeos.

[00098] Mais especificamente, os polipeptídeos, fragmentos, variantes, polipeptídeos de fusão, e similares, contêm determinantes antigêni- cos ou epítopes que induzem a formação de anticorpos. Estes determinantes antigênicos ou epítopes podem ser, ou lineares, ou conformaci- onais (descontínuos). Epítopes lineares são compostos de uma seção única de aminoácidos do polipeptídeo, enquanto que epítopes confor- macionais ou descontínuos são compostos de seções de aminoácidos de regiões diferentes da cadeia de polipeptídeo que são trazidos em proximidade após dobramento do polipeptídeo. Os epítopes podem ser identificados por qualquer dos métodos conhecidos na técnica. Adicio- nalmente, epítopes a partir dos polipeptídeos podem ser usados como reagentes de pesquisa, em ensaios, e para purificar anticorpos de ligação específica de substâncias, tais como soro policlonal ou sobrenadan- tes de hibridomas cultivados. Tais epítopes ou variantes destes podem ser produzidos usando técnicas conhecidas na técnica, tais como síntese de fase sólida, clivagem química ou clivagem enzimática de um poli- peptídeo, ou usando tecnologia de DNA recombinante.

[00099] Ambos anticorpos policlonal e monoclonal para os polipep- tídeos podem ser preparados por técnicas convencionais. As linhagens de célula de hidridoma que produzem anticorpos monoclonais específicos para os polipeptídeos são também aqui contemplados. Tais hibridomas podem ser produzidos e identificados por técnicas convencionais. Para a produção de anticorpos, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injeção com um polipeptídeo de NtTS, fragmento, variante, ou mutantes deste. Tais animais hospedeiros podem incluir, mas não são limitados a, coelhos, camundongos, e ratos, para denominar uns poucos. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica. Dependendo da espécie de hospedeiro, tais adjuvantes incluem, mas não são limitados a, géis minerais de Freund (completo e incompleto), tais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas de superfície, tais como lisolecitin, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianina de lapa de keyhole, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis, tais como BCG (bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Os anticorpos monoclonais podem ser recuperados por técnicas convencionais. Tais anticorpos monoclonais podem ser de qualquer classe de imunoglobulina, incluindo, IgG, IgWI, IgE, IgA, IgD, e qualquer subclasse destes.

[000100] Os anticorpos podem também serem usados em ensaios para detectar a presença dos polipeptídeos ou fragmentos, ou in vitro ou in vivo. Os anticorpos também podem ser empregados na purificação de polipeptídeos ou fragmentos por cromatografia de imunoafini- dade.

[000101] As composições que podem reduzir a expressão, ou a atividade de treonina sintase, incluem, mas não são limitadas a, polinu- cleotídeos específicos de sequência, que podem interferir com a transcrição de um ou mais gene(s) de treonina sintase endógeno(s); polinu- cleotídeos específicos de sequência que podem interferir com a translação de transcritos de RNA de treonina sintase (por exemplo, RNAs de trançado duplo, microRNA, siRNAs, ribozimas); polipeptídeos específicos de sequência que podem interferir com a estabilidade de proteínas de treonina sintase; polinucleotídeos específicos de sequência que podem interferir com a atividade enzimática de proteína de treoni- na sintase, ou a atividade de ligação de proteína de treonina sintase com relação aos substratos ou proteínas regulatórias; anticorpos que exibem especificidade para proteína de treonina sintase; compostos de molécula pequena que podem interferir com a estabilidade de proteína de treonina sintase, ou a atividade enzimática de proteína de treonina sintase, ou a atividade de ligação de proteína de treonina sintase; proteínas de garra de zinco que ligam polinucleotídeo de treonina sintase; e meganucleases que têm atividade em direção a polinucleotídeo de treonina sintase.

[000102] A tecnologia de antisentido é um método bem conhecido que pode ser usado para modular (por exemplo, reduzir ou inibir) a expressão de um polipeptídeo de NtTS. Um polinucleotídeo do gene de NtTS a ser reprimido é clonado e operavelmente ligado a uma região regulatória e a uma sequência de terminação de transcrição de modo que o trançado de antisentido de RNA é transcrito. O construto recom- binante é, então, transformado em plantas, e o trançado de antisentido de RNA é produzido. O polinucleotídeo não necessita ser a sequência total do gene a ser reprimido, mas tipicamente será substancialmente complementar a pelo menos uma porção do trançado de sentido do gene a ser reprimido (indiferente se se ele está na região de codificação ou não codificação).

[000103] Um polinucleotídeo pode ser transcrito em uma ribozima, ou RNA catalítico, que afeta expressão de um mRNA. As ribozimas podem ser designadas para especificamente emparelharem com virtualmente qualquer RNA alvo e clivar o suporte de fosfodiéster a uma localização específica, inativando, funcionalmente, desse modo, o RNA alvo. Os polinucleotídeos heterólogos podem codificar ribozimas designadas para clivar transcritos de mRNA particulares, desse modo, impedindo expressão de um polipeptídeo. Ribozimas de martelo são úteis para destruir mRNAs particulares, embora várias ribozimas que clivam mRNA em sequências de reconhecimento específicas de local possam ser usadas. As ribozimas de martelo clivam mRNAs em localizações representadas por regiões de flanqueamento que formam pares bases complementares com o mRNA alvo. O único requerimento é que o RNA alvo contenha uma sequência de nucleotídeo 5'-UG-3'. A construção e produção de ribozimas de martelo são conhecidas na técnica. Sequências de ribozima martelo podem ser embutidas em um RNA estável, tal como um RNA de transferência (tRNA) para aumentar a eficiência de clivagem in vivo.

[000104] Em uma concretização, os polinucleotídeos específicos de sequência que podem interferir com a translação de transcrito(s) de RNA de treonina sintase, é RNAi. Interferência de RNA ("RNAi") ou silenciamento de RNA é um processo evolucionariamente conservado pelo qual mRNAs específicos podem ser alvo para degradação enzi- mática. Um RNA de trançado duplo (RNA de trançado duplo) deve ser introduzido ou produzido por uma célula (por exemplo, vírus de RNA de trançado duplo, ou polinucleotídeos de RNAi de NtTS) para iniciar a trajetória de RNAi. O RNA de trançado duplo pode ser convertido em dúplexes de siRNA múltiplo de comprimento de 21-23 bp ("siRNAs") por RNases III, que são endonucleases específicas de RNA de trançado duplo ("Dicer"). Os siRNAs podem ser subsequentemente reconhecidos por complexos de silenciamento induzido por RNA ("RISC") que promovem o desbobinamento de siRNA através de um processo dependente de ATP. O trançado de antisentido desbobinado do siRNA guia o RISC ativado ao mRNA alvo (por exemplo, variantes de RNA de NtTS) compreendendo uma sequência complementar ao trançado de antisentido de siRNA. O mRNA alvo e o trançado de antessentido pode formar uma hélice de forma A, e a ranhura maior da hélice de forma A pode ser reconhecida pelo RISC ativado. O mRNA alvo pode ser clivado por RISC ativado em um local único definido pelo local de ligação da extremidade 5' do trançado de siRNA. O RISC ativado pode ser reciclado para catalisar outro evento de clivagem.

[000105] Os vetores de expressão de RNAi de NtTS podem compreender construtos de RNAi de NtTS que codificam polinucleotídeos de RNAi de NtTS que exibem atividade de interferência de RNA por redução do nível de expressão de mRNAs de NtTS, pré-mRNAs de NtTS, ou variantes de RNA de NtTS relacionados. Os vetores de expressão podem compreender um promotor posicionado à montante e opera- velmente ligado a um construto de RNAi de NtTS, conforme adicionalmente aqui descrito. Os vetores de expressão de RNAi de NtTS podem compreender um promotor de núcleo mínimo adequado, um construto de RNAi de NtTS de interesse, uma região regulatória à montante (5'), uma região regulatória à jusante (3'), incluindo terminação de transcrição e sinais de poliadenilação, e outras sequências co-nhecidas aos técnicos no assunto, tais como vários marcadores de seleção.

[000106] Os polinucleotídeos de NtTS podem ser produzidos em vá- rias formas, incluindo como estruturas de trançado duplo (isto é, uma molécula de RNA de trançado duplo compreendendo um trançado de antisentido e um trançado de sentido complementar), estruturas similares a grampo de trançado duplo ("dsRNAi"), ou estruturas de trançado único (isto é, uma molécula de ssRNA compreendendo somente um trançado de antisentido). As estruturas podem compreender uma estrutura dúplex, uma estrutura dúplex assimétrica, estrutura secundária de grampo, ou estrutura secundária de grampo assimétrica, tendo trançados de sentido auto complementar, e de antisentido. O dsRNAi de NtTS podem ser enzimaticamente convertidos em siRNAs de NtTS de trançado duplo. Um dos trançados dos dúplexes de siRNA de NtTS podem se ligar a uma sequência complementar dentro de mRNA de NtTS e variantes de RNA de NtTS relacionadas. Os dúplexes de siR- NA/mRNA são reconhecidos por RISC que podem clivar RNAs de NtTS em locais múltiplos em uma maneira dependente de sequência, resultando na degradação da mRNA de NtTS alvo e variantes de RNA de NtTS relacionadas.

[000107] As moléculas de RNA de trançado duplo podem incluir moléculas de siRNA montadas de um oligonucleotídeo único em uma estrutura de haste e ansa, em que regiões de sentido auto complementar e de antisentido da molécula de siRNA são ligadas por meio de um ligador(es) à base de polinucleotídeo, ou ligador(es) à base de não po- linucleotídeo, bem como RNA de trançado único circular tendo duas ou mais estruturas de ansa e uma haste compreendendo trançados de sentido auto complementar e de antisentido, em que o RNA circular pode ser processado ou in vivo ou in vitro, para gerar uma molécula de siRNA ativa capaz de mediar RNAi.

[000108] O uso de moléculas de RNA de grampo pequeno (shRNA) é também aqui contemplado, e compreende uma sequência de anti- sentido específica em adição à sequência de complemento reverso (sentido), tipicamente separada por um espaçador ou sequência cíclica. A clivagem do espaçador ou loop proporciona uma molécula de RNA de trançado único e seu complemento reverso, tal que eles podem se ligar para formar uma molécula de RNA de trançado duplo (opcionalmente com etapas de processamento adicionais que podem resultar em adição ou remoção de um, dois, três ou mais nucleotídeos a partir da extremidade 3' ou da extremidade 5', de qualquer ou ambos os trançados). O espaçador pode ser de um comprimento suficiente para permitir as sequências de antisentido e de sentido para ligar e formar uma estrutura de trançado duplo (ou haste) antes de clivagem do espaçador (e, opcionalmente, etapas de processamento subsequentes que podem resultar em adição ou remoção de um, dois, três, quatro, ou mais nucleotídeos a partir da extremidade 3', ou da extremidade 5' de qualquer ou ambos os trançados). A sequência espaçadora é tipicamente uma sequência de nucleotídeo não relacionada que está situada entre duas regiões de sequência complementar de nucleotídeo que, quando ligada em um polinucleotídeo de trançado duplo, compreende um shRNA. A sequência espaçadora geralmente compreende entre cerca de 3 e cerca de 100 nucleotídeos.

[000109] Qualquer polinucleotídeo de RNA de NtTS de interesse pode ser produzido por seleção de uma composição de sequência adequada, tamanho do loop, e comprimento de haste, para produção do dúplex de grampo de NtTS. Uma faixa adequada para delineação dos comprimentos de haste de um dúplex de grampo, inclui comprimentos de haste de pelo menos cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos - tais como cerca de 14-30 nucleotídeos, cerca de 30-50 nucleotídeos, cerca de 50-100 nucleotídeos, cerca de 100-150 nucleotídeos, cerca de 150-200 nucleotídeos, cerca de 200-300 nucle- otídeos, cerca de 300-400 nucleotídeos, cerca de 400-500 nucleotí- deos, cerca de 500-600 nucleotídeos, e cerca de 600-700 nucleotí- deos. Uma faixa adequada para delineação de comprimentos de loop de um dúplex de grampo, incluem comprimentos de loop de cerca de 4-25 nucleotídeos, cerca de 25-50 nucleotídeos, ou mais longos, se o comprimento de haste do dúplex de grampo é substancial. Em certas concretizações, um RNA de trançado duplo (dsRNA), ou molécula de RNA de trançado duplo (ssRNA), é entre cerca de 15 e cerca de 40 nucleotídeos de comprimento. Em outra concretização, a molécula de siRNA é uma molécula de dsRNA ou ssRNA entre cerca de 15 e cerca de 35 nucleotídeos de comprimento. Em outra concretização, a molécula de siRNA é uma molécula de dsRNA ou ssRNA entre cerca de 17 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. Em outra concretização, a molécula de siRNA é uma molécula de dsRNA ou ssRNA entre cerca de 19 e cerca de 25 nucleotídeos de comprimento. Em outra concretização, a molécula de siRNA é uma molécula de dsRNA ou ssRNA entre cerca de 21 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento. Em certas concretizações, estrutura de grampo com regiões dúplexadas mais longas do que 21 nucleotídeos podem promover silenciamento direcionado de siRNA efetivo, indiferente de sequência de loop e comprimento.

[000110] A sequência de mRNA alvo é tipicamente entre cerca de 14 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento. O mRNA alvo pode, portanto, ser escaneado para regiões entre cerca de 14 e cerca de 50 nu- cleotídeos de comprimento que, preferivelmente, encontram um ou mais dos seguintes critérios para uma sequência alvo: uma razão de A+T/G+C de entre cerca de 2:1 e cerca de 1 :2; um dinucleotídeo AA ou um dinucleotídeo CA na extremidade 5' da sequência alvo; uma sequência de pelo menos 10 nucleotídeos consecutivos únicos ao mRNA alvo (isto é, a sequência não está presente em outras sequências de mRNA a partir da mesma planta); e nenhum "curso" de mais do que três nucleotídeos de guanina consecutivos (G), ou mais do que três nucleotídeos de citosina consecutivos (C). Estes critérios podem ser avaliados usando várias técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, programas de computador, tal como BLAST, pode ser usado para pesquisar bases de dados publicamente disponíveis para determinar se a sequência alvo selecionada é única ao mRNA alvo. Alternativamente, uma sequência alvo pode ser selecionada (e uma sequência de siRNA designada) usando software de computador comercialmente disponível (por exemplo, OligoEngine, Target Finder, e o siRNA Design Tool, que são comercialmente disponíveis.

[000111] Em uma concretização, sequências de mRNA alvos são selecionadas que são entre cerca de 14 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, que encontram um ou mais dos critérios acima. Em outra concretização, as sequências alvos são selecionadas, que são entre cerca de 16 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, que encontram um ou mais dos critérios acima. Em uma concretização adicional, sequências alvos são selecionadas, que são entre cerca de 19 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, que encontram um ou mais dos critérios acima. Em outra concretização, sequências alvos são selecionadas, que são entre cerca de 19 e cerca de 25 nucleotídeos de comprimento, que encontram um ou mais dos critérios acima. Em uma concretização exemplar, as moléculas usadas para modular expressão compreendem uma sequência específica (por exemplo, uma sequência de antisentido) que é complementar a pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou mais de nucleotídeos contíguos de qualquer uma das sequências de polinucle- otídeo de NtTS aqui descritas - tais como SEQ ID NOs:1 a 5 ou 20.

