CN109182347B - 烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用，属于基因工程技术领域，能够通过对NtTS3基因的调控促进或延缓烟草叶片的衰老，可对烟草叶片的衰老进行有效的人工干预，从而高效控制烟草的衰老进程。该技术方案包括利用基因克隆技术获得包含Zinc finger CCCH功能域基因的NtTS3基因，通过过量表达NtTS3基因促进烟草叶片的衰老，利用RNAi技术获得NtTS3基因的RNAi载体，通过降低其表达延缓烟草叶片的衰老。本发明能够应用于烟草叶片衰老的调控中。

Description

烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用。

背景技术

衰老是叶片发育的最后一个阶段，是一个受外因(气候环境、生物或非生物胁迫等)和内因(基因表达、激素含量等)综合作用的有序过程。叶片衰老是植物适应的表现，在逆境环境中，植物通过叶片衰老将能够重新利用的物质通过再循环再利用，分配到种子或者幼嫩器官，以增加植物抵抗外界不利环境。提早衰老或者推迟衰老在农业生产中都会对作物产生影响，植物叶片早衰，叶片光合作用时间变短，可能会导致农作物减产，有机物积累不够，品质会降低；另一方面，作物过晚衰老，又会影响作物正常生理周期，不利于栽培耕作。因此，如何高效调控作物衰老正在成为农艺学家解决作物高产高品质的有效途径之一。

烟草作为一类重要的经济作物，叶片是其主要收获器官；烟草叶片的状态直接影响到烟叶增产、烟农增收；烟草叶片不合时宜的衰老会给烟叶品质带来重大影响；在烟叶生产中常常会碰到因阴雨天气造成的烟叶“返青”现象，本应该成熟的烟叶，在环境影响下造成晚熟；这给后续的烤烟环节带来不利；因此，在烟草农业生产中，如何通过技术手段实现烟叶成熟的可控性，成为烟叶生产增产提质的有效策略。已有研究表明，在叶片衰老过程中大量转录因子基因表达受到影响，这些转录因子包括了NAC、WRKY等家族成员，它们通过相互协作影响叶片衰老进程，克隆并了解这些基因功能对理解叶片衰老过程极为重要。烟草中克隆到的相关基因还很少，因此，如何在烟草中克隆衰老相关基因并加以利用，从而对烟草叶片的衰老进行人工干预，这将具有重要利用意义。

发明内容

本发明提出一种烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用，能够通过对NtTS3基因的调控促进或延缓烟草叶片的衰老，可对烟草叶片的衰老进行有效的人工干预，从而高效控制烟草的衰老进程。

为了达到上述目的，本发明提供了一种烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用，包括以下步骤：

利用基因克隆技术获得包含Zinc finger CCCH功能域基因的NtTS3基因，通过过量表达NtTS3基因促进烟草叶片的衰老，利用RNAi技术获得NtTS3 基因的RNAi载体，通过降低其表达延缓烟草叶片的衰老。

作为优选，利用基因克隆技术获得包含Zinc finger CCCH功能域基因的NtTS3基因包括以下步骤：

设计含有Gateway接头的NtTS3基因扩增引物和Gateway扩增引物，所述NtTS3基因扩增引物包括如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物和如SEQ ID NO.2所示第一反向引物，所述Gateway扩增引物包括如SEQ ID NO.3所示的第二正向引物和如SEQ ID NO.4所示第二反向引物；

提取烟草叶片RNA并反转录为cDNA，以此为模板，利用所述第一正向引物和第一反向引物进行退火梯度降落PCR扩增；

将上述退火梯度降落PCR扩增的产物片段切胶回收后，利用所述第二正向引物和第二反向引物进行普通PCR扩增；

将上述普通PCR扩增的产物回收纯化后，通过gateway试剂盒连接到中间载体pDonor207上，反应后将所得产物通过化学转化方法转入大肠杆菌DH5a 中，测序提取阳性克隆质粒，命名为NtTS3-pDonor207，具有如SEQ ID NO.5 所示序列。

作为优选，退火梯度降落PCR扩增程序包括：步骤1:95℃ 3min；步骤2:95℃ 30S,68℃ 30S,72℃ 1min；3个循环；步骤3:95℃ 30 S,66℃ 30S,72℃ 1min；3个循环；步骤4:95℃ 30S,64℃ 30S, 72℃ 1min；3个循环；步骤5:95℃ 30S,62℃ 30S,72℃ 1min；3 个循环；步骤6:95℃ 30S,60℃ 30S,72℃ 1min；3个循环；步骤 7:95℃ 30S,58℃ 30S,72℃1min；1个循环；步骤8:72℃ 10min。

作为优选，通过gateway试剂盒连接到中间载体pDonor207的反应体系和方法包括：pDonor207载体1μL、纯化后的PCR片段3μL、BP酶1μL，将上述体系于25℃过夜连接。

作为优选，通过过量表达NtTS3基因促进烟草叶片的衰老包括如下步骤：

通过LR反应将NtTS3-pDonor207连入最终过表达载体pEarlyGate101 中，并将连接产物转入大肠杆菌DH5a中，鉴定提取阳性质粒，命名为 NtTS3-101，获得促进烟草叶片衰老的阳性转基因材料。

作为优选，利用RNAi技术获得NtTS3基因的RNAi载体包括如下步骤：

设计含有Gateway接头的NtTS3-RNAi基因扩增引物和Gateway扩增引物，所述NtTS3-RNAi基因扩增引物包括如SEQ ID NO.6所示的第三正向引物和如SEQ ID NO.7所示第三反向引物，所述Gateway扩增引物包括如SEQ ID NO.3所示的第二正向引物和如SEQ IDNO.4所示第二反向引物；

选取如SEQ ID NO.8所示的针对NtTS3基因的RNAi片段，以NtTS3-101 载体为模板，利用第三正向引物和第三反向引物对所述RNAi片段进行第一次 PCR扩增；

将上述第一次PCR扩增的产物片稀释50倍为模板，利用所述第二正向引物和第二反向引物进行第二次PCR扩增；

将上述第二次PCR扩增片段通过gateway试剂盒连接到中间载体 pDonor207上，反应后将所得产物转入大肠杆菌DH5a中，测序提取阳性克隆质粒，命名为NtTS3-RNAi-pDonor207，具有如SEQ ID NO.9所示序列。

作为优选，所述第一次PCR扩增和第二次PCR扩增的程序包括：95℃ 3 min；95℃30S,58℃ 30S,72℃ 1min，33个循环；72℃ 10min；

将第二次PCR扩增片段通过gateway试剂盒连接到中间载体pDonor207 的反应体系和方法包括：NtTS3-RNAi片段2μL、pDonor207中间载体2μL、 BP酶1μL，将上述体系于25℃过夜连接。

作为优选，利用RNAi技术获得NtTS3基因的RNAi载体，通过降低其表达而延缓烟草叶片的衰老包括如下步骤：

通过LR反应将NtTS3-RNAi-pDonor207连入到pANDA载体上，并将连接产物转入大肠杆菌DH5a中，提取阳性克隆质粒，命名为NtTS3-RNAi-pANDA，获得延缓烟草叶片衰老的阳性转基因材料。

作为优选，通过LR反应将NtTS3-pDonor207连入最终过表达载体pEarlyGate101的反应体系和方法包括：NtTS3-pDonor207载体2μL、 pEarlyGate101载体2μL、LR酶1μL，将上述体系于25℃过夜连接；

通过LR反应将NtTS3-RNAi-pDonor207连入到pANDA载体的反应体系和方法包括：NtTS3-RNAi-pDonor207载体2μL、pANDA RNAi最终载体2μL、 LR酶1μL，将上述体系于25℃过夜连接。

作为优选，还包括对所述阳性转基因材料鉴定的步骤，具体如下：

设计鉴定引物，所述鉴定引物包括如SEQ ID NO.10所示的第四正向引物和如SEQID NO.11所示第四反向引物；

分别提取烟草叶片、NtTS3基因过量表达及RNAi处理叶片的RNA，并反转录为cDNA，利用第四正向引物和第四反向引物，以其cDNA为模板进行 qRT-PCR鉴定。

与现有技术相比，本发明的优势在于能够通过对NtTS3基因的调控促进或延缓烟草叶片的衰老，可对烟草叶片的衰老进行有效的人工干预，从而高效控制烟草的衰老进程。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的NtTS3基因克隆电泳图；

图2为本发明实施例所提供的NtTS3基因过表达载体在细菌中的鉴定图，其中，图2A为通过普通PCR技术检查阳性克隆结果图，图2B为测序正确的质粒转化进入农杆菌GV3101中，通过PCR技术检测阳性克隆图；图2A和图2B为1.2％的琼脂糖凝胶电泳图谱；

图3为本发明实施例所提供的NtTS3-RNAi载体的农杆菌检测图；

图4为本发明实施例所提供的NtTS3基因过量表达及RNAi材料的 qRT-PCR鉴定图，其中，图4A为NtTS3基因过量表达材料鉴定图，图4B为 NtTS3-RNAi材料鉴定图；

图5为本发明实施例所提供的NtTS3基因能够促进/延缓烟草叶片衰老进程图，其中，图5A为生长80天的红花大金元、NtTS3-RNAi及NtTS3基因过量表达烟草表型图，图5B为不同材料中部叶位叶绿素含量测定图，图5C为不同材料中部叶位的光合效率测定图。

具体实施方式

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用，下面将结合具体实施例进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