[000112] Em uma concretização exemplar adicional, as moléculas usadas para modular expressão compreendem uma sequência (por exemplo, uma sequência de antisentido) que é complementar a pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30, ou mais nucleotídeos contíguos de nucleotídeos 1-46 de SEQ ID NOs: 1 , 2 e 3; nucleotídeos 1-52 de SEQ ID NO:20; nucleotí- deos 99-141 de SEQ ID NO:1; nucleotídeos 102-144 de SEQ ID NO: 2, e SEQ ID NO:3; nucleotídeos 102-153 de SEQ ID NO:20; nucleotí- deos 1325-1362 de SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; ou nucleotídeos 1334-1371 de SEQ ID NO:20.

[000113] Em uma concretização exemplar adicional, as moléculas usadas para modular expressão compreendem uma sequência (por exemplo, uma sequência de antisentido) que é complementar a pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 ou mais de nucleotídeos contíguos de nucleotídeos 454-805 de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, ou SEQ ID NO:3, ou nucleotídeos 463-814 de SEQ ID NO:20.

[000114] A sequência de antisentido específica compreendida pela molécula de siRNA pode ser idêntica, ou substancialmente idêntica, ao complemento da sequência alvo. Em uma concretização, a sequência de antisentido específica compreendida pela molécula de siRNA é pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao complemento da sequência de mRNA alvo. Métodos de determinação da identidade de sequência são conhecidos na técnica, e podem ser determinados, por exemplo, pelo uso do programa BLASTN do software do Grupo de Computador da Universidade de Wisconsin (GCG), ou providos na NCBI website.

[000115] A sequência de antisentido específica das moléculas de siRNA pode exibir variabilidade por diferir (por exemplo, por substituição de nucleotídeo, incluindo transição ou transversão) em um, dois, três, quatro ou mais nucleotídeos a partir da sequência do mRNA alvo. Quando tais substituições de nucleotídeo estão presentes no trançado de antisentido de uma molécula de RNA de trançado duplo, o nucleo- tídeo complementar no trançado de sentido com o qual o nucleotídeo adequado formaria tipicamente ligação de hidrogênio, emparelhamen- to de base pode ou não pode ser correspondentemente moléculas de RNA de trançado duplo substituído em que uma ou mais substituições de nucleotídeo ocorrem na sequência de sentido, mas não no trançado de antisentido, são também contemplados. Quando a sequência de antisentido de uma molécula de siRNA compreende uma ou mais de- sequiparações entre a sequência de nucleotídeo do siRNA e a sequência alvo de nucleotídeo, conforme descrito acima, as desequipa- rações podem ser encontradas no terminal 3', no terminal 5', ou na porção central da sequência de antisentido.

[000116] Em outra concretização, as moléculas de siRNA compreendem uma sequência de antisentido específica que é capaz de hibridi- zar seletivamente sob condições estringentes a uma porção de um gene alvo que ocorre naturalmente, ou mRNA alvo. Conforme conhecido àqueles técnicos no assunto, variações na estringência de condições de hibridização podem ser alcançadas pela alteração do tempo, temperatura ou concentração das soluções usadas para a hibridização e etapas de lavagem. Condições adequadas podem também depender, em parte, das sequências de nucleotídeo particulares usadas, por exemplo, a sequência do mRNA alvo ou gene.

[000117] Um método para indução de silenciamento de RNA de trançado duplo em plantas é transformação com um construto de gene que produz RNA de grampo (ver, Smith et al. (2000) Nature, 407, 319320). Tais construtos compreendem regiões invertidas da sequência de gene alvo, separadas por um espaçador apropriado. A inserção de uma região de intron de planta funcional como um fragmento de espa- çador aumenta adicionalmente a eficiência da indução de silenciamen- to de gene, devido a geração de um RNA de grampo repartido de intron (Wesley ef al. (2001) Plant J., 27, 581-590). Adequadamente, o comprimento de haste é cerca de 50 nucleotídeos a cerca de 1 kiloba se de comprimento. Métodos para produção de RNA de grampo repartido de intron são bem descritos na técnica (ver, por exemplo, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617).

[000118] Moléculas de RNAi tendo uma estrutura dúplex ou de trançado duplo, por exemplo, RNA de trançado duplo ou shRNA, pode ter extremidades cegas, ou pode ter balanços 3' ou 5'. Conforme aqui usado, "balanço" se refere ao nucleotídeo não emparelhado ou nucleo- tídeos que se projetam de uma estrutura dúplex quando um terminal 3' de um trançado de RNA se prolonga além do terminal 5' do outro trançado (balanço 3'), ou vice versa (balanço 5'). Os nucleotídeos compreendendo o balanço podem ser ribonucleotídeos, deoxiribonucleotídeos ou versões modificadas destes. Em uma concretização, pelo menos um trançado da molécula de RNAi tem um balanço 3' de cerca de 1 a cerca de 6 nucleotídeos de comprimento. Em outras concretizações, o balanço 3' é de cerca de 1 a cerca de 5 nucleotídeos, de cerca de 1 a cerca de 3 nucleotídeos, e de cerca de 2 a cerca de 4 nucleotídeos de comprimento.

[000119] Quando a molécula de RNAi compreende um balanço 3' em uma extremidade da molécula, a outra extremidade pode ser de extremidade cega, ou ter também um balanço (5' ou 3'). Quando a molécula de RNAi compreende um balanço e ambas as extremidades da molécula, o comprimento dos balanços pode ser o mesmo ou diferente. Em uma concretização, a molécula de RNAi compreende balanços 3' de cerca de 1 a cerca de 3 nucleotídeos em ambas as extremidades da molécula. Em uma concretização adicional, a molécula de RNAi é um RNA de trançado duplo tendo um balanço 3' de 2 nucleotídeos em ambas as extremidades da molécula. Em ainda outra concretização, os nucleotídeos compreendendo o balanço do RNAi são dinucleotí- deos TT ou dinucleotídeos UU.

[000120] Quando se determina a identidade de percentagem da mo- lécula de RNAi compreendendo um ou mais balanços para a sequência de mRNA alvo, o(s) balanço(s) pode(m) ou não pode(m) ser(em) levado(s) em conta. Por exemplo, os nucleotídeos de um balanço 3' e até 2 nucleotídeos a partir do terminal 5'-ou 3' do trançado duplo, podem ser modificados sem perda significante de atividade da molécula de siRNA.

[000121] As moléculas de RNAi podem compreender uma ou mais estruturas de capa 5' ou 3'. A molécula de RNAi pode compreender uma estrutura de capa na extremidade 3' do trançado de sentido, do trançado de antisentido, ou ambos dos trançados de sentido e de anti- sentido; ou na extremidade 5' do trançado de sentido, do trançado de antisentido, ou ambos dos trançados de sentido e de antisentido da molécula de RNAi. Alternativamente, a molécula de RNAi pode compreender uma estrutura de capa e ambas a extremidade 3' e extremidade 5' da molécula de RNAi. O termo "estrutura de capa" se refere a uma modificação química incorporada em qualquer terminal de um oli- gonucleotídeo, que protege a molécula de degradação de exonuclease, e pode também facilitar a distribuição ou localização dentro de uma célula.

[000122] Outra modificação aplicável às moléculas de RNAi é a ligação química à molécula de RNAi de uma ou mais porções ou conjugados que intensificam a atividade, distribuição celular, aceitação celular, biodisponibilidade, ou estabilidade da molécula de RNAi. Os polinucle- otídeos podem ser sintetizados ou modificados por métodos bem estabelecidos na técnica. Modificações químicas podem incluir, mas não são limitadas a, modificações 2', introdução de bases não naturais, fixação covalente a um ligante, e substituição de ligações de fosfato com ligações de tiofosfato. Nesta concretização, a integridade da estrutura dúplex é fortalecida por pelo menos uma, e tipicamente duas, ligações químicas. A ligação química pode ser alcançada por qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas, por exemplo, por introdução de ligações de hidrogênio ou iônicas covalentes; interações hidrofóbicas, interações de empilhamento ou de van der Waals; por meio de coordenação de metal-íon, ou através do uso de análogos de purina.

[000123] Em ainda outra concretização, os nucleotídeos em um ou ambos dos dois trançados únicos podem ser modificados para reduzir ou inibir a ativação de enzimas celulares, tais como, por exemplo, sem limitação, certas nucleases. Técnicas para redução ou inibição da ativação de enzimas celulares são conhecidas na técnica, incluindo, mas não limitadas a, modificações de 2'-amino, modificações de 2'-flúor, modificações de 2'-alquil, modificações de suporte não carregado, modificações de morfolino, modificações de 2'-0-metil, e fosforamidato. Desse modo, pelo menos um 2'-grupo hidroxil dos nucleotídeos em um NA de trançado duplo é substituído por um grupo químico. Também, pelo menos um nucleotídeo pode ser modificado para formar um nu- cleotídeo travado. Tal nucleotídeo travado contém uma ponte de meti- leno ou de etileno que liga o 2'-oxigênio de ribose com o 4'-carbono de ribose. A introdução de um nucleotídeo travado em um oligonucleotí- deo aperfeiçoa a afinidade para sequências complementares, e aumenta a temperatura de fusão por vários graus.

[000124] Os ligantes podem ser conjugados a uma molécula de RNAi, por exemplo, para intensificar sua absorção celular. Em certas concretizações, um ligante hidrofóbico é conjugado à molécula para facilitar permeação direta da membrana celular. Estas abordagens foram usadas para facilitar permeação de célula de oligonucleotídeos de antisentido. Em certos exemplos, conjugação de um ligante catiônico a oligonucleotídeos frequentemente resulta em resistência aperfeiçoada a nucleases. Exemplos representativos de ligantes catiônicos incluem propilamônia e dimetilpropilamônio. Os oligonucleotídeos de antisenti- do podem reter sua alta afinidade de ligação a mRNA quando o ligante catiônico é disperso através de todo o oligonucleotídeo.

[000125] As moléculas e nucleotídeos aqui descritos podem ser preparados usando técnicas bem conhecidas de síntese de fase sólida. Qualquer outro meio para tal síntese conhecido na técnica pode, adicionalmente, ou alternativamente, ser empregado.

[000126] Várias concretizações são direcionadas a vetores de expressão de NtTS compreendendo um ou mais polinucleotídeos de NtTS ou construtos de RNAi de NtTS que compreendem um ou mais polinucleotídeo de NtTS. Várias concretizações são direcionadas a vetores de expressão compreendendo um ou mais polinucleotídeo de NtTS, ou um ou mais construtos de RNAi de NtTS.

[000127] Várias concretizações são direcionadas a vetores de expressão compreendendo um ou mais polinucleotídeo de NtTS, ou um ou mais construtos de RNAi de NtTS que codificam um ou mais poli- nucleotídeos de RNAi de NtTS capazes de auto ligação para formar uma estrutura em grampo, em que o construto compreende (a) um ou mais polinucleotídeos de NtTS; (b) uma segunda sequência que codifica um elemento espaçador que forma um loop da estrutura em grampo; e (c) uma terceira sequência compreendendo uma sequência complementar reversa da primeira sequência, posicionada na mesma orientação como à primeira sequência, em que a segunda sequência é posicionada entre a primeira sequência e a terceira sequência, e a segunda sequência é operavelmente ligada à primeira sequência e à terceira sequência.

[000128] As sequências reveladas podem ser utilizadas para construção de vários polinucleotídeos de NtTS que não formam estrutura de grampo. Por exemplo, um NA de trançado duplo de NtTS pode ser formado por (1) transcrição de um primeiro trançado do DNA de NtTS por ligação operavelmente a um primeiro promotor, e (2) transcrição da sequência complementar reversa ao primeiro trançado do fragmento de DNA de NtTS por ligação operavelmente a um segundo promotor. Cada trançado do polinucleotídeo de NtTS pode ser transcrito a partir do mesmo vetor de expressão, ou de vetores de expressão diferentes. O dúplex de RNA de NtTS tendo atividade de interferência de RNA pode ser enzimaticamente convertido em siRNAs para reduzir níveis de RNA de NtTS.

[000129] Desse modo, várias concretizações são direcionadas a vetores de expressão de NtTS compreendendo polinucleotídeo de NtTS ou construto de RNAi de NtTS que codifica polinucleotídeos de RNAi de NtTS capazes de auto ligação, em que o construto compreende (a) um ou mais dos polinucleotídeos de NtTS aqui descritos; e (b) uma segunda sequência compreendendo uma sequência complementar (por exemplo, complementar reversa) da primeira sequência, posicionada na mesma orientação como a primeira sequência.

[000130] Várias composições e métodos são providos para redução dos níveis de expressão endógeno de NtTS por promoção de co- supressão da expressão de gene de NtTS. O fenômeno de co- supressão ocorre como um resultado de introdução de cópias múltiplas de um transgene em um hospedeiro de célula de planta. A integração de cópias múltiplas de um transgene pode resultar em expressão reduzida do transgene e do gene endógeno alvo. O grau de co- supressão é dependente do grau de identidade de sequência entre o transgene e o gene endógeno alvo. O silenciamento de ambos o gene endógeno e o transgene pode ocorrer por metilação extensiva do local silenciado (isto é, o promotor endógeno e gene endógeno de interes-se), que pode evitar transcrição. Alternativamente, em alguns casos, co-supressão do gene endógeno e do transgene pode ocorrer por si- lenciamento de gene pós- transcricional ("PTGS"), em que transcritos podem ser produzidos, mas taxas intensificadas de degradação evitam acúmulo de transcritos. O mecanismo para co-supressão por PTGS é pensado se assemelhar a interferência de RNA, em que RNA parece ser ambos um iniciador importante e um alvo nestes processos, e pode ser mediado, pelo menos em parte, pela mesma maquinaria molecular, possivelmente através de degradação de guia de RNA de mRNAs.

[000131] A co-supressão de ácido nucleico de NtTS pode ser alcançada por integração de cópias múltiplas do ácido nucleico de NtTS ou fragmentos deste, como transgenes, no genoma de uma planta de interesse. A planta hospedeira pode ser transformada com um vetor de expressão compreendendo um promotor operavelmente ligado a ácido nucleico de NtTS, ou fragmentos deste. Várias concretizações são direcionadas a vetores de expressão para promoção de co-supressão de genes endógenos de NtTS compreendendo um promotor opera- velmente ligado a um polinucleotídeo de NtTS.