NtTS3基因的克隆

1、设计含有Gateway接头的NtTS3基因扩增引物

本步骤中，为了能够通过gateway重组技术将引物连接到过量表达载体上，这里用到的正向和反向引物都具有特异性，可特异性克隆NtTS3基因，同时该引物两端加有gateway系统的必须的部分接头，通过下一步巢式PCR扩增可得到含有gateway重组接头的NtTS3基因，具体方法如下：第一正向引物 (NtTS3-gatewayF)SEQ ID NO.1:

TACAA AAAAG CAGGC TTCAT GATGA TCGGA GAGAG AAACC；

第一反向引物(NtTS3-gatewayR)SEQ ID NO.2:

GTACA AGAAA GCTGG GTCCT GGATC AGTTC AGAGA TCCA；

2、提取红花大金元叶片(主栽培烟草品种)RNA并反转录为cDNA，以此为模板，利用所述第一正向引物和第一反向引物进行退火梯度降落PCR扩增，扩增程序为：

步骤1:95℃ 3min；

步骤2:95℃ 30S,68℃ 30S,72℃ 1min；3个循环；

步骤3:95℃ 30S,66℃ 30S,72℃ 1min；3个循环；

步骤4:95℃ 30S,64℃ 30S,72℃ 1min；3个循环；

步骤5:95℃ 30S,62℃ 30S,72℃ 1min；3个循环；

步骤6:95℃ 30S,60℃ 30S,72℃ 1min；3个循环；

步骤7:95℃ 30S,58℃ 30S,72℃ 1min；1个循环；

步骤8:72℃ 10min；

上述扩增程序中引物退火温度控制在68℃到58℃范围内，集合多种退火温度可以有效特异性富集目的片段，减少非特异性扩增。

3、合成gateway扩增引物

所述Gateway扩增引物包括：

第二正向引物(attBF)SEQ ID NO.3：

GTGGG GACAA GTTTG TACAA AAAAG CAGGC TTC；

第二反向引物(attBR)SEQ ID NO.4：

GTGGG GACCA CTTTG TACAA GAAAG CTGGG TC；

4、将上述退火梯度降落PCR扩增的产物片段切胶回收后，利用第二正向引物和第二反向引物进行普通PCR扩增，扩增程序为：

步骤1:95℃ 3min；

步骤2:95℃ 30S,58℃ 30S,72℃ 1min；33个循环；

步骤3:72℃ 10min。

5、将上述普通PCR扩增的产物回收纯化后，通过gateway试剂盒连接到中间载体pDonor207上，反应体系和方法包括：pDonor207载体1μL、纯化后的PCR片段3μL、BP酶1μL，将上述体系于25℃过夜连接；

反应后，将连接产物通过化学转化方法转入大肠杆菌DH5a中，测序提取阳性克隆质粒，命名为NtTS3-pDonor207，具有如SEQ ID NO.5所示序列，电泳图谱如图1所示，克隆结果如图2A和图2B所示。如图2A和图2B可知，已获得大小与预期一致的PCR片段，说明NtTS3-pDonor207载体构建成功。

促进烟草叶片衰老的阳性转基因材料的获得

NtTS3基因过量表达

通过LR反应将NtTS3-pDonor207连入最终过表达载体pEarlyGate101 中，反应体系和方法包括：NtTS3-pDonor207载体2μL、pEarlyGate101载体2μL、LR酶1μL，将上述体系于25℃过夜连接；

反应后，将连接产物转入大肠杆菌DH5a中，鉴定提取阳性质粒，命名为 NtTS3-101，获得促进烟草叶片衰老的阳性转基因材料，如图2B所示。

促进烟草叶片衰老的阳性转基因材料的鉴定

设计鉴定引物，所述鉴定引物包括：

第四正向引物(NtTS3-qF)SEQ ID NO.10：

GGAAG TGCGC ACGTG GGAAG；

第四反向引物(NtTS3-qR)SEQ ID NO.11：

ACGGA ACTCA GGGCA TGCAG；

分别提取烟草叶片、NtTS3基因过量表达的阳性转基因材料叶片的RNA，并反转录为cDNA，利用第四正向引物和第四反向引物，分别以其cDNA为模板进行qRT-PCR鉴定，如图4A所示。由图4A可知，在转基因株系中NtTS3基因表达明显较对照高，说明我们获得了NtTS3基因高表达的转基因植株。

实施例2

NtTS3基因RNAi载体的获得

1、设计含有Gateway接头的NtTS3-RNAi基因扩增引物

本步骤中，为了能够通过gateway重组技术将引物连接到过量表达载体上，该对引物可特异扩增用于NtTS3基因的RNAi片段，并且该对引物两端都加有部分gateway接头，可以通过巢式PCR获得直接用于gateway系统的RNAi 片段，具体如下：

第三正向引物(NtTS3-RNAi-F)SEQ ID NO.6：

TACAA AAAAG CAGGC TTCGC TGAAC AAGGT GAAGT CCA；

第三反向引物(NtTS3-RNAi-R)SEQ ID NO.7：

GTACA AGAAA GCTGG GTCTC ACTGG ATCAG TTCAG AG；

2、选取如SEQ ID NO.8所示的针对NtTS3基因的RNAi片段，以NtTS3-101 载体为模板，利用第三正向引物和第三反向引物对所述RNAi片段进行第一次 PCR扩增，扩增程序包括：95℃ 3min；95℃ 30S,58℃ 30S,72℃ 1min， 33个循环；72℃ 10min；

3、以第一次PCR扩增的产物片稀释50倍为模板，利用所述第二正向引物和第二反向引物进行第二次PCR扩增，扩增程序包括：95℃ 3min；95℃ 30 S,58℃ 30S,72℃ 1min，33个循环；72℃ 10min；

4、将第二次PCR扩增片段通过gateway试剂盒连接到中间载体pDonor207 上，反应体系和方法包括：NtTS3-RNAi片段2μL、pDonor207中间载体2μ L、BP酶1μL，将上述体系于25℃过夜连接；

反应后将所得产物转入大肠杆菌DH5a中，测序提取阳性克隆质粒，命名为NtTS3-RNAi-pDonor207，具有如SEQ ID NO.9所示序列。该阳性克隆质粒的普通PCR鉴定图如3所示。由图3可知，已获得大小与预期一致的PCR片段，说明NtTS3-RNAi-pDonor207载体构建成功。

延缓烟草叶片衰老的阳性转基因材料的获得

通过LR反应将NtTS3-RNAi-pDonor207连入到pANDA载体上，反应体系和方法包括：NtTS3-RNAi-pDonor207载体2μL、pANDA RNAi最终载体2μL、 LR酶1μL，将上述体系于25℃过夜连接；

反应后，将连接产物转入大肠杆菌DH5a中，提取阳性克隆质粒，命名为 NtTS3-RNAi-pANDA，获得延缓烟草叶片衰老的阳性转基因材料。

延缓烟草叶片衰老的阳性转基因材料的鉴定

分别提取烟草叶片、NtTS3基因RNAi处理的阳性转基因材料叶片的RNA，并反转录为cDNA，利用第四正向引物和第四反向引物，分别以其cDNA为模板进行qRT-PCR鉴定，如图4B所示。由图4B可知，在RNAi转基因株系中NtTS3 基因表达水平明显低于对照，说明NtTS3-RNAi-pANDA载体在转基因烟草中已经工作。

性能测试

表型分析法：叶片衰老的直接表现是叶片变黄，我们首先从整体上观察转基因植株与对照间叶片变黄情况；进一步通过乙醇测定法定量不同类型烟草的叶绿素含量变化；另外，在叶片衰老进程中，随着衰老的进行，光合效率下降，利用光和效率测定仪测定Fv/Fm，进一步反应转基因株系及对照间叶片衰老差异。

结果如图5所示，结果表明，在自然条件下，同时种植野生型红花大金元、 NtTS3过表达及RNAi转基因株系，80天后观察叶片衰老表型得出，与野生型相比，NtTS3过量表达明显促进了叶片衰老进程，但RNAi转基因株系则延迟了叶片衰老进程。

同时，检测了不同材料的叶绿素含量，叶绿素测定方法：用剪刀剪取2cm X 2cm小片，称重后，放入10ml 100％乙醇中，黑暗处理18小时，4000g离心，取上清1ml，测定645nm、663nm和652nm吸光度，利用公式计算不同材料的叶绿素含量。

按下列公式分别计算叶绿素a、b和叶绿素的总浓度

叶绿素a(μg/mL)＝13.95x A665-6.88x A649

叶绿素b(μg/mL)＝24.96x A649-7.32x A665

Total(mg/g FW)＝(Ca+Cb)x V/W

V:提取buffer的体积，本实验中10mL；W:叶片鲜重

结果表明，与野生型相比，过量表达NtTS3基因材料叶绿素明显降低，而RNAi转基因株系的叶绿素含量升高；另外，光合效率(Fv/Fm)测定结果表明，过量表达NtTS3基因材料叶绿素明显降低，而RNAi转基因株系的叶绿素含量升高。

序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tacaaaaaag caggcttcat gatgatcgga gagagaaacc 40

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtacaagaaa gctgggtcct ggatcagttc agagatcca 39

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtggggacaa gtttgtacaa aaaagcaggc ttc 33

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggggacca ctttgtacaa gaaagctggg tc 32