[000132] Várias concretizações são direcionadas a métodos para modulação (por exemplo, redução ou inibição) do nível de expressão de DNA de NtTS por integração de cópias múltiplas de um polinucleo- tídeo de NtTS em um genoma de planta (tabaco), compreendendo: transformar um hospedeiro de célula de planta com um vetor de expressão que compreende um promotor operavelmente ligado a um po- linucleotídeo de NtTS.

[000133] Várias composições e métodos são providos para redução do nível de expressão de gene endógeno de NtTS por redução ou inibição da translação de mRNA de NtTS. Uma célula de planta hospedeira (tabaco) pode ser transformada com um vetor de expressão compreendendo: um promotor operavelmente ligado a um polinucleo- tídeo de NtTS, posicionado em orientação antessentido com relação ao promotor para capacitar a expressão de polinucleotídeos de RNA tendo uma sequência complementar a uma porção de mRNA de NtTS.

[000134] Vários vetores de expressão para redução ou inibição da translação de mRNA de NtTS podem compreender: um promotor ope- ravelmente ligado a um polinucleotídeo de NtTS em que a sequência é posicionada em orientação antessentido com relação ao promotor. Os comprimentos de polinucleotídeos de RNA de NtTS de antisentido podem variar, e podem ser de cerca de 15-20 nucleotídeos, cerca de 2030 nucleotídeos, cerca de 30-50 nucleotídeos, cerca de 50-75 nucleo- tídeos, cerca de 75-100 nucleotídeos, cerca de 100-150 nucleotídeos, cerca de 150-200 nucleotídeos, e cerca de 200-300 nucleotídeos.

[000135] Métodos para obtenção de polinucleotídeos de NtTS mu- tantes e polipeptídeos são também providos. Qualquer planta de interesse, incluindo uma célula de planta, ou material de planta, pode ser geneticamente modificada por vários métodos conhecidos por induzir mutagênese, incluindo mutagênese de local direcionado, mutagênese direcionada de oligonucleotídeo, mutagênese quimicamente induzida, mutagênese induzida por irradiação, mutagênese utilizando bases modificadas, mutagênese utilizando DNA dúplex com folga, mutagê- nese de quebra de trançado duplo, mutagênese utilizando cepas de hospedeiro de reparo deficiente, mutagênese por síntese de gene total, embaralhamento de DNA, e outros métodos equivalentes.

[000136] Alternativamente, os genes de NtTS podem ser direcionados para inativação por introdução de ribozimas derivadas de um número de RNAs circulares pequenos que são capazes de auto clivagem e replicação em plantas. Estes RNAs podem replicar ou sozinhos (RNAs de viróide), ou com um vírus auxiliador (RNAs de satélite). Exemplos de RNAs adequados incluem aqueles derivados de viróide de sunblotch de abacate e RNAs de satélite derivados de vírus de ringspot de tabaco, vírus de faixa transiente de luzerna, vírus de mote de tabaco de veludo, vírus de mote solanum nodiflorum, e vírus de mote de trevo subterrâneo. Várias ribozimas específicas de RNA alvo são conhecidas aos técnicos no assunto.

[000137] Em algumas concretizações, a expressão de um polipeptí- deo de NtTS é reduzida por meios não transgênicos, tal como criação de uma ou mais mutações em um gene de NtTS. Métodos que introduzem uma mutação aleatoriamente em uma sequência de gene podem incluir mutagênese química, mutagênese de SEM, e mutagênese de radiação. Métodos que introduzem uma ou mais mutações alvos em uma célula incluem, mas não são limitadas a, tecnologia de edição de genoma, particularmente mutagênese mediada por finger nuclease, recombinação homóloga de cultivo (lesões locais induzidas alvo em genomas), mutagênese direcionada de oligonucleotídeo, e mutagêne- se mediada por meganuclease.

[000138] Alguns exemplos não limitativos de mutações são anulações, inserções e mutações sem sentido de pelo menos um nucleotí- deo, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), e uma repetição de sequência única. Após mutação, classificação pode ser realizada para identificar anulações que criam códons de parada prematuros ou, de outro modo, genes de NtTS não funcionais. A classificação de mutan- tes pode ser efetuada por sequenciamento, ou pelo uso de uma ou mais sondas ou iniciadores específicos ao gene ou proteína de NtTS. Mutações específicas em polinucleotídeos de NtTS podem também serem criadas que podem resultar em expressão de gene de NtTS reduzida, estabilidade reduzida de mRNA de NtTS, ou estabilidade reduzida da proteína de NtTS. Tais plantas são referidas aqui como plantas mutantes.

[000139] As plantas mutantes podem ter qualquer combinação de uma ou mais mutações que resultam em níveis de polipeptídeo de NtTS reduzidos. Por exemplo, as plantas mutantes podem ter uma mutação única em um gene de NtTS único. ou mutações múltiplas em um gene de NtTS único. Consequentemente, plantas mutantes compreen- dendo as variantes de polipeptídeo de NtTS mutantes são reveladas.

[000140] Em uma concretização, sementes de plantas são mutageni- zadas e, em seguida, crescidas em plantas mutantes de primeira geração. As plantas de primeira geração são, em seguida, permitidas auto- polinizarem, e as sementes das plantas de primeira geração são crescidas em planta de segunda geração, que são, em seguida, classificadas para mutações em seu local de NtTS. Embora o material de planta mu- tagênico possa ser classificado para mutações, uma vantagem de classificação da planta de segunda geração é que todas as mutações somáticas correspondem a mutações de linhagem de germe. Um técnico no assunto compreenderia que uma variedade de materiais de planta, incluindo, mas não limitados a, sementes, pólen, tecido de planta, ou células de planta, podem ser mutagenizados de modo a criar as plantas mutantes de NtTS. Contudo, o tipo de material de planta mutagenizado pode afetar quando o ácido nucleico da planta é classificado para mutações. Por exemplo, quando pólen é submetido a mutagênese antes da polinização de uma planta não mutagenizada, as sementes resultantes daquela polinização são crescidas em plantas de primeira geração. Toda célula das plantas de primeira geração conterá mutações criadas no pólen; desse modo, estas plantas de primeira geração podem, em seguida, serão classificadas para mutações de NtTS ao invés de esperarem até a segunda geração. Os mutagênicos que criam mutações de ponto, anulações curtas, inserções, transversões, e ou transições, incluindo mutagênicos químicos ou radiação, podem ser usados para criar as mutações. Mutagênicos incluem, mas não são limitados a, etil meta- nosulfonato (EMS), metilmetano sulfonato (MMS), N-etil-N-nitrosuréia (ENU), trietilmelamina (TEM), N-metil-N-nitrosouréia (MNU), procarba- zina, clorambucil, ciclofosfamida, dietil sulfato, monômero de acrilamida, melfalan, mostarda de nitrogênio, vincristina, dimetilnitrosamina, N- metil-N'-nitro-Nitrosoguanidina (MNNG), nitrosoguanidina, 2-aminopu- rina, 7,12 dimetil-benz(a)antraceno (DMBA), óxido de etileno, hexametil- fosforamida, bisulfan, diepoxialcanos (diepoxioctano (DEO), diepoxibu- tano (BEB), e similares), 2-metoxi-6-cloro-9[3-(etil-2-cloro-etil)amino propilamino]acridina dihidrocloreto (ICR-170), e formaldeído. As mutações espontâneas no local de NtTS que podem não ter sido diretamente causadas pelo mutagênico são também contempladas, provido que elas resultam no fenótipo desejado. Agentes mutagênicos adequados também incluem, por exemplo, radiação de ionização - tal como raios-X, raios gama, irradiação rápida de nêutron, e radiação de UV. Qualquer método de preparação de ácido nucleico de planta conhecido àqueles técnicos no assunto pode ser usado para preparar o ácido nucleico da planta para classificação de mutação de NtTS. Qualquer método de preparação de ácido nucleico de planta conhecido àqueles técnicos no assunto pode ser usado para preparar o ácido nucleico de planta para classificação de mutação de NtTS.

[000141] O ácido nucleico preparado de plantas individuais, células de planta, ou material de planta, podem, opcionalmente, ser reunido de modo a expedir classificação de mutações no gene de NtTS da população de plantas que se originam do tecido de planta mutagênico, células ou material. Uma ou mais gerações subsequentes de plantas, células de planta, ou material de planta, podem ser classificados. O tamanho do grupo opcionalmente reunido é dependente da sensibilidade do método de classificação usado.

[000142] Após as amostras de ácido nucleico serem opcionalmente reunidas, elas podem ser submetidas a técnicas de amplificação de polinucleotídeo de NtTS, tal como Reação de Cadeia de Polimerase (PCR). Qualquer um ou mais iniciadores ou sondas específicos ao gene de NtTS, ou às sequências imediatamente adjacentes ao gene de NtTS, podem ser utilizados para amplificar as sequências de NtTS dentro da amostra de ácido nucleico opcionalmente reunida. Preferi- velmente, o um ou mais iniciadores são designados para amplificar as regiões do local de NtTS onde mutações úteis são mais prováveis de ocorrer. Mais preferivelmente, o iniciador é designado para detectar mutações dentro das regiões do polinucleotídeo de NtTS. Adicionalmente, é preferível que o(s) iniciador(es) evite(m) locais polimórficos conhecidos de modo a fácil classificação para mutações de ponto. Para facilitar detecção de produtos de amplificação, o um ou mais iniciadores ou sondas podem ser etiquetados usando qualquer método de etiquetação convencional. O(s) iniciador(es) ou sondas podem ser designados baseado nas sequências de NtTS, conforme aqui descrito, usando métodos que são bem compreendidos na técnica. Os polimorfismos podem ser identificados por meios conhecidos na técnica.

[000143] Em um aspecto adicional, é provido um método de preparação de uma planta mutante. O método envolve provisão de pelo menos uma célula de uma planta compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo de NtTS funcional. Em seguida, a pelo menos uma célula da planta é tratada sob condições efetivas para modular a atividade do gene de NtTS. A pelo menos uma célula de planta mutante é, em seguida, propagada em uma planta mutante, onde a planta mutante tem um nível modulado de polipeptídeo de NtTS, conforme comparado àquele de uma planta de controle. Em uma concretização deste método de produção de uma planta mutante, a etapa de tratamento envolve submeter a pelo menos uma célula a um agente de mutageni- zação química, conforme descrito acima, e sob condições efetivas para produzir pelo menos uma célula de planta mutante. Em outra con-cretização deste método, a etapa de tratamento envolve submeter a pelo menos uma célula a uma fonte de radiação sob condições efetivas para produzir pelo menos uma célula de planta mutante. O termo "planta mutante" inclui plantas mutantes em que o genótipo é modificado, conforme comparado a uma planta de controle, adequadamente por meio de outro do que engenharia genética, ou modificação genética.

[000144] Em certas concretizações, a planta mutante, célula de planta mutante, ou material de planta mutante, pode compreender uma ou mais mutações que ocorreram naturalmente em outra planta, célula de planta, ou material de planta, e conferem um traço desejado. Esta mutação pode ser incorporada (por exemplo, introgredida) em outra planta, célula de planta, ou material de planta (por exemplo, uma planta, célula de planta, ou material de planta, com um antecedente genético diferente para a planta da qual a mutação foi derivada) para conferir o traço a esta. Desse modo, por meio de exemplo, uma mutação que ocorreu naturalmente em uma primeira planta pode ser introduzida em uma segunda planta - tal como uma segunda planta com um antecedente genético diferente para a primeira planta. O técnico no assunto é, portanto, capaz de pesquisar e identificar uma planta conduzindo naturalmente em seu genoma, um ou mais alelos mutantes do gene de NtTS que conferem um traço desejado. O(s) alelo(s) mutante(s) que ocorre(m) naturalmente pode(m) ser transferido(s) à segunda planta por vários métodos, incluindo geração, retro cruzamento, e introgres- são, para produzir uma linhagem, variedades ou híbridos que têm uma ou mais mutações no gene de NtTS. As plantas mostrando um traço desejado podem ser classificadas de uma reunião de plantas mutan- tes. Adequadamente, a seleção é efetuada utilizando o conhecimento da sequência de nucleotídeos de NtTS, conforme aqui descrito. Consequentemente, é possível classificar um traço genético sendo indicativo de níveis aumentados de metionina livre, conforme comparado a um controle. Tal abordagem de classificação pode envolver a aplicação de técnicas convencionais de amplificação e/ou hibridização de ácido nucleico, conforme aqui discutido. Desse modo, um aspecto adicional se relaciona a um método para identificação de uma planta mu- tante compreendendo as etapas de: (a) proporcionar uma amostra compreendendo um polinucleotídeo de NtTS de uma planta; e (b) determinar a sequência de ácido nucleico do polinucleotídeo de NtTS, em que uma diferença na sequência do polinucleotídeo de NtTS, conforme comparada ao polinucleotídeo de NtTS de uma planta de controle, é indicativa que referida planta é uma planta mutante de NtTS. Em outro aspecto, é provido um método para identificação de uma planta mutante que acumula níveis aumentados de metionina livre, conforme comparado a uma planta de controle compreendendo as etapas de: (a) proporcionar uma amostra de uma planta a ser classificada; (b) determinar se referida amostra compreende uma ou mais mutações no po- linucleotídeo de NtTS; e (c) determinar o teor de metionina de referida planta; em que se referida amostra compreende uma ou mais mutações no polinucleotídeo de NtTS que modula a expressão, ou a atividade da proteína codificada, conforme comparado a uma planta de controle, e uma parte da planta tem um aumento no teor de metionina de pelo menos 5%, conforme comparado a uma planta de controle em que a expressão ou a atividade de treonina sintase não foi reduzida, é indicativo de uma planta mutante que ocorre naturalmente que acumula níveis aumentados de metionina livre. Em outro aspecto, é provido um método para preparação de uma planta mutante que acumula níveis aumentados de metionina livre, conforme comparado a uma planta de controle compreendendo as etapas de: (a) proporcionar uma amostra de uma primeira planta; (b) determinar se referida amostra compreende uma ou mais mutações no polinucleotídeo de NtTS que resulta no acúmulo de níveis aumentados de metionina livre na mesma; e (c) transferir a uma ou mais mutações em uma segunda planta. A(s) mutação(ões) pode(m) ser transferida(s) na segunda planta usando vários métodos que são conhecidos na técnica - tais como, por engenharia genética, manipulação genética, introgressão, geração de planta, retro cruzamento, e similares. Em uma concretização, a primeira planta é uma planta que ocorre naturalmente. Em uma concretização, a segunda planta tem um antecedente genético diferente para a primeira planta. Em outro aspecto, é provido um método para preparação de uma planta mutante que acumula níveis aumentados de metio- nina livre, conforme comparado a uma planta de controle compreendendo as etapas de: (a) proporcionar uma amostra de uma primeira planta; (b) determinar se referida amostra compreende uma ou mais mutações no polinucleotídeo de NtTS que resulta no acúmulo de ní-veis aumentados de metionina livre na mesma; e (c) introgressão da uma ou mais mutações a partir da primeira planta em uma segunda planta. Em uma concretização, a etapa de introgressão compreende geração de planta, opcionalmente incluindo retro cruzamento, e similares. Em uma concretização, a primeira planta é uma planta que ocorre naturalmente. Em uma concretização, a segunda planta tem um antecedente genético diferente para a primeira planta. Em uma concretização, a primeira planta não é um cultivar ou um cultivar de elite. Em uma concretização, a segunda planta é um cultivar, ou um cultivar de elite. Um aspecto adicional se relaciona a uma planta mutante (incluindo um cultivar, ou uma planta mutante de cultivar de elite), obtida pelos métodos aqui descritos. Em certas concretizações, as plantas mu- tantes podem ter uma ou mais mutações localizadas somente em uma região específica da planta - tal como dentro da sequência do polinu- cleotídeo de NtTS. De acordo com esta concretização, a sequência genômica remanescente da planta mutante será a mesma, ou substancialmente a mesma, como a planta antes da mutagênese.