<210> 5

<211> 4525

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgctagcc aggaagagtt 60

tgtagaaacg caaaaaggcc atccgtcagg atggccttct gcttagtttg atgcctggca 120

gtttatggcg ggcgtcctgc ccgccaccct ccgggccgtt gcttcacaac gttcaaatcc 180

gctcccggcg gatttgtcct actcaggaga gcgttcaccg acaaacaaca gataaaacga 240

aaggcccagt cttccgactg agcctttcgt tttatttgat gcctggcagt tccctactct 300

cgcgttaacg ctagcatgga tctcgggccc caaataatga ttttattttg actgatagtg 360

acctgttcgt tgcaacaaat tgatgagcaa tgctttttta taatgccaag tttgtacaaa 420

aaagcaggct aaatgatgat cggagagaga aaccaccctt atccgacggt ccatattcca 480

ccatggtcgt tcggagataa tcagacggat aacatgcacc taactttaag cccaagcggc 540

aatgcaactt caagccccag cttcagtgcc gcctctggtg aggactattc catgtttcta 600

caaaacgaca ccggtttgaa ggcactccag cgttaccttc cattcaacga cgtcgttggt 660

gattttgact ttgaatacgg cgaaggtaag gatattgacc ttccggtaga cgcatactct 720

tgtgatcagt tccgtatgta cgagtttaag gtgaggaagt gcgcacgtgg gaagtcacac 780

gattggacag agtgtccgta cgcacatccc ggcgagaaag ctcgtcggag ggacccacgt 840

aagtatcact attcgggcac tgcatgccct gagttccgta aagggaactg taggaaaggt 900

gatggttgtg agttcgctca tggcgtattt gagtgctggc tccaccctgc tcgctatcgt 960

acgcagcctt gtaaagatgg tctcaattgt aagagaaggg tttgtttctt tgctcactca 1020

ccggaacaga tccgagtact gagtccgcgt gccgattcgt tcgatggctc tccttccatt 1080

tccaggtacg gttttgaggg gaaaaatttg cattttataa cgtctcctga gtcaggctcg 1140

ccaccttgtg agtcgccgcc gatgactcag acgaccaact cagtgagctc gctgagtcga 1200

tctctagggt ctaattactc gatcaacgaa atggtggcgt cactacgtca attgcagctg 1260

aacaaggtga agtccatgcc ctcttcctgg aatttacaaa tgggatctcc ggtactcggg 1320

tcaccaagga tacccgtaaa ccgacccggt ttttgtagct taccctcaac gccaactcgg 1380

gccttcaacc gacccggtgt ctgttgcttt gatctttgcg aggaagaacc agttatggaa 1440

agggtagaat cagggaggga tttaagggct aaaatgtttg agaaattgag taaagagaat 1500

ccgttagatg ggatggtacc cgacccgatt ccttctgaag ctacgaaccc ggatgttggt 1560

tggatctctg aactgatcca gtgaaaccca gctttcttgt acaaagtggg cattataaga 1620

aagcattgct tatcaatttg ttgcaacgaa caggtcacta tcagtcaaaa taaaatcatt 1680

atttgccatc cagctgcagc tctggcccgt gtctcaaaat ctctgatgtt acattgcaca 1740

agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca gtaatacaag 1800

gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcgaggccg cgattaaatt ccaacatgga 1860

tgctgattta tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat 1920

ctatcgcttg tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag 1980

cgttgccaat gatgttacag atgagatggt cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc 2040

tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc 2100

gatccccgga aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat 2160

tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc 2220

ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt 2280

ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa 2340

agaaatgcat aaacttttgc cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc 2400