[000145] Em certas concretizações, as plantas mutantes podem ter uma ou mais mutações localizadas em mais do que uma região da planta - tal como dentro da sequência do polinucleotídeo de NtTS, e em uma ou mais regiões adicionais do genoma. De acordo com esta concretização, a sequência genômica remanescente da planta mutante não será a mesma, ou não será substancialmente a mesma como a planta antes da mutagênese. Em certas concretizações, as plantas mutantes podem não ter uma ou mais mutações em um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais exons do poli- nucleotídeo de NtTS; ou não podem ter uma ou mais mutações em um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou cinco ou mais introns do polinucleotídeo de NtTS; ou não podem ter uma ou mais mutações em um promotor do polinucleotídeo de NtTS; ou podem não ter uma ou mais mutações na região não transladada 3' do polinucleo- tídeo de NtTS; ou podem não ter uma ou mais mutações na região não transladada 5' do polinucleotídeo de NtTS; ou podem não ter uma ou mais mutações na região de codificação do polinucleotídeo de NtTS; ou podem não ter uma ou mais mutações na região de não codificação do polinucleotídeo de NtTS; ou qualquer combinação de dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais; ou seis ou mais partes destes.

[000146] Em uma concretização, uma sequência (por exemplo, uma sequência complementar) que é pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 ou mais nucleotídeos contíguos de nucleotídeos 1-46 de SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; nucleotídeos 1-52 de SEQ ID NO:20; nucleotídeos 99-141 de SEQ ID NO:1; nucleo- tídeos 102-144 de SEQ ID NO: 2, e SEQ ID NO:3; nucleotídeos 102153 de SEQ ID NO:20; nucleotídeos 1325-1362 de SEQ ID NOs: 1, 2 e 3; ou nucleotídeos 1334-1371 de SEQ ID NO:20, é usada para modular expressão.

[000147] Em outra concretização, uma sequência (por exemplo, uma sequência complementar) que é pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 ou mais nucleotídeos contíguos de nucleotídeos 454-805 de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, ou SEQ ID NO:3, ou nucleotídeos 463-814 de SEQ ID NO:20 é usada para modular a expressão. Em um aspecto adicional é provido um método de identificação de uma planta, uma célula de planta, ou material de planta, compreendendo uma mutação em um gene que codifica NtTS compreendendo: (a) submeter uma planta, uma célula de planta, ou material de planta, a mutagênese; (b) obter uma amostra de ácido nucleico de referida planta, célula de planta, ou material de planta, ou descendentes destes; e (c) determinar a sequência de ácido nucleico do gene que codifica NtTS, ou uma variante, ou um fragmento deste, em que uma diferença na referida sequência é indicativa de uma ou mais mutações na mesma.

[000148] Proteínas dedos de zinco podem ser usadas para modular a expressão, ou a atividade de treonina sintase. Em várias concretizações, uma sequência de DNA genômica compreendendo uma parte de, ou toda da sequência de codificação de um polinucleotídeo de NtTS, é modificada por mutagênese mediada por dedos de zinco. A sequência de DNA genômica é pesquisada para um local único para ligação de proteína dedos de zinco. Alternativamente, a sequência de DNA genômica é pesquisada para dois locais únicos para ligação de proteína dedos de zinco em que ambos os locais estão em trançados opostos e proximamente juntos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais pares bases á parte. Consequentemente, as proteínas dedos de zinco que se ligam a polinucleotídeo de NtTSs, são providas.

[000149] Uma proteína dedos de zinco pode ser projetada para reconhecer um local alvo selecionado no gene de NtTS. Uma proteína dedos de zinco pode compreender qualquer combinação de motivos derivados de domínios de ligação de DNA de dedos de zinco natural e domínios de ligação de DNA de dedos de zinco não natural, por truncamento ou expansão, ou um processo de mutagênese direcionada de local acoplada a um método de seleção, tal como, mas não limitado a, seleção de exibição de fago, seleção de dois híbridos bacteriais, ou seleção de um híbrido bacterial. O termo "domínio de ligação de DNA de dedos de zinco não natural" se refere a um domínio de ligação de DNA de dedos de zinco que se liga a uma sequência de três pares bases dentro do DNA alvo, e que não ocorre na célula ou organismo compreendendo o DNA que é para ser modificado. Métodos para o projeto de proteína dedos de zinco que se liga às sequências de nu- cleotídeo específicas que são únicas a um gene alvo, são conhecidos na técnica.

[000150] Uma nuclease dedos de zinco pode ser construída por produção de uma fusão de um primeiro polinucleotídeo que codifica para uma proteína dedos de zinco que se liga a um polinucleotídeo de NtTS, e um segundo polinucleotídeo que codifica para uma endonuclease não específica, tal como, mas não limitada a, aquela de uma endonuclease Tipo IIS. Uma proteína de fusão entre uma proteína dedos de zinco e a nuclease pode compreender um espaçador consistindo de dois pares bases ou, alternativamente, o espaçador pode consistir de três, quatro, cinco, seis, sete ou mais, pares bases. Em várias concretizações, uma nuclease dedos de zinco introduz uma quebra de trançado duplo em uma região regulatória, uma região de codificação, ou uma região de não codificação de uma sequência de DNA genômi- ca de um polinucleotídeo de NtTS, e conduz a uma redução do nível de expressão de um polinucleotídeo de NtTS, ou uma redução na atividade da proteína, desse modo, codificada. A clivagem por nuclease dedos de zinco frequentemente resulta na anulação de DNA no local de clivagem em seguida ao reparo de DNA por união terminal não homóloga.

[000151] Em outras concretizações, uma proteína dedos de zinco pode ser selecionada para se ligar a uma sequência regulatória de um polinucleotídeo de NtTS. Mais especificamente, a sequência regulató- ria pode compreender um local de iniciação de transcrição, um códon de partida, uma região de um exon, um limite de um exon-intron, um terminador, ou um códon de parada. Consequentemente, a revelação proporciona uma planta mutante, que ocorre não naturalmente, ou transgênica, ou células de planta, produzidas por mutagênese mediada por nuclease dedos de zinco na vizinhança de, ou dentro do gene de NtTS, e métodos para produção de uma planta, ou célula de planta, por mutagênese mediada por nuclease dedos de zinco. Métodos para distribuição de proteína dedos de zinco e nuclease dedos de zinco a uma planta são similares àqueles descritos abaixo para distribuição de meganuclease.

[000152] Em outro aspecto, a revelação adicionalmente proporciona métodos para produção de plantas que ocorrem não naturalmente, mutantes, ou, de outro modo, plantas modificadas geneticamente transgênicas usando meganucleases - tal como l-Crel. Meganucleases que ocorrem naturalmente, bem como meganucleases recombi- nantes, podem ser usadas para especificamente causarem uma quebra de trançado duplo em um local único, ou em relativamente poucos locais no DNA genômico de uma planta para permitir rompimento de um gene de NtTS. A meganuclease pode ser uma meganuclease projetada com propriedades de reconhecimento de DNA alteradas. Proteínas de meganuclease podem ser distribuídas em células de planta por uma variedade de mecanismos diferentes conhecidos na técnica.

[000153] A revelação envolve o uso de meganucleases para inativar polinucleotídeo de NtTSs em uma célula de planta ou planta. Particularmente, a revelação proporciona um método para inativação de um polinucleotídeo de NtTS em uma planta usando uma meganuclease compreendendo:(a) provisão de uma célula de planta compreendendo um polinucleotídeo de NtTS; (b) introdução de uma meganuclease ou um construto que codifica uma meganuclease na referida célula de planta; e (c) permitir que a meganuclease inative substancialmente o polinucleotídeo de NtTS.

[000154] Meganucleases podem ser usadas para clivar locais de re-conhecimento de meganuclease dentro das regiões de codificação de um polinucleotídeo de NtTS. Tal clivagem frequentemente resulta na anulação de DNA no local de reconhecimento de meganuclease em seguida a reparo de DNA de mutagênese por união terminal não homóloga. Tais mutações na sequência de codificação de gene são tipicamente suficientes para inativar o gene. Este método para modificar uma célula de planta envolve, primeiro, a distribuição de um cassete de expressão de meganuclease a uma célula de planta usando um método de transformação adequado. Para eficiência mais alta, é desejável ligar o cassete de expressão de meganuclease a um marcador selecionável, e selecionar bem sucedidamente células transformadas na presença de um agente de seleção. Esta abordagem resultará na integração do cassete de expressão de meganuclease no genoma, contudo, que pode não ser desejável se a planta é provável de reque-rer aprovação regulatória. Em tais casos, o cassete de expressão de meganuclease (e marcador de gene selecionável ligado) pode ser segregado distante nas gerações de planta subsequentes usando técnicas de geração convencionais. Alternativamente, as células de planta podem ser inicialmente transformadas com um cassete de expressão de meganuclease carecendo de um marcador selecionável, e podem ser crescidas no meio carecendo de um agente de seleção. Sob tais condições, uma fração das células tratadas adquirirá o cassete de expressão de meganuclease e expressará a meganuclease projetada transientemente sem integração do cassete de expressão de meganuclease no genoma. Devido a não se contar com a eficiência de transformação, este último procedimento de transformação requer que um grande número de células tratadas seja classificado para obter a modi- ficação de genoma desejada. A abordagem acima pode também ser aplicada para modificar uma célula de planta quando se usa uma proteína dedos de zinco ou nuclease dedos de zinco.

[000155] Em seguida a distribuição do cassete de expressão de me-ganuclease, as células de planta são crescidas, inicialmente, sob condições que são típicas para o procedimento de transformação particular que foi usado. Isto pode significar crescimento de células transformadas no meio a temperaturas abaixo de 26°C, frequentemente no escuro. Tais condições padrões podem ser usadas por um período de tempo, preferivelmente 1-4 dias, para permitir que a célula de planta se recupere a partir do processo de transformação. Em qualquer ponto em seguida a este período de recuperação inicial, a temperatura de crescimento pode ser elevada para estimular a atividade da meganuclease projetada para clivar e proporcionar mutação do local de reconhecimento de meganuclease.

[000156] Para certas aplicações, pode ser desejável remover precisamente o polinucleotídeo de NtTS a partir do genoma da planta. Tais aplicações são possíveis usando um par de meganucleases projetadas, cada um do qual cliva um local de reconhecimento de meganuclease em qualquer lado da anulação pretendida.

[000157] Plantas adequadas para uso na modificação genética, de acordo com a revelação, incluem plantas monocotiledôneas e dicotile- dôneas, e sistemas de célula de planta, incluindo espécies de uma das seguintes famílias: Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidace- ae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyl- laceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbita- ceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melan- thiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinace- ae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sa- pindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae, ou Vitaceae.

[000158] Espécies adequadas podem incluir membros do gênero Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, An- drographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharandesse modo, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cu- curbita, Cynodon, Datura, Diandesse modo, Digitalis, Dioscorea, Ela- eis, Ephedra, Eriandesse modo, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galandesse modo, Glycine, Gossypium, Heliandesse modo, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lu- pinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Mis- candesse modo, Musa, Nicotiana, Oryza,

[000159] Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Pha- laris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Tritico- secale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis, e Zea.

[000160] Espécies adequadas podem incluir Panicum spp., Sorghum spp., Miscandesse modo spp., Saccharum spp., Eriandesse modo spp., Populus spp., Andropogon gerardii (big bluestem), Pennisetum purpureum (grama de elefante), Phalaris arundinacea (reed canarygrass), Cynodon dactylon (bermudagrass), Festuca arundinacea (festuca dos prados), Spartina pectinata (erva da pradaria), Medicago sativa (alfalfa), Arundo. donax (cana gigante), Secale cereale (rye), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale (trigo triticum x centeio), bamboo, Heliandesse modo annuus (girassol), Car- thamus tinctorius (açafroa), Jatropha curcas (pinhão), Ricinus communis (castor), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linho), Brassica juncea, Beta vulgaris (beterraba), Manihot esculenta (cassa- ya), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (alface), Wlusa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couves de Bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (coco), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (grape), Ananas comosus (ananás), Capsicum annum (pimenta e pimentão), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora), Cu- curbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum me- longena (beringela), Rosa spp. (rosa), Diandesse modo caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétias), Lu- pinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveias), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (choupo), Pinus spp. (pine), Abies spp. (fir), Acer spp. (ácer), Hordeum vulgare (cevada), Poa pratensis (bluegrass), Lolium spp. (azevém) e Phleum pratense (rabo-de-gato), Pani- cum virgatum (switchgrass), Sorghum bicolor (sorgo, sudangrass), Miscandesse modo giganteus (miscandesse modo), Saccharum sp. (cana energética), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (milho), Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Heliandesse modo annuus (girassol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (beterraba), ou Pennisetum glaucum (milho miúdo).

[000161] Várias concretizações são direcionadas a plantas mutantes, plantas que ocorrem não naturalmente, ou plantas transgênicas modificadas, para reduzir expressão de gene de NtTS, desse modo, produzindo plantas - tais como plantas de tabaco - em que o nível de expressão de NtTS é reduzido dentro dos tecidos de planta de interesse, conforme comparado a uma planta de controle. As composições e métodos revelados podem ser aplicados a qualquer espécie do gênero Nicotiana, incluindo N. rustica e W. tabacum (por exemplo, LA B21 , LN KY171, Tl 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 , e Peti- co). Outras espécies incluem N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goods- peedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. 5 otophora, N. paniculate, N. pauciflo- ra, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. set- chellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. sua- veolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioi- des, e N. x sanderae.

[000162] A planta mutante, ou planta transgênica que ocorre não naturalmente, pode, portanto, ser uma variedade de tabaco, ou cultivar de tabaco de elite, que compreende um ou mais transgenes, ou uma ou mais mutações genéticas, ou uma combinação destes. A(s) muta- ção(ões) genética(s) (por exemplo, um ou mais polimorfismos) po- de(m) ser mutações que não existem naturalmente na variedade de tabaco individual, ou cultivar de tabaco (por exemplo, cultivar de tabaco de elite), ou podem ser mutação(ões) genética(s) que ocorre(m) naturalmente, provido que a mutação não ocorre naturalmente na variedade de tabaco individual, ou cultivar de tabaco (por exemplo, cultivar de tabaco de elite). Variedades de Nicotiana tabacum particularmente úteis incluem tabacos tipo Burley, tipo escuro, tipo curado, e tabacos tipo Oriental. Exemplos não limitativos de variedades ou cultivares são: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao tabaco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Hybrid 403LC, Hybrid 404LC, Hybrid 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371 LC, NC 25 100, NC 102, NC 2000, NC 291 , NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71 , NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, 'Perique' tabaco, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51 , R 610, R 630, R 7-11 , R 7-12, RG 17, RG 81 , RG H51 , RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G- 30 28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, Tl 1406, Tl 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37- I , B 13P, Xanthi (Mit- chell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC número 2 Hybrid 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01 , PG 04, P01 , P02, P03, RG I I, RG 8, VA 509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, 35 Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besu- ki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elas- sona, Kutsage E1 , LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, Tl-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. As subvariedades de conversores dos acima, mesmo se não especificamente aqui identificadas, são também contempladas.

[000163] Concretizações são também direcionadas a composições e métodos para produção de plantas mutantes, plantas que ocorrem não naturalmente, plantas híbridas, ou plantas transgênicas, que foram modificadas para reduzir expressão de treonina sintase, ou atividade que resulta em um aumento na concentração de metionina livre em uma ou mais partes (por exemplo, as folhas) de uma planta, conforme comparado a um controle. Vantajosamente, as plantas mutantes, plantas que ocorrem não naturalmente, plantas híbridas, ou plantas trans- gênicas, que são obtidas, são similares ou substancialmente as mesmas em aparência total às plantas de controle. Várias características fenotípicas, tais como grau de maturidade, número de folhas por planta, altura do caule, ângulo de inserção de folha, tamanho da folha (largura e comprimento), distância de internodo, e razão de lâmina- nervura, podem ser avaliadas por observações de campo.

[000164] Um aspecto é uma semente de uma planta mutante, uma planta que ocorre não naturalmente, uma planta híbrida, uma planta transgênica da revelação. Preferivelmente, a semente é uma semente de tabaco. Um aspecto adicional da revelação é pólen ou um óvulo de uma planta mutante, uma planta que ocorre não naturalmente, uma planta híbrida, uma planta transgênica da revelação. Em adição, é provido uma planta mutante, uma planta que ocorre não naturalmente, uma planta híbrida, uma planta transgênica, conforme descrito, que compreende adicionalmente um ácido nucleico que confere esterilidade de macho.

[000165] A revelação também proporciona uma cultura de tecido de células regeneráveis da planta mutante, planta que ocorre não naturalmente, planta híbrida, ou planta transgênica, ou uma parte destas, cuja cultura regenera plantas capazes de expressarem todas as carac- terísticas morfológicas e fisiológicas da origem. As células regeneráveis da revelação incluem, mas não são limitadas a, células de folhas, pólen, embriões, cotiledôneas, hipocotis, raízes, pontas de raiz, ante- res, flores e uma parte destes, óvulos, rebentos, hastes, caules, medula e cápsulas ou calos ou protoplastos derivados destes.

[000166] Em uma concretização, a altura do caule da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica é substancialmente a mesma como uma planta de controle em três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura. Por exemplo, a altura do caule da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica, não é menor do que a altura do caule das plantas de controle três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura. Em outra concretização, a altura do caule da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou planta transgênica é cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% mais alta ou mais baixa do que das plantas de controle em três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura. Em outra concretização, o teor de clorofila da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica é substancialmente o mesmo como uma planta de controle em três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura. Por exemplo, o teor de clorofila da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica, é não menor do que o teor de clorofila da planta de controle três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura. Em outra concretização, o teor de clorofila da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica, é cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% mais alto ou mais baixo do que a planta de controle em três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura. Em outra concretização, a altura do caule da planta mutante, da planta que ocorre não natural- mente, ou da planta transgênica é substancialmente a mesma como uma planta de controle em três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura, e o teor de clorofila da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica, é substancialmente o mesmo como uma planta de controle em três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura. Por exemplo, a altura do caule da planta mutante; da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênicas é não menor do que a altura do caule da planta de controle três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura, e o teor de clorofila da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica, é não menor do que o teor de clorofila da planta de controle três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura. Em outra concretização, a altura do caule da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica, é cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% mais alta ou mais baixa do que a planta de controle em três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura, e o teor de clorofila da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica, é cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% mais alto ou mais baixo do que a planta de controle em três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura. Em outras concretizações, qualquer uma ou mais das seguintes características: grau de maturidade, número de folhas por planta, altura do caule, ângulo de inserção da folha, tamanho da folha (largura e comprimento), distância de internodo, razão de lâmina- nervura, e coloração das folhas da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica, é substancialmente a mesma como uma planta de controle em três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura.

[000167] Em outro aspecto, é provido um método para aumentar a concentração de metionina livre em pelo menos uma parte de uma planta (por exemplo, as folhas), compreendendo as etapas de: (i) reduzir a expressão ou atividade de treonina sintase na planta, preferivelmente, em que a treonina sintase compreende a sequência de poli- nucleotídeo descrita aqui, ou a sequência de polipeptídeo aqui descrita; (ii) medição da concentração de metionina livre em pelo menos uma parte (por exemplo, as folhas) da planta que ocorre não naturalmente, planta mutante ou planta transgênica obtida na etapa (i); e (iii) identificação de uma planta mutante, planta que ocorre não naturalmente, ou planta transgênica, em que a concentração de metionina livre nesta aumentou em comparação a uma planta de controle. Adequadamente, a aparência total de referida planta mutante, planta que ocorre não naturalmente, ou planta transgênica, é substancialmente a mesma como uma planta de controle três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura. Adequadamente, a concentração de treonina livre em parte da planta - tal como as folhas - é aumentada, conforme comparado à planta de controle.

[000168] A redução na expressão de treonina sintase, conforme comparada à planta de controle, pode ser de cerca de 5% a cerca de 100%, de cerca de 5% a cerca de 99% ou menos, de cerca de 5% a cerca de 95% ou menos, de cerca de 5% a cerca de 90% ou menos, ou uma redução de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos98 %, ou 100%, que inclui uma redução na atividade transcricional e/ou expressão de proteína. Em uma concretização, a redução na expressão de treonina sintase é uma redução parcial na expressão, que inclui uma redução na atividade transcricional e/ou expressão de proteína. Em uma concretização, a redução parcial na expressão permite que a planta mutante, planta que ocorre não naturalmente, ou planta transgênica, ou célula de planta, mantenha níveis residuais de treonina sintase.

[000169] A redução na atividade de treonina sintase, conforme comparado a uma planta de controle, pode ser de cerca de 5% a cerca de 100%, de cerca de 5% a cerca de 99% ou menos, de cerca de 5% a cerca de 95% ou menos, de cerca de 5% a cerca de 90% ou menos, ou uma redução de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou 100%, ou mais. Em uma concretização, a redução na atividade de treonina sintase é uma redução parcial na atividade. Em uma concretização, a redução parcial na atividade permite que a planta mutante, planta que ocorre não naturalmente, ou planta transgênica, ou célula de planta, mantenham níveis residuais de treonina sintase.

[000170] O aumento na concentração de treonina livre, conforme comparado a uma planta de controle, pode ser de cerca de 5% a cerca de 100%, ou um aumento de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou até 100%.

[000171] Em certas concretizações, a expressão de SEQ ID NO:1, ou SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3, ou SEQ ID NO:20, ou a atividade da proteína codificada, desse modo, é reduzida (por exemplo, silenciada ou inibida). Em certas concretizações, a expressão de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:20, ou a atividade da proteína codificada, desse modo, é reduzida (por exemplo, se- lenciada ou inibida). Em certas concretizações, a expressão de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:20, ou a atividade da proteína codificada, desse modo, é reduzida (por exemplo, selenciada ou inibida). Em certas concretizações, a expressão de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:20, ou a atividade da proteína codificada, desse modo, é reduzida (por exemplo, selenciada ou inibida). Em certas concretizações, a expressão de SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:20, ou a atividade da proteína codificada, desse modo, é reduzida (por exemplo, selenci- ada ou inibida). Em certas concretizações, a expressão de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:20, ou a atividade da proteína codificada, desse modo, é reduzida (por exemplo, selenciada ou inibida). Em certas concretizações, a expressão de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:20, ou a atividade da proteína codificada, desse modo, é reduzida (por exemplo, selenciada ou inibida). Em certas con-cretizações, a expressão de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:20, ou a atividade da proteína codificada, desse modo, é reduzida (por exemplo, selenciada ou inibida). Em certas concretizações, a expressão de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:20, ou a atividade da proteína codificada, desse modo, é reduzida (por exemplo, selenciada ou inibida). Em certas concretizações, a expressão de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, ou a atividade da proteína codificada, desse modo, é reduzida (por exemplo, selenciada ou inibida). Em certas concretizações, a expressão de cada de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO: 3, ou a atividade de cada das proteínas codificadas desse modo, individualmente ou em uma combinação, é reduzida a uma extensão maior do que uma expressão de SEQ ID NO:20. Em uma concretização, a adição de ingredientes exógenos- tais como aminoácidos - por exemplo, treonina e/ou isoleucina - não é requerida de modo a obter plantas de aparência visual aceitável.

[000172] Um objetivo é proporcionar plantas mutantes, plantas transgênicas ou plantas que ocorrem não naturalmente, que exibem um nível aumentado de metionina livre, enquanto que mantêm subs- tancialmente a mesma aparência visual e uma ou mais características agronômicas, conforme comparado a uma planta de controle. Conse-quentemente, é aqui descrito plantas mutantes, plantas transgênicas, ou plantas que ocorrem não naturalmente, ou células geneticamente modificadas que têm um nível aumentado de metionina livre, e uma atividade de treonina sintase reduzida, ou expressão, conforme comparado às células de tabaco de controle, ou plantas de controle. A planta mutante, planta transgênica, ou planta que ocorrem não naturalmente, ou células, foram modificadas para reduzir a síntese de treo- nina sintase por redução de uma expressão de um ou mais polipeptí- deos que codificam a sequência de polinucleotídeos aqui descrita, preferivelmente codificada por um ou mais polinucleotídeos compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência que codifica uma treonina sintase, e tendo pelo menos 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, e/ou SEQ ID NO:3, ou por um ou mais polinucleotídeos compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência que codifica uma treonina sintase, e tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% de identidade de sequência para sequência SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, ou SEQ ID NO:20.

[000173] Um aspecto adicional se relaciona a plantas mutantes, plantas que ocorrem não naturalmente, ou plantas transgênicas, em que expressão de treonina sintase, ou uma atividade da proteína codificada, desse modo, é reduzida, e uma parte da planta (por exemplo, as folhas) têm um aumento no teor de metionina de pelo menos 5%, conforme comparado a uma planta de controle em que uma expressão ou a atividade de treonina sintase não foi reduzida. Preferivelmente, a concentração de metional na fumaça ou aerossol de produtos de tabaco é aumentada por pelo menos 5%, conforme comparado à fumaça ou aerossol de produto de tabaco produzidos da planta de controle.

[000174] O aumento no teor de metionina, conforme comparado à planta de controle, pode ser pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou cerca de 100%, ou mais.

[000175] O aumento na concentração de metional na fumaça ou aerossol preparado do produto de tabaco, conforme comparado à planta de controle, pode ser pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, ou cerca de 100%, ou mais.

[000176] Adequadamente, a aparência visual ou uma ou mais características agronômicas de referida planta é substancialmente a mesma como uma planta de controle três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura, preferivelmente, em que a altura do caule da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica, é substancialmente a mesma como uma altura do caule das plantas de controle, três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura, e/ou o teor de clorofila da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica, é substancialmente o mesmo como o teor de clorofila das plantas de contro- le, três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura.

[000177] Adequadamente, a concentração de metionina livre em uma parte da planta (por exemplo, as folhas) é aumentada, conforme comparado à planta de controle.

[000178] Adequadamente, (i) a concentração de metionina livre em parte da planta (por exemplo, as folhas) é pelo menos cerca de 0,026 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,027 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,028 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,029 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,03 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,031 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,032 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,032 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,033 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,034 mg/g; (ii) a concentração de treonina livre em parte da planta (por exemplo, as folhas) é pelo menos cerca de 0,5 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,52 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,54 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,56 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,58 mg/g, adequadamente pelo menos cerca de 0,6 mg/g; e (iii) a concentração de metional em aerossol sob aquecimento em parte da planta (por exemplo, as folhas) é pelo menos cerca de 2000 μg/g, adequadamente pelo menos cerca de 2100 μg/g, adequadamente pelo menos cerca de 2200 μg/g, adequadamente pelo menos cerca de 2500 μg/g, adequadamente pelo menos cerca de 2750 μg/g, adequadamente pelo menos cerca de 3000 μg/g, adequadamente pelo menos cerca de 3250 g/g, adequadamente pelo menos cerca de 3500 μg/g, adequadamente pelo menos cerca de 3750 g/g, adequadamente pelo menos cerca de 3800 g/g, ou mais alta.

[000179] Adequadamente, (i) a concentração de metionina livre em parte da planta (por exemplo, as folhas) é pelo menos cerca de 0,03 mg/g; (ii) a concentração de treonina livre em parte da planta (por exemplo, as folhas) é entre cerca de 0,5 mg/g a 0,65 mg/g; e (iii) a concentração de metional em aerossol sob aquecimento em parte da planta (por exemplo, as folhas) é pelo menos cerca de 2200 μg/g.

[000180] Adequadamente, (i) a concentração de metionina livre em parte da planta (por exemplo, as folhas) é pelo menos cerca de 0,03 mg/g; (ii) a concentração de treonina livre em parte da planta (por exemplo, as folhas) é entre cerca de 0,5 mg/g a 0,65 mg/g; e (iii) a concentração de metional em aerossol sob aquecimento em parte da planta (por exemplo, as folhas) é entre cerca de 2200 μg/g e cerca de 4000 μg g, adequadamente entre cerca de 2200 μg g e cerca de 3850 μg g.

[000181] A planta pode ser aquecida a 100°C ou acima - tal como pelo menos 125°C, pelo menos 150°C, pelo menos 175°C, ou pelo menos 200°C - para liberar o aerossol.