acttgataac cttatttttg acgaggggaa attaggccgg gaagccgatc tcggcttgaa 2460

cgaattgtta ggtggcggta cttgggtcga tatcaaagtg catcacttct tcccgtatgc 2520

ccaactttgt atagagagcc actgcgggat cgtcaccgta atctgcttgc acgtagatca 2580

cataagcacc aagcgcgttg gcctcatgct tgaggagatt gatgagcgcg gtggcaatgc 2640

cctgcctccg gtgctcgccg gagactgcga gatcatagat atagatctca ctacgcggct 2700

gctcaaacct gggcagaacg taagccgcga gagcgccaac aaccgcttct tggtcgaagg 2760

cagcaagcgc gatgaatgtc ttactacgga gcaagttccc gaggtaatcg gagtccggct 2820

gatgttggga gtaggtggct acgtctccga actcacgacc gaaaagatca agagcagccc 2880

gcatggattt gacttggtca gggccgagcc tacatgtgcg aatgatgccc atacttgagc 2940

cacctaactt tgttttaggg cgactgccct gctgcgtaac atcgttgctg ctgcgtaaca 3000

tcgttgctgc tccataacat caaacatcga cccacggcgt aacgcgcttg ctgcttggat 3060

gcccgaggca tagactgtac aaaaaaacag tcataacaag ccatgaaaac cgccactgcg 3120

ccgttaccac cgctgcgttc ggtcaaggtt ctggaccagt tgcgtgagcg catacgctac 3180

ttgcattaca gtttacgaac cgaacaggct tatgtcaact gggttcgtgc cttcatccgt 3240

ttccacggtg tgcgtcaccc ggcaaccttg ggcagcagcg aagtcgaggc atttctgtcc 3300

tggctggcga acgagcgcaa ggtttcggtc tccacgcatc gtcaggcatt ggcggccttg 3360

ctgttcttct acggcaaggt gctgtgcacg gatctgccct ggcttcagga gatcggaaga 3420

cctcggccgt cgcggcgctt gccggtggtg ctgaccccgg atgaagtggt tcgcatcctc 3480

ggttttctgg aaggcgagca tcgtttgttc gcccaggact ctagctatag ttctagtggt 3540

tggctactaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat 3600

cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt 3660

caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat 3720

gagtttttct aatcagaatt ggttaattgg ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact 3780

tgacgggacg gcgcaagctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 3840

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 3900

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 3960

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 4020

tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 4080

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 4140

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 4200

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 4260

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 4320

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 4380

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 4440

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 4500

tttgctggcc ttttgctcac atgtt 4525

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tacaaaaaag caggcttcgc tgaacaaggt gaagtcca 38

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtacaagaaa gctgggtctc actggatcag ttcagag 37

<210> 8

<211> 328

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctgaacaag gtgaagtcca tgccctcttc ctggaattta caaatgggat ctccggtact 60

cgggtcacca aggatacccg taaaccgacc cggtttttgt agcttaccct caacgccaac 120

tcgggccttc aaccgacccg gtgtctgttg ctttgatctt tgcgaggaag aaccagttat 180

ggaaagggta gaatcaggga gggatttaag ggctaaaatg tttgagaaat tgagtaaaga 240

gaatccgtta gatgggatgg tacccgaccc gattccttct gaagctacga acccggatgt 300

tggttggatc tctgaactga tccagtga 328

<210> 9

<211> 3701

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgctagcc aggaagagtt 60

tgtagaaacg caaaaaggcc atccgtcagg atggccttct gcttagtttg atgcctggca 120

gtttatggcg ggcgtcctgc ccgccaccct ccgggccgtt gcttcacaac gttcaaatcc 180

gctcccggcg gatttgtcct actcaggaga gcgttcaccg acaaacaaca gataaaacga 240

aaggcccagt cttccgactg agcctttcgt tttatttgat gcctggcagt tccctactct 300

cgcgttaacg ctagcatgga tctcgggccc caaataatga ttttattttg actgatagtg 360

acctgttcgt tgcaacaaat tgatgagcaa tgctttttta taatgccaag tttgtacaaa 420

aaagcaggct aagctgaaca aggtgaagtc catgccctct tcctggaatt tacaaatggg 480

atctccggta ctcgggtcac caaggatacc cgtaaaccga cccggttttt gtagcttacc 540

ctcaacgcca actcgggcct tcaaccgacc cggtgtctgt tgctttgatc tttgcgagga 600

agaaccagtt atggaaaggg tagaatcagg gagggattta agggctaaaa tgtttgagaa 660

attgagtaaa gagaatccgt tagatgggat ggtacccgac ccgattcctt ctgaagctac 720

gaacccggat gttggttgga tctctgaact gatccagtga aacccagctt tcttgtacaa 780

agtgggcatt ataagaaagc attgcttatc aatttgttgc aacgaacagg tcactatcag 840

tcaaaataaa atcattattt gccatccagc tgcagctctg gcccgtgtct caaaatctct 900

gatgttacat tgcacaagat aaaaatatat catcatgaac aataaaactg tctgcttaca 960

taaacagtaa tacaaggggt gttatgagcc atattcaacg ggaaacgtcg aggccgcgat 1020

taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc 1080

aatcaggtgc gacaatctat cgcttgtatg ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga 1140

aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc 1200

tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct gatgatgcat 1260

ggttactcac cactgcgatc cccggaaaaa cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg 1320

attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc 1380

ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac 1440

gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg 1500

ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataaac ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca 1560

ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta ggccgggaag 1620

ccgatctcgg cttgaacgaa ttgttaggtg gcggtacttg ggtcgatatc aaagtgcatc 1680

acttcttccc gtatgcccaa ctttgtatag agagccactg cgggatcgtc accgtaatct 1740

gcttgcacgt agatcacata agcaccaagc gcgttggcct catgcttgag gagattgatg 1800

agcgcggtgg caatgccctg cctccggtgc tcgccggaga ctgcgagatc atagatatag 1860

atctcactac gcggctgctc aaacctgggc agaacgtaag ccgcgagagc gccaacaacc 1920

gcttcttggt cgaaggcagc aagcgcgatg aatgtcttac tacggagcaa gttcccgagg 1980

taatcggagt ccggctgatg ttgggagtag gtggctacgt ctccgaactc acgaccgaaa 2040

agatcaagag cagcccgcat ggatttgact tggtcagggc cgagcctaca tgtgcgaatg 2100

atgcccatac ttgagccacc taactttgtt ttagggcgac tgccctgctg cgtaacatcg 2160

ttgctgctgc gtaacatcgt tgctgctcca taacatcaaa catcgaccca cggcgtaacg 2220

cgcttgctgc ttggatgccc gaggcataga ctgtacaaaa aaacagtcat aacaagccat 2280

gaaaaccgcc actgcgccgt taccaccgct gcgttcggtc aaggttctgg accagttgcg 2340

tgagcgcata cgctacttgc attacagttt acgaaccgaa caggcttatg tcaactgggt 2400

tcgtgccttc atccgtttcc acggtgtgcg tcacccggca accttgggca gcagcgaagt 2460

cgaggcattt ctgtcctggc tggcgaacga gcgcaaggtt tcggtctcca cgcatcgtca 2520

ggcattggcg gccttgctgt tcttctacgg caaggtgctg tgcacggatc tgccctggct 2580

tcaggagatc ggaagacctc ggccgtcgcg gcgcttgccg gtggtgctga ccccggatga 2640

agtggttcgc atcctcggtt ttctggaagg cgagcatcgt ttgttcgccc aggactctag 2700

ctatagttct agtggttggc tactaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc 2760

agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt 2820

acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt 2880

tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt aattggttgt aacactggca 2940

gagcattacg ctgacttgac gggacggcgc aagctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 3000

ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 3060

ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 3120

tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 3180

cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 3240

gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 3300

gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 3360

tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 3420

ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 3480

gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 3540

ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 3600

tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 3660

ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt t 3701

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggaagtgcgc acgtgggaag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acggaactca gggcatgcag 20

<210> 12

<211> 1152

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgatgatcg gagagagaaa ccacccttat ccgacggtcc atattccacc atggtcgttc 60

ggagataatc agacggataa catgcaccta actttaagcc caagcggcaa tgcaacttca 120

agccccagct tcagtgccgc ctctggtgag gactattcca tgtttctaca aaacgacacc 180

ggtttgaagg cactccagcg ttaccttcca ttcaacgacg tcgttggtga ttttgacttt 240

gaatacggcg aaggtaagga tattgacctt ccggtagacg catactcttg tgatcagttc 300

cgtatgtacg agtttaaggt gaggaagtgc gcacgtggga agtcacacga ttggacagag 360

tgtccgtacg cacatcccgg cgagaaagct cgtcggaggg acccacgtaa gtatcactat 420

tcgggcactg catgccctga gttccgtaaa gggaactgta ggaaaggtga tggttgtgag 480

ttcgctcatg gcgtatttga gtgctggctc caccctgctc gctatcgtac gcagccttgt 540

aaagatggtc tcaattgtaa gagaagggtt tgtttctttg ctcactcacc ggaacagatc 600

cgagtactga gtccgcgtgc cgattcgttc gatggctctc cttccatttc caggtacggt 660

tttgagggga aaaatttgca ttttataacg tctcctgagt caggctcgcc accttgtgag 720

tcgccgccga tgactcagac gaccaactca gtgagctcgc tgagtcgatc tctagggtct 780

aattactcga tcaacgaaat ggtggcgtca ctacgtcaat tgcagctgaa caaggtgaag 840

tccatgccct cttcctggaa tttacaaatg ggatctccgg tactcgggtc accaaggata 900

cccgtaaacc gacccggttt ttgtagctta ccctcaacgc caactcgggc cttcaaccga 960

cccggtgtct gttgctttga tctttgcgag gaagaaccag ttatggaaag ggtagaatca 1020

gggagggatt taagggctaa aatgtttgag aaattgagta aagagaatcc gttagatggg 1080

atggtacccg acccgattcc ttctgaagct acgaacccgg atgttggttg gatctctgaa 1140

ctgatccagt ga 1152

Claims (10)

1.烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

利用基因克隆技术获得包含Zinc finger CCCH 功能域基因的NtTS3基因，通过过量表达NtTS3基因促进烟草叶片的衰老，利用RNAi技术获得NtTS3基因的RNAi 载体，通过降低NtTS3基因表达延缓烟草叶片的衰老；

所述NtTS3基因的序列如SEQ ID NO.12所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用基因克隆技术获得包含Zinc fingerCCCH 功能域基因的NtTS3基因包括以下步骤：

设计含有Gateway接头的NtTS3基因扩增引物和Gateway扩增引物，所述NtTS3基因扩增引物包括如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物和如SEQ ID NO.2所示第一反向引物，所述Gateway扩增引物包括如SEQ ID NO.3所示的第二正向引物和如SEQ ID NO.4所示第二反向引物；