[000182] Em um aspecto ainda adicional, é provido uma planta mutante, uma planta que ocorre não naturalmente, ou uma planta trans- gênica, em que a expressão de treonina sintase, ou uma atividade da proteína codificada, desse modo, é reduzida e (i) a concentração de metionina livre em parte da planta (por exemplo, as folhas) é cerca de 0,03 mg/g; (ii) a concentração de treonina livre em parte da planta (por exemplo, as folhas) é cerca de 0,5 a cerca de 0,7 mg/g; e (iii) a concentração de metional em aerossol sob aquecimento em parte da planta (por exemplo, as folhas) é pelo menos cerca de 2000 μg/g, e adequadamente em que a aparência visual, ou uma ou mais características agronômicas de referida planta é substancialmente a mesma como uma planta de controle três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura, preferivelmente, em que a altura do caule da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica, é substancialmente a mesma como uma altura do caule das plantas de controle, três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura, e/ou o teor de clorofila da planta mutante, da planta que ocorre não naturalmente, ou da planta transgênica, é subs-tancialmente o mesmo como o teor de clorofila das plantas de controle, três meses após transplante de campo, ou 36 dias após cobertura.

[000183] De acordo com a revelação, uma planta conduzindo um alelo modificado de treonina sintase pode ser usada em um programa de geração de planta para criar linhagens úteis, variedades, e híbridos. Um alelo modificado pode ser um alelo mutante. Em particular, o alelo modificado de treonina sintase é introgredido nas variedades comercialmente importantes, conforme descrito acima. Desse modo, métodos para geração de plantas são providos, que compreendem cruzamento de uma planta mutante, uma planta que ocorre não naturalmente, ou uma planta transgênica, conforme aqui descrito, com uma planta compreendendo uma identidade genética diferente. O método pode adicionalmente compreender cruzamento da planta de progenia com outra planta, e, opcionalmente, repetição do cruzamento até que uma progenia com os traços genéticos desejáveis ou antecedente genético, seja obtida. Uma proposta servida por tais métodos de geração é introduzir um traço genético desejável em outras variedades, linhagens de geração, híbridos ou cultivares, particularmente aqueles que são de interesse comercial. Outra proposta é facilitar empilhamento de modificações genéticas de genes diferentes em uma variedade de planta única, linhagens, híbridos, ou cultivares. Cruzamentos intraespecíficos, bem como interespecíficos, são contemplados. As plantas de progenia que ocorrem de tais cruzamentos, também referidas como linhagens de geração, são exemplos de plantas que ocorrem não naturalmente da revelação.

[000184] Em uma concretização, um método é provido para produção de uma planta que ocorre não naturalmente compreendendo: (a) cruzamento de uma planta mutante ou planta transgênica, com uma segunda planta, para produzir semente de tabaco de progenia; (b) crescimento da semente de tabaco de progenia, sob condições de crescimento de planta, para produzir a planta que ocorre não naturalmente. O método pode adicionalmente compreender: (c) cruzamento da geração anterior de planta que ocorre não naturalmente com si própria, ou outra planta para produzir semente de tabaco de progenia; (d) crescimento da semente de tabaco de progenia da etapa (c) sob condições de crescimento de planta, para produzir plantas que ocorrem não naturalmente adicionais; e (e) repetição das etapas de cruzamento e de crescimento (c) e (d) múltiplas vezes para gerar gerações adicionais de plantas que ocorrem não naturalmente. O método pode, opcionalmente, compreender antes da etapa (a), uma etapa de proporcionar uma planta de origem que compreende uma identidade genética que é caracterizada e que não é idêntica à planta mutante ou planta transgênica. Em algumas concretizações, dependendo do programa de geração, as etapas de cruzamento e crescimento são repetidas de 0 a 2 vezes, de 0 a 3 vezes, de 0 a 4 vezes, 0 a 5 vezes, de 0 a 6 vezes, de 0 a 7 vezes, de 0 a 8 vezes, de 0 a 9 vezes, ou de 0 a 10 vezes, de modo a gerar gerações de plantas que ocorrem não naturalmente. Retro cruzamento é um exemplo de tal método em que uma progenia é cruzada com um de seus parentes, ou outra planta geneticamente similar a este parente, de modo a obter uma planta de progenia na próxima geração que tem uma identidade genética que é mais próxima àquela dos parentes. Técnicas para geração de planta, particularmente geração de planta de tabaco, são bem conhecidas, e podem ser usadas nos métodos da revelação. A revelação adicionalmente proporciona plantas que ocorrem não naturalmente produzidas por estes métodos.

[000185] Em algumas concretizações dos métodos aqui descritos, linhagens resultantes de geração e classificação para genes de treoni- na sintase variantes são avaliadas no campo usando procedimentos de campo padrões. Genótipos de controle incluindo o parente não mu- tagenizado original são incluídos, e entradas são dispostas no campo em um desenho de bloco completo randomizado, ou outro desenho de campo apropriado. Para tabaco, práticas agronômicas padrões são usadas, por exemplo, o tabaco é coletado, pesado, e amostrado para teste químico, e outro teste comum antes e durante cura. Análises estatísticas dos dados são realizadas para confirmar a similaridade das linhagens selecionadas à linhagem de origem. A análise citogenética das plantas selecionadas são, opcionalmente, realizadas para confirmar o complemento de cromossomo e relacionamentos de empare- lhamento de cromossomo.

[000186] Impressão genética, polimorfismos de nucleotídeo único, marcadores de microssatélite, ou tecnologias similares, podem ser usados em um programa de geração de seleção auxiliada por marcador (MAS) para transferir ou gerar alelos modificados ou mutantes do gene de treonina sintase em outros tabacos, conforme aqui descrito. Por exemplo, um reprodutor pode criar segregação de populações de hibridizaçãos de um genótipo contendo um alelo mutante com um ge- nótipo agronomicamente desejável. As plantas na F2 ou gerações de retro cruzamento podem ser classificadas usando um marcador desenvolvido de uma sequência genômica de treonina sintase, ou um fragmento deste, usando uma das técnicas aqui listadas. As plantas identificadas como possuindo o alelo mutante pode ser retrocruzada ou autopolinizada, para criar uma segunda população a ser classificada. Dependendo do modelo de hereditariedade esperado ou da tecnologia de MAS usada, pode ser necessário autopolinizar as plantas selecionadas antes de cada ciclo de retro cruzamento para auxiliar a identificação das plantas individuais desejadas. Retro cruzamento ou outro procedimento de geração podem ser repetidos até que o fenótipo desejado da origem recorrente seja recuperado.

[000187] De acordo com a revelação, em um programa de geração, cruzamentos bem sucedidos produzem plantas F1 que são férteis. Plantas F1 selecionadas podem ser cruzadas com um dos parentes, e as primeiras plantas de geração de retro cruzamento são autopoliniza- das para produzir uma população que é novamente classificada para expressão variante de treonina sintase (por exemplo, a versão nula do gene de treonina sintase). O processo de retro cruzamento, autopolini- zação e classificação é repetido, por exemplo, pelo menos 4 vezes, até que a classificação final produza uma planta que seja fértil e razoavelmente similar ao parente recorrente. Esta planta, se desejado, é autopolinizada, e a progenia é subsequentemente classificada novamente para confirmar que a planta exiba expressão de gene variante de treonina sintase. Em algumas concretizações, uma população de planta na geração de F2 é classificada para expressão de gene variante de treonina sintase, por exemplo, uma planta é identificada, que falha em expressar treonina sintase devido a ausência de um gene de treonina sintase de acordo com métodos padrões, por exemplo, pelo uso de um método de PCR com iniciadores baseados na informação de sequência de nucleotídeo para treonina sintase aqui descrita.

[000188] Variedades híbridas podem ser produzidas por prevenção de autopolinização de plantas de origem fêmeas (isto é, origens de planta) de uma primeira variedade, permitindo que o pólen de plantas de origem fêmeas de uma segunda variedade fertilize as plantas de origem fêmea, e permitindo que sementes híbridas F1 se formem nas plantas fêmeas. A autopolinização de plantas fêmeas pode ser impedida por fragilização das flores em um estágio precoce de desenvolvimento da flor. Alternativamente, a formação de pólen pode ser impedida nas plantas de origem fêmeas usando uma forma de esterilidade fêmea. Por exemplo, esterilidade fêmea pode ser produzida por esterilidade fêmea citoplásmica (CMS), ou esterilidade fêmea transgênica em que um transgene inibe micro esporogênese e/ou formação de pólen, ou autoincompatibilidade. Plantas de origem fêmea contendo CMS são particularmente úteis. Nas concretizações em que as plantas de origem fêmea são CMS, pólen é coletado de plantas férteis machos, e aplicado manualmente aos estigmas de plantas de origem fêmeas de CMS, e a semente F1 resultante é coletada.

[000189] Variedades e linhagens aqui descritas podem ser usadas para formar híbridos F1 de cruzamento único. Em tais concretizações, as plantas das variedades de origem podem ser crescidas como substancialmente homogênea, unindo populações para facilitar polinização cruzada natural a partir das plantas de origem macho para as plantas de origem fêmea. A semente F1 formada nas plantas de origem fêmea é seletivamente coletada por meios convencionais. Ela também pode desenvolver as duas variedades de planta de origem em massa, e coletar uma mistura de semente híbrida F1 formada no parente fêmea e semente formada após o parente fêmea como o resultado de autopoli- nização. Alternativamente, o cruzamento de três vias pode ser efetuado, em que um híbrido F1 de cruzamento único é usado como um parente fêmea, e é cruzado com um parente fêmea diferente. Como al-ternativa, híbridos de cruzamento duplo podem ser criados em que a progenia de F1 de dos cruzamentos únicos diferentes são cruzados entre si.

[000190] Uma população de planta mutante, de planta que ocorre não naturalmente, ou de planta transgênica, pode ser classificada ou selecionada para aqueles membros da população que têm um traço ou fenótipo desejados. Por exemplo, uma população de progenia de um evento de transformação simples pode ser classificada para aquelas plantas tendo um nível desejado de expressão de polipeptídeo de NtTS ou polinucleotídeo. Métodos físicos e bioquímicos podem ser usados para identificar níveis de expressão. Estes incluem análise de Southern ou amplificação de PCR para detecção de um polinucleotí- deo; Northern blots, proteção de S1 RNase, iniciador-extensão, ou amplificação de RT-PCR para detecção de transcritos de RNA; ensaios enzimáticos para detecção de atividade de enzima ou ribozima de polipeptídeos e polinucleotídeos; e eletroforese de gel de proteína, Western blots, imunoprecipitação, e imunoensaios ligados a enzima para detectar polipeptídeos. Outras técnicas, tais como hibridização in situ, coloração de enzima, e imunocoloração, também podem serem usadas para detectar a presença ou expressão de polipeptídeos ou polinucleotídeos.

[000191] Células de planta mutante, de planta que ocorre não naturalmente, ou de planta transgênica, são aqui descritas compreendendo um ou mais polinucleotídeo recombinantes - tais como um ou mais polinucleotídeos de NtTS isolados, um ou mais construtos de polinu- cleotídeo, um ou mais RNAs de trançado duplo, um ou mais conjugados, ou um ou mais vetores/vetores de expressão.

[000192] Em algumas concretizações, uma planta em que expressão de um polinucleotídeo de NtTS é reduzida pode ter um aumento na concentração de metionina livre, especialmente nas folhas. A concentração de metionina livre pode ser aumentada por pelo menos cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% ou mais, conforme comparado à concentração de metionina livre em uma planta de controle correspondente em que expressão de polinucleotídeo de NtTS não foi ainda reduzida.

[000193] Em algumas concretizações, uma planta em que expressão de polinucleotídeo de NtTS é reduzida pode ter uma diminuição na concentração de treonina livre, especialmente nas folhas. A concentração de treonina livre pode ser diminuída por pelo menos cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% ou mais, conforme comparado à concentração de treonina livre em uma planta de controle correspondente em que expressão de polinucleotídeo de NtTS não foi ainda reduzida. Em uma concretização, a concentração de treonina livre pode ser diminuída por pelo menos cerca de 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, ou 80% ou mais, conforme comparado à concentração de treonina livre em uma planta de controle correspondente em que expressão de polinucleotídeo de NtTS não foi ainda reduzida.

[000194] A expressão de NtTS pode ser avaliada usando métodos incluindo, por exemplo, RT-PCR, Northern blots, proteção de RNase, extensões de iniciador, Western blots, eletroforese de gel de proteína, imunoprecipitação, imunoensaios ligados a enzima, ensaios de chip, e espectrometria de massa. Deve ser notado que se um polipeptídeo é expresso sob o controle de um promotor preferencial de tecido, ou promotor que expressa amplamente, a expressão pode ser avaliada na planta total, ou em um tecido selecionado. Similarmente, se um po- lipeptídeo é expresso em um tempo particular, por exemplo, em um tempo particular em desenvolvimento, ou sob indução, expressão pode ser avaliada seletivamente a um período de tempo desejado.

[000195] Sem limitação, as plantas aqui descritas podem ser modificadas para outras propostas, ou antes ou após a expressão ou atividade de treonina sintase ter sido modulada. Uma ou mais das seguintes modificações genéticas adicionais podem estar presentes na planta mutante, que planta ocorre não naturalmente, ou planta transgênica, da revelação. Em uma concretização, um ou mais genes que são envolvidos em entrada de metal pesado ou transporte de metal pesado é modificado resultando em plantas ou partes de plantas (tais como folhas) tendo um teor de metal pesado inferior do que as plantas de controle ou partes destas sem a(s) modificação(ões). Exemplos não limitantes incluem genes pertencentes à família de facilitadores de difusão de cátion (CDF), a família de proteínas similares à Zrt-, Irt-like (ZIP), a família de trocadores de cátion (CAX), a família de transportadores de cobre (COPT), a família de metal-pesado tipo P ATPases (HMAs, conforme descrito em WO2009074325), a família de homólogos de proteínas de macrófago associadas de resistência natural (NRAMP), e a família de transportadores de cassete de ligação de ATP (ABC), que participam no transporte de metais pesados. O termo metal, conforme aqui usado, inclui metais de transição. Em outra concretização, um ou mais genes que são envolvidos na conversão de intermediários metabólicos nitro- genosos é modificado resultando em plantas ou partes de plantas (tais como folhas) que quando aquecidas, produzem níveis mais baixos de pelo menos uma nitrosamina específica de tabaco (por exemplo, 4- (metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona, N-nitrosonornicotina, N- nitrosoanatabina, e N-nitrosoanabasina) do que plantas de controle ou partes destas. Exemplos não limitativos de genes que podem ser modificados incluem genes que codificam uma nicotina demetilase, tais como CYP82E4, CYP82E5 e CYP82E10 que participam na conversão de nicotina em nornicotina, e são descritos em WO2006091194, WO2008070274, WO2009064771 e PCT/US2011/021088.

[000196] Exemplos de outras modificações incluem tolerância à herbicida, por exemplo, glifosato é um ingrediente ativo de muitos herbicidas de espectro amplo. Plantas transgênicas resistentes à glifosato foram desenvolvidas por transferência do aroA gene (um glifosato EPSP sintetase de Salmonella typhimurium e E.coli). Plantas resistentes à sulfoniluréia foram produzidas por transformação do gene mutante ALS (acetolactato sintetase) de Arabidopsis. Proteína OB de fotosis- tema II de mutante Amarandesse modo hybridus foi transferida a plan tas para produzir plantas transgênicas resistentes á atrazina; e plantas transgênicas resistentes á bromoxinil foram produzidas por incorporação do gene bxn a partir do bacterium Klebsiella pneumoniae. Outra modificação exemplar resulta em plantas que são resistentes a insetos. Toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) podem proporcionar um modo efetivo de retardar a emergência de pestes resistentes á Bt, conforme recentemente ilustrado em broccoli onde genes de pyramided crylAc e crylC Bt controlam motes de diamondback resistentes a qualquer proteína única e significantemente retarda a evolução de insetos resistentes. Outras modificações exemplares resultam em plantas que são resistentes a doenças causadas por patogenias (por exemplo, vírus, bactéria, fungo). Plantas expressando o gene Xa21 (resistência a crestamento bacteriano) com plantas expressando ambos um gene de fusão de Bt e um gene de chitinase (resistência a broca de haste amarela e tolerância à blindagem) foram projetados. Outra modificação exemplar resulta em capacidade reprodutiva alterada, tal como esterilidade de macho. Outra modificação exemplar resulta em plantas que são tolerantes a estresse abiótico (por exemplo, secura, temperatura, salinidade), e plantas transgênicas tolerantes foram produzidas por transferência de enzima de acil glicerol fosfato de Arabidopsis; genes que codificam manitol dehidrogenase e sorbitol dehidrogenase que são envolvidos na síntese de manitol e sorbitol aperfeiçoam a resistência á secura. Outra modificação exemplar resulta em plantas que produzem proteínas que têm propriedades imunogênicas favoráveis para uso em humanos. Por exemplo, plantas capazes de produzirem proteínas que substancialmente carecem de resíduos de alfa-1,3- ligado fucose, resíduos de beta-1,2-ligado xilose, ou ambos, em seu N- glican, podem ser de uso. Outras modificações exemplares podem resultar em plantas com proteínas de armazenagem aperfeiçoadas e óleos, plantas com eficiência fotossintética intensifica, plantas com vi- da útil prolongada, plantas com teor de carboidrato intensificado, e plantas resistentes à fungos; plantas que codificam uma enzima envolvida na biossíntese de alcalóides. Plantas transgênicas em que uma expressão de S-adenosil-L-metionina (SAM) e/ou cistationina gama- sintase (CGS) foram moduladas, são também contempladas.

[000197] Um ou mais tais traços podem ser introgredidos na planta mutante, planta que ocorre não naturalmente, ou planta transgênica de tabaco da revelação de outro cultivar de tabaco, ou podem ser diretamente transformados nas mesmas. A introgressão do(s) traço(s) na planta mutante, planta que ocorre não naturalmente, ou planta trans- gênica da revelação pode ser alcançada por qualquer método de geração de planta conhecido na técnica, por exemplo, geração de pedigree, retro cruzamento, geração de haplóide duplo, e similares (ver, Wernsman, E. A, e Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tabaco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 pp.). Técnicas a base de biologia molecular descritas acima, em particular RFLP e marcadores de microssatélite, podem ser usadas em tais retro cruzamentos para identificar as progenias tendo o grau mais alto de identidade genética com a origem recorrente. Isto permite acelerar a produção de variedades tendo pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade genética com a origem recorrente, ainda mais preferivelmente geneticamente idênticos à origem recorrente, e adicionalmente compreendendo o(s) traço(s) introgredido(s) a partir do parente doador. Tal determinação de identidade genética pode ser baseada nos marcadores moleculares conhecidos na técnica.

[000198] A última geração de retro cruzamento pode ser provida para dar progenia de geração pura para o(s) ácido(s) nucleico(s) sendo transferidos. As plantas resultantes geralmente têm essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas da planta mutante, planta que ocorre não naturalmente, ou planta transgênica da revelação, em adição ao(s) traço(s) transferido(s) (por exemplo, um ou mais traços de genes únicos). O protocolo de retro cruzamento exato dependerá do traço sendo alterado para determinar um protocolo de teste apropriado. Embora os métodos de retro cruzamento sejam simplificados quando o traço sendo transferido é um alelo dominante, um ale- lo recessivo pode também ser transferido. Neste exemplo, pode ser necessário introduzir um teste da progenia para determinar se o traço desejado foi bem sucedidamente transferido.

[000199] Várias concretizações proporcionam plantas mutantes, plantas que ocorrem não naturalmente, ou plantas transgênicas, bem como biomassa em que um nível de expressão de polinucleotídeo de NtTS é reduzido para aumentar a concentração de metionina livre na mesma - particularmente em, mas não limitados, às folhas.

[000200] Partes das tais plantas, particularmente plantas de tabaco, e, mais particularmente, a lâmina de folha, e nervura de plantas de tabaco, podem ser incorporados em, ou usados na produção de vários produtos consumíveis, incluindo, mas não limitados a, materiais de formação de aerossol, dispositivos de formação de aerossol, artigos de fumo, artigos fumáveis, produtos sem combustão, e produtos de tabaco. Exemplos de materiais de formação de aerossol, particularmente materiais de formação de nicotina aerossol, incluem, mas não são limitados a, composições de tabaco, tabacos, extrato de tabaco, tabaco cortado, carga cortada, tabaco curado, tabaco expandido, tabaco homogeneizado, tabaco reconstituído, e tabacos para cachimbo. Artigos de fumo e artigos fumáveis são tipos de dispositivos de formação de aerossol, incluindo dispositivos de formação de nicotina aerossol. Exemplos de artigos de fumo ou artigos fumáveis incluem, mas não são limitados a, cigarros, cigarrilhas, e charutos. Exemplos de produtos sem combustão compreendem tabacos de mascar, e rapés. Em certos dispositivos de formação de aerossol, preferivelmente do que combustão, uma composição de tabaco, ou outro material de formação de aerossol, é aquecido por um ou mais elementos de aquecimento elétrico para produzir um aerossol. Em outro tipo de dispositivo de formação de aerossol aquecido, um aerossol é produzido pela transferência de calor de um elemento combustível ou fonte de calor a um material de formação de aerossol fisicamente separado, que pode estar localizado dentro de, ao redor de, adjacente a, ou à jusante da fonte de calor. Os produtos de tabaco sem combustão, e vários materiais de formação de aerossol contendo tabaco, podem conter tabaco em qualquer forma, incluindo como partículas secas, pedaços, grânulos, pós, ou uma pasta, depositados em, misturados em, circundados por, ou, de outro modo, combinados com outros ingredientes em qualquer formato, tais como flocos, películas, espumas, ou gotícu- las. Conforme aqui usado, o termo 'fumo' é usado para descrever um tipo de aerossol que é produzido por artigos de fumo, tais como cigarros (por exemplo, fumo de cigarro), ou por combustão de um material de formação de aerossol.

[000201] Em uma concretização, é também provido material de planta curado incluindo folhas curadas, ou partes de planta curadas de planta mutante de tabaco, planta transgênica de tabaco, e planta que ocorre não naturalmente de tabaco, aqui descritas. Processos de cura de folhas de tabaco verdes são conhecidos por aqueles técnicos no assunto, e incluem, sem limitação, cura por ar, cura por fogo, cura por gás, e cura por sol. O processo de cura de folhas de tabaco verdes depende do tipo de tabaco coletado. Por exemplo, tabaco Virginia flue (claro) é tipicamente curado por gás, Burley, e certas cepas escuras são usualmente curadas por ar, e tabaco para cachimbo, tabaco de mascar, e rapé, são usualmente curados por fogo.

[000202] Em outra concretização, é descrito produtos de tabaco in- cluindo materiais de formação de nicotina aerossol, ou materiais contendo tabaco de formação de aerossol compreendendo folhas, preferivelmente folhas curadas, produzidos de folhas de plantas mutantes de tabaco, plantas transgênicas de tabaco, ou plantas que ocorre não naturalmente de tabaco, aqui descritas. Os produtos de tabaco aqui descritos podem ser um produto de tabaco misturado que pode adicionalmente compreender tabaco de uma ou mais outras variedades de plantas de tabaco, incluindo plantas de tabaco não modificadas.

[000203] A percentagem de metionina livre nos materiais de formação de aerossol, ou composições de tabaco, da revelação, é um valor de pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, t, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e 100% mais alto, quando comparado aos materiais de formação de aerossol, ou composições de tabaco derivadas de plantas não mutantes, plantas que ocorrem não naturalmente, ou plantas de contraparte não transgênicas.

[000204] A planta mutante, planta que ocorre não naturalmente, ou planta transgênica, pode ter outros usos em, por exemplo, agricultura. Por exemplo, planta mutante, planta que ocorre não naturalmente, ou planta transgênica, aqui descritas, podem ser usadas para produzir alimentação de animal e produtos de alimentação humano.

[000205] A revelação também proporciona métodos para produção de sementes compreendendo cultivo da planta mutante, planta que ocorre não naturalmente, ou planta transgênica, aqui descritas, e coleta de sementes a partir das plantas cultivadas. As sementes de plantas aqui descritas podem ser acondicionadas em material de acondicionamento por meios conhecidos na técnica para formar um artigo de produção. Materiais de acondicionamento, tais como papel e tecido, são bem conhecidos na técnica. Um pacote de semente pode ter uma etiqueta, por exemplo, um rótulo ou etiqueta segura ao material de acondicionamento, uma etiqueta impressa no material de acondicionamento, ou uma etiqueta inserida dentro do pacote que descreve a natureza das sementes neste. Um aspecto adicional se relaciona a um método para produção de metional compreendendo as etapas de: (a) provisão de parte de uma planta mutante, planta que ocorre não naturalmente, ou planta transgênica; biomassa, semente ou folhas; ou formação dos materiais de aerossol, conforme aqui descrito; e (b) provisão de calor aos mesmos.

[000206] Composições, métodos e kits para genotipagem de plantas para identificação, seleção, ou geração, são envolvidos pela revelação, e podem compreender um meio de detecção da presença de um polinucleotídeo de NtTS em uma amostra de polinucleotídeo. Consequentemente, uma composição é descrita compreendendo um de mais iniciadores para especificamente amplificar pelo menos uma porção de polinucleotídeo de NtTS e, opcionalmente, uma ou mais sondas e, opcionalmente, um ou mais reagentes para condução da amplificação ou detecção. Consequentemente, iniciadores ou sondas de oligonucleotí- deo específicos de gene compreendendo cerca de 10 ou mais polinu- cleotídeos contíguos correspondentes ao polinucleotídeo de NtTS são revelados. Referidos iniciadores ou sondas podem compreender ou consistir de cerca de 15, 20, 25, 30, 40, 45 ou 50 mais polinucleotídeos contíguos que hibridizam (por exemplo, especificamente hibridizam) ao polinucleotídeo de NtTS. Em algumas concretizações, os iniciadores ou sondas podem compreender ou consistir de cerca de 10 a 50 nu- cleotídeos contíguos, cerca de 10 a 40 nucleotídeos contíguos, cerca de 10 a 30 nucleotídeos contíguos, ou cerca de 15 a 30 nucleotídeos contíguos, que podem ser usados em métodos dependentes de sequência de identificação de gene (por exemplo, hibridização de Southern), ou isolamento (por exemplo, hibridização in-situ de colônias bacteriais ou placas de bacteriófago), ou detecção de gene (por exem- plo, como um ou mais iniciadores de amplificação em amplificação ou detecção de ácido nucleico). O um ou mais iniciadores ou sondas específicos podem ser designados e usados para amplificar e detectar uma parte ou todo do polinucleotídeo de NtTS. Por meio de exemplo específico, dois iniciadores podem ser usados em um protocolo de reação de cadeia de polimerase para amplificar um fragmento de ácido nucleico que codifica ácido nucleico de NtTS - tal como DNA ou RNA. A reação de cadeia de polimerase pode também ser realizada usando um iniciador que é derivado de sequência de ácido nucleico de NtTS, e um segundo iniciador que hibridiza para uma sequência à montante ou à jusante da sequência de ácido nucleico de NtTS - tal como uma sequência promotora de NtTS, a extremidade 3' do precursor de mRNA, ou uma sequência derivada de vetor. Exemplos de técnicas térmicas e isotérmicas úteis para amplificação in vitro de polinucleotídeos são bem conhecidas na técnica. A amostra pode ser ou pode ser derivada de uma planta, uma célula de planta, ou material de planta, ou um produto de tabaco produzido ou derivado da planta, da célula de planta, ou do material de planta, conforme aqui descrito.

[000207] Desse modo, em um aspecto adicional, é também provido um método de detecção de um polinucleotídeo de NtTS em uma amostra compreendendo a etapa de: (a) proporcionar uma amostra compreendendo, ou suspeita de compreender, um polinucleotídeo; (b) contatar referida amostra com um de mais iniciadores ou um ou mais sondas para detectar especialmente pelo menos uma porção de poli- nucleotídeo de NtTS; e (c) detecção da presença de um produto de amplificação, em que a presença de um produto de amplificação é indicativa da presença do polinucleotídeo de NtTS na amostra. Em um aspecto adicional, é também provido o uso de um de mais iniciadores ou sondas para especialmente detectar pelo menos uma porção do polinucleotídeo de NtTS. Kits para detectar pelo menos uma porção do polinucleotídeo de NtTS são também providos que compreendem um de mais iniciadores ou sondas para especificamente detectar pelo menos uma porção de polinucleotídeo de NtTS. O kit pode compreender reagentes para amplificação de polinucleotídeo - tal como reação de cadeia de polimerase (PCR) - ou reagentes para tecnologia de detecção de hibridização de sonda de ácido nucleico - tais como Southern Blots, Northern Blots, hibridização in-situ, ou micro arranjo. O kit pode compreender reagentes para tecnologia de detecção de ligação de anticorpo, tais como Western Blots, ELISAs, espectrometria de massa SELDI, ou tiras de teste. O kit pode compreender reagentes para se- quenciamento de DNA. O kit pode compreender reagentes e/ou instruções para determinação de teor de metionina, treonina e/ou metional. Em algumas concretizações, um kit pode compreender instruções para um ou mais dos métodos descritos. Os kits descritos podem ser úteis para determinação de identidade genética, estudos filogenéticos, ge- notipagem, halotipagem, análise de pedigree, ou geração de planta, particularmente com uma classificação de codominante.