提取烟草叶片RNA并反转录为cDNA，以此为模板，利用所述第一正向引物和第一反向引物进行退火梯度降落PCR扩增；

将上述退火梯度降落PCR扩增的产物片段切胶回收后，利用所述第二正向引物和第二反向引物进行普通PCR扩增；

将上述普通PCR扩增的产物回收纯化后，通过gateway试剂盒连接到中间载体pDonor207上，反应后将所得产物通过化学转化方法转入大肠杆菌DH5a中，测序提取阳性克隆质粒，命名为NtTS3-pDonor207，其序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，退火梯度降落PCR扩增程序包括：步骤1:95 ℃ 3 min; 步骤2: 95 ℃ 30 S, 68 ℃ 30 S, 72 ℃ 1 min; 3个循环；步骤3: 95 ℃30 S, 66℃ 30 S, 72 ℃ 1 min; 3个循环；步骤4: 95 ℃ 30 S, 64 ℃ 30 S, 72 ℃ 1min; 3 个循环；步骤5: 95 ℃ 30 S, 62 ℃ 30 S, 72 ℃ 1 min; 3 个循环；步骤6: 95℃ 30 S, 60 ℃ 30 S, 72 ℃ 1 min; 3 个循环；步骤7:95 ℃ 30 S, 58 ℃ 30 S, 72℃ 1 min; 1 个循环；步骤8: 72 ℃ 10 min。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过gateway试剂盒连接到中间载体pDonor207的反应体系和方法包括：pDonor207载体 1 μL、纯化后的PCR片段 3μL、BP酶 1 μL，将上述体系于25℃过夜连接。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过过量表达NtTS3基因促进烟草叶片的衰老包括如下步骤：

通过LR反应将NtTS3-pDonor207连入最终过表达载体pEarlyGate101中，并将连接产物转入大肠杆菌DH5a中，鉴定提取阳性质粒，命名为NtTS3-101，获得促进烟草叶片衰老的阳性转基因材料。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，利用RNAi技术获得NtTS3基因的RNAi 载体包括如下步骤：

设计含有Gateway接头的NtTS3-RNAi基因扩增引物和Gateway扩增引物，所述NtTS3- RNAi基因扩增引物包括如SEQ ID NO.6所示的第三正向引物和如SEQ ID NO.7所示第三反向引物，所述Gateway扩增引物包括如SEQ ID NO.3所示的第二正向引物和如SEQ ID NO.4所示第二反向引物；

选取如SEQ ID NO.8所示的针对NtTS3基因的RNAi片段，以NtTS3-101载体为模板，利用第三正向引物和第三反向引物对所述RNAi片段进行第一次PCR扩增；

将上述第一次PCR扩增的产物片稀释50倍为模板，利用所述第二正向引物和第二反向引物进行第二次PCR扩增；

将上述第二次PCR扩增片段通过gateway试剂盒连接到中间载体pDonor207上，反应后将所得产物转入大肠杆菌DH5a中，测序提取阳性克隆质粒，命名为NtTS3-RNAi-pDonor207，其序列如SEQ ID NO.9所示。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述第一次PCR扩增和第二次PCR扩增的程序包括：95℃ 3 min; 95℃ 30 S, 58℃ 30 S, 72℃ 1 min，33 个循环；72℃ 10 min；

将第二次PCR扩增片段通过gateway试剂盒连接到中间载体pDonor207的反应体系和方法包括：NtTS3-RNAi片段 2μL、pDonor207中间载体 2μL、BP酶 1μL，将上述体系于25℃过夜连接。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用RNAi技术获得NtTS3基因的RNAi 载体，通过降低其表达而延缓烟草叶片的衰老包括如下步骤：

通过LR反应将NtTS3-RNAi-pDonor207连入到pANDA载体上，并将连接产物转入大肠杆菌DH5a中，提取阳性克隆质粒，命名为NtTS3-RNAi-pANDA，获得延缓烟草叶片衰老的阳性转基因材料。

9.根据权利要求5或8所述的应用，其特征在于，通过LR反应将NtTS3-pDonor207连入最终过表达载体pEarlyGate101的反应体系和方法包括：NtTS3-pDonor207载体 2μL、pEarlyGate101载体 2 μL、LR酶 1μL，将上述体系于25℃过夜连接；

通过LR反应将NtTS3-RNAi-pDonor207连入到pANDA载体的反应体系和方法包括：NtTS3-RNAi-pDonor207 载体2μL、pANDA RNAi最终载体 2μL、LR酶 1μL，将上述体系于25℃过夜连接。

10.根据权利要求5或8所述的应用，其特征在于，还包括对所述阳性转基因材料鉴定的步骤，具体如下：

设计鉴定引物，所述鉴定引物包括如SEQ ID NO.10所示的第四正向引物和如SEQ IDNO.11所示第四反向引物；

分别提取烟草叶片、NtTS3基因过量表达及RNAi处理叶片的RNA，并反转录为cDNA，利用第四正向引物和第四反向引物，以其cDNA为模板进行qRT-PCR鉴定。

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