[000208] A presente revelação também proporciona um método de genotipagem de uma planta, uma célula de planta, ou material de planta, compreendendo um polinucleotídeo de NtTS. A genotipagem proporciona um meio de distinção de homólogos de um par de cromossomos, e pode ser usada para segregantes diferenciados em uma população de planta. Os métodos de marcador molecular podem ser usados para estudos filogenéticos, caracterizando relacionamentos genéticos entre variedades de cultivo, identificação de cruzamentos, ou híbridos somáticos, localização de segmentos cromossomais que afetam traços monogênicos, clonagem baseada em mapa, e o estudo de hereditariedade quantitativa. O método específico de genotipagem pode empregar qualquer número de técnicas analíticas de marcador molecular incluindo amplificação de polimorfismos de comprimento de fragmento (AFLPs). AFLPs são os produtos de diferenças alélicas entre amplificação de fragmentos causada por variabilidade de sequência de nucleotídeo. Desse modo, a presente revelação proporciona adicionalmente um meio para seguir segregação de um gene de NtTS, ou ácido nucleico, bem como sequências cromossomais geneticamente ligadas a estes genes, ou ácidos nucleicos usando tais técnicas como análise de AFLP. A correlação entre metionina produzida em plantas resultantes de silenciamento de treonina sintase, e compostos químicos encontrados em tabaco curado, foram monitorados em folhas curadas usando espectrometria de massa. Os perfis de espectrometria de massa de extratos de planta indicam que silenciamento de treonina sintase em plantas conduz mudanças de avanço nas plantas, visto que quatro picos mostram perfis alterados em linhagens silenciadas de sin- tase, conforme comparado a extratos de plantas de controle (ver Figura 1). Três picos aumentam em abundância, pelo que um reduz em abundância. Estas mudanças no perfil podem ser usadas para identificar plantas em que os níveis de metional em aerossol é provável de serem aumentados. Consequentemente, em um aspecto adicional, é provido um método para identificação de material de tabaco que libera níveis elevados de metional em aerossol sob aquecimento, compreendendo as etapas de: (a) preparar uma amostra de material de tabaco; (b) determinação do perfil de massa molecular da amostra; e (c) com-paração do perfil de massa molecular em uma ou mais de uma razão de massa:carga àquela de uma planta de controle; em que uma mudança específica na razão de massa:carga, conforme comparado a uma planta de controle, é indicativa que os níveis de metional no aerossol é elevado. Adequadamente, a massa molecular é medida por espectrometria de massa, preferivelmente, espectrometria de massa- cromatografia líquida (LC- S), cromatografia de gás-espectrometria de massa (GC-MS). Em um aspecto adicional, é provido material de taba- co identificado ou identificável por este método.

[000209] A revelação é adicionalmente descrita nos Exemplos abaixo, que são providos para descrever a invenção em detalhe adicional. Estes exemplos, que colocam um modo preferido presentemente contemplado para efetuar a invenção, são pretendidos para ilustrar e não limitar a invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Identificação de treonina sintase de tabaco

[000210] O gene de treonina sintase de tabaco é identificado usando sequências EST de tabaco encontradas em Tobacco Genome Initiative. Outro tabaco EST contig (NCBI_45312-v2pep-fl), próximo a treoni- na sintase de tabaco, é montado a partir das sequências NCBI EST. Esta sequência de codificação tem exatamente o mesmo comprimento (1569bp) como a treonina sintase de tabaco. Dados usando DNA- chips de micro série exon Affymetrix (sondas de sequência de NtPMIa1g193542e1) mostram que treonina sintase de tabaco é igualmente expressa nas raízes, tricomas, folhas verdes e senescentes de W. tabacum. Nenhuma mudança maior nos níveis de expressão de gene foi encontrada entre folha de Flue-cured (K326, K399) e tabaco Burley (TN90, Bu64). Em adição, estresse de cádmio e exposição a frio não afetam os níveis de expressão de treonina sintase de tabaco, indicando, desse modo, que esta treonina sintase é muito provavelmente constitutivamente expressa em folha de tabaco.

Exemplo 2: Sobre expressão de cistationina gama-sintase (CGS)

[000211] Arabidopsis thaliana CGS (MT01, TAIR Accession AT3901120) é introduzida sob controle transcricional do promotor 35S do vírus de mosaico de couve-flor em tabaco TN90 de Burley, via Agrobacterium tumefasciens usando um procedimento de disco de folha clássico conforme descrito na literatura. O gene de seleção de antibiótico de canamicina é também inserido.

Exemplo 3: Silenciamento de expressão de treonina sintase em plantas de tabaco

[000212] Usando um fragmento de DNA de SEQ ID NO:1, iniciadores são gerados para silenciar NtTS em tabaco usando uma abordagem de RNAi. Os iniciadores usados são 5'-ctgaaatcgacagcgatgata-3' (SEQ ID NO: 9) e 5'-caaccaatagctaacggagctt-3' (SEQ ID NO: 10). A sequência de RNAi correspondente é amplificada de cDNA por reação de cadeia de transcriptase-polimerase reversa (RT-PCR) e, em seguida, inserida no vetor Gateway pB7GWIWG2(ll), via um vetor de entrada, exatamente conforme detalhado pelo fabricante (Invitrogen). Este vetor contém um promotor para expressão constitutiva (o promotor 35S de vírus de mosaico de couve-flor CaMV) do transgene em todos os tecidos da planta e gene de canamicina ttie para seleção de antibiótico de canamicina em placas agar (100 mg/ml). O construto é, em seguida, inserido no genoma do tabaco TN90 de Burley, via Agrobacterium tu- mefasciens usando um procedimento de disco de folha clássico. A partir dos calos, linhagens individuais são regeneradas e selecionadas em canamicina. O silenciamento de RNAi linhagens TO são monitoradas por (i) RT-PCR e crescidas para produção de semente em DNA ge- nômico usando um iniciador no promotor 35S (5'-gagcatcgtggaa aaagaagac-3'), e um iniciador dentro do fragmento usado para silenci- amento (5'-aagctccgttagctattggttg -3'), e por (ii) RT-PCR usando iniciadores específicos que flanqueiam o inserto usado para silenciamento (5'-ttgattcacgtgtcggtaagac-3'), e crescidos para produção de semente. Sementes T1 são coletadas, recrescidas em agar contendo canamici- na, e monitoradas exatamente como plantinhas TO. PCR em gDNA genômico mostra que o fragmento de DNA de NtTS é inserido no ge- noma, e efetivamente silencia treonina sintase de tabaco.

Exemplo 4: Cultivo de plantas de tabaco silenciadas por treonina sin- tase

[000213] As plantas resistentes a canamicina são crescidas em bandejas flutuantes antes do cultivo no campo (Kentucky, US). Vinte plantas da linhagem de treonina sintase silenciada (linhagem NtTS-RNAi; Exemplo 2), linhagem de cistationina gama-sintase (Exemplo 3), um controle de vetor (VC, pB7GWIWG2(ll)) e um tabaco antecedente TN90 US, são cultivados em quatro réplicas de 20 plantas. Três meses após transplante de campo (36 dias após cobertura), uma folha de posição média de caule é amostrada em 10 plantas idênticas, fora das 20 para cada réplica. As folhas ("folhas verdes") são imediatamente armazenadas em gelo seco e liofilizadas. Dez plantas das melhores duas linhagens são selecionadas e, em seguida, curadas, de acordo com as práticas agrícolas de Burley. Após cura, três folhas em posição média de caule são amostradas. Para monitorar o efeito de silenciamento nas linhagens de treonina sintase silenciadas, e para comparar com as linhagens de cistationina gama-sintase, as "folhas verdes" das três linhagens são enterradas e submetidas a análise de aminoácido livre.

Exemplo 5: Análise de metional

[000214] A correlação entre metionina produzida em folhas verdes, resultante de silenciamento de treonina sintase, e compostos químicos encontrados em tabaco curado, é monitorada em folhas curadas usando LC-MS usando as linhagens descritas acima. A extração é realizada em metanol. O equipamento usado é um sistema Waters Acqui- ty UPLC acoplado a MS. A coluna é uma WatersXBridge Shield RP18 usando como fase móvel A água:acetonitrila (95:5 v/v) e como fase B metanol. Os perfis de LC-MS indicam que silenciamento de treonina sintase em folhas verdes conduz avanço de um sinal químico em folhas curadas. De fato, quatro picos mostraram perfis alterados em linhagens silenciadas por treonina sintase comparados a controles (ver Figura 1). Três picos aumentam claramente em abundância, pelo que um reduz. Isto sugere que metionina que se acumula em folhas verdes é convertida, ou para degradação de produtos de enxofre, ou derivados de metionina em níveis curados.

[000215] Como a metionina é um precursor possível de metional, nós analisamos o teor de metional no aerossol formado após aquecimento do tabaco curado (réplicas arquivadas selecionadas TN90, VC, NtTS- 1, NtTS-1 e NtTS-3) e submetido a câmara fria. A plataforma de fumo usada é um simulador de fumaça com uma fonte de calor tipo Macor (54W) incluindo um regime de 12 Baforadas de 2s. Antes de fumar, a lâmina curada de tabaco foi cortada e impregnada com 20% de glicerina. Os aerosóis produzidos por aquecimento de tabacos curados impregnados (100 mg, 3 réplicas cheias) foram condensados usando um sistema criogênico desenvolvido por Air Liquid e dissolvidos em diclo- rometano (2 vezes 5 mL). Os níveis de metional em soluções de aerossol foram determinados por GC-MS após derivatização Na produção de íon, o sinal mais abundante foi usado para adquirir dados quan-titativos no modo Single Ion Monitoring (SIM).

[000216] A correlação entre metionina produzida em folhas verdes, resultante de silenciamento de treonina sintase, e compostos químicos encontrados em tabaco curado, foram monitorados em folhas curadas usando LC-MS usando as linhagens replicadas descritas acima. A extração foi realizada em metanol. O equipamento usado é um sistema Waters Acquity UPLC acoplado a MS. A coluna foi uma WatersXBrid- ge Shield RP18 usando uma fase móvel A água:acetonitrila (95:5 v/v) e como fase móvel B metanol. Os resultados são apresentados na Tabela 1.

[000217] Conforme mostrado na Tabela 1, as plantas de NtTS-RNAi não mostram quaisquer diferenças visuais a partir das plantas de controle. Por exemplo, a altura da planta e teor de clorofila nas plantas de tabaco silenciadas por treonina sintase foram quase idênticas às planta de controle. A concentração de metionina livre em folhas verdes das plantas de tabaco silenciadas por treonina sintase foi mais alta do que nas plantas de controle. A concentração de metional em aerossol foi muito mais alta nas plantas de tabaco silenciadas por treonina sintase do que nas plantas de controle. O teor de treonina de folhas verdes exibiu uma redução de mais do que 20% em plantas de tabaco silenciadas por treonina sintase em comparação com as plantas de controle.

[000218] Exemplo 6: Análise de expressão de treonina sintase em linhagens de tabaco NtTS-RNAi, SEQ ID NOs: 1 , 2, 3 e 20 são ali- nhagemdas em um consenso de 1587 bases a partir do início ao có- don de parada. As regiões de fragmento que são homólogas entre SEQ ID NOs: 1 , 2 e 3, e diferentes de SEQ ID NO:20 são nucleotí- deos 1-46 de SEQ ID NOs: 1, 2 e 3 e nucleotídeos 1-52 de SEQ ID NO:20; nucleotídeos 99-141 de SEQ ID NO:1, nucleotídeos 102-144 de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO:3, e nucleotídeos 102-153 de SEQ ID NO:20; e nucleotídeos 1325-1362 de SEQ ID NOs: 1, 2 e 3 e nucleotí- deos 1334-1371 de SEQ ID NO:20. Estas sequências são usadas para designar iniciadores específicos para SEQ ID NOs 1, 2, 3. Um conjunto de iniciadores específicos para SEQ ID NO: 20 são também designados.

[000219] Linhagens de RNAi de NtTS são preparadas usando regiões correspondentes a nucleotídeos 454-805 de SEQ ID NO:1; nucleo- tídeos 454-805 de SEQ ID NO: 2: nucleotídeos 456-805 de SEQ ID NO:3 e nucleotídeos 463-814 de SEQ ID NO:20. 3 plantas individuais de 3 linhagens de RNAi de NtTS independentes (NtTS1, NtTS2 e NtTS3), positivamente expressando o(s) transgene(s) para silencia- mento de RNAi (testado por PCR para a presença do 35S promotor em gDNA), são submetidas a RT-PCR semi-quantitativo usando os iniciadores específicos para SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, e iniciadores específicos para SEQ ID NO: 20. Tubulin é usado como um controle para uma expressão de house-keeping genes. 3 plantas Burley TN90 são usadas como um controle para uma expressão dos transcritos relacionados para SEQ ID NOS: 1, 2, 3 e 20.

[000220] O uso de iniciadores específicos para SEQ ID NOS: 1, 2 e 3, ou iniciadores específicos para SEQ ID NO: 3 somente, ou iniciadores específicos para SEQ ID NOS: 1 e 2 somente em RT-PCR semi- quantitativo, indica que um silenciamento parcial em expressão de tre- onina sintase ocorreu em cada das 3 linhagens de RNAi de NtTS independentes, conforme comparado ao controle. O uso de iniciadores específicos para SEQ ID NO: 20 indica que silenciamento parcial nas plantas de RNAi de NtTS ocorreu, e que o nível de silenciamento é menor do que aquele alcançado para SEQ ID NOS: 1-3. O silencia- mento foi observado ser mais efetivo para SEQ ID NO:3 do que para SEQ ID NO:20, embora a % de identidade de sequência entre as se-quências seja idêntica.

[000221] Qualquer publicação citada ou descrita aqui proporciona informação relevante revelada antes da data de depósito do presente pedido. As citações aqui não são para serem construídas como uma admissão que os inventores são intitulados antecederem tais revelações. Tais publicações mencionadas no relatório descritivo acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações da revelação serão aparentes àqueles técnicos no assunto sem fugir do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com concretizações preferidas específicas, deve ser compreendido que a invenção, conforme reivindicada, não deve ser indevidamente limitada a tais concretizações específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para efetuar a invenção que são óbvias àqueles técnicos em biologia celular, molecular e de planta, ou campos relacionados, são pretendidas estarem dentro do escopo das seguintes reivindicações. TABLE 1

Claims

1. Método para aumento da concentração de metionina livre em pelo menos uma parte de uma planta de tabaco, caracterizado pelas etapas de: (a) reduzir a expressão ou atividade de treonina sintase na planta de tabaco, em que a treonina sintase consiste em (i) um polinucleotídeo consistindo na sequência SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5; (ii) um polipeptídeo codificado por qualquer um dos referidos polinucleotídeos indicados em (i); ou (iii) um polipeptídeo de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, ou SEQ ID NO:8; (b) medir a concentração de metionina livre em pelo menos uma parte da planta mutante ou de ocorrência não-natural obtida na etapa (i); e (c) identificar uma planta de tabaco mutante ou de ocorrência não-natural, em que a concentração de metionina livre na mesma aumentou em pelo menos 50% em comparação a uma planta de tabaco de controle em que a expressão ou atividade de treonina sintase não foi reduzida, e em que a aparência visual de referida planta de tabaco mutante ou de ocorrência não-natural é equivalente da planta de tabaco de controle três meses após transplante de campo ou 36 dias após cobertura.

2. Método para produção de metional, caracterizado pelas etapas de: (a) prover parte de uma planta de tabaco mutante ou de ocorrência não-natural obtida ou obtenível pelo método como definido na reivindicação 1; e (b) prover calor à mesma